phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin từ động vật thân mềm hai vỏ sống ở biển

Do vậy sử dụng các chế phẩm vi sinh có thể là một giải pháp hiệu quả, nhằm giúp kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn có hại nhờ tính cạnh tranh của các chủng có lợi, nâng cao khả năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan kết quả của luận văn “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin từ động vật thân mềm hai vỏ sống ở biển” thuộc đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản” (Mã số : 106.03 – 2011.34) do Quỹ phát

triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ - Trường Đại học Nha Trang chủ trì - TS Nguyễn Văn Duy làm chủ nhiệm, được thực hiện từ tháng 02 năm

2012 đến tháng 03 năm 2013 là chính xác Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác tới thời điểm này Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

HỒ THỊ HỒNG NHI

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và sự kính trọng tới thầy hướng dẫn TS Nguyễn Văn Duy – Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, đã định hướng và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu nhà trường, các thầy cô trong Khoa Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong thời gian tham gia khóa học

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện, các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian thực hiện luận văn

Xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đã

hỗ trợ kinh phí thuộc đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản”

(Mã số : 106.03 – 2011.34) giúp tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài

Một lần nữa, tôi xin cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó

Tác giả luận văn

Hồ Thị Hồng Nhi

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về bacteriocin 3

1.1.1 Khái niệm về bacteriocin 3

1.1.2 Phân loại bacteriocin 4

1.1.2.1 Bacteriocin của vi khuẩn 6

1.1.2.2 Bacteriocin từ sinh vật cổ (Archaea) 8

1.1.3 Một số tính chất hóa lý của bacteriocin 9

1.1.3.1 Độ bền enzyme 9

1.1.3.2 Độ bền nhiệt 10

1.1.3.3 Độ bền pH 10

1.1.4 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 10

1.1.5 Ứng dụng của bacteriocin 12

1.1.5.1 Bảo quản thực phẩm 12

1.1.5.2 Bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi trên cạn 12

1.2 Triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh bacteriocin làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản 14

1.2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 14

1.2.2 Những giải pháp mới phòng trừ dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản bền vững 15

1.2.3 Triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản 17

1.3 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn biển 20

1.3.1 Trên thế giới 20

1.3.2 Tại Việt Nam 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

2.2 Nguyên vật liệu 27

2.2.1 Mẫu tu hài 27

2.2.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị 27

2.2.3 Hóa chất, môi trường và thuốc thử 27

2.2.4 Thiết bị chuyên dụng 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phân lập vi khuẩn 30

2.3.2 Nuôi cấy và bảo quản chủng vi khuẩn 30

2.3.3 Xác định hoạt tính sinh bacteriocin 31

2.3.3.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 31

2.3.3.2 Xác định bản chất của chất kháng khuẩn 32

2.3.4 Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô 32

2.3.4.1 Thử độ bền với enzyme của dịch bacteriocin thô 32

2.3.4.2 Xác định độ bền với nhiệt của dịch bacteriocin thô 32

2.3.4.3 Xác định độ bền với pH của dịch bacteriocin thô 33

2.3.5 Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn 33

2.3.5.1 Xác định hình thái khuẩn lạc 33

2.3.5.2 Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn 33

2.3.6 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và rpoB 34

2.3.7 Phân tích quan hệ phát sinh loài 35

2.3.8 Xử lý thống kê 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn từ thịt tu hài 37

3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn 37

3.3 Xác định bản chất bacteriocin của các chất kháng khuẩn 41

3.4 Ảnh hưởng của enzyme, nhiệt độ và pH đến hoạt tính kháng khuẩn của các chủng tuyển chọn 45

3.5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng nghiên cứu 50

3.6 Định danh các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA và rpoB 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 ATP Adenosin triphosphat

2 BLIS Bacteriocin-like substance (chất tương tự bacteriocin)

3 CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

4 DNA Deoxyribonucleotide Acid

5 FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức LHQ về

lương thực và nông nghiệp)

6 FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm và

dược phẩm Hoa Kỳ)

7 GRAS Generally recognized as safe (Được công nhận rộng rãi là

an toàn)

8 NTTS Nuôi trồng thủy sản

9 OD Optical Density (Mật độ quang)

10 TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

11 TSA Tryptone Soya Agar

12 TSB Tryptone Soya Broth

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh giữa bacteriocin và kháng sinh 4

Bảng 1.2 Bacteriocin của vi khuẩn và sinh vật cổ 5

Bảng 1.3 Tính chất hóa lý của một số bacteriocin từ vi khuẩn .9

Bảng 1.4 Các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 22

Bảng 1.5 Bacteriocin từ vi khuẩn lactic được phân lập từ động vật biển 24

Bảng 2.1 Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển 27

Bảng 3.1 Số chủng vi khuẩn ở các lần phân lập 37

Bảng 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của của các chủng phân lập đối với ba chủng vi khuẩn đích 38

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của trypsin và proteinase K đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của các chủng tuyển chọn 44

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của một số enzyme thủy phân lên hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn đối với vi khuẩn chỉ thị Entercoccus faecalis B1.1 45

Bảng 3.5 Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn 46

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn 48

Bảng 3.7 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 51

Bảng 3.8 So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng H9, H18, H51, H61 và H108 với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 53

Bảng 3.9 So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng H77 (1064 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 55

Bảng 3.10 So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng H108 (857 nuleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 56

Bảng 3.11 So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng H77 (904 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của một số bacteriocin đặc trưng 6 Hình 1.2 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 11 Hình 1.3 Quy trình tuyển chọn một probiotic trong nuôi trồng thủy sản 19 Hình 1.4 Số lượng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi chu kỳ 10 năm từ 1949-2010 20Hình 2.1 Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính của luận văn .36 Hình 3.1 Khuẩn lạc trên đĩa thạch ở độ pha loãng 10-6 sau 24 giờ nuôi cấy 37

Hình 3.2 Tỉ lệ các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng với vi khuẩn chỉ thị ở ba lần phân lập 39 Hình 3.3 Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị

Vibrio alginolyticus V3.3 trên môi trường TCBS 40

Hình 3.4 Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị

Entercoccus faecalis B1.1 trên môi trường TSA 40

Hình 3.5 Vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập đối với chủng chỉ thị V

parahaemolyticus C1 trên môi trường TCBS 41

Hình 3.6 Vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng H18 và H76 sau khi xử lý

với proteinase K và trypsin, vi khuẩn chỉ thị là Entercoccus faecalis B1.1 42

Hình 3.7 Vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của hai chủng H18, X1.10 sau khi

xử lý với trypsin và proteinase K, vi khuẩn chỉ thị là V alginolyticus V3.3 (A) và V

parahaemolyticus C1 (B) 43

Hình 3.8 Ảnh hưởng của lipase và α-amylase hoạt tính kháng khuẩn của dịch

bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn 47 Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của dịch bacteriocin thô của chủng H108 và H18 47 Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của dịch bacteriocin thô từ chủng H108 49 Hình 3.11 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng H77 và H108 49 Hình 3.12 Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng sinh bacteriocin nghiên cứu 50

Hình 3.13 Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn phân lập trên gel agarose 1% 52 Hình 3.14 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của các chủng H9, H18, H51, H61, H108 và các chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi

Cronobacter 54

Hình 3.15 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng H77 và

các chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi Enterobacter 55 Hình 3.16 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen rpoB của chủng H108, H77 và các chủng có quan hệ gần gũi 57

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản (NTTS) hiện là một trong những lĩnh vực sản xuất thực phẩm phát triển mạnh nhất nước ta Sự phát triển về qui mô và đa dạng loài trong NTTS đã đem lại sự tăng vượt bậc về sản lượng nuôi trồng trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Tuy nhiên, do thiếu qui hoạch đồng bộ và phát triển quá nhanh trong 5 - 6 năm gần đây, dịch bệnh đã xảy ra ở một số khu vực nuôi thủy sản tập trung hoặc nuôi công nghiệp với tần suất khá thường xuyên Trong các tác nhân gây bệnh thì

vi khuẩn, điển hình là các loài Vibrio, trong lĩnh vực nuôi biển được coi là một trong

những nguyên nhân chính [90] Hơn nữa, cùng với biến đổi khí hậu toàn cầu, những khó khăn đối với các vi khuẩn gây bệnh ngày càng tăng lên, bởi vì ở nhiệt độ cao hơn thì khả năng gây bệnh và truyền nhiễm cũng tăng lên [16, 32]

Động vật thủy sản bị nhiễm bệnh thường phải dùng một số loại kháng sinh như tetracycline, streptomycin, rifampicin, oxytetraxycline để điều trị Những loại kháng sinh này nếu sử dụng trong giai đoạn sản xuất giống thường làm cho ấu trùng chậm lớn, còi cọc, các giai đoạn biến thái xảy ra không đều, dẫn đến tỷ lệ sống của ấu trùng thấp Sử dụng kháng sinh trong quá trình nuôi thương phẩm dẫn đến hiện tượng tích lũy kháng sinh trong sản phẩm sau thu hoạch làm giảm chất lượng, chi phí sản xuất tăng trong khi giá trị sản phẩm giảm Việc lạm dụng kháng sinh trong nghề nuôi hiện nay khá phổ biến nên hiện tượng kháng kháng sinh của nhiều chủng vi khuẩn đang là vấn đề hết sức nan giải [55]

Chính vì vậy, một xu hướng mới hiện nay là việc thay thế sử dụng các chất kháng sinh phổ rộng truyền thống bằng các chế phẩm sinh học (probiotic), chất kháng sinh thế hệ mới hay các loại vaccine Tuy nhiên việc sử dụng vaccine thường tốn kém lớn về chi phí sản xuất, chi phí nhân công, hơn nữa các động vật bậc thấp chưa có hệ miễn dịch đặc hiệu nên việc sử dụng vaccine rất khó khăn [13] Do vậy sử dụng các chế phẩm vi sinh có thể là một giải pháp hiệu quả, nhằm giúp kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn có hại nhờ tính cạnh tranh của các chủng có lợi, nâng cao khả năng chống chịu bệnh của vật nuôi, đồng thời còn có tác dụng cải thiện môi trường nuôi và

an toàn đối với sức khỏe con người [95] Hiện nay, việc sử dụng chế phẩm probiotic từ

vi khuẩn sinh bacteriocin có thể là giải pháp thay thế phù hợp do khả năng kháng khuẩn và tính an toàn của nó

Trong nhiều năm qua bacteriocin thường được thu nhận từ vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ các loại thực phẩm nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, để ứng dụng trong phòng và trị bệnh cho lĩnh vực nuôi trồng hải sản đòi hỏi vi khuẩn sinh bacteriocin phải được phân lập từ các sinh vật biển hoặc môi trường nước biển để thích nghi với điều kiện môi trường nuôi Bên cạnh đó, vấn đề nghiên cứu vi khuẩn biển sinh bacteriocin còn rất mới ở nước ta Do đó, nhằm tìm ra cơ sở để phát triển các chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng hải sản, từ các vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin, phù hợp với đặc điểm môi trường và điều kiện khí hậu ở Việt Nam, đề tài

“Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin từ động vật thân mềm hai vỏ sống ở biển” được thực hiện

Mục tiêu của đề tài:

- Phân lập vi khuẩn tổng số từ một đối tượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ (tu hài)

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh bacteriocin làm nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc đa năng (kháng sinh thế hệ mới, probiotic) trong nuôi trồng thủy sản

Các nội dung của đề tài:

- Phân lập các chủng vi khuẩn từ thịt tu hài (Lutraria philippinarum)

- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn

- Xác định bản chất bacteriocin của các chất kháng khuẩn

- Xác định ảnh hưởng của enzyme, nhiệt độ và pH đến hoạt tính kháng khuẩn của các chủng tuyển chọn

- Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin

- Định danh các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin dựa trên trình tự đoạn gen 16S

rDNA và rpoB

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bacteriocin

1.1.1 Khái niệm về bacteriocin

Bacteriocin là các peptide kháng khuẩn được tổng hợp trên ribosom của tế bào

vi khuẩn Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn có quan hệ họ hàng gần gũi với chủng sinh bactriocin đó [15, 22, 32] Bacteriocin được sản xuất ở hầu hết các nhóm vi khuẩn và có thể là tất cả các nhóm cổ khuẩn [90] Các bacteriocin rất đa dạng về kích thước, vi khuẩn đích, cơ chế hoạt động, cơ chế tiết, cơ chế miễn dịch Có thể chia bacteriocin thành hai nhóm chính: nhóm sản xuất bởi vi khuẩn Gram âm và Gram dương [51] Hơn nữa một số nhỏ bacteriocin từ sinh vật cổ cũng đang được nghiên cứu [90] Một số loài vi khuẩn sản sinh độc tố có thể có nhiều tính chất giống như bacteriocin, nhưng chưa có đầy đủ đặc tính của một bacteriocin, những độc tố này được gọi là “chất ức chế kiểu bacteriocin” hoặc BLIS (Bacteriocin-like inhibitory substance) [63]

Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình nghiên cứu

tìm cách tiêu diệt vi khuẩn E coli gây bệnh, kết quả của công trình này đã thúc đẩy

nghiên cứu về chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên

là Colicin do E coli sinh tổng hợp nên [36] Cho đến nay, bacteriocin được sinh bởi cả

vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm khác biệt:

Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: gồm nhiều loại protein khác nhau về kích

thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có khả năng kháng khuẩn yếu hơn bacteriocin của

vi khuẩnGram dương và bacteriocin được nghiên cứu nhiều nhất là Colicin [46, 90]

Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương: các loại bateriocin này cũng đa dạng như

ở vi khuẩn Gram âm Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn Gram âm ở hai điểm sau: việc sản sinh bacteriocin không nhất thiết làm chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩnGram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩnGram âm [46, 90]

Hiện nay có nhiều tài liệu xếp bacteriocin thuộc một nhóm chất kháng sinh (antibiotic) [49], đó là peptide antibiotic vì nó có bản chất là polypeptide, có khả năng kháng khuẩn và do vi sinh vật tạo ra để chống lại các vi sinh vật cạnh tranh khác, tương tự với hoạt tính của các chất kháng sinh khác [37] Trong khi một số khác, để phân biệt rõ sự khác nhau giữa bacteriocin và antibiotic trong điều trị và để tránh sự

nhầm lẫn giữa hai loại chất kháng khuẩn này, họ mới đặt tên cho các polypeptide mà

có khả năng kháng khuẩn và do vi khuẩn sinh ra là bacteriocin, và xếp nó vào nhóm peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptide) Theo Cleveland và Tchikindas [27], có

sự khác nhau rõ giữa bacteriocin và antibiotic trong điều trị (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 So sánh giữa bacteriocin và kháng sinh

Sinh tổng hợp Trên ribosom, do gen quy

định

Sản phẩm trao đổi chất bậc II

Phạm vi hoạt động Phổ kháng khuẩn hẹp Phổ kháng khuẩn rộng Khả năng gây đáp ứng miễn

Cơ chế kháng thuốc của tế

bào mục tiêu

Ảnh hưởng đến thành phần cấu tạo màng tế bào Liên quan đến gen

Cơ chế hoạt động Tạo lỗ màng, sinh tổng hợp

thành tế bào

Tác động lên màng tế bào hoặc các vi trí đích nội bào

1.1.2 Phân loại bacteriocin

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi

Bacteriocin thường được phân loại dựa trên nhóm vi khuẩn sản sinh ra chúng (Gram âm, Gram dương), ngoài ra còn có nhóm bacteriocin từ những loài sinh vật cổ (Archaea) cũng đang được nghiên cứu.Bảng 1.2 miêu tả tóm tắt các nhóm bacteriocin của vi khuẩn và sinh vật cổ và các loại bacteriocin đại diện cho từng nhóm [90]

Bảng 1.2 Bacteriocin của vi khuẩn và sinh vật cổ

Tạo lỗ trên màng Colicin A, B Colicin

Nuclease Colicin E2, E3 Giống colicin Chưa biết S-pyocin, Klebicin

Giống đuôi phage Chưa biết R và F pyocin

Biến đổi sau dịch mã Microcin C7

Mersacidin Lớp I

Type C-hỗn hợp Lacticin 3147 Class IIa-kháng

Listeria Pediocin PA1 Lớp II

Class IIb-hỗn hợp Carnobacteriocin B2 Type IIIa-enzyme

Lớp III

Type IIIb-peptide không phân giải Helveticin

Protein halocin Halocin H1, H4

1.1.2.1 Bacteriocin của vi khuẩn

Bateriocin thường được phân loại dựa vào các đặc điểm: chủng vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng, và tính tương đồng về các amino acid hoặc hệ gen của nó [32] Nhìn chung, bacteriocin được chia thành 4 lớp chính như sau:

a Lớp I là những bacteriocin được gọi là lantibiotic [46] Lantibiotic là những

peptide có kích thước nhỏ (<5 kDa) [42] và thường được chia thành 3 nhóm dựa trên cấu trúc và phổ hoạt động của chúng [46]

Lantibiotic A, như là nisin, thường là những protein nhỏ (2-5 kDa), có hình ốc

vít, kéo dài và chứa những phân tử mang điện tích dương Cơ chế kháng khuẩn của chúng là hình thành những lỗ nhỏ dẫn đến làm tan màng tế bào và làm các chất chuyển hóa đi giải phóng các tế bào nhạy cảm [50, 94]

Lantibiotic B, như là mersacidin Cơ chế kháng của chúng là ức chế các phản

ứng enzyme các tế bào, như là tổng hợp thành tế bào [94]

Lantibiotic hai thành phần như là lacticin 3147 [102], chúng chứa hai chuỗi

peptide có hoạt tính kháng khuẩn bổ sung nhau [79]

A: Nisin, B: microcin B17, C: pediocin PA-1 D: patellamide A

(Desrias et al, 2010) [32]

Hình 1.1 Cấu trúc của một số bacteriocin đặc trưng

b Lớp II bao gồm các loại bacteriocin bền nhiệt, rất ít bị biến đổi [46]

Bacteriocin lớp II từ vi khuẩn lactic cũng là những peptide chứa nonlanthiomine nhỏ

[35, 68] Đại đa số bacteriocin trong lớp này thể hiện tính kháng bằng sự thấm qua màng tế bào và sau đó tấn công vào các phân tử của vi khuẩn đích Lớp II được chia thành các phân lớp nhỏ:

Lớp IIa là nhóm lớn nhất và các loại bacteriocin trong lớp này được phân biệt

nhờ vào hoạt tính Listeria và sự gắn kết với bề mặt vi khuẩn đích nhờ vào một đoạn

amino (YGNGVXaaC) Cũng giống với loại lantibiotic A, lớp này có cơ chế kháng nhờ tạo các lỗ nhỏ trên bề màng tế bào chất Các ví dụ thuộc nhóm này là bacteriocin pediocin, sakacin A và leucocin A [35, 50, 68]

Lớp IIb như là laticin F và lactococcin G có khả năng tạo lỗ nhỏ trên màng tế

bào đích, chúng bao gồm hai loại protein riêng biệt [44, 50] Trong nhóm này điển hình là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK

Lớp IIc bao gồm các peptide nhỏ, bền nhiệt Tiêu biểu trong nhóm này là

divergicin A và acidocin B

c Lớp III bao gồm những loại bacteriocin có kích thước lớn hơn, không bền

nhiệt, như là helveticin J hoặc lactacin B [34, 55]

d Lớp IV là các bacteriocin phức hợp, chúng mang một nửa là lipit hoặc

carbohydrate [36] Cấu trúc và chức năng của nhóm này chưa được biết nhiều, bao gồm các bacteriocin như leuconocin S và lactocin 27 [23, 99]

Trong các lớp trên thì lớp I và II được tập trung nghiên cứu để ứng dụng làm probiotic hơn cả

Bên cạnh đó, bacteriocin còn được phân thành 4 lớp chính: colicin, bacteriocin

có cấu trúc giống colicin, bacteriocin có cấu trúc giống đuôi phage và microcin (Bảng

1.2) Trong đó các loại colicin từ E.coli được nghiên cứu nhiều nhất [21] Hơn nữa

chúng còn được sử dụng như là mô hình mẫu để nghiên cứu về cấu trúc, chức năng và

sự tiến hóa của bacteriocin [75, 77]

Colicin

Nhìn chung, các loại colicin là những protein, nhạy cảm với protease và nhiệt Chúng có kích thước dao động từ 25 - 90 kDa [73] Colicin được chia thành hai loại dựa vào kiểu hoạt động của chúng:

Colicin tạo lỗ màng như là colicin A, B, E1, Ia, Ib, K, E1, 5, chúng kháng các

chủng vi khuẩn nhạy cảm với chúng nhờ vào phương thức tạo các lỗ nhỏ trên màng tế bào [47]

Colicin nuclease bao gồm colicin E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9 hoạt động

kháng của chúng dựa vào khả năng phân cắt DNA/ RNA do có hoạt tính của các enzyme DNAse, RNAse, hoặc tRNAse [47]

Các loại bacteriocin có cấu trúc giống colicin

Các loại bacteriocin giống colicin (pyocin S5) có những đặc điểm tương đồng với colicin về cấu trúc và chức năng, do đó chúng cũng có kiểu hoạt động tạo lỗ trên màng tế bào hoặc chúng là những nuclease [64] Trong nhóm này, Klebicin từ các loài

Klebsiella, S-pyocin của loài Pseudomonas aeruginosa và alveicins của loài Hafnia alvei đang được nghiên cứu nhiều

Bacteriocin giống đuôi Phage

Các loại bacteriocin thuộc nhóm này thường có cấu trúc phân tử lớn hơn các loại khác, chúng có sự tương đồng về cấu trúc với bacteriophage Có một số ý kiến cho

rằng chúng là những thể thực khuẩn chưa hoàn chỉnh [17] Pyocin R và F của P

aeruginosa là một trong những loài được nghiên cứu kỹ trong nhóm này

Microcin

Microcin là những bateriocin có chuỗi peptide rất ngắn (<10 kDa), chúng có chung đặc tính với các loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương, bao gồm tính chịu nhiệt, kháng được một số loại protease, tính không ưa nước tương đối và tính bền ở các ngưỡng pH cao hay thấp [13, 47] Hiện nay đã có báo cáo về 14 loại microcin, trong đó

7 loại được tập trung nghiên cứu do có tính đa dạng về hoạt tính kháng khuẩn

Nhìn chung, chúng được chia thành 2 loại: microcin bị biến đổi sau quá trình dịch mã (bao gồm microcin B17, C7, J27, và D93); và microcin không bị biến đổi (bao gồm microcin E492, V, L, H47 và 24) (Bảng 1.2) [47]

1.1.2.2 Bacteriocin từ sinh vật cổ (Archaea)

Archaea cũng sản sinh ra một số chất có hoạt tính kháng khuẩn giống bacteriocin, được gọi là archaeocin [84] Hiện nay, nhóm này chưa được nghiên cứu nhiều như các loại bacteriocin từ vi khuẩn, nhưng trong số đó hai loại bacteriocin

halocin của Halobacteria và sulfolobicin của các loài Sulfolobus đã được xác định

Halocin có thể là những peptide (<10 kDa) hoặc là những protein (>10 kDa) [84] Theo Toreblanca và Meseguer [98] sản sinh Halocin là một nét đặc trưng tiêu

biểu của Halobacteria Halocin thường được mã hóa bởi các gen nằm trên

megaplasmid Sulfolobicin vẫn chưa được biết nhiều, chúng được phân lập tử vi khuẩn

Sulfolobus islamdicus ở miệng núi lửa tại Iceland Hoạt động kháng của chúng là liên

kết với màng tế bào chứ không phải được phóng ra từ tế bào Sulfolobicin cũng liên kết với những túi giống màng tế bào có kích thước đường kính từ 90 - 80 nm [90] Cũng giống với một số loại bacteriocin khác, chúng có khả năng bền nhiệt ở nhiệt độ cao và ít bền khi xử lý với enzyme Phổ hoạt động của chúng vẫn chưa được biết đến [38]

1.1.3 Một số tính chất hóa lý của bacteriocin

1.1.3.1 Độ bền enzyme

Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu tạo hóa học khác nhau nên sẽ chịu sự phân cắt đặc hiệu của các enzyme khác nhau Khi bị phân cắt bởi các enzyme đặc hiệu này, bacteriocin sẽ bị mất hoạt tính kháng khuẩn Đây có thể coi là một dấu hiệu xác định chất kháng khuẩn có phải là bacteriocin hay không [96]

Bảng 1.3 Tính chất hóa lý của một số bacteriocin từ vi khuẩn

Tên bacteriocin Nhiệt độ xử lý Khoảng pH bền Enzyme thủy phân

Megacin A – 216 60°C/30 phút 2 - 7 Chymotripsin, Pepsin, Trypsin

Clostocin A 100°C/30 phút 4 - 9 Trypsin, Chymotripsin,

Pronase P, Rnase, Dnase

Clostocin B 80°C/10 phút 4 - 9 Trypsin, Chymotripsin,

Pronase P, RNAse, DNAse

Clostocin C 80°C/10 phút 4 - 9 Trypsin, Chymotripsin,

Pronase P, RNAse, DNAse

Clostocin D 100°C/30 phút 4 - 9 Trypsin, Chymotripsin,

Pronase P, RNAse, DNAse

Boticin E – S5 100°C/10 phút 1,1 - 9,5 Trypsin, Chymotripsin,

Pronase P, RNAse, DNAse

Boticin P 60°C/30 phút 6,5 - 7,5

Trypsin, RNAse, DNAse, Alkaline phosphotase, Phospholipase C, D

1.1.3.2 Độ bền nhiệt

Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy các loại bacteriocin của những loại vi khuẩn khác nhau thì có khả năng chịu nhiệt khác nhau Mỗi loại bacteriocin có khả năng chịu nhiệt ở một khoảng nhất định nhưng những loại bacteriocin chịu nhiệt chủ yếu thuộc Lớp I và Lớp II Ví dụ loại bacteriocin ST28MS và ST26MS được sinh ra

bởi Lactobacillus plantarum có khả năng kháng khuẩn không giảm sau khi xử lý 90 phút tại điều kiện 100oC hay 20 phút ở 121oC [96] Khả năng chịu nhiệt của bacteriocin có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin

1.1.3.3 Độ bền pH

Một số bacteriocin có thể hoạt động tốt dưới những điều kiện pH nhất định Ví

dụ SR28MS và ST26MS [96], bên cạnh có độ bền nhiệt cao, chúng còn có thể hoạt động ổn định trong 2 giờ tại những giá trị pH từ 2 - 12 Đặc tính này khác nhau ở các loại bacteriocin khác nhau và được quy định bởi thành phần cấu trúc và cấu tạo hóa học của mỗi bacteriocin Độ bền nhiệt độ và pH rất quan trọng trong quá trình sản xuất

và sử dụng bacteriocin, tùy vào từng loại bacteriocin khác nhau mà người ta lựa chọn điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp sao cho hiệu quả sản xuất và hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất

1.1.4 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Cho đến nay thì cơ chế hoạt động của bacteriocin đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công bố

Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác có thể do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào Nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào [2] Các cơ chế hoạt động khác cũng đã được phát hiện đối với các bacteriocin như thay đổi hoạt động enzyme, ức chế sự nảy mầm của bào tử và ức chế hoạt động của các chất mang điện tích âm thông qua sự hình thành của các lỗ [12, 94] Hoạt tính kháng khuẩn chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi một số yếu tố như lượng bacteriocin và độ tinh khiết của nó, tình trạng sinh lý của các tế bào chỉ thị và các điều kiện thí nghiệm [24]

Có khả năng là lớp I và II sử dụng cùng các cơ chế hoạt động giống nhau

Các cơ chế hoạt động của các nhóm bacteriocin đã được nghiên cứu:

Lớp I - điển hình là nisin: các bacteriocin khác nhau thì cơ chế tác động có thể

là lên thành peptidoglycan hoặc màng nguyên sinh, hoặc kết hợp cả hai cơ chế Ví dụ,

nisin có cả hai cơ chế trong khi đó thì lacticin thì chỉ có khả năng tác động lên thành peptidoglycan

Đối với thành peptidoglycan: lipid II giữ vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các đơn vị tổng hợp nên thành peptidoglycan từ trong tế bào chất Bacteriocin thuộc nhóm này có khả năng liên kết với lipid nằm trên màng nguyên sinh, sự liên kết này được giải thích rằng do phần lớn bacteriocin mang điện tích dương và lipid màng mang điện tích âm vì thế sự liên kết được dễ dàng tạo ra trên màng Sau khi tạo liên kết, bacteriocin sẽ khóa lipid làm chúng mất khả năng vận chuyển các tiểu đơn vị cấu tạo nên thành peptidoglycan

Đối với màng sinh chất, bacteriocin liên kết và sử dụng lipid trên màng nguyên sinh thực hiện quá trình oxi hóa khử, lúc này lipid có tác dụng như những con dao cắt tạo nên những lổ hỏng trên màng nguyên sinh Những lỗ hỏng này làm thất thoát nhiều các ion, các chất hòa tan trong nguyên sinh chất (muối khoáng, acid amin, acid nucleic…), làm thủy phân và thất thoát nhiều ATP dẫn đến tế bào chết nhanh chóng hơn [50]

Hình 1.2 Cơ chế hoạt động của bacteriocin Lớp II - điển hình là Sakacin: do thuộc nhóm kỵ nước sau khi tạo ra kênh dẫn

trong màng, bacteriocin thuộc nhóm này sẽ liên kết với lipid trong thành phần phospholipid màng, chúng sẽ gắn trực tiếp vào màng như một thành phần của màng, sau đó thực hiện các phản ứng oxi hóa khử tạo nên những lỗ hỏng và tác động như nhóm I [50]

Lớp III - điển hình lysostaphin: tác động trực tiếp lên thành tế bào, làm phân

hủy tan thành tế bào và phá vỡ tính thẩm thấu [50]

Lớp IV- hiện nay các nhà khoa học vẫn chưa đưa ra một kết luận cụ thể rõ ràng

nào cho cơ chế tác động của nhóm này Theo sự giả định của các nhà khoa học, họ cho rằng nhóm này tác động chủ yếu lên DNA, RNA và sự tổng hợp protein Các bacteriocin nhóm này có thể tạo phức hợp không tan với DNA ngăn cản DNA tổng hợp nên RNA và protein, hoặc liên kết với DNA làm dịch mã ra các protein không bình thường, cũng có thể nó liên kết trực tiếp và ức chế hoạt động của protein [50]

1.1.5 Ứng dụng của bacteriocin

1.1.5.1 Bảo quản thực phẩm

Một trong những thách thức chính của ngành thực phẩm là việc bảo quản sản phẩm không sử dụng các hóa chất độc hại gây ảnh hưởng đến người tiêu thụ Do đó, bacteriocin đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, hiện nay chỉ có nisin và pediocin PA1/ AcH là hai nhóm được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm

Ứng dụng bacteriocin trong thực phẩm có thể qua các cách như: sản xuất tại chổ

(in situ) bởi những vi khuẩn trong các thực phẩm lên men tinh chế hoặc tinh chế một phần sau rồi đuợc bổ sung vào thực phẩm hoặc sử dụng các vi khuẩn sinh bacteriocin như là một thành phần trong quá trình lên men Bên cạnh đó, bacteriocin có thể được sử dụng kết hợp với chất mang cellulose vi khuẩnnhằm nâng cao hiệu quả sử dụng [6]

Nisin và bacteriocin của vi khuẩn Gram dương đã được FAO đảm bảo an toàn

thực phẩm Nghiên cứu trước đây khi bổ sung nisin có thể giảm sự phát triển của L

monocytogenes trong thịt cá hồi xông khói Đặc biệt khi bổ sung C02 trong quá trình

đóng gói đã làm tăng tác dụng của nisin kháng lại Listeria [90] Có những nghiên cứu

đang được khuyến khích để tráng thêm một lớp nisin trong quá trình đóng gói

1.1.5.2 Bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi trên cạn

Hiện nay, bacteriocin và ứng dụng của chúng ở động vật trên cạn là rất lớn Đặc biệt là các bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm như là colicin và microcin của vi khuẩn

đường ruột, pyocin của P.aeruginosa có sự hứa hẹn lớn cho thuốc của con người và

thú y [90]

Trong tuyến tiêu hóa của con người có sự tồn tại cân bằng giữa hệ vi sinh vật đường ruột và vật chủ Vi sinh vật đường ruột đóng vai trò quan trọng cho sự phát

triển hệ miễn dịch niêm mạc Phần lớn vi khuẩn lactic chiếm ưu thế trong hệ đường

ruột, đặc biệt chúng thể hiện hoạt tính sinh bacteriocin trong nghiên cứu in vitro Một

nghiên cứu trước đây của Claesson và cộng sự [25] đã chứng minh bacteriocin Abp

118 từ chủng Lactobacillus valivarius UCC 118 kháng lại tác nhân gây bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm (Listeria monnocytogenes) Helicobacter pylori, một tác nhân gây bệnh tá tràng, bị kháng bởi bacteriocin sản sinh từ chủng Lactobacillus johnsonii LA1 và Lactobacillus acidophilus LB [28]

Tuy nhiên, bacteriocin sản sinh từ vi khuẩn Gram dương có nhược điểm trong việc sử dụng làm chế phẩm probiotic, đó là chúng ít ức chế vi khuẩn gây bệnh đường

ruột thông thường như là Enterobacter, Klebsiella hoặc Samonella Trong khi đó

bacteriocin được sinh ra từ vi khuẩn Gram âm có khả năng ức chế các loại vi khuẩn này

Như chủng E.coli H22 có thể ức chế sinh trưởng của 7 chi trong họ Enterobacteriaceae (đó là Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Salmonella, Shigella và

Yersinia) Khả năng ức chế này được cho là do sự sản sinh ra microcin C7 [86] và

colicin E1 và Ib [29]

Đối với gia súc và gia cầm, vấn đề quản lý sự phát triển quá mức của các tác nhân gây bệnh cơ hội trong nguyên liệu sản xuất thức ăn là rất quan trọng Đặc biệt là chúng có thể bị nhiễm trong khâu sản xuất và ngay cả quá trình tiêu thụ Do đó, việc

bổ sung probitotic trong quá trình nuôi là một việc làm thiết yếu Nghiên cứu của

Carina Audisio và cộng sự [18] khi bổ sung bacteriocin sản xuất từ Enterococcus

faecium J96 có khả năng kháng tác nhân gây bệnh Salmonella pullorum, và nâng cao

tỷ lệ sống của gà con [18] Trong gia súc, dạ cỏ bò là nơi trú ẩn của tác nhân gây bệnh

khó có thể kiểm soát bởi kháng sinh như là E coli O157:H7 [54] Bên cạnh đó, khi sử

dụng kháng sinh còn làm tăng tính độc của những tác nhân gây bệnh này Một số công

trình nghiên cứu gần đây về bổ sung colicin từ các chủng E.coli vào dạ cỏ của bò đã

làm giảm số lượng tác nhân gây bệnh một cách rõ rệt [33] như coicin E7 [83] Bảy chủng sản sinh colicin phân lập từ gia súc mang bệnh có kết quả kháng lại

enterohemorrhagic E.coli [82] Khi phối trộn các chủng sinh colicin với nhau kết quả cho thấy giảm mật độ các chủng E.coli trong các con bò cái nghiên cứu [83] Ngoài ra microcin B17 của chủng E.coli cũng có khả năng hạn chế vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

ở bê con [100]

1.2 Triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh bacteriocin làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản

1.2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản

Một thách thức lớn trong NTTS hiện nay là vấn đề dịch bệnh và sự thay đổi khí hậu toàn cầu [16] Vi khuẩn thường phát triển và thể hiện khả năng gây bệnh cao hơn ở nhiệt độ cao, dẫn đến dịch bệnh càng lớn và nguy hiểm hơn [32] Hệ vi sinh vật của cá

có thể bao gồm những tác nhân gây bệnh cơ hội trong điều kiện stress như là thay đổi nhiệt độ đột ngột, mật độ cao và chất lượng nước xấu và do đó gây ra dịch bệnh ở các đối tượng nuôi Nguyên nhân gây ra bệnh trong nuôi trồng cá biển bao gồm: bệnh do nấm, ký sinh trùng, do virus, do vi khuẩn Hiện nay, bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề ương nuôi cá thương phẩm Nhiều bệnh trên cá nuôi lồng bè trên biển do

vi khuẩn đã được ghi nhận: bệnh đốm trắng ở thận trên cá giò nuôi thương phẩm, bệnh Vibriosis, bệnh mòn vây cụt đuôi và bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu ở cá mú, cá

chẽm, cá giò [4] Trong các bệnh do vi khuẩn gây ra thì nhóm Vibrio spp gây bệnh đang

được chú ý hơn cả vì tốc độ lây lan và mức độ ảnh hưởng nghiêm trọng của chúng

Vibrio- vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản

Bệnh vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do

vi khuẩn Vibrio spp gây ra Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân

sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, cùng với ký sinh trùng hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) ở động vật thủy sản [3]

Vibrio là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đối với động vật thủy sản V

anguillarum, V.salmonicida, và V.vulnificus là ba trong số những loài gây bệnh chính

cho vài loài cá [7, 77] Số lượng chết gây ra bởi Vibrio trên cá và các loài sò hến là rất

phổ biến trong giai đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ

Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá lồng trên biển phát triển mạnh, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản

[3] Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật

thủy sản nước lợ và nước mặn, sự phân bố bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ [90]

Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang được nuôi phổ biến ở nhiều quốc

gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thường bị bệnh

này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển [90] Bệnh thường thể hiện các dấu hiệu: xuất hiện các đốm đỏ nhỏ trên thân, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ và sâu Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi

bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở các thể thứ cấp tính [3] Từ cá bệnh ở Việt Nam

người ta đã phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V

alginolyticus, và V anguillarum Ngoài ra có những báo cáo khác về bệnh do Vibrio ở

cá như vi khuẩn V anguillarum, V vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình,

V salmonicida gây bệnh ở cá vùng nước lạnh [3]

1.2.2 Những giải pháp mới phòng trừ dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản bền vững

a) Vaccine

Vaccine là một chế phẩm được làm từ vi sinh vật gây bệnh đã được tiêu hủy độc tính, khi tiêm truyền vào cơ thể động vật có xương sống, làm cơ thể sản sinh kháng thể, tạo sự miễn dịch cho động vật dùng vaccine [26]

Ngày nay, vaccine đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt ở các vùng nuôi cá hồi công nghiệp của các nước Bắc Âu, Chile, Canada, Mỹ, Nhật hay các trang trại nuôi cá da trơn ở Mỹ, mô hình nuôi cá chẽm, cá rô phi ở Châu Âu hay các mô hình nuôi nhỏ ở Trung Quốc, Nga, Tây Ban Nha và Đức Cho đến tháng 7 năm 2005, đã có

35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine phòng bệnh virus được đăng ký bản quyền và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá hồi, cá chẽm châu Âu, cá chẽm châu Á, cá rô phi, cá bơn và cá bơn đuôi vàng Bên cạnh đó 5 loại vaccine phòng bệnh virus trên động vật thủy sản khác đang được nghiên cứu và phát triển [26]

Việc sử dụng vaccine có những ưu điểm sau:

- Vaccine sống có tác dụng làm kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể động vật [26] Nó còn có thể duy trì và gia tăng cùng với vật chủ, đó là kết quả của sự phản ứng mạnh của tế bào nhằm bảo vệ nó trong thời gian dài

- Vaccine có thể dễ dàng đưa vào cơ thể vật nuôi bằng nhiều con đường như nhúng, ngâm, tiêm [26]

- Đặc biệt, khi sử dụng vaccine ít để lại dư lượng trong cơ thể đối tượng nuôi, tác động đến môi trường không đáng kể, ít ảnh hưởng tới sức khỏe vật nuôi và khả năng phòng bệnh rất cao [26]

Tuy nhiên, việc sử dụng vaccine cũng có một số hạn chế: đòi hỏi công nghệ sản xuất hiện đại, do đó giá thành tương đối cao; độc lực của vi khuẩn có thể được phục hồi khi chúng được tăng sinh trong cơ thể động vật Hơn nữa, việc tiêm vaccine có thể gây stress cho động vật Mặc dù vaccine có hiệu quả cao nhưng vẫn không có vaccine đặc hiệu chống lại các tác nhân gây bệnh trên tôm và nhuyễn thể [88]

b) Probiotic

Do những vấn đề liên quan đến sử dụng kháng sinh, các nhà khoa học hiện đang nghiên cứu việc ứng dụng chế phẩm sinh học để thúc đẩy sự phát triển của hệ vi sinh có lợi để kháng lại các tác nhân gây bệnh [90]

Thuật ngữ probiotic gần đây được sử dụng để nhắm đến các loại vi khuẩn mà

có khả năng cải thiện sức khỏe của các loài động vật khác [58] Theo Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên hợp quốc (FAO): “Probiotic là những vi sinh vật sống, nếu được bổ sung với liều lượng hợp lý sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ” [40] Trong dinh dưỡng của con người và động vật, vi khuẩn lactic thường được sử dụng nhiều để làm probiotic trên toàn thế giới Thực vậy, tính an toàn và hiệu quả của

nó cũng đã được kiểm chứng qua nhiều thập kỷ Việc sử dụng chế phẩm probiotic làm một giải pháp ngăn ngừa và phòng chống dịch bệnh đang được phổ biến ngày càng rộng hơn Đặc biệt là các chủng vi sinh vật bản địa được phân lập trên động vật biển

Probiotic sử dụng trong NTTS giúp phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thụ xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy, giảm độc tố trong môi trường nước, do đó cải thiện chất lượng nước nuôi, nâng cao khả năng miễn dịch của đối tượng nuôi Ngoài ra, các vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có thể cạnh tranh dinh dưỡng, vị trí bám với các sinh vật có hại, nên có thể ức chế sự hoạt động và phát triển của sinh vật có hại, hạn chế được các nhân gây bệnh Đồng thời, chế phẩm probiotic còn giúp ổn định pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thụ chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều Chế phẩm probiotic còn có tác dụng gián tiếp làm tăng oxy hòa tan trong nước [5, 14]

Các chủng sử dụng làm probiotic thường thuộc nhóm vi khuẩn lactic [45, 101],

Bacillus [52], Aeromonas, Pseudomonas, Pseudolateromonas, Roseobacter … [14] và

thường được phân lập từ hệ vi sinh vật trên thủy động vật Vibrio hiếu khí v

Pseudomonas kỵ khí tùy tiện đại diện cho các loài vi khuẩn bản địa từ cá biển [67]

Ngược lại, các chủng bản địa trên cá nước ngọt thuộc họ Enterobacteriaceae, đại diện là

chi Aeromonas, Plesimonas và các chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc của chi

Fusubacterium, và Eubacterium [83] Vi khuẩn lactic, điển hình là chi Carnobacterium,

cũng thường gặp phổ biến ở trên cá

c) Kháng sinh thế hệ mới

Hiện nay, việc lạm dụng chất kháng sinh đang tạo ra áp lực lớn trong NTTS

Do đó, thay thế kháng sinh truyền thống bằng các kháng sinh thế hệ mới như bacteriocin, peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides) hoặc thể thực khuẩn (bacteriophage) là một việc làm cần thiết [55]

Giống với thể thực khuẩn, các loại bacteriocin có khả năng kháng đến một chủng hay một chi vi khuẩn nào đó Tuy nhiên, khác với virus, bacteriocin thường an toàn cho sức khỏe con người (theo GRAS) [46] và do đó đang trở thành đối tượng nghiên cứu và phát triển thuốc mới trong phòng trị bệnh ở người và động vật

1.2.3 Triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng thủy sản

Bacteriocin từ vi khuẩn biển đang được tập trung nghiên cứu Phần lớn những nghiên cứu này tập trung vào xác định tính kháng của các chủng sản sinh bacteriocin

để sử dụng chúng như là một chất kháng sinh hoặc probiotic [53] Vi khuẩn sinhbacteriocin có thể nói là một “vũ khí” có hiệu quả, do bản thân bacteriocin là một kháng sinh thế hệ mới, còn chủng sinh ra nó đóng vai trò làm probiotic [43, 70]

Các chủng vi khuẩn sử dụng làm probitotic khác nhau về hoạt tính sinh học, hoạt động trao đổi chất và phổ kháng khuẩn Tuy nhiên, để ứng dụng trên động vật thì các chủng vi khuẩn này phải là những loài không gây bệnh và không sản sinh ra độc

tố Ngoài ra, chúng còn phải nâng cao sức đề kháng của vật chủ, kháng lại các chủng

có hại [56] Đối với một chế phẩm probiotic, hoạt tính kháng khuẩn có ý nghĩa quan trọng, có vai trò cạnh tranh hoặc ức chế vi khuẩn gây bệnh Một số vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn theo cơ chế tiết ra chất kháng khuẩn không đặc hiệu như là các acid béo mạch ngắn [19], hoặc H2O2 [39], trong khi một số chủng vi khuẩn khác lại sản sinh ra các độc tố có phổ kháng khuẩn rất hẹp như là bacteriocin hoặc các chất ức chế giống bacteriocin (BLIS) và thực khuẩn Louis và cộng sự [60] đã chứng minh các

chủng sinh bacteriocin có khả năng cạnh tranh với các chủng vi khuẩn gây hại trong cùng môi trường sống Hơn nữa, bacteriocin là một peptide có tính kháng khuẩn tương đối hẹp, chỉ có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn có họ hàng gần với chủng sản sinh

ra nó, và có phổ ức chế đặc hiệu [31] Do bản chất của chúng, nên bacteriocin được coi

là một chất kháng sinh mới thích hợp để thay thế các chất kháng sinh truyền thống.Chính vì vậy, một giải pháp mới hiện nay trong ngành NTTS là lựa chọn các chủng vi khuẩn làm probiotic với định hướng phòng trừ bệnh cho một vài nhóm vi khuẩn cụ thể

Tiềm năng ứng dụng bacteriocin trong NTTS dựa trên các quan điểm sau:

- Bacteriocin có thể là một giải pháp có hiệu quả nhất trong phòng ngừa dịch bệnh cho các đối tượng nuôi, do hạn chế sự tiếp xúc giữa vật chủ và các tác nhân gây bệnh [32]

- Sử dụng các chất kháng sinh truyền thống không chỉ làm tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh và gây ra hiện tượng mất cân bằng mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản có hại cho sức khỏe người tiêu dùng [6] Do đó việc sử dụng chất kháng sinh thế hệ mới, bacteriocin, là giải pháp thay thế mang tính an toàn (GRAS) theo FDA [32]

- Do bacteriocin có phổ kháng khuẩn hẹp, nên bổ sung probiotic của các chủng sinh bacteriocn để để phòng trừ dịch bệnh là thích hợp Bởi vì chúng chỉ có khả năng kháng đến một số vi khuẩn gây bệnh đích, vẫn giữ được các chủng vi khuẩn có lợi khác và hạn chế rủi ro của việc kháng thuốc [32]

Tuy nhiên không phải một chủng vi khuẩn nào cũng được lựa chọn để làm probiotic Tiêu chí để lựa chọn các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin để làm chế phẩm sinh học bao gồm:

- Đầu tiên, chủng vi khuẩn đó phải được phân lập từ động vật có xương sống và không có xương sống ở biển nhằm thích nghi với điều kiện về nhiệt và độ mặn của vùng nuôi [1, 32] Tuyển chọn các chủng vi khuẩn này cần trải qua giai đoạn thử tính

kháng trong điều kiện in vitro

- Hai là các chủng vi khuẩn làm probiotic được tuyển chọn bằng in vitro để xác

định khả năng đối kháng của nó với các chủng vi khuẩn đích gây bệnh [80]

Sau khi vi khuẩn được lựa chọn, chúng có thể được sử dụng dưới dạng là những chất kháng khuẩn được thu nhận trong quá trình nuôi hoặc là chế phẩm probiotic (Hình 1.3)

(Desriac et al; 2010) [32]

Hình 1.3 Quy trình tuyển chọn một probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Khi sử dụng dưới dạng chất kháng khuẩn thường phải được xác định nguồn gốc

tự nhiên, kiểu hoạt động và kiểu gen của vi khuẩn Do đó giá thành sản xuất thường cao và giảm hiệu quả kinh tế khi áp dụng trong NTTS, đặc biệt là đối với các trại nuôi

Mẫu động vật hoặc nước biển

Kiểm tra tính kháng khuẩn in vitro

Các chủng vi khuẩn được phân lập

Bacteriocin – kháng sinh

Vi khuẩn – Probiotic

Kiểm tra tính kháng khuẩn in vitro

Các chủng vi khuẩn được phân lập

Vi khuẩn – Probiotic

trong những nước đang phát triển Cho nên, các sản phẩm probiotic thường được sử dụng với tác dụng kép: hiệu quả về tác dụng và giá thành sản phẩm.

Chính vì vậy, tiêu chí cuối là giá thành sản phẩm của các chế phẩm sinh học phải phù hợp với người nuôi Bước đầu tiên của lựa chọn một chủng làm probiotic là chọn các chủng vi khuẩn từ động vật biển có những tính kháng đối với các chủng đích nghiên cứu Việc phân lập được các chủng vi khuẩn ban đầu có hoạt tính được cho là giai đoạn quan trọng để đánh giá chất lượng của một probiotic, mặc dù không phải lúc

nào hoạt tính in vitro cũng thể hiện hiệu quả trong điều kiện in vivo [80]

1.3 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn biển

1.3.1 Trên thế giới

Bacteriocin từ vi khuẩn biển đang là một chủ đề nghiên cứu hấp dẫn do tiềm năng ứng dụng của chúng trong NTTS như là một chế phẩm sinh học hoặc là chất kháng khuẩn thế hệ mới [43, 70] Cho đến nay trên thế giới mới chỉ có một số ít nghiên cứu cơ bản về các sinh vật biển sinh bacteriocin hay BLIS được công bố (Hình 1.4) [32]

Hình 1.4 Số lượng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi chu kỳ 10

Bacteriocin biển đầu tiên được phân lập từ Vibrio harveyi McCall và Sizemore

[62] đã tuyển chọn được 795 chủng Vibrio spp sản sinh bacteriocin tại đảo Galveston,

Texas Theo nghiên cứu này khoảng 5% chủng Vibrio spp có khả năng kháng khuẩn

được phát hiện có khả năng sinh bacteriocin Các bacteriocin này có trọng lượng phân

tử cao, được mã hóa trên plasmid và chỉ có khả năng kháng khuẩn đối với các chủng

thuộc loài V harveyi (Bảng 1.4) Do đó, các loại bacteriocin này được gọi là

harveyicin [62] Những nghiên cứu sâu hơn cho biết rằng harveyicin có bản chất protein, bị biến tính khi xử lý với các loại enzyme, và bền nhiệt (không mất hoạt tính kháng khuẩn sau khi được xử lý nhiệt ở 55oC trong 4 giờ [53] Harveyicin có khả năng cạnh tranh với các loài vi khuẩn trong đường ruột và trong môi trường phù du ở nhiệt

độ 4 - 39oC, pH 5 - 9,5 và độ mặn 1,75% - 3,5% [53] Việc phát hiện ra harveyicin đã khơi mào cho nghiên cứu các loại bacteriocin từ vi khuẩn biển Phần lớn những nghiên cứu này tập trung vào xác định tiềm năng sử dụng chúng như là một chất kháng sinh

thế hệ mới hoặc probiotic

Các loài Vibrio thường gặp phổ biến trong môi trường nước biển, và được phân

lập chủ yếu từ cá và động vật thân mềm Một vài loài trong số đó có thể là các tác nhân gây bệnh, nhưng đa số khác thì không gây bệnh đến vật chủ Zai và cộng sự

[104] đã phân lập và định danh 50 chủng Vibrio phân lập từ mang và ruột cá da trơn (Arianus thalassinus) khỏe và bị bệnh (Bảng 1.4)

Carraturo và cộng sự [20] đã phân lập được ba chủng vi khuẩn không gây bệnh

cho người thuộc chi Vibrio (V mediterranei 1, V mediterranei 4, và V fluvialis) trên hải sản tươi và đông lạnh, nhưng có hoạt tính đối kháng với các tác nhân gây bệnh V

parahaemolyticus và V mediterranei trên đĩa thạch Bản chất protein của chúng được

thể hiện qua sự bất hoạt bởi enzyme proteinase K

Prasal và cộng sự [72] khi nghiên cứu một vài chủng V harveyi từ bộ sưu tập của họ đã phát hiện ra bacteriocin được sản sinh từ một chủng V harveyi (VIB 571)

Điều thú vị hơn nữa là chủng này đang được cho là tác nhân gây bệnh ở cá hồi vân

(Oncorhynchus mykiss) và cá hồi Đại Tây Dương (Salmon salar) [105] Bacteriocin từ chủng V harveyi VIB 571 đã được chứng minh kháng lại bốn chủng có họ hàng gần với nó là V harveyi, V fisheri, V gazogenes và V parahaemolyticus (Bảng 1.4) Dịch

bacteriocin thô được thu bằng kết tủa amonium-sulphate đối với dịch nuôi vi khuẩn sau 72 giờ, bị bất hoạt bởi lipase, proteinase K, pepsin, trypsin, pronase E và SDS (ủ

10 phút, ở 60oC) Mặt khác, hoạt tính kháng khuẩn không bị ảnh hưởng bởi pH [87]

Bảng 1.4 Các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin

Chủng sản xuất Bacteriocin Chủng chỉ thị Nguồn phân lập

Kích thước bacteriocin (kDa)

Cá da trơn (Arius thalassimus) khỏe

Vibrio harveyi VIB

(Beneckea harveyi SY) Harveyicin SY V harveyi Đảo Galveston 24

Vibrio vulnificus IW1, BC1, BC2

Vibrio spp

Plesiomonas shigelloides

E coli

Mẫu nước ở Wilmington (NC, Mỹ)

<10

Vibrio sp NM 10 BLIS

Pasteurella piscicida

E coli, V vulnificus Enterococcus seriolicida

Leiognathus nuchlis <5

Chủng vi khuẩn Gram

dương ZM81 Bacteriocin/BLIS

Chủng vi khuẩn biển ZM19

Vibrio Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum

Bán đảo Brittany 280

Chủng Vibrio sp NM 10 được phân lập từ cá biển Leiognathus nuchalis từ

vùng bờ biển đảo Enoshima, Kanagawa, Nhật Bản Chủng này thể hiện tính kháng

mạnh với chủng P piscicida K-III, nhưng cũng có khả năng ức chế E coli IAM 1264,

V vulnificus RIMD 2219009 và Enterococcus seriolicida YT-3 [89] Bacteriocin từ Vibrio sp NM 10 đã được xác nhận có bản chất là protein, không bền nhiệt, với trọng

lượng phân tử nhỏ hơn 5 kDa [89]

Shehane và Sizemore [85] đã phân lập được ba chủng vi khuẩn sinh bacteriocin

từ các cửa sông gần Wilmington (NC, Mỹ) và phổ kháng khuẩn của chúng cũng được

xác định (Bảng 1.4) IW1 ức chế một vài chủng của V vulnificus; BC1 ức chế một vài chủng của V vulnificus, V cholerae và V parahaemolyticus; và BC2 ức chế tất cả các chủng Vibrio spp., Plesiomonas shigelloides và E coli thử nghiệm Bacteriocin IW1

dễ biến tính bởi nhiệt, trong khi đó BC1 bền nhiệt ở mức độ trung bình BC2 rất bền nhiệt và duy trì hoạt tính của chúng khi đông lạnh, hấp khử trùng hoặc khi xử lý ở các mức pH thấp hoặc cao Nhóm tác giả khuyến cáo rằng những loại bacteriocin này có

thể được sử dụng để tiêu diệt V vulnificus trong hải sản

Bacteriocin từ Aeromonas sp biển

Moro và cộng sự [69] và Messi và cộng sự [63] đã thông báo sự sinh tổng hợp

bacteriocin ở loài Aeromonas hydrophilla Tất cả các chủng Aeromonas hydrophila

trong hai nghiên cứu này thể hiện hoạt tính ức chế chống lại một vài chủng của

Staphylococcus aureus (Bảng 1.4) Messi và cộng sự [63] đã chứng tỏ khả năng ức chế

của chúng đối với Listeria, Streptococcus agalactiae và Lactobacillus sp Tuy nhiên,

không có sự ức chế nào được thể hiện chống lại các chủng vi khuẩn Gram âm được

nghiên cứu, bao gồm các loài gần gũi (Aeromonas sobria ATCC 43979, A caviae

ATCC 13137)

Bacteriocin từ Pseudoalteromonas sp biển

Longeon và cộng sự [59] nghiên cứu vi khuẩn thu từ bán đảo Brittany và họ tập

trung vào chủng Pseudoalteromonas sp X-153 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao

Sau khi tinh chế, protein kháng khuẩn từ chủng này được xác định có kích thước là

289 kDa, có hoạt tính kháng khuẩn đối với cả các vi khuẩn thuộc nhóm Gracilicutes

(Vibrio) và Firmicutes (Staphylococcus epidermidis, Propioni bacterium acnes và

P.granulosum)

Bacteriocin từ Firmicutes và vi khuẩn lactic phân lập từ động vật biển

Vi khuẩn Gram dương bao gồm vi khuẩn lactic thường gặp phổ biến trong dạ dày của động vật đẳng nhiệt Hệ vi sinh vật đường ruột của các con cá khỏe mạnh

thường bao gồm các loại vi khuẩn lactic thuộc các chi Streptococcus, Lactobacillus,

Carnobacterium, Leuconostoc [78] Divercin và piscicocin là hai loại bacteriocin từ Carnobacterium phân lập từ ruột cá đã được miêu tả một cách chi tiết (Bảng 1.5) [74]

Hai loại bacteriocin này thuộc bacteriocin Lớp IIa

Pirzada và cộng sự [71] phân lập chủng vi khuẩn ZM81, một vi khuẩn Gram dương có tế bào que đa hình, từ khu vực ngoài khơi của Karachi Bản chất protein của bacteriocin từ chủng vi khuẩn này đã được xác định bởi sự bất hoạt khi xử lý với enzyme pronase và trypsin Đồng thời, nó không bền nhiệt nhưng bền với dải pH rộng

Thịt cá bơn

L innocua

Động vật thân mềm (hàu, vẹm…)

L monocytogenes

Ruột

cá hồi vân

4416

4526

Những nghiên cứu gần đây trên 258 chủng vi khuẩn phân lập từ nước và trầm

tích ở bán đảo Jucatan cho thấy rằng có 46 chủng thuộc các chi Aeromonas, Bacillus,

Burkholderia, Photobacterium, Pseudomonas, Serratia và Stenotrophomonas có hoạt

tính kháng sinh Trong đó, 50% hoạt tính kháng sinh này có bản chất là bacteriocin hoặc BLIS [30]

Ngoài ra Wilson và cộng sự [103] đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn biển sinh chất kháng khuẩn từ một vài loài động vật không xương sống ở biển (hàu, bọt biển,

nhím biển…) (Bảng 1.5) [103] Khi xử lý các chất kháng sinh này với proteinase K, các chất kháng khuẩn bị bất hoạt hoàn toàn Balacázar và cộng sự [15] đã tiến hành phân lập và xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ

loài cá ngựa (Hippocampus guttulatus) Nghiên cứu này đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn (V harveyi, V mediterranei và V paraharmolyticus) có khả năng sinh các chất

kháng sinh bacteriocin Điều đó chỉ ra rằng, sự đa dạng của các loại bacteriocin và BLIS từ vi sinh vật biển đang được quan tâm nghiên cứu

1.3.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu cơ bản nào về bacteriocin từ vi khuẩn biển đã được công bố [1] cho đến khi nhóm của Nguyễn Văn Duy bắt đầu nghiên cứu từ năm

2012 Các nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập trung vào các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men, nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự [2] tại Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng

Lactobacillus plantarum L24 phân lập từ nước dưa Bên cạnh đó, tác giả Hoa Thị

Minh Tú và cộng sự [10] cũng đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số bacteriocin

từ vi khuẩn phân lập từ sữa bò, nhằm hướng tới ứng dụng trong bảo quản thực phẩm,

đồ hộp, sữa tươi…

Các tác giả Lê Thị Hồng Tuyết và Hoàng Quốc Khánh [11] thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm chế phẩm probiotic trong nuôi tôm cao sản Một trong những chủng vi sinh vật được dùng là

Lactobacillus sp Chế phẩm có tác dụng làm tăng tính ngon miệng, giúp tiêu hoá các

chất dinh dưỡng có trong thức ăn, tăng cường sức đề kháng, phòng ngừa các bệnh

đường ruột như nhiễm E coli, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại, do đó nâng

cao năng suất nuôi tôm

Bên cạnh đó, động vật biển ở các vùng ven biển địa phương đang được coi là nguồn để phân lập các chủng vi khuẩn hữu ích Thậm chí chúng cũng được coi là nơi

để phát hiện ra loài vi khuẩn mới bởi vì các vi sinh vật trong đường ruột của động vật đặc hữu ở các vùng miền địa phương hiếm khi được nghiên cứu đầy đủ của cộng đồng khoa học quốc tế Đánh giá đa dạng sinh học của vi khuẩn sản sinh bacteriocin có thể cung cấp sự hiểu biết sâu sắc hơn về đặc điểm sinh thái, sinh lý học và tiến hóa của vi sinh vật biển trong sự tương tác với các động vật chủ và vi khuẩn đích Hơn nữa, ứng

dụng tiềm năng của chúng trong phát triển probiotic sẽ góp phần phòng trừ dịch bệnh

do vi khuẩn trong nuôi trồng thủy hải sản

Nói tóm lại, tuy đã có những nghiên cứu trên thế giới về vi khuẩn biển sinh bacteriocin được phân lập các đối tượng thủy sản, như cá và động vật thân mềm nhưng chủ đề này vẫn còn bỏ ngỏ ở Việt Nam Hiện nay chưa có nghiên cứu nào trên thế giới

và ở Việt Nam về vi khuẩn biển sinh bacteriocin phân lập từ tu hài Sự thành công của

đề tài sẽ cung cấp bộ sưu tập các chủng vi khuẩn mới sinh bacteriocin và góp phần vào hưóng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong NTTS, từ đó mang đến cho những người nông dân địa phương hy vọng để giảm thiểu tổn thất do dịch bệnh gây ra, góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống và bảo vệ môi trường khu vực nuôi

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin phân lập từ Tu hài

(Lutraria philippinarum) sống tại vịnh Nha Trang và vịnh Cam Ranh

- Thời gian nghiên cứu: từ 2/ 2012 – 2/ 2013

- Địa điểm nghiên cứu: Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, số 2 Nguyễn Đình Chiểu, Nha Trang

2.2 Nguyên vật liệu

2.2.1 Mẫu tu hài

Mẫu tu hài để phân lập vi khuẩnđược thu tại các trại nuôi thuộc vịnh Nha Trang và Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa Tại nơi thu mẫu, mẫu được cắt bỏ những phần không cần thiết và thu lấy phần cơ thịt bằng dao, panh vô trùng Sau đó mẫu được đưa vào nước muối sinh lý vô trùng, rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn tổng số

Bảng 2.1 Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển

STT Ngày phân lập Địa điểm thu mẫu Số lượng mẫu (con)

2.2.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị

Các chủng vi khuẩn chỉ thị được sử dụng để thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn

phân lập được Các chủng này bao gồm các chủng Enterococcus faecalis B1.1, Vibrio

parahaemolyticus C1 và Vibrio alginolyticus V3.3 được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của

Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

Các chủng trên được nuôi cấy trên môi trường TSB, hoặc TCBS, bổ sung 1,5 % NaCl, lắc 180 vòng/phút, ở 37oC

2.2.3 Hóa chất, môi trường và thuốc thử

a) Môi trường nuôi cấy lỏng TSB (Trypton Soy Broth)

Trypticase pepton: 17 g Phytone pepton :3 g

pH (ở 25oC): 7,3 ± 0,2

Hòa tan 30 g môi trường TSB tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau

đó đổ môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và bọc giấy bạc, hấp khử trùng

ở 121oC trong vòng 15 phút

b) Môi trường thạch nuôi cấy vi khuẩn tổng số TSA (Trypton soy agar)

Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm 1,5 % agar c) Môi trường thạch nuôi cấy TCBS ( Thiosulphate Citrate Bile salts Sucrose) Peptone special : 10 g/l Yeast extrat: 5 g/l

Sodium thiosulphate: 10 g/l Sodium citrate: 10 g/l

Feric citrate: 1 g/l Bromo thymol blue: 0,04 g/l

pH (250C): 8,8 ± 0,2

Hòa tan 89 g môi trường TCBS tổng hợp trong 1000 ml nước tiệt trùng vào bình tam giác sạch Sau đó làm nút bông, bọc giấy bạc và đun sôi đến khi agar trong môi trường tan hết

d) Dung dịch nước muối sinh lý

Hòa tan 8,5 g NaCl trong 1 L nước cất Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong

Hòa tan 1g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1)

Hòa tan 2g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn chung dung dịch 1 và 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet

f) Thuốc nhuộm Lugol

Iod tinh thể : 1 g

Nước cất : 200 ml

Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu

g) Thuốc nhuộm Fuchsin

Fuschin kiềm : 1 g

Rượu ethylic 95%: 10 ml

Phenol tinh thể : 5 g

Nước cất : 100 ml

Hòa tan Fuchsin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1)

Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn đều dung dịch 1 và 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuchsin

- Cân phân tích (Shimadzu, Nhật)

- Máy ly tâm (Eppendof Mikrol 120, Đức)

- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ)

- Máy quang phổ khả kiến (Genesys 20 Thermo)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

ấm ở nhiệt độ 30oC trong vòng 24 giờ Sau đó khuẩn lạc đại diện sẽ được thu tách và thuần khiết

Trong quá trình phân lập vi khuẩn, ngay sau khi cấy mẫu và ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 - 36 giờ các khuẩn lạc sẽ mọc trên thạch đĩa, lúc này ta tiến hành đếm tổng số

khuẩn lạc trên các đĩa này Chọn các đĩa petri có từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết

quả Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri có độ pha loãng khác nhau cần tuân thủ theo một quy luật hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc đếm được trên đĩa petri phải càng ít Nếu kết quả không hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm

Công thức tính (CFU g)

d

C C

N – số khuẩn lạc có trong 1 g mẫu ban đầu

C1, C2 - số khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa petri ở độ pha loãng đã chọn

d – hệ số pha loãng mẫu

2.3.2 Nuôi cấy và bảo quản chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi trên môi trường TSB (dịch lỏng), TSA (thạch) hoặc TCBS (thạch) theo mô tả của Trần Linh Thước [8] Các chủng vi khuẩn sau khi thuần khiết được bảo quản cho các thí nghiệm tiếp theo Cách bảo quản như sau: nuôi cấy vi khuẩn trong các bình tam giác chứa môi trường TSB đến khi mật độ quang OD600 đo được nằm trong khoảng 0,8 – 1 thì đem lưu giữ Các chủng vi khuẩn