nghiên cứu thử nghiệm tác dụng ngăn chặn biến đen của dịch chiết nấm rơm (volvariella volvacea) trên tôm sau thu hoạch

Trong số các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, dịch chiết từ các loài nấm ăn đã được nhiều nghiên cứu chứng minh rằng chúng vừa có hoạt tính chống oxy hóa, vừa có hoạt tính ức chế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- -

LÊ THANH HẢI

NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG NGĂN CHẶN BIẾN ĐEN CỦA DỊCH CHIẾT NẤM RƠM (Volvariella

volvacea) TRÊN TÔM SAU THU HOẠCH

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả luận văn

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và

TS Nguyễn Minh Trí, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm đề tài, hai thầy đã cung cấp và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này

Cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trung tâm thí nghiệm thực hành – Trường Đại học Nha Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẽ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm ở trong và ngoài nước 3

1.1.1 Tình hình sản xuất nấm ngoài nước 3

1.1.2 Tình hình sản xuất nấm trong nước 4

1.1.3 Các chất có hoạt tính sinh học hiện diện trong nấm ăn 4

1.2 Giới thiệu về nấm rơm 6

1.2.1 Đặc điểm hình thái 6

1.2.2 Phân loại nấm rơm 7

1.2.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của nấm rơm 8

1.2.4 Một số nghiên cứu về nấm rơm 9

1.3 Tổng quan về biến đen 11

1.3.1 Sự biến đen ở tôm 11

1.3.2 Phương pháp ngăn chặn 13

1.3.3 Các quy định mang tính pháp lý liên quan đến việc sử dụng chất chống biến đen 15

1.3.4 Ảnh hưởng của nấm ăn lên sự biến đen 17

1.3.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên vật liệu 20

2.1.1 Nấm rơm: 20

2.1.2 Tôm nguyên liệu: 21

2.2 Hóa chất: 21

2.3 Máy và thiết bị: 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu: 22

2.4.1 Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm 22

2.4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 24

2.4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 25

2.4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 26

2.4.2 Phân tích hàm lượng ergothioneine (ESH), hoạt tính ức chế enzyme polyphenoloxidase (PPO) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 27

2.4.3 Thử nghiệm khả năng ngăn chặn biến đen của dịch chiết nấm rơm trên tôm thẻ chân trắng 30

2.4.4 Các phương pháp phân tích 32

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Ảnh hưởng của điều kiện chiết tách đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 34

3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 34

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 35

3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 37

3.1.4 Đề xuất quy trình chiết nấm thích hợp 39

3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dịch của chiết nấm rơm, khả năng ức chế enzyme polyphenoloxydase và phân tích hàm lượng ergothioniene có trong dịch chiết nấm rơm 40

3.2.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 40

3.2.2 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme PPO của dịch chiết nấm rơm 41

3.2.3 Phân tích hàm lượng ergothioneine 44

3.3 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm rơm và thời gian xử lý đến sự biến đen của tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo quản bằng nước đá 45

3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm rơm và thời gian xử lý đến sự biến đen của tôm thẻ chân trắng đánh giá bằng phương pháp đánh giá cảm quan biến đen 45

3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm rơm và thời gian xử lý đến sự biến đen của tôm thẻ chân trắng đánh giá bằng phương pháp phân tích hình ảnh 51

3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm rơm và thời gian xử lý đến sự biến đen của tôm thẻ chân trắng đánh giá bằng phương pháp đánh giá cảm quan chất lượng 59

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 76

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Sản lượng nấm ăn trên thế giới 3

Bảng 1.2 Hàm lượng Ergothioneine được chiết từ các loại nấm .5

Bảng 1.3 Giá trị dinh dưỡng của nấm rơm 8

Bảng 1.4 Thành phần acid amino trong nấm rơm 9

Bảng 1.5 Đại diện chất ức chế enzyme gây nâu trong Trái cây, rau quả và thủy hải sản 16

Bảng 1.6 Luật 98/72/EC của Liên minh châu Âu xác định nồng độ sulfua tối đa cho phép có trong động vật giáp xác 17

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các cơ chế sinh hóa học liên quan đến việc hình thành các đốm đen

ở tôm 12

Hình 1.2 Sơ đồ các phản ứng sinh hóa học hình thành đốm đen ở tôm 12

Hình 2.1 Nấm rơm (V volvacea) 20

Hình 2.2 Tôm thẻ chân trắng (P vannamei) 21

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm 23

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 24

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 25

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa của chiết nấm rơm 26

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích hàm lượng ESH, hoạt tính ức chế enzyme PPO và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm 27

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả năng ngăn chặn biến đen của dịch chiết nấm rơm trên tôm thẻ chân trắng 31

Hình 3.1 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết nấm rơm theo nhiệt độ chiết 34

Hình 3.2 Tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm theo nhiệt độ chiết 35

Hình 3.3 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết nấm rơm theo thời gian chiết .36

Hình 3.4 Tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm theo thời gian chiết 36

Hình 3.5 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết nấm rơm theo các tỷ lệ chiết 37

Hình 3.6 Tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm theo các tỷ lệ chiết .38

Hình 3.7 Quy trình chiết nấm thích hợp 39

Hình 3.8 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm; Khả năng khử gốc tự do DPPH (A); Tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm (B) 40

Hình 3.9 Khả năng ức chế hoạt động enzyme PPO của dịch chiết nấm rơm .42

Hình 3.10 Sắc ký đồ của Ergothioneine chuẩn (A); Ergothioneine của dịch chiết nấm rơm (B); 44 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễ giá trị cảm quan màu sắc của tôm thẻ chân trắng đã qua xử lý ở các độ pha loãng dịch chiết nấm rơm khác nhau (a) thời gian xử

lý 5 phút, (b) thời gian xử lý 10 phút, (c) thời gian xử lý 15 phút .46 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn giá trị màu xám của tôm thẻ chân trắng đã qua xử

lý ở các độ pha loãng dịch chiết nấm rơm khác nhau (a) thời gian xử lý 5 phút, (b) thời gian xử lý 10 phút, (c) thời gian xử lý 15 phút .52 Hình 3.13 Biến đổi màu sắc của tôm thẻ chân trắng trong quá trình bảo quản bằng nước đá 58 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn giá trị cảm quan chất lượng của tôm thẻ chân trắng

đã qua xử lý ở các độ pha loãng khác nhau (a) thời gian xử lý 5 phút, (b) thời gian xử lý 10 phút, (c) thời gian xử lý 15 phút .60

LỜI MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Các mặt hàng tôm chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu các sản phẩm thủy sản xuất khẩu của Việt Nam Một trong những dạng hư hỏng thường gặp trong quá trình bảo quản chế biến tôm đó là sự biến đen Hiện tượng này thường xảy ra ở tôm trong quá trình bảo quản sau thu hoạch, đặc biệt là trong điều kiện nhiệt độ bảo quản dao động và không duy trì tốt dưới 4OC Mặc dù ăn tôm bị biến đen không ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng nhưng sự biến đen có ảnh hưởng lớn đến giá trị cảm quản của tôm Vì vậy, sự biến đen ở tôm được xem là một dạng hư hỏng gây thiệt hại kinh tế đáng kể

Hiện nay, các nhà chế biến đang sử dụng các hóa chất tổng hợp có tác dụng

ức chế hoạt động enzyme polyphenoloxydase hoặc chống oxy hóa như hợp chất sulfit, 4-hexylresorcinol, để ngăn chặn sự biến đen ở tôm trong quá trình bảo quản, chế biến Nhược điểm chính của biện pháp này là dư lượng hóa chất sử dụng còn lại trong tôm có thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng Một số loại hóa chất bị cấm hoặc giới hạn liều lượng sử dụng theo quy định về an toàn thực thẩm Vì lý do này, việc nghiên cứu tìm giải pháp ngăn chặn sự biến đen ở tôm bằng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, an toàn đối với người tiêu dùng là một vấn đề cấp thiết

Trong số các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, dịch chiết từ các loài nấm ăn đã được nhiều nghiên cứu chứng minh rằng chúng vừa có hoạt tính chống oxy hóa, vừa có hoạt tính ức chế hoạt động của enzyme polyphenoloxydase Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng dịch chiết nấm ăn để ngăn chặn sự biến đen ở tôm là một giải pháp, có thể đáp ứng được nhu cầu cấp thiết của ngành chế biến thực phẩm

thủy sản hiện nay Trong số các loại nấm ăn thì nấm rơm (Volvariella volvacea)

được trồng dễ dàng và khá phổ biến ở nước ta, hầu như nấm rơm được trồng ở khắp

các tỉnh trong cả nước Vì thế, việc tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thử nghiệm tác

dụng ngăn chặn biến đen của dịch chiết nấm rơm (Volvariella volvacea) trên tôm sau thu hoạch” là cần thiết

Mục tiêu của đề tài

- Xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết chất chống oxy hóa từ nấm rơm

- Xác định hàm lượng ergothioniene, đánh giá hoạt tính ức chế enzyme polyphenoloxydase và chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

- Tìm ra điều kiện xử lý thích hợp để ngăn chặn sự biến đen ở tôm bằng dịch chiết nấm rơm

Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp thêm dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho cán bộ kỹ thuật, các nhà sản xuất kinh doanh và sinh viên ngành Chế biến thủy sản về hoạt tính chống biến đen ở tôm của chất chiết suất từ nấm rơm; về khả năng ứng dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn thực phẩm để thay thế các hóa chất độc hại bị ngăn cấm hoặc hạn chế sử dụng trong xử lý và bảo quản tôm

- Tạo cơ sở khoa học để nghiên cứu sản xuất chất ngăn chặn sự biến đen ở tôm từ nấm rơm bằng phương pháp sinh học

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Thành công của đề tài sẽ mở ra một hướng mới giúp giải quyết vấn đề dư lượng sulfite và các chất bảo quản khác được sử dụng để ngăn chặn sự biến đen ở tôm trong các xí nghiệp chế biến thủy sản hiện nay

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm ở trong và ngoài nước

1.1.1 Tình hình sản xuất nấm ngoài nước

Ngành sản xuất nấm ăn đã hình thành và phát triển trên thế giới hàng trăm năm Hiện nay người ta đã biết 2000 loài nấm ăn được, trong đó 80 loài nấm ăn ngon và đang được nghiên cứu trồng nhân tạo (UNESSCO-2004) Việc nghiên cứu trồng nấm trên thế giới đang ngày càng phát triển mạnh mẽ, đã trở thành một ngành công nghiệp thực phẩm thực thụ Theo Tổ chức Nông lương thế giới (FAO), trong

10 năm qua (1997-2007) Sản lượng nấm ăn nuôi trồng tăng từ 2,18 lên đến 3,41 triệu tấn nấm tươi/năm, tỉ lệ gia tăng đạt 56% [30]

Bảng 1.1 Sản lượng nấm ăn trên thế giới (FAO, 2009)

1.1.2 Tình hình sản xuất nấm trong nước

Tổng sản lượng các loại nấm ăn và nấm dược liệu của Việt Nam hiện nay đạt khoảng 250.000 tấn nấm tươi/năm, kim ngạch xuất khẩu khoảng 25-30 triệu USD/năm Hiện nay, đang nuôi trồng 6 loại nấm phổ biến ở các địa phương:

- Sản lượng nấm rơm đạt 64.500 tấn Nấm rơm được trồng phổ biến ở các tỉnh Tây Nam bộ (Đồng Tháp, Sóc Trăng, Trà Vinh, Cần Thơ…), chiếm khoảng 90% sản lượng nấm rơm

- Sản lượng nấm Mộc nhĩ đạt 120.000 tấn Mộc nhĩ được trồng tập trung ở các tỉnh miền Đông Nam bộ (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bình Phước…) chiếm 70% sản lượng Mộc nhĩ cả nước

- Nấm sò, nấm hương, nấm mỡ chủ yếu trồng ở các tỉnh miền bắc, sản lượng mỗi năm đạt khoảng 60.000 tấn

- Nấm dược liệu: Linh chi, Vân chi, đầu khỉ… mới được nuôi trồng ở một số tỉnh, thành phố (Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Hồ Chí Minh, Đà Lạt…), sản lượng mỗi năm đat khoảng 4.000 tấn

- Một số loại nấm khác như kim châm, trân châu… đang được nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm nên sản lượng không đáng kể

1.1.3 Các chất có hoạt tính sinh học hiện diện trong nấm ăn

Trong nấm ăn có chứa rất nhiều chất có hoạt tính sinh học quý, đã được biết đến như:

- Saponin có nhiều trong nấm linh chi (Ganoderma lucidum) Saponin được

biết là chất có khả năng chống oxid hóa, chống lão hóa, nhiều khảo cứu cho thấy vai trò của các saponin-triterpen và các polyphenol Trung Quốc đã chứng minh khả

năng khử gốc tự do hydroxyl của G lucidum và khả năng chống lão hóa tế bào, gần

đây Jing Song Zhang (2002) đã chiết được một chất đặt tên là GLIS từ quả thể Linh chi làm tăng sinh bạch huyết bào ở lách chuột thí nghiệm và là một nhân tố kích thích lympho bào B làm tăng khả năng miễn dịch cho người sử dụng [39]

- Ergothioneine có nhiều trong nấm Pleurotus cornucopiae, Pleurotus

eryngii, Flammulina velutipes là chất có khả năng chống oxy hóa mạnh Bao và

cộng sự (2010) chỉ ra rằng hàm lượng Ergothioneine chiết từ trong môi trường nuôi

trồng nấm F velutipes cao hơn 1,7 lần so với chiết từ nấm F velutipes (Bảng

Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy trong nấm ăn có nhiều lợi ích đối với

sức khỏe và trong đời sống như:

Chen Shiu-Nan (2007) cho rằng trong các chất chiết xuất từ nấm của loài

như nấm linh chi, nấm mỡ, nấm kim châm, nấm vân chi, nấm thượng hoàng có chứa

các pholysaccharid và globin có khả năng phòng chống ung thư và bệnh tim

mạch[23]

Bao và cộng sự (2009) cho thấy khi sử dụng chất chiết từ nấm kim châm

(Flammulina velutipes) bổ xung vào thức ăn cho cá yellow tail (Seriola

quinqueradiata) có khả năng ổn định màu sắc cơ thịt cá và hạn chế sự oxy hóa lipit

trong quá trình bảo quản lạnh [12] Trong năm 2010, Bao và cộng sự chỉ ra rằng

chất chiết từ nấm kim châm (Flammulina velutipes) có khả năng chống oxy hóa, ổn

đình màu sắc của cỏ thịt cá ngừ [13]

- Theo nghiên cứu của Fu và cộng sự (2004) cho thấy các loài nấm như nấm

mỡ (Agaricus bisporus), nấm rơm (Volvariella volvacea), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes), nấm đùi gà (Pleurotus eryngii), nấm sò (Pleurotus ostreatus) chứa các hợp chất phenol có khả năng chống oxy hóa và tính chống oxy hóa được sắp xếp theo thứ tự: Agaricus bisporus > Hypsizigus marmoreus > Volvariella volvacea > Flammulina velutipes > Pleurotus eryngii > Pleurotus ostreatus [32]

Từ các nghiên cứu trên cho thấy các hoạt chất chống oxy hóa trong các loại nấm ăn là rất lớn, đặt biệt là ergothioniene Chất này có khả năng chống oxy hóa

cao được Bao và cộng sự nghiên cứu nhiều trên nấm kim châm (F velutipes) Bên

cạnh đó, nấm rơm là loài được trồng khá phổ biến ở nước ta, là một trong những loài nấm có khả năng chống oxy hóa, tuy nhiên chưa có bài báo nghiên cứu chuyên sâu về nấm rơm và ứng dụng những chất có trong nấm rơm để chống biến đen trên tôm thẻ chân trắng Từ những giả thuyết nêu trên cho thấy việc xác định và ứng dụng những chất có hoạt tính chống oxy hóa trong nấm rơm là hướng đi có hiệu quả

1.2 Giới thiệu về nấm rơm

Nấm rơm là nấm ăn được của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Lần đầu tiên được trồng ở Trung Quốc vào đầu năm 1822 Khoảng năm 1932-1935, nấm rơm được đưa vào Việt Nam, Malaysia và các nước Đông Nam châu Á khác Điều kiện

để nấm rơm phát triển là nhiệt độ tối thiểu 25°C, nhiệt độ tối ưu 37°C, nhiệt độ tối

đa 40°C; pH tối ưu 6,0 và độ ẩm tối ưu 57-60%

1.2.1 Đặc điểm hình thái

- Nấm rơm gồm có 3 phần:

+ Bao gốc (volva): Dài và cao lúc nhỏ, bao lấy tai nấm Khi tai nấm trưởng thành, nó chỉ còn lại phần trùm lấy phần gốc chân cuống nấm, bao nấm là hệ sợi tơ

nấm chứa sắc tố melanin tạo ra màu đen ở bao gốc Độ đậm nhạt tùy thuộc vào ánh sáng Ánh sáng càng nhiều thì bao gốc càng đen

+ Cuống nấm: Là bó hệ sợi xốp, xếp theo kiểu vòng tròn đồng tâm Khi còn non thì mềm và giòn Nhưng khi già xơ cứng và khó bẻ gãy

+ Mũ nấm: Hình nón, cũng có melanin, nhưng nhạt dần từ trung tâm ra rìa mép

- Chu kỳ sống của nấm rơm gồm 6 giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu đinh ghim

+ Giai đoạn hình nút nhỏ

+ Giai đoạn hình nút

+ Giai đoạn hình trứng

+ Giai đoạn hình chuông

+ Giai đoạn trưởng thành

- Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của nấm rơm rất nhanh chóng Từ lúc trồng đến khi thu hoạch chỉ sau 10-12 ngày Những ngày đầu chúng nhỏ như hạt tấm có màu trắng (giai đoạn đinh ghim), 2-3 ngày sau lớn rất nhanh bằng hạt ngô, quả táo, quả trứng (giai đoạn hình trứng), lúc trưởng thành (giai đoạn phát tán bào tử) trông giống như một chiếc ô dù, có cấu tạo thành các phần hoàn chỉnh

1.2.2 Phân loại nấm rơm

Nấm volvariella có nhiều loại nhưng phổ biến là: Volvariella esculenta,

Volvariella volvacea, ngoài ra còn có : Volvariella bombycina, Volvariella

speciosa

- Volvariella volvacea: Mũ nấm màu nâu sẫm có hình elip, đường kính 5-20

cm Cuống nấm màu trắng Vỏ bọc rộng và có nhiều thịt, màu nâu hoặc xám, nhỏ gọn, cò mùi của củ cải Thường sống hoại sinh trên chất thải nhà máy Trồng nhiều

ở các nước Châu Á

- Volvariella esculenta: Được trồng nhiều ở Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam… Hình dạng tương tự Volvariella volvacea nhưng mũ có màu trắng hơi vàng

1.2.3 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của nấm rơm

Nấm rơm có hương vị độc đáo và cấu trúc cấu tạo khác biệt với các loại nấm

ăn được khác Các giai đoạn trưởng thành và công đoạn cắt của quá trình thu hoạch làm ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của nấm rơm Thành phần dinh dưỡng của nấm rơm trong Bảng 1.2 cho thấy trọng lượng tươi chứa khoảng 90% nước, 30-43% protein thô, 1-6% chất béo, tinh bột 12-48%, 4-10% chất xơ và 5,13% tro Chất béo tăng lên 5% từ giai đoạn trưởng thành và hoàn toàn trưởng thành Các carbohydrate tăng từ giai đoạn nút trứng và giảm ở giai đoạn trưởng thành Các chất xơ thô không thay đổi trong ba giai đoạn đầu và tăng ở giai đoạn trưởng thành Giai đoạn quả trứng hàm lượng của protein cao nhất và giảm ở giai đoạn trưởng thành Các thành phần còn lại hầu như không thay đổi ở tất cả các giai đoạn phát triển Nấm rơm giàu khoáng chất như natri, kali và phốt pho Các nguyên tố vi lượng như: Cu, Zn, Fe không thay đổi ở các giai đoạn phát triển khác nhau [20]

Bảng 1.3: Giá trị dinh dưỡng của nấm rơm (Verma, 2002)

Thành phần (Khối lượng/100g tươi nấm)

Hàm lượng của thiamin và riboflavin trong nấm rơm thấp hơn so với nấm

Agaricus bisporus và Lentinula edodes, trong khi hàm lượng niacin là ngang với hai

nấm Trong các giai đoạn acid amino thiết yếu nhiều nhất là lysine và acid amino

không thiết yếu nhiều nhất là acid glutamic và acid aspartic (Bảng 1.4) Hàm lượng

thấp nhất trong số các acid amino thiết yếu là tryptophan và methionine Hàm lượng

của phenylalanine tăng gần gấp hai lần ở giai đoạn kéo dài, trong khi lysine giảm

khoảng một nửa ở giai đoạn nút Trong thực tế, tỷ lệ phần trăm các acid amino thiết

yếu trong nấm rơm cao hơn so với nấm khác và quan trọng nhất là chứa nhiều

lysine [20]

Bảng 1.4: Thành phần acid amino trong nấm rơm

(Zakia Bano và cộng sự,1972; Verma, 2002)

Acid Amino Hàm lượng (mg/100g protein)

1.2.4 Một số nghiên cứu về nấm rơm

- Các nghiên cứu trên y dược cho thấy rằng công dụng của nấm rơm rất lớn

Năm 1989, Etsu Kishida, Yoshiaki Sone, Akira Misaki đã nghiên cứu thành công

khả năng ức chế sự phát triển của cá khối u trên chuột bằng (1 → 3)-β-d-glucan

được chiết từ nấm rơm [29] Chiu và cộng sự (1995) nghiên cứu chỉ ra rằng dịch

chiết từ nấm rơm có khả năng hạ huyết áp ở động vật bao gồm cả con người Khi

tiêm 25 mg dịch chiết nấm rơm trọng lượng khô/kg trọng lượng cơ thể vào chuột

cho thấy có tác dụng hạ huyết áp Dịch chiết nấm rơm không làm tăng bài tiết nước tiểu cũng không lợi tiểu natri Nó sản xuất được chronotropic và hiệu ứng co cơ tâm nhĩ phải bị ức chế và dẫn đến các dải động mạch bị ức chế [25] Theo nghiên cứu Peter năm 1998 cho rằng, nấm rơm có khả năng làm giảm lượng cholesterol trong máu nếu được ăn hàng ngày [51] Cũng trong năm 1998, Qing-Bai và cộng sự, đã nghiên cứu xác định rằng lectin được chiết từ nấm rơm có khả năng làm tăng hệ miễn dịch trên chuột [53]

- Khả năng tách, chiết enzyme và một số chất khác từ nấm rơm đã mở ra một hướng mới cho các nhà sản xuất Năm 1982, Chang và Steinkraus đã sản xuất được Enzymes Lignocellulolytic từ nấm rơm [21] Năm 1994, Cai và cộng sự cũng đã sản xuất thành công cellulases và hemicellulases từ nấm rơm [18] Ball và Jackson (1995) đã thu hồi enzyme lignocelluloses từ môi trường sản xuất nấm rơm [15]

- Một số nghiên cứu trong chế biến, bảo quản nấm rơm cho thấy tiềm năng kinh tế to lớn của nấm rơm.Theo Gow-Chin Yen, 1992, cho rằng nấm rơm khi nấu thì hàm lượng acid amin ban đầu sẽ bị mất đi khoảng 80% Trong quá trình bảo quản ở 4OC trong 5 ngày thì hàm lượng acid amin lại tăng lên, nhiều nhất là hàm lượng của 2-phenylethylamine và tyramine Tuy nhiên, hàm lượng của tất cả acid amin tăng rõ rệt hơn khi bảo quản ở nhiệt độ 25OC và hàm lượng putrescine và cadaverine tăng đáng kể so với các acid amin khác khi bảo quản ở nhiệt độ 4OC[33] Năm 1995, Siu Wai Chiu và cộng sự đã thành công trong việc sử dụng AP-PCR (arbitrarily-primed polymerase chain reaction) để tạo ra các dấu DNA và phân biệt các loài và giống Thông qua phương pháp này để xác định tính không đồng nhất

chủng V.volvacea trong thương mại [55] Theo Jeng-Leun và cộng sự (1997) cho rằng các hợp chất hương vị của nấm rơm Volvariella volvacea khác nhau ở các giai

đoạn Các hợp chất hương vị dễ bay hơi tìm thấy trong nấm rơm bao gồm: limonene, octa-1 ,5-dien-3-ol, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octanol, và 2-octen-1-ol, trong đó các hợp chất chính là 1-octen-3-ol, chiếm 71,6-83,1% tổng số các chất bay hơi Nấm rơm trưởng thành có hương thơm nhất Nấm rơm hàm lượng cao nhất là trehalose (349,0-457,6 mg/g trọng lượng khô) và thấp nhất là mannitol (0-25,5

mg/g) Trong quá trình phát triển của nấm rơm, hàm lượng acid aspartic và glutamic, tăng đáng kể, từ 36,11 đến 11,20 mg/g trọng lượng khô ở giai đoạn 1 lên 60,18 và 26,21 mg/g ở giai đoạn 5, trong đó acid glutamic là tăng nhiều nhất, tăng

từ 7,72 trong giai đoạn 1 với trọng lượng khô 21,00 mg/g ở giai đoạn 5 Do đó, nấm rơm nên thu hoạch ở giai đoạn 4 và 5 (thân cây nấm kéo dài và mở nắp) thì các hợp chất hương vị, bao gồm cả hương thơm và các hợp chất hương vị, đạt hiệu quả tốt nhất [37] Để phát triển công nghệ bảo quản nấm rơm, năm 2009, Rong Rui-fen và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản, phương pháp đóng gói, tác nhân chống biến màu nâu (cysteine), sự hình thành màu nâu và tỷ lệ thối mềm trên nấn rơm Kết quả cho thấy nhiệt độ bảo quản thích hợp nhất là 13OC , có thể được kéo dài đến 9 ngày và 11 ngày nếu gói kín với màu nâu tỷ lệ 54% trong khi đó bảo quản thông thường là 5 ngày [54]

- Các nghiên cứu nâng cao hiệu quả sản xuất nấm rơm Buswell và cộng sự (1996) sử dụng lignocellulosies làm tăng sự phát triển của nấm rơm [17] Banik và

Nandi (2000) đề nghị bổ sung biomanure trồng Volvariella volvacea, kết quả cho

thấy không chỉ làm tăng sản xuất (tăng số lượng nấm rơm và kích thước lớn hơn) nhưng cũng làm gia tăng đáng kể hàm lượng protein Ngoài ra chất dinh dưỡng, khoáng chất cần thiết tức, P, Ca, K, Fe, Cu, Zn, Mn cũng tăng lên [16]

1.3 Tổng quan về biến đen

1.3.1 Sự biến đen ở tôm

Biến đen là một hiện tượng phổ biến xảy ra ở tôm trong quá trình bảo quản, chế biến Các đốm đen xuất hiện chủ yếu ở phần đầu ngực, đuôi và ở màng liên kết giữa các đốt Biến đen thường xảy ra ở tôm nguyên con do sự tác dụng của enzyme polyphenoloxydase (có trong nhóm enzyme proteases) có trong đầu tôm Chính vì vậy, việc loại bỏ đầu và rửa sạch để loại bỏ enzyme proteases ngay sau khi thu hoạch sẽ hạn chế được sự biến đen xảy ra ở tôm trong quá trình bảo quản

Sự biến đen ở tôm xảy ra theo hai cơ chế sinh hóa học như sau:

Hình 1.1 Các cơ chế sinh hóa học liên quan đến việc hình thành các đốm đen ở

Hình 1.2 Sơ đồ các phản ứng sinh hóa học hình thành đốm đen ở tôm

Nâu đen (Melanine)

Tyrosine (không màu)

DOPA (vàng nhạt)

Polyphenoloxydase (dịch cơ thể và các tuyến dưới vỏ giáp)

N-Acetyldopamime

DOPA quinone (màu vàng)

Diphenoloxydase (oxy hóa)

N-Acetyldopamime

Đa tụ Dopadecarboxylase

Hoặc Transacetylase

Polyphenoloxydase đóng vai trò rất quan trọng đối với động vật giáp xác trong trong quá trình phát triển ở giai đoạn xơ cứng vỏ giáp sau khi lột xác hoặc phục hồi vết thương [42].

Jiang và cộng sự (1991) xác định được 3 trong 4 loại protease có trong gan tụy của tôm sú có tác dụng kích hoạt enzyme Polyphenoloxydase Trong đó tripsin đóng vai trò chính trong việc gây ra hiện tượng đốm đen do nó có tác dụng làm mềm vỏ tôm dẫn đến làm thoái hóa các protein sợi cơ Các yếu tố chính có liên quan đến sự hình thành đốm đen ở tôm là:

- Enzyme Polyphenoloxydase Hoạt động của enzyme này bị ức chế ở pH =

3, nhưng với độ pH này sẽ làm biến tính cơ thịt của tôm

- Oxy là chất tham gia trực tiếp trong tất cả các phản ứng của quá trình oxy hóa dẫn đến sự hình thành đốm đen ở tôm

- Sự hiện diện của một hoặc nhiều cơ chất tham gia vào phản ứng gây biến đen ở tôm như tyrosine, DOPA,

- Ảnh hưởng của các yếu tố khác như: giai đoạn lột xác, loài, nhiệt độ, vết thương,

Nhiệt độ thấp có tác dụng làm chậm các phản ứng hình thành đốm đen ở tôm chứ không thể ngăn chặn được các phản ứng này xảy ra Do đó, một trong những cách để hạn chế sự biến đen ở tôm là làm lạnh tôm ngay sau khi thu hoạch

1.3.2 Phương pháp ngăn chặn

Để hạn chế sự biến đen xảy ra ở tôm sau thu hoạch thì quá trình đánh bắt phải được thực hiện nhẹ nhàng để tránh làm tôm bị tổn thương Vấn đề chính sau khi thu hoạch là ngăn chặn sự khơi mào các phản ứng hình thành đốm đen Để thực hiện mục đích này, nhiều kỹ thuật có thể được áp dụng trong chế biến như làm lạnh, đông lạnh, nấu chín, chiếu xạ hoặc sử dụng các chất ức chế

Khi lựa chọn các biện pháp kỹ thuật để ngăn chặn sự biến đen ở tôm yêu cầu không được làm ảnh hưởng đến kết cấu, hương vị của tôm và không được gây độc trực tiếp hay gián tiếp đối với người tiêu dùng Kỹ thuật thu hoạch tốt kết hợp với việc duy trì nhiệt độ bảo quản lạnh ổn định là chìa khóa trong việc kiểm soát sự

hình thành đốm đen ở tôm Nếu tôm bị stress, nhiệt độ bảo quản không ổn định hoặc không bảo quản ở nhiệt độ thấp, đốm đen có thể xuất hiện ở tôm trong vòng vài phút sau khi thu hoạch Điều này rất quan trọng, vì khi đốm đen bắt đầu xuất hiện thì không thể khử được, các phản ứng biến đen sẽ tiếp tục xảy ra nhanh chóng

và rất khó ngăn chặn

Một số kỹ thuật chế biến có thể làm chậm hoặc thậm chí ngừng sự hình thành đốm đen nhưng lại ảnh hưởng đến cấu trúc cơ thịt tôm Đông lạnh ở -18°C không phá hủy được các enzyme mà chỉ ngừng hoạt động của chúng Các enzyme này sẽ hoạt đông trở lại khi sản phẩm được rã đông Hoạt động của các vi sinh vật cũng góp phần xúc tiến cho phản ứng hình thành đốm đen ở tôm, nhiều nghiên cứu cho thấy sự biến đen xảy ra nhanh hơn ở những mẫu tôm có mật độ vi sinh vật cao

Trong hầu hết trường hợp, sự biến đen không xảy ra ở tôm đã được nấu ở

95OC từ 3 đến 4 phút tùy thuộc vào kích cỡ Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng để ngăn chặn có hiệu quả sự hình thành đốm đen, tôm phải được nấu ở nhiệt độ cao hơn và lâu hơn Tuy nhiên, nếu nấu ở nhiệt độ quá cao trong thời gian dài sẽ làm ảnh hưởng đến kết cấu, hương vị của tôm và sẽ không được người tiêu dùng chấp nhận Đây là lý do tại sao việc sử dụng các chất ức chế để kiểm soát sự hình thành đốm đen ở tôm hiện nay là biện pháp được áp dụng nhiều nhất Từ cơ chế của các phản ứng hình thành melanine ở Hình 1.1 cho thấy để ngăn chặn sự hình thành đốm đen

ở tôm thì việc trước tiên là ức chế hoạt động của enzyme và sau đó là kiểm soát các

cơ chất tham gia phản ứng

Hiện nay, chất chống biến đen được sử dụng nhiều nhất là natri metabisulfite mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tìm chất thay thế để đạt hiệu quả cao hơn nhưng vẫn chưa thành công Metabisulfite phản ứng với các hợp chất trung gian hình thành trong chuỗi phản ứng gây biến đen, đặc biệt là phản ứng với quinone tạo thành sulfaquinone Ngoài ra metabisufite còn gây bất hoạt enzyme bằng cách làm giảm lượng oxy dẫn đến thiếu lượng oxy cần thiết cho phản ứng oxy hóa

Việc sử dụng natri metabisulfite phải được thực hiện trước khi các phản ứng khởi đầu của quá trình hình thành đốm đen xảy ra thì mới có hiệu quả Khi các phản ứng này đã bắt đầu thì việc sử dụng natri metabisulfite chỉ có thể làm chậm và nguy

cơ xuất hiện lại đốm đen tại thời điểm rã đông tôm là rất lớn gây hậu quả nghiêm trọng trong thương mại Vì thế, nên sử dụng natri metabisulfite ngay sau khi thu hoạch và làm lạnh tôm

+ Ưu điểm của natri metabisulfite: tác dụng nhanh, thời gian ngăn chặn biến đen tùy thuộc vào hàm lượng sử dụng, màu nguyên liệu ít bị thay đổi

+ Nhược điểm của natri metabisulfite: Một số nước cấm hoặc giới hạn liều lượng sử dụng, dư lượng của sulfite có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, khi hết sulfite thì đốm đen sẽ xuất hiện, sử dụng lặp lại nhiều lần

Trong thời gian gần đây, các nhóm nghiên cứu đã tìm thấy một số dẫn xuất resorcinol có thể ngăn chặn được sự biến nâu ở các loại rau, quả và khoai tây Hai chế phẩm thương mại có chứa 4-hexylresorcinol là EVERFRESH của Mỹ và SUNNYFRESH của Nhật Bản Thực nghiệm sử dụng 4-hexylresorcinol nguyên chất đã ngăn chặn được sự phát triển đốm đen trên tôm rất tốt và thậm chí còn hiệu quả hơn metabisulfite Tuy nhiên, các sản phẩm thương mại lại không cho thấy hiệu quả tương tự

+ Ưu điểm của sản phẩm 4-hexylresorcinol: tác dụng nhanh, thời gian ngăn chặn biến đen lâu dài, màu nguyên liệu không bị thay đổi, sử dụng 1 lần trong việc ngăn chăn biến đen

+ Nhược điểm của natri metabisulfite: Một số nước chưa chấp nhận sử dụng,

có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

1.3.3 Các quy định mang tính pháp lý liên quan đến việc sử dụng chất chống biến đen

Các chất chống biến đen sử dụng phổ biến được trình bày ở Bảng 1.5

Bảng 1.5 Đại diện chất ức chế enzyme gây nâu trong Trái cây, rau quả và thủy

hải sản (McEvily và cộng sự, 1992)

Chất khử Sulphiting; cysteine; glutathione; acid ascorbic và dẫn xuất Chất tạo keo Phosphate; EDTA; các acid hữu cơ

Tác nhân acid hóa acid citric; acid phosphoric

Chất ức chế enzyme acid carboxylic mạch vòng; rượu béo; anion; peptide; dẫn

xuất resorcinol Enzyme Oxigenases; porteases; o-methyl transferase

- Ảnh hưởng đến kết cấu, hương vị của thủy sản nên không được khách hàng chấp nhận Ví dụ như acid ascorbic gây ra màu vàng ở tôm

- Hiệu quả của việc xử lý không tối ưu so với những chất khác

- Các chi phí cho việc xử lý là không thỏa đáng

Mặc dù sulfite không được coi là chất độc hại, nhưng là chất có thể gây ra vấn đề sức khỏe đối với một số người tiêu dùng, đặc biệt là những người bị hen suyễn Do vậy, nhãn của sản phẩm phải ghi rõ rằng sản phẩm có chứa metabisulfite được sử dụng như các chất phụ gia dùng trong chế biến

Tiêu chuẩn liên quan đến tỷ lệ tối đa được phép thay đổi tùy thuộc vào các quốc gia Như Hoa Kỳ và Nhật Bản chấp nhận tối đa dư lượng SO2 trong cơ thịt là 100ppm, nhưng đối với Liên minh châu Âu thì yêu cầu dư lượng SO2 thay đổi tùy theo kích thước của tôm được trình bày ở Bảng 1.6

Bảng 1.6 Luật 98/72/EC của Liên minh châu Âu xác định nồng độ sulfua tối

đa cho phép có trong động vật giáp xác Loại sản phẩm và kích thước Giới hạn tối đa (mg/kg hoặc mg/l)

Sản phẩm tươi, đông lạnh và đông lạnh sâu

1.3.4 Ảnh hưởng của nấm ăn lên sự biến đen

Trong những năm qua, có nhiều đề tài nghiên cứu tách chiết từ các loại nấm

ăn như: Agaricus bisporus, Boletus badius, Flammulina velutipes, Hericium erinaceus, Hypsizigus marmoreus, Lentinula edodes, Lepista nuda, Pleurotus eryngii, Pleurotus ostreatus, Polyporus squamosus, Russula delica và Verpa conica

để ngăn chặn sự hóa nâu trong táo và trong bảo quản tôm Một số tính năng có trong nấm ăn cũng đã được phát hiện như khả năng chống oxy hóa, khả năng hỗ trợ điều trị một số bệnh như tim mạch, huyết áp…Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu chất chống oxy hóa trong nấm ăn cũng còn là hạn chế, nhất là trong nấm rơm

(Volvariella volvacea) hầu như chưa có đề tài nghiên cứu về vấn đề này

1.3.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

Sự biến đen ở tôm đã được nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ XX Năm 1984, Ogawa đã nghiên cứu khía cạnh vật lý của đốm đen xuất hiện trên tôm Năm 1986, Otwell và Marshall đã nghiên cứu sử dụng sulfite để kiểm soát sự biến đen ở tôm, kết quả cho thấy, các loài tôm ảnh hưởng đến sự xuất hiện biến đen, tôm

sẽ biến đen sau 3 ngày và phát triển mạnh sau bảy ngày trong bảo quản lạnh, ngâm bisulfate 2,5% cho hiệu quả ngăn chặn biến đen tốt hơn bisulfate 1,25% (giới hạn cho phép) Sử dụng hỗn hợp bisulfit với acid citric, erythrobate, EDTA ngăn chặn biến đen có hiệu quả nhất Năm 1991, Motohashi và công sự đã nghiên cứu sự ảnh

hưởng của sulfite lên phản ứng melanine bằng cách ức chế hoạt động enzyme polyphenoloxydase [48]

Năm 2001, Montero và cộng sự nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất ức chế và áp suất cao để ngăn chặn sự biến đen và phát triển vi sinh vật trên tôm, kết quả cho thấy, Sodium benzoate và axít kojic phối hợp với nhau có hiệu quả ngăn chặn biến đen ở tôm Hợp chất 4-hexylresorcinol hoặc kết hợp với ascorbic acid citric cho hiệu quả cao nhất trong ngăn chặn biến đen và vi sinh vật gây hư hỏng trong tôm Áp suất cao làm tăng sự biến đen, nhưng nó không làm thay đổi hiệu quả các chất ức chế Tổng số vi sinh vật thấp nhất khi xử lý bằng acid ascorbic và acid citric dưới áp suất cao [50]

Năm 2004, Gokoglu nghiên cứu sự ảnh hưởng acid hữu cơ đến khả năng ngăn chặn biến đen ở tôm cho thấy, Tôm được xử lý với lactic (1%), citric (1%), axit axetic(1%) và metabisulfite natri (0,3%) Sau khi xử lý, tôm được lưu trữ ở 4°C

và được đánh giá sự biến đen hàng ngày Kết quả sodium metabisulphite hiệu quả nhất trong việc ngăn chặn biến đen Axit citric và lactic tăng khả năng biến đen ít hơn, nhưng acid acetic không có hiệu lực [32]

Năm 2005, Carmen và cộng sự, nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ SO2lên khả năng ngăn chặn biến đen trên tôm cho thấy, khi nhúng tôm trong một giờ với 50 g/kg sulfite, cùng với acid citric và chelants, thì khả năng ngăn chặn biến đen

ít nhất một tuần và liều lượng SO2 trong khẩu phần ăn không được vượt quá 0,3 g/kg SO2 [19]

Năm 2005, Montero và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế biến đen và

dư lượng 4-hexylresorcinol trên tôm (Parapenaeus longirostris) bằng các phương

pháp khác nhau Năm 2008, Fernando và cộng sự đã nghiên cứu ức chế hoạt động

của enzyme polyphenoloxydase trong hemocyanin của tôm chân trắng (Penaeus vannamei) bằng phương pháp biến đổi gen [50]

Năm 2009, Nilesh Prakash Nirmal, Soottawat Benjakul đã nghiên cứu sự ảnh hưởng acid ferulic ức chế enzyme polyphenoloxidase trong tôm thẻ chân trắng, khi khảo sát acid ferulic (FA) và acid ferulic oxy hóa (OFA) ở các nồng độ (0,1%, 0,5%, 1% và 2% (w/v) cho thấy FA hiệu quả hơn OFA trong việc ức chế hoạt động

enzyme polyphenoloxidase Khi xử lý tôm với FA nồng độ 1% hoặc 2 % thì thời gian bảo quản trong nước đá lên đến 10 ngày Sau bảo quản 10 ngày trong nước đá, tôm được xử lý bằng FA 2% có sự biến đen ít hơn và hương vị, màu sắc tốt hơn so với xử lý bằng sodium metabisulphite 1,25% (SMS) [46]

Năm 2009, Nilesh Prakash Nirmal và cộng sự đã nghiên cứu sự biến đen và

thay đổi chất lượng ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) được xử lý bằng

catechin trong thời gian bảo quản lạnh Cũng trong năm này, Encarnacion và cộng

sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của ergothioneine chiết tách từ nấm ăn (Flammulina velutipes) đến sự biến đen và oxy hóa lipid ở tôm he Nhật bản (Marsupenaeus japonicus) [27]

Ở Việt Nam, Nguyễn Việt Dũng và Huỳnh Nguyễn Duy Bảo (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt độ của enzyme

polyphenoloxydase từ tôm sú (Penaeus monodon)[5] Năm 1997, Nguyễn Việt

Dũng và Nguyễn Tiến Thơm đã nghiên cứu sử dụng EVERFRESH để ngăn chặn sự biến đen ở tôm sú trong quá trình bảo quản bằng nước đá [6]

Cho đến nay các công trình nghiên cứu đã công bố trên thế giới về việc sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên để ngăn chặn sự biến đen ở tôm còn rất hạn chế Ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về vấn đề này Việc tìm ra một hợp chất tự nhiên, an toàn đối với người tiêu dùng và có thể thay thế được các hóa chất sử dụng trọng ngặn chặn sự biến đen ở tôm là một vấn đề cấp thiết đang được các nhà chế biến thủy sản rất quan tâm Vì vậy, đề tài này sẽ nghiên cứu sử dụng dịch chiết nấm rơm để ngăn chặn sự biến đen ở tôm sau thu hoach nhằm góp phần tìm ra giải pháp đảm bảo an toàn thực phẩm để áp dụng trong bảo quản và chế biến tôm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Tên tiếng anh là Straw mushroom

Nấm rơm được mua ở trang trại nấm của ông Hoàng Văn Thuận, xã Cam Hiệp, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa Nấm rơm vừa mới thu hoạch, còn tươi nguyên, không bị dập nát, tổn thương Nấm rơm được cho vào túi PE và bảo quản trong thùng xốp để vận chuyển về phòng thí nghiệm

Hình 2.1 Nấm rơm (V volvacea)

2.1.2 Tôm nguyên liệu:

Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) dùng trong nghiên cứu này được

mua tại ao nuôi của ông Trần Tiến ở tổ dân phố Hà Liên, phường Ninh Hà, thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa Tôm được nuôi công nghiệp với diện tích 5000m2 Được vận chuyển sống trong thùng xốp có sục khí về phòng thí nghiệm Kích cỡ tôm từ 90-100 con/kg, không dùng tôm bị thương hoặc tôm bệnh

Hình 2.2 Tôm thẻ chân trắng (P vannamei)

2.2 Hóa chất:

Các hóa chất sử dụng cho nghiên cứu này bao gồm: Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O, cồn 90O, FeCl3.6H2O, methanol, acid acetic và được sản xuất bởi công ty Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd DPPH được mua của Sigma-Aldrich (St Louis, MO) Tất cả các hóa chất đều có độ tinh khiết trên 99%

Các hóa chất trên đều đạt tiêu chuẩn sử dụng trong phòng thí nghiệm

2.3 Máy và thiết bị:

- Hệ thống phân tích hình ảnh gồm: Camera kỹ thuật số Panasonic DMC 10

Mp, buồng chụp hình (không có ánh bên ngoài chiếu vào, được lắp 04 đèn huỳnh quang ở 04 đỉnh của buồng), laptop có phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ (Phần mềm này được cung cấp miễn phí bởi Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ, Bethesda, MD)

- Một số thiết bị quan trọng khác:

+ Máy quang phổ UV-1600PC SHIMADZU

+ Máy sắc ký LCMS-2010EV SHIMADZU

2.4 Phương pháp nghiên cứu:

2.4.1 Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm

Mục đích của thí nghiệm này là xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết nấm rơm Theo nghiên cứu Ilgaz Akata và cộng sự (2012) cho thấy thành

phần hóa học của nấm kim châm (F Velutipes) trong 100g nấm khô như sau: Hàm

lượng ẩm: 9,84%; Tro: 10,40%; Protein: 22,04%; Chất béo: 7,33%; Carbohydrates:

50,40% [36] Trong khi đó thành phần hóa học của nấm rơm (V volvacea ) trong

100g nấm khô như sau: Hàm lượng ẩm: 9,36%; Tro: 10,00%; Protein: 28,04%; Chất béo: 3,33%; Carbohydrates: 50,31% [9] Thành phần hóa học của hai loại nấm tương tự nhau Vì vậy nghiên cứu này, các công đoạn chính của quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm đề xuất dựa vào quy trình chiết tách chất chống oxy

hóa từ nấm kim châm (F Velutipes) của Bao và cộng sự (2009) [12]

Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm được trình bày trên sơ đồ hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát xác định các thông số thích hợp

cho quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm

Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa:

2.4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống

oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

b) Cách tiến hành: Nấm rơm (2 kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí

nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất Sau đó, lấy mỗi mẫu 100g nấm đã được xay nhỏ cho vào trong 1000 ml nước và cố định thời gian chiết là 60 phút Theo nghiên cứu Bao và cộng sự (2009) nhiệt độ chiết tối ưu đối với nấm kim châm

là 95OC Do đó, nghiên cứu này đã chọn khảo sát nhiệt độ chiết ở 3 mốc là: 90OC,

95OC và 100OC Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên được điều chỉnh về cùng thể

Chiết

- Thời gian: 60 phút

- Tỷ lệ nấm/nước: 1/10

- Nhiệt độ (OC)

tích là 1000 ml và đem đi phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn nhiệt độ thích hợp Thí nghiệm trên được tiến hành lặp lại 3 lần

2.4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống

oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

b) Cách tiến hành: Nấm rơm (2kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí

nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất Sau đó, lấy mỗi mẫu 100g nấm đã được cắt nhỏ cho vào trong 1000 ml nước và cố định nhiệt độ chiết là 95OC Theo nghiên cứu Bao và cộng sự (2009) thời gian chiết tối ưu đối với nấm kim châm là

60 phút Do đó, nghiên cứu này đã chọn khảo sát thời gian chiết ở 3 mốc là: 30

Chiết

- Nhiệt độ: 95OC

- Tỷ lệ nấm/nước: 1/10

- Thời gian (Phút)

phút, 60 phút và 90 phút Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên được điều chỉnh về cùng thể tích là 1000 ml và đem đi phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn nhiệt độ thích hợp Thí nghiệm trên được tiến hành lặp lại 3 lần

2.4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính

chống oxy hóa của chiết nấm rơm

b) Cách tiến hành: Nấm rơm (2kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí

nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất Sau đó, lấy mỗi mẫu cố định nhiệt độ chiết là 95OC và thời gian chiết là 60 phút Theo nghiên cứu Bao và cộng sự (2009)

Chiết

- Nhiệt độ: 95OC

- Thời gian: 60 Phút

- Tỷ lệ nấm/nước

tỷ lệ chiết nấm/nước tối ưu đối với nấm kim châm là 1/10 Do đó, nghiên cứu này

đã chọn khảo sát tỷ lệ chiết nấm/nước ở 3 mốc là: 1/12, 1/10 và 1/8 Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên được điều chỉnh về cùng thể tích là 1000 ml và đem đi phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn nhiệt độ thích hợp Thí nghiệm trên được tiến hành lặp lại 3 lần

2.4.2 Phân tích hàm lượng ergothioneine (ESH), hoạt tính ức chế enzyme polyphenoloxidase (PPO) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

Mục đích của thí nghiệm này là xác định hàm lượng ESH, hoạt tính ức chế enzyme PPO và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm chuẩn bị theo quy trình hoàn thiện Hình 2.3

a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích hàm lượng ESH, hoạt tính ức chế

enzyme PPO và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

Phân tích hoạt tính ức chế enzyme PPO

Phân tích hoạt tính chống oxy hóa

Phân tích tổng năng lực khử Phân tích khả năng

khử gốc tự do DPPH

b) Cách tiến hành thí nghiệm

+ Dịch chiết nấm rơm được chuẩn bị theo quy trình tối ưu theo sơ đồ Hình 2.3 được đem đi phân tích hàm lượng Ergothioniene theo phương pháp của Bao và cộng sự (2008): Cho 1ml methimazole 1mM vào hỗn hợp chứa 0,2 ml dịch chiết nấm rơm; 4,8 ml nước cất và 14 ml ethanol tuyệt đối Hỗn hợp trên được pha trộn ở

40C trong 2 giờ Sau đó ly tâm ở 3000g trong 15 phút ở nhiệt độ 40C Loại bỏ phần nổi và phần ethanol bốc hơi ở 400C Phần còn lại hòa tan 10ml nước cất Hàm lượng Ergothioneine được phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LCMS-2010EV Sử dụng cột C30 (Develosil C30-UG-5, đường kính 4,6 mm, chiều dài cột

250 mm, kích thước hạt 5 µm, Nomura Chemical Co Ltd.,Aichi, Japan) Sử dụng nước khử ion làm pha động được bơm với tốc độ là 0,25 ml/phút Thể tích mẫu là

20 ml và nhiệt độ cột được giữ ở 250C Hàm lượng ERT được xác định bởi các ion giám sát ERT và IS tại 230 và 115 m/z Được biểu diễn bằng đường cong hiệu chuẩn thể hiện các nồng độ khác nhau Tất cả số liệu thu được thể hiện hàm lượng

mg ERT thu được trong mỗi ml dịch chiết nấm

+ Phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002): Cho vào 4 ống nghiệm dịch chiết nấm rơm lần lượt là (0,05 ml; 0,1 ml; 0,15 ml và 0,2 ml) thêm nước cất vào sao cho tổng mỗi ống là 2 ml, lắc đều rồi thêm 1 ml cồn tuyệt đối, lắc đều và thêm 1 ml DPPH 0,1 mM Sau đó để phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối Sau 30 phút, hỗn hợp phản ứng được đem đi đo độ hấp phụ tại bước sóng 517 nm trên thiết bị UV-VIS Mẫu đối chứng được chuẩn bị giống như trên nhưng thay thế dung dich mẫu bằng nước cất

Khả năng khử gốc tự do được xác định như sau:

ACL = AĐC – AM

Trong đó

ACL: Độ hấp phụ còn lại của mẫu tại bước sóng 517 nm

AĐC: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng tại bước sóng 517 nm

AM: Độ hấp phụ của mẫu tại bước sóng 517

Dựa trên đồ thị đường chuẩn DPPH để xác định nồng độ còn lại của DPPH Nồng độ DPPH bị khử được tính bằng công thức sau:

+ Phân tích hoạt tính ức chế enzyme PPO : Cho 1 ml dịch chiết nấm rơm vào hệ phản ứng bao gồm 0,1 ml catechol 500 mM; 0,1 ml L-Proline 500 mM; 2,9

ml đệm phosphate (pH 6,8) 50 mM và 0,1 ml dung dich enzyme polyphenoloxydase

có chứa 100 đơn vị hoạt độ/mL Ở mẫu đối chứng 1 ml dung dịch mẫu được thay bằng dung dịch đệm phosphate Hỗn hợp phản ứng được đưa đi đo liên tục trong

600 giây ở bước sóng hấp thụ 530 nm (A530) trên thiết bị UV-VIS Hoạt tính ức chế hoạt động enzyme polyphenoloxydase được tính theo công thức sau đây:

Hoạt tính ức chế hoạt (%) = 100 - [(A x 100) / B]

Trong đó: A = Độ hấp thụ của mẫu dịch chiết nấm rơm ở bước sóng 530 nm

B = Độ hấp thụ của mẫu đối chứng (không có dịch chiết nấm rơm) ở bước sóng