nghiên cứu quy trình cắt mạch chitosan trạng thái rắn bằng hydroperoxit để sản xuất chitosan có phân tử lượng thấp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------ VŨ LỆ QUYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CẮT MẠCH CHITOSAN TRẠNG THÁI RẮN BẰNG HYDROPEROXIT ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP Chuyên ngành: Công nghệ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- -

VŨ LỆ QUYÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CẮT MẠCH CHITOSAN TRẠNG THÁI RẮN BẰNG HYDROPEROXIT ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nghiên cứu nêu trong Luận văn là trung thực

Tác giả Luận văn

Vũ Lệ Quyên

đã đóng góp rất lớn cho việc hoàn thành luận văn này

Tiếp theo, tôi xin được dành lời cảm ơn đến Quí thầy cô giáo phụ trách phòng thí nghiệm – Trung tâm Thí nghiệm Thực hành đã tạo điều kiện cho tôi về hóa chất và trang thiết bị thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin được cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp vì những tình cảm của họ là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với tôi

Và cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình Họ là những người luôn ủng hộ tôi trên từng bước đường học tập và công tác

Khánh Hòa - 2012

Vũ Lệ Quyên

2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitosan, nồng độ H2O2, nhiệt độ và thời gian thủy phân

27

Trang 2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan 31 2.2.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan PTLT

2.3.1 Phương pháp xác định khối lượng phân tử 34 2.3.2 Độ ẩm được phân tích theo phương pháp chuẩn của AOAC 34 2.3.3 Xác định độ deacetyl theo phương pháp nung 34

3.1 XÁC ĐỊNH CÁC CHẾ ĐỘ CẮT MẠCH CHITOSAN BẰNG H2O2 36 3.1.1 Xác định kích thước chitosan nguyên liệu thích hợp 36 3.1.2 Xác định nồng độ H2O2 thủy phân chitosan trạng thái rắn 37 3.1.3 Xác định thời gian thủy phân chitosan bằng H2O2 39 3.1.4 Xác định nhiệt độ thủy phân chitosan bằng H2O2 41 3.2 KIỂM TRA HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN VÀ CHITOSAN PTLT

43

3.2.1 Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn Gram (-) 43 3.2.2 Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn Gram (+) 48 3.3 SO SÁNH KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM (-) VÀ GRAM (+) CỦA CHITOSAN VÀ CHITOSAN PTLT

53

3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA

CHITOSAN VÀ CHITOSAN PTLT TRÊN CÁ NGỪ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CFU Colony forming unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc)

TSVKHK Tổng số vi khuẩn hiếu khí

V parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Chế độ cắt mạch và độ nhớt của các sản phẩm chitosan 14 Bảng 1.2 Nồng độ nhỏ nhất của chitosan (%) ức chế 11 chủng VSV khác nhau 20

Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của chitosan và chitosan PTLT khi bảo quản cá Ngừ Ồ

56

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin và chitosan 3

Hình 1.3 Đồ thị biểu diễn mức độ hấp thụ chất béo của chitosan 9 Hình 1.4 Minh họa cơ chế cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit 11 Hình 1.5 Ảnh hưởng của thời gian, DD đến khả năng cắt mạch chitosan của H2O2 12 Hình 1.6 Hình ảnh của VSV trước (A) và sau khi xử lý chitosan 30 phút (B) 21 Hình 1.7 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan 23

Hình 1.8 Ảnh hưởng của EDTA đến khả năng kháng E coli (A) và S aureus (B)

của chitosan

24

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitosan thích hợp 27 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ H2O2 thích hợp 28 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp 29 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp 30 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và chitosan phân tử lượng thấp

31

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chitosan

và chitsan phân tử lượng thấp khi bảo quản cá Ngừ

Hình 3.5 Qui trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp 42

Hình 3.6 Kết quả kháng E coli của C và C1 ở thời gian xử lý: 90 phút (a),

Hình 3.10 Biểu đồ so sánh khả năng kháng khuẩn của C (a), C1 (b) ở thời gian

xử lý: 120 phút trên bốn chủng VSV nghiên cứu

54

MỞ ĐẦU

Năm 2011, Việt Nam khai thác được 2,2 triệu tấn thủy sản; nuôi đạt 3 triệu tấn hàng thủy sản xuất đi 150 nước trên thế giới Kim ngạch xuất khẩu đạt 6,1 tỷ USD Trong đó, riêng tôm đạt 402.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 2,1 tỷ USD Phế liệu tôm có thể lên tới (40 ÷ 70)% khối lượng nguyên liệu Tương ứng với sản lượng tôm năm 2011 có thể ước tính lượng phế liệu tôm là (160.000 ÷ 281.400) tấn

Ở Việt Nam, phế liệu tôm chủ yếu dùng để sản xuất thức ăn gia súc, chitosan thô với chất lượng thấp để xuất khẩu Phần nhỏ được dùng để sản xuất chitosan chất lượng cao, olygochitosan và glucosamin Tuy nhiên, việc ứng dụng chúng trong cuộc sống còn nhiều hạn chế Nguyên nhân là chưa có nhiều công trình nghiên cứu về lĩnh vực này được công bố, chitosan có trọng lượng phân tử lớn, không tan trong nước nên

có nhiều hạn chế cho việc ứng dụng Để cải thiện khả năng hoà tan và hoạt tính sinh học của chitosan, người ta đã sản xuất ra loại chitosan phân tử lượng thấp:

Chitosan trọng lượng phân tử thấp có một số đặc tính đặc biệt như kháng nấm, kháng khuẩn, tăng cường hệ miễn dịch và có nhiều ứng dụng trong y dược như ngăn ngừa được sự phát triển của bệnh đái tháo đường, ngăn ngừa được sự gia tăng của cholesterol của chuột khi sử dụng thức ăn đã được bổ sung cholesterol [35]

Chitosan có hoạt tính kháng khuẩn nên đã được nghiên cứu và ứng dụng trong thực phẩm để bảo quản thực phẩm, cá, thịt bò và trái cây (thanh long, táo, vú sữa…) [1, 2, 7, 8, 9] Ngoài ra, chitosan còn được ứng dụng như một phụ gia để tăng khả năng tạo gel trong sản xuất giò, chả, xúc xích, surimi [10]

Để có chitosan phân tử lượng thấp, người ta thường sử dụng các phương pháp hoá học, sinh học và vật lý để cắt mạch chiosan có phân tử lượng cao

Có thể dùng HCl, H2SO4, H2O2, enzyme hoặc thủ pháp chiếu xạ (chùm tia năng lượng cao), để tạo chitosan phân tử lượng thấp [11, 21, 39, 41, 43] Tuy nhiên, các phương pháp cắt mạch đã trình bày ở trên thường phải thực hiện trong thời gian dài, và phải sử dụng acid để hòa tan chitosan trước khi cắt mạch, tinh sạch sản phẩm khó khăn nên chi phí cao, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp và có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường

Vì vậy, nghiên cắt mạch chitosan trạng thái rắn là một hướng đi mới với nhiều

ưu điểm như không gây ô nhiễm môi trường, qui trình sản xuất đơn giản, giảm chi phí trong quá trình sản xuất do loại bỏ được công đoạn tinh sạch sản phẩm Đó là lý do tác giả thực hiện đề tài “Nghiên cứu qui trình cắt mạch chitosan trạng thái rắn bằng hydroperoxit để sản xuất chitosan có phân tử lượng thấp”

Mục tiêu của đề tài:

- Xây dựng quy trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp bằng phương pháp thủy phân chitosan trạng thái rắn

Nội dung của đề tài bao gồm:

- Nghiên cứu xác định chế độ cắt mạch chitosan trạng thái rắn bằng hydroperoxit

và thử nghiệm sản xuất chitosan phân tử lượng thấp

- Thử nghiệm hoạt tính khángkhuẩn củachitosanvàchitosanphân tử lượng thấp

Tính mới của đề tài: Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về cắt mạch chitosan trạng trái rắn bằng H2O2

Ý nghĩa khoa học của đề tài: Nghiên cứu qui trình cắt mạch chitosan trạng thái rắn bằng hydroperoxit đã tạo ra một phương pháp thủy phân chitosan mới với nhiều ưu điểm so với các phương pháp đã và đang thực hiện ở Việt Nam

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Hiện nay các nhà khoa học cũng như các nhà doanh nghiệp sản xuất chitosan và olygochitosan đang mong đợi một phương pháp sản xuất chitosan phân tử lượng thấp mới, hiệu quả cao, không gây ô nhiễm môi trường,

và sản phẩm có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng trong y học, thực phẩm và công nghệ sinh học Vì vậy, khả năng ứng dụng của đề tài này là khá cao

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG

1.1.1 Cấu trúc và tính chất của chitosan

1.1.1.1 Cấu trúc của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin Trong tự nhiên, chitosan có ở màng tế bào

nấm mốc, thuộc họ Zygemyceces và ở một vài loại tảo; cũng như ở một số côn trùng

Chitosan có nhiều trong vỏ động vật giáp xác như: Tôm, cua, ghẹ và mai mực

Vì vậy, các loại vỏ này được dùng để sản xuất chitin - chitosan và dẫn xuất của chúng

Hình 1 1 Công thức cấu tạo của chitin và chitosan

Tuy nhiên, trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân

tử chitosan (khoảng 10%) Vì vậy, công thức chính xác của chitosan được thể hiện trên Hình 1.2

Hình 1.2 Công thức hóa học của chitosan

Tên hoá học của chitosan là: Poly--(1,4)-D-glucosamin, hay còn gọi là poly--(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose

Như vậy, chitosan là một polymer hữu cơ, có cấu trúc tuyến tính, từ các đơn vị β- D- Glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1- 4 glucoside

Công thức phân tử: (C6H11O4N)n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

1.1.1.2 Một số tính chất của chitosan

- Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột có màu trắng ngà, ở dạng vảy có màu trắng trong hay màu hơi vàng

- Chitosan thương mại ít nhất phải có DD (độ deacetyl) > 70% và trọng lượng phân tử (100.000 – 1.200.000) Dalton

- Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hoà tan trong nước, trong dung dịch kiềm Nhưng hoà tan trong dung dịch acid acetic loãng, tạo thành dung dịch keo dương Nhờ đó, keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như: Pb3+, Hg+,…

- Chitosan tác dụng với Iốt trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím Phản ứng này dùng để phân tích định tính chitosan

- Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic (pH < 6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (- NH2) [36]

- Chitosan có tính kháng nấm, kháng khuẩn cao [8, 13, 29]

- Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể [1, 13]

Những đặc tính quý giá trên đã nâng cao khả năng ứng dụng của chitosan trong sinh học, y học, công nghệ thực phẩm

1.1.2 Ứng dụng của chitosan

Do tính chất không tan trong nước, chitin ít được sử dụng trực tiếp Nhưng từ

nó có thể điều chế dẫn xuất như: Chitosan, COS, glucosamine [6, 11] Chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

1.1.2.1 Trong nông nghiệp [13]

Trong nông nghiệp olygoglucosamin ảnh hưởng đến sinh trưởng của rau cải, đậu cove và một số loại rau khác, nó còn có tác dụng tăng năng suất, tăng khả năng kháng bệnh, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, góp phần bảo vệ môi trường

Chitosan được sử dụng để bọc nang các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt

Ngày nay, chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua , gà, để kích thích sinh trưởng và tăng khả năng kháng bệnh

1.1.2.2 Trong y học [3, 4, 5]

Ứng dụng quan trọng nhất và mang lại hiệu quả kinh tế cao của chitosan là ở lĩnh vực y học Các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhiều đến lĩnh vực ứng dụng này

Do khả năng kháng khuẩn và tạo màng nên chitosan được ứng dụng phối hợp với một số thành phần phụ liệu khác để tạo các sản phẩm dùng trong y học: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép chống nhiễm khuẩn và cầm máu,

Chitosan dùng làm hoạt chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết bỏng, vết mổ vô trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol trong máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, viêm xương, loãng xương, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn dịch,

Ngoài ra, chitosan còn được dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm:

- Làm tá dược độn, tá dược dính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng,…

- Làm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer có tác dụng chậm, kéo dài thời gian tác dụng của thuốc,

1.1.2.3 Trong công nghiệp [13]

Chitosan dùng làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm trong kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in, phim ảnh,

Trong công nghiệp giấy

Do cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời làm cho việc in trên giấy tốt hơn [13]

Trong công nghiệp dệt

Dung dịch chitosan có thể thay hồ tinh bột, để hồ vải Nó có tác dụng làm sợi tơ bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được acid và kiềm nhẹ

Chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải cold

Trong ngành hóa mỹ phẩm

Chitosan có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm -NH3+ Các nhóm này liên kết với tế bào sừng hoá của da Dựa vào đặc tính này, người ta sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da: Giữ ẩm, chống khô, làm mềm da, ngăn ngừa tia cực tím làm hại da,

Trong công nghiệp xử lý nước

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt với các ion kim loại như: Pb2+, Hg+,… chitosan được dùng để lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm

Là một hợp chất polymer tự nhiên, không độc và rất an toàn đối với thực phẩm,

có khả năng kháng khuẩn, chống ẩm, tạo màng, hấp phụ màu mà không hấp phụ mùi, hấp phụ một số kim loại nặng,… nên chitosan được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực công nghệ sản xuất và bảo quản thực phẩm, góp phần bảo đảm an toàn cho người [8, 9]

Chitosan cùng với các loại vật liệu tạo màng khác nhau, tạo ra các màng bao có khả năng kéo dài thời gian bảo quản rau quả, thịt, [1, 2]

Chitosan dùng để lọc các loại nước quả ép, bia rượu vang,

Ở Việt Nam, chitosan đã được sử dụng thay hàn the trong sản xuất chả giò, bánh cuốn, bánh phu thê… như một chất phụ gia tăng độ dòn, độ dai cho chúng [10]

1.1.2.4 Trong công nghệ sinh học

Trong công nghệ sinh học, chitosan dùng để cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang, sử dụng trong sắc ký chọn lọc [13]

1.2 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất và ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX

Hiểu biết của loài người về những nội dung trên, được trình bày ở mục 1.1 đã khái quát toàn diện, đầy đủ thành tựu nghiên cứu của thế giới 90 năm qua về các vấn

Người ta ước tính sản lượng chitosan của thế giới sẽ đạt tới 118.000 tấn/năm Trong đó Nhật Bản, Hoa Kỳ vẫn là hai nước sản xuất chính

Trong phạm vi Đề tài được giao, chúng tôi quan tâm đến các phương pháp cắt mạch chitosan để tạo chitosan có phân tử lượng thấp, với mục đích giảm nguy cơ gây

ô nhiễm môi trường và cắt giảm một số công đoạn phức tạp trong qui trình sản xuất

1.2.1 Nghiên cứu tạo chitosan phân tử lượng thấp trên thế giới

Có rất nhiều phương pháp để sản xuất chitosan có phân tử lượng thấp, nhưng người ta phân loại chúng thành các phương pháp sau: Phương pháp sinh học, hoá học

và vật lý Trong đó, phương pháp hóa học và sinh học được ứng dụng nhiều nhất trong cuộc sống bởi chúng có một số ưu điểm vượt trội

1.2.1.1 Dùng tác nhân sinh học để thủy phân

Có hơn 30 loại enzyme có thể được sử dụng để cắt mạch chitosan: Chitosanase, cellulase thu được từ các VSV khác nhau (vi khuẩn, nấm mốc), papain chiết tách từ đu đủ…[15, 18, 31, 43, 46] Phương pháp cắt mạch bằng enzyme có hiệu quả cắt mạch tốt

và không gây ô nhiễm môi trường Tuy vậy, phương pháp này vẫn còn những hạn chế khi sản xuất ở quy mô lớn như: Chi phí sản xuất cao do công đoạn tinh sạch sản phẩm khó khăn, qui trình sản xuất phức tạp, tính đặc hiệu của enzyme cao nên có những enzyme chỉ cắt liên kết giữa các đơn vị có chứa nhóm acetyl, hoặc chỉ cắt liên kết giữa các đơn vị đã bị khử nhóm acetyl nên hiệu quả thủy phân chưa cao

1.2.1.2 Dùng tác nhân hóa học để thủy phân

Có nhiều tác nhân hóa học đã được nghiên cứu và ứng dụng để thủy phân chitosan để thu chitosan PTLT hoặc COS: acid nitrous, acid acetic, acid sulfuric, acid phosphotungtic và acid hydrofluoric [16, 28, 31, 36, 50] Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi thời gian dài, quá trình tinh sạch sản phẩm khó khăn, không thân thiện với môi trường và phải dùng thiết bị hiện đại nếu sản xuất ở qui mô công nghiệp

Ngoài ra, các tác giả Allan, Chang, Tanioka đã sản xuất thành công chitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng việc cắt mạch chitosan trạng thái lỏng (sau khi đã pha loãng trong môi trường acid) bởi các tác nhân oxy hóa như ozone, natri nitrite và hydroperoxit (H2O2) [17, 22, 45] Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa khắc phục được những nhược điểm lớn nhất của phương pháp hóa học là có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và quá trình tinh chế sản phẩm còn gặp nhiều khó khăn Vì vậy, acid HCl

đã được nghiên cứu để thuỷ phân chitosan trạng thái rắn với mong muốn tìm ra phương pháp mới với nhiều ưu điểm như giảm chi phí, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và dễ thực hiện Nghiên cứu đã thành công với 80% chitosan được chuyển thành glucosamin Tuy nhiên, phương pháp này rất khó để thương mại hóa sản phẩm

vì việc xử lý nước thải gặp nhiều khó khăn và sản phẩm chủ yếu không phải là chito – olysaccharide [28]

Phương pháp hóa học thường cho hiệu quả cắt mạch cao Tuy nhiên, các nhà khoa học lo ngại về hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân tạo thành (hoạt tính kháng khuẩn, chống oxi hóa, khả năng hấp thụ chất béo) không cao và có nguy cơ gây

ô nhiễm môi trường Do đó cần phải tìm ra một phương pháp hóa học hoàn hảo hơn có thể khắc phục được hai nhược điểm trên

1.2.1.3 Dùng tác nhân vật lý để thủy phân

Wasikiewicz và cộng sự, 2004 đã dùng tia gamma, tia UV và sóng siêu âm để thủy phân chitosan Kết quả thu được COS có phân tử lượng khá thấp (> 25kDa) Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chitosan phải hòa tan trong môi trường acid trước khi thủy phân với nồng độ thấp (0,1 – 1)% và thời gian thủy phân dài, nên

đã gây khó khăn cho quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp [30]

Czechowska-Biskup và cộng sự, 2005 [40] đã thử nghiệm với phương pháp vật

lý để thủy phân chitosan thu được COS đồng thời thử nghiệm khả năng kết hợp giữa COS và chất béo với mục đích ứng dụng COS trong dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng để làm giảm khả năng hấp thụ chất béo của con người (với 1g chitosan có thể hấp thu 8 – 20g chất béo) Hình 1.3

Khối lượng phân tử (kDa)

Hình 1.3 Đồ thị biểu diễn mức độ hấp thụ chất béo của chitosan [40]

Có những phương pháp chiếu xạ sau:

- Chiếu xạ ở trạng thái khô: dùng tia gamma phát ra từ nguồn 60Co với liều lượng là 0.56 Gy s_

- Chiếu xạ trong dung dịch: dùng tia gamma phát ra từ nguồn 60Co với liều lượng là 0.023 Gy s_

- Siêu âm trong dung dịch Phương pháp này cũng dễ dàng thu được chitosan phân tử lượng thấp phụ thuộc vào tần số của sóng siêu âm sử dụng

Nguyễn Ngọc Duy, 2011 đã kết hợp phương pháp vật lý và hóa học khi cho thủy phân chitosan bằng tia gamma trong môi trường có bổ sung H2O2 và thu được olygochitosan có khối lượng phân tử thấp (5 – 10kDa) [38]

1.2.1.4 Cơ chế cắt mạch chitosan bằng H 2 O 2 [22, 23, 32]

Trong quá trình thủy phân chitosan bằng hydroperoxit, liên kiết glucoside trong chuỗi polysaccharide bị bẻ gẫy, làm giảm trọng lượng phân tử của chitosan

Quá trình cắt mạch chitosan diễn ra qua một loạt các phản ứng hóa học Chitosan

ưu tiên nhận thêm một proton (tức cation H+) do H2O2 sinh ra để ion hóa nhóm - NH2

+

+ HOO- (3) Nồng độ ion H+ giảm dần làm tăng pH trong suốt quá trình thủy phân

Thêm vào đó anion hydroperoxit (HOO-) rất linh động, dễ dàng phân phủy tạo

ra gốc tự do HO*, O* và nhóm - OH-, điều đó có nghĩa H2O2 bị phân hủy liên tục Quá trình diễn ra theo phản ứng sau:

HOO− → OH− + O* (4)

H2O2 + HOO− → HO* + O2

*

+ H2O (5) Gốc hydroxyl có khả năng oxy hóa rất mạnh, nó phản ứng với carbohydrates rất nhanh Gốc tự do HO* lấy hydro nguyên tử của mạch phân tử chitosan Đồng thời nước được hình thành, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân, cho ra glucosamine (GlcN)

Phản ứng diễn ra như sau:

(GlcN)m − (GlcN)n + HO*→ (GlcN.)m − (GlcN)n + H2O (6) (GlcN.)m− (GlcN)n + H2O→ (GlcN)m + (GlcN)n (7)

Trong quá trình phản ứng, cấu trúc chitosan không thay đổi Mạch ngắn lại do

liên kết glucoside1,4 bị cắt đứt

Toàn bộ quá trình cắt mạch chitosan được mô tả trên Hình 1.4

Phân tích cơ chế cắt mạch trên đây cho thấy: Hoàn toàn có thể trực tiếp tiến

hành cắt mạch chitosan rắn ở dạng bột mịn, bằng H2O2 mà không cần hòa tan chitosan

trong dung dịch acid Giả thuyết trên đã được kiểm định Tác giả đã thực hiện thành

công vào tháng 04 năm 2012 tại Trường Đại học Nha Trang

Hình 1.4 Minh họa cơ chế cắt mạch chitosan bằng H2O2 [20]

(a) Quá trình phá vỡ cấu trúc kết tinh, (b) Quá trình phân cắt phần không kết tinh

Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng cắt mạch

Phản ứng cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit phụ thuộc vào nhiều yếu tố

Đáng kể nhất là: kích thước nguyên liệu, nồng độ H2O2, DD nhiệt độ và thời gian

thủy phân

- Ảnh hưởng của nồng độ hydroperoxit

Nghiên cứu của Tian, 2004 [23] chỉ ra rằng trọng lượng phân tử của sản phẩm

thủy phân chitosan giảm dần khi nồng độ H2O2 tăng Một lượng nhỏ H2O2 cũng có thể

làm giảm trọng lượng phân tử của chitosan Khi điều kiện phản ứng được giữ không

đổi, nồng độ H2O2 càng cao thì trọng lượng phân tử càng giảm

Ở nồng độ hydroperoxit lớn hơn 0,5M sản phẩm tạo thành có thể coi là chitosan

có trọng lượng phân tử thấp

- Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý

Cũng theo Tian và cộng sự, 2004 tốc độ cắt mạch chitosan tăng mạnh khi nhiệt

độ và thời gian tăng lên Chitosan phân tử lượng thấp đạt được khi thủy phân ở nhiệt

độ (40 – 70)oC sau 3 giờ [23]

Quan hệ giữa khối lượng phân tử chitosan được tạo ra với thời gian xử lý của các loại chitosan ban đầu khác nhau nêu ở đồ thị trên Hình 1.5

Thời gian (giờ)

Hình 1.5 Ảnhhưởng của thời gian vàDDđến khả năng cắt mạchchitosan

của H2O2 [23]

- Ảnh hưởng của loại chitosan

Các loại chitosan khác nhau bị thủy phân khác nhau bởi H2O2

Nghiên cứu của Tian, 2004 thể hiện ở Hình 1.5 cho thấy: Chitosan có DD càng cao thì tốc độ thủy phân càng nhanh và quá trình thủy phân càng triệt để

Ngoài các yếu tố trên, tốc độ và hiệu quả của phản ứng cắt mạch chitosan còn phụ thuộc vào môi trường phản ứng Trong môi trường H+ hoặc OH-, H2O2 có tác động mạnh với chitosan, hơn là khi nó đứng một mình

Hydroperoxit đã được sử dụng để thủy phân chitosan còn vì dễ thao tác, rẻ tiền

và thân thiện với môi trường [6]

Kỹ thuật này dựa vào sự hình thành các gốc tự do, có khả năng tấn công vào liên kết β - D - (1 - 4) glucoside của chitosan

Thông thường, việc oxi hoá chitosan bằng H2O2 xảy ra trong pha đồng nhất (khi chitosan được hòa tan trong môi trường acid) Tuy nhiên, quá trình này cũng có thể được thực hiện khi chitosan ở trạng thái không đồng nhất [28] Như vậy, tránh được việc sử dụng acid để chuyển chitosan từ trạng thái rắn sang trạng thái lỏng trước khi thủy phân, giảm thiểu ô nhiễm môi trường

1.2.2 Nghiên cứu tạo chitosan phân tử lượng thấp ở Việt Nam

Hiện nay nhiều cơ sở khoa học của Việt Nam đang nghiên cứu sản xuất chitosan như: Trường Đại học Nha Trang, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu polymer - Viện khoa học Việt Nam, Viện Hoá thuộc Viện khoa học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ và Sinh học Thủy sản - Viện Nghiên cứu Môi trường Thuỷ sản 2,…

Gần đây, Đại học Nha Trang đã công bố nhiều quy trình sản xuất chitosan theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý và những nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme [6, 11]

Đáng kể nhất là các công trình của GS Trần Thị Luyến và các cộng sự, 2006

đã nghiên cứu sản xuất COS bằng HCl Sản phẩm thu được có màu sắc trắng, đẹp và chất lượng tốt

- Cũng năm 2006, GS Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất COS có nguồn gốc

từ chitin, chitosan bằng enzyme papain, hemicellulose, enzyme cellulase từ xạ khuẩn [11]

Theo tác giả Trần Thị Luyến khi dùng enzyme papain chiết rút từ đu đủ xanh, kết quả thu được 95% COS từ chitosan Khi dùng enzyme thương phẩm thì thu được 97% COS

Khi dùng enzyme hemicellulose thương phẩm, kết quả thu được 88,9% COS từ chitosan và 86,7% COS từ chitin

Khi dùng enzyme cellulase từ xạ khuẩn [11] sẽ thu được 52,6% COS từ chitosan

và 45,6% COS từ chitin

Đỗ Thị Liền (2008), đã nghiên cứu cắt mạch chitosan trong dung dịch acid acetic bằng hydroperoxit (H2O2) [6] Tác giả Đỗ Thị Liền đã sản xuất thử nghiệm

thành công 9 sản phẩm chitosan ngắn mạch Bảng 1.1 là loại chitosan, các chế độ cắt mạch và độ nhớt của sản phẩm chitosan ngắn mạch, do tác giả Liền chế tạo được

Thời gian (giờ)

Nồng độ

H2O2(%)

Nhiệt

độ (oC)

Thời gian (giờ)

Nồng độ

H2O2(%)

Nhiệt

độ (oC)

Thời gian (giờ)

về phương diện định lượng thì chưa đủ

Hơn nữa, việc dùng acid để pha loãng dung dịch chitosan sẽ ảnh hưởng đến môi trường Công đoạn tách, tinh sạch sản phẩm là rất khó khăn và tốn kém

Phân tích cơ chế cắt mạch chitosan như đã trình bày ở Hình 1.4, cho thấy: Có thể trực tiếp cắt mạch chitosan rắn ở dạng bột mịn, bằng H2O2 mà không cần hòa tan chitosan trong dung dịch acid acetic

1.3 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN PHÂN

TỬ LƯỢNG THẤP

1.3.1 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và gây hại của vi sinh vật [12, 14]

Hiểu biết về vi sinh vật (VSV) nói chung, về loại có hại nói riêng và những biện pháp khống chế, tiêu diệt chúng, hiện có, là rất phong phú

VSV sống trong đất, không khí, nước và ở ngay trong động, thực vật ở cả ba vùng nước: Mặn, lợ, ngọt, Đương nhiên, chúng có cả ở các sản phẩm thủy sản đang sống, sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản

Độ nhớt

(mPa/s)

Chế độ

cắt mạch

Chẳng hạn, ở cá, chúng có tại các túi vẩy, trên toàn bề mặt ngoài da, khoảng (102 - 107) CFU/cm2; có trong ruột cá, khoảng (103 - 109) CFU/g

Tốc độ phát triển của VSV rất cao Chẳng hạn, với S aureus trong sữa,

cá, thịt, xấp xỉ 200.000 lần trong một giây Ở 37oC, cứ khoảng (8 - 9) phút chủng

V parahaemolycus lại sinh thêm một thế hệ Sau 24 giờ có thể có 400 tấn

Sau đây là đặc điểm sinh trưởng và phát triển của một số VSV gây bệnh:

1.3.1.1 Escherichia coli (E coli)

E coli là trực khuẩn Gram (-), hiếu khí, phổ biến nhất trong ruột người và động

vật máu nóng Chúng chiếm tới 80% vi khuẩn hiếu khí sống ở ruột Bình thường

chúng không gây bệnh E coli có lợi cho đường ruột nhờ hạn chế được một số vi

khuẩn gây bệnh khác, giữ thế cân bằng sinh thái trong ruột và sinh tổng hợp một số vitamin

E coli có dạng hình que, hai đầu tròn, kích thước khoảng (2 - 3μm) x 0,5μm

Có tiêm mao mọc khắp bề mặt và có khả năng di động Không có khả năng hình thành

bào tử E coli dễ mọc được trên môi trường hiếu khí cũng như kị khí Có thể sống ở

nhiệt độ từ (5 – 40)oC, pH từ 5,5 – 8,0, nhưng thích hợp nhất là ở 37oC và pH trong khoảng 7 – 7,2 Có thể phát triển ở điều kiện hoạt độ của nước (aw) là 0,91 Trên môi trường thạch thường có khuẩn lạc dạng S (nhẵn, bóng, bờ đều), đôi khi hình thành khuẩn lạc dạng R (nhăn nheo) hoặc dạng M (nhày) Khuẩn lạc thường có màu xám, đục

E coli sinh nội độc tố chịu nhiệt Bình thường E coli sống trong ruột không

gây bệnh nhưng khi cơ thể suy yếu E coli không những gây ra các bệnh ở đường ruột

như: Ỉa chảy, kiết lị mà còn có thể gây một số bệnh khác như viêm đường tiết niệu,

viêm gan, viêm phế quản, viêm màng phổi Tuy nhiên, E coli dễ bị tiêu diệt bằng

các thuốc sát trùng thông thường và bị tiêu diệt ở 60oC trong 30 phút

1.3.1.2 Staphylococcus aureus

S aureus thuộc họ Micrococceae là chủng tụ cầu khuẩn hiếu khí tùy nghi,

Gram (+), thường kết thành dạng chùm Đường kính tế bào (0,5 ÷ 1)µm Không tạo bào tử, không di động, ưa mặn, có thể phát triển ở nồng độ muối (7 ÷ 15)%

S aureus là chủng vi khuẩn có sức sống tương đối mạnh Ở nhiệt độ 37oC sau 24h trong môi trường sữa, khối lượng của nó tăng lên 190.000 lần, trên thịt tăng

184.000 lần còn trên cá 195.000 S aureus chịu được sự thay đổi của môi trường và có

thể phát triển ở điều kiện hoạt độ của nước (aw) thấp tới 0,85 S aureus phát triển

mạnh nhất ở pH 7,0 – 7,5, có thể chịu được pH thấp nhất là 4,2 và cao nhất là 9,3, nhiệt độ tối thích 30 – 37°C, có thể chịu được 70°C

Sự nguy hiểm của S aureus ở chỗ nó có mặt phổ biến mọi nơi, thường thấy trên

da, xoang mũi, mắt, các vết thương, móng tay, kẽ tay, tóc,… ở người (đây chính là nguồn lây nhiễm quan trọng nhất vào thực phẩm) Khi phát triển trong thực phẩm,

S aureus có khả năng sinh một loại độc tố protein phân tử lượng thấp (30.000 dalton)

gọi là độc tố đường ruột của Staphylococcus (A, B, C1,C2, C3, D và E) Các độc tố

này thuộc loại chịu nhiệt, một khi đã hình thành trong thực phẩm, việc đun sôi rất khó phá huỷ được chúng Nhiệt độ sôi thì phải đến 2h hoặc 120°C cũng phải đến 20 phút mới phá hủy được các độc tố này Đặc biệt ở nhiệt độ thấp nó vẫn giữ được độc tính sau 2 tháng

S aureus gây bệnh mụn nhọt và gây chứng ngộ độc ở dạ dày, ruột Những triệu

chứng phổ biến thường xảy ra từ 2 - 4 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm là: Nôn mửa, đau thắt bụng, đôi khi cả tiêu chảy Các triệu chứng này thường kéo dài không quá

24 giờ Nạn nhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội, trong một số trường hợp nghiêm trọng hiện tượng mất nước có thể dẫn tới sốc và suy sụp

Nguy cơ bị nhiễm S aureus cao ở những thức ăn đã nấu chín, sản phẩm muối, thực

phẩm ăn liền đặc biệt là các sản phẩm từ cá, thịt, trứng như cá khô, cá hun khói,

pho mát, bơ, Chỉ cần 4 giờ ở nhiệt độ phòng, S aureus cũng tạo ra một lượng độc tố

đủ gây tai họa

Trên môi trường nuôi cấy TSA (Tryptone Soya Agar), S aureus tạo khuẩn lạc

tròn, bờ đều, màu vàng

Là VSV ưa áp: Có thể sinh trưởng trong một phạm vi rộng về hoạt tính của nước và nồng độ thẩm thấu

1.3.1.3 Salmonella

Salmonella thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột Chúng sinh sống trong

đường ruột của người và một số động vật

Gram (-), hình que ngắn, kích thước trung bình khoảng (1 - 3) x 0,5 micromet,

không có khả năng hình thành bào tử và giáp mạc Có nhiều tiêm mao quanh tế bào,

có khả năng di động

Dễ nuôi cấy, mọc tốt ở các môi trường thông thường, mọc được ở điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí Phát triển tốt ở nhiệt độ 37oC và pH trung tính Trên khuẩn lạc thường tạo khuẩn lạc dạng D đôi khi có dạng R, kích thước khuẩn lạc thường lớn (2 – 4mm), khuẩn lạc có màu trắng đục

Salmonella có sức đề kháng tốt, có thể sống ở môi trường ngoài cơ thể trong

thời gian lâu Trong đất hoặc nước có thể sống được 2 – 3 tuần, trong nước đá tồn tại

2 – 3 tháng, tồn tại được ở nhiệt độ 100oC trong 5 phút mới bị tiêu diệt, ở nhiệt độ

60oC sống được (10 – 20) phút

Salmonella là nguyên nhân gây bệnh thương hàn, phó thương hàn, ỉa chảy và

bệnh nhiễm độc do ăn uống

Listeria monocytogenes gây bệnh ở súc vật, có thể truyền sang người

Trong bệnh phẩm, chúng nằm trong tế bào, có hình thể to và ngắn Trong môi trường nuôi cấy chúng thường xếp như hàng rào và có hình thể dài hơn

L monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh Chúng được thấy trong cát,

nước, trong phân súc vật và cả trong phân người, rau cải, salade và có thể bị nhiễm từ nước bẩn và từ phân gia súc

Con người có thể bị nhiễm khuẩn L monocytogenes nếu có sự tiếp xúc trực tiếp với thú có mang vi khuẩn này Các bà mẹ nếu bị nhiễm L monocytogenes trong thời

gian mang thai có thể sinh ra hài nhi bị bệnh listeriosis với một loạt các triệu chứng bao gồm tiêu chảy nhẹ, viêm màng não, và nhiễm trùng huyết

1.3.2 Sử dụng chitosan và chitosan phân tử lượng thấp để diệt khuẩn

1.3.2.1 Đặc tính, cơ chế và nhân tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan

Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic (pH < 6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (- NH2) Do vậy nó có tính kháng nấm, kháng khuẩn cao [42]

Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể

Nhờ hai tính chất trên đây, chitosan được ứng dụng nhiều trong Công nghệ Thực phẩm; trước hết là ngăn chặn và diệt khuẩn có hại trong lĩnh vực này

Thực phẩm lạnh, đông và đã qua xử lý nhiệt trong bảo quản, không ngon bằng thực phẩm tươi Kháng khuẩn bằng hai phương pháp truyền thống là lạnh, lạnh đông, và nhiệt độ cao , không thực hiện được đối với thực phẩm tươi

Kháng khuẩn bằng chitosan khắc phục được nhược điểm của các phương pháp trên để có thực phẩm tươi

Mười lăm năm qua, thế giới và ngay ở Việt Nam, người ta đã sử dụng chitosan

để diệt vi khuẩn và nấm mốc cho thực phẩm ở nhiệt độ bình thường, cho mục đích trên

Từ kết quả nghiên cứu và áp dụng trong thực tiễn, người ta đã nêu ra đặc điểm,

cơ chế và những nhân tố ảnh hưởng tới khả năng kháng khuẩn và nấm mốc của chitosan Có thể tóm tắt như sau:

a) Đặc tính kháng khuẩn của chitosan

Chitosan và dẫn xuất của nó thể hiện đặc tính kháng khuẩn khá cao đối với

vi khuẩn và nấm mốc

b) Cơ chế kháng khuẩn của chitosan

Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ về khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào và khả năng khuếch tán vào trong nội bào vi sinh vật [19, 24, 26, 49]

Người ta giải thích cơ chế kháng khuẩn của chitosan theo hai hướng kể trên

như sau:

- Nhờ tác dụng của những nhóm - NH3

+

trong chitosan lên các vị trí mang điện

âm ở trên màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào Quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng Lúc này, vi sinh vật không thể nhận các chất dinh dưỡng cơ bản (như glucose) cho sự phát triển bình thường, dẫn đến mất cân bằng giữa bên trong và bên ngoài màng tế bào, làm cho tế bào chết

Nói cách khác: Chính sự liên kết giữa polycation chitosan với polyme mang tính axit (polyanion) trên bề mặt tế bào vi sinh vật, tạo nên polyelectrolic (trung hòa điện) đã gây khó khăn trong quá trình trao đổi chất cho vi khuẩn

- Chitosan có thể cản trở và làm mất cân bằng sự phát triển của vi sinh vật do có khả năng lấy đi các ion kim lọai đóng vai trò quan trọng trong thành phần enzyme như

Cu2+, Co2+, Cd2+… của tế bào vi sinh vật do sự tạo phức với nhóm - NH2 có trong phân

tử chitosan đồng thời các nhóm này có thể tác dụng với các nhóm anion của bề mặt thành tế bào Như vậy, vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến các ion quan trọng

- Chitosan có khả năng phá hủy màng tế bào thông qua tương tác của nhóm

Có thể kiểm chứng giả thuyết này bằng chitosan có phân tử lượng lớn hơn, và chitosan có phân tử lượng thấp hơn, khác nhau, trên các loại vi khuẩn khác nhau, Gram (-) và Gram (+)

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan

Nhiều nghiên cứu cho rằng chitosan có khả năng kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào các yếu tố sau:

a) Khối lượng phân tử chitosan

Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng khối lượng phân tử ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan Chitosan có khối lượng phân tử nhỏ thì dễ dàng

khuếch tán qua màng tế bào, và ảnh hưởng đến các quá trình sinh hóa của vi sinh vật

và ức chế khả năng phát triển của vi sinh vật Một số nghiên cứu này cũng chỉ ra chitosan có khối lượng phân tử thấp hơn 2,2 kDa không có khả năng ngăn chặn sự phát triển của VSV Nhưng COS có KLPT từ (5 – 27) kDa có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật tùy thuộc vào nồng độ sử dụng Với chitosan có KLPT lớn hơn 30 kDa ít được dùng là tác nhân ức chế vi sinh vật do nó không hòa tan trong nước ở pH trung tính [33]

No và cộng sự, 2002 [25] cho rằng khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào khối lượng phân tử, độ deacetyl, nồng độ chitosan và pH của dung môi hòa tan chitosan KLPT của chitosan càng cao thì khảng năng kháng khuẩn càng tốt Nồng

độ nhỏ nhất của các chitosan có thể ức chế vi sinh vật được thể hiện trong Bảng 1.2: Bảng1.2 Nồngđộ nhỏ nhất củachitosan(%)ứcchế 11 chủng VSV khác nhau [25]

Mw (kDa) Các chủng vi sinh vật

1671 1106 746 470 224 28

Escherichia coli 0,11 >0,1 0,08 0,08 0,1 >0,1

Pseudomonas fluorescens 0,1 >0,1 0,08 0,08 0,08 0,1

Salmonella typhimurium >0,1 >0,1 >0,1 0,08 0,1 >0,1 Gram (-)

các chitosan có KLPT: 5, 48, 72, 129 kDa, đã chỉ ra rằng chitosan có KLPT càng lớn

thì khả năng kháng S aureus càng tốt Ngược lại với E coli, chitosan có khối lượng phân tử càng cao thì khả năng kháng E coli càng kém

Liu và cộng sự, 2006 [37] cho rằng: Trong dải khối lượng phân tử từ 5,5 x104 – 15,5x 104 Da, KLPT chitosan càng thấp thì khả năng kháng E coli càng cao

và ngược lại Trước đó, một vài nghiên cứu lại cho rằng chitosan có khối lượng phân

tử < 2,2kDa ít ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật Tóm lại, nếu khối lượng phân tử chitosan quá thấp hay quá cao thì hiệu quả kháng khuẩn sẽ không cao

b) Nồng độ chitosan

Liu và cộng sự, 2005 đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ của chitosan đến khả năng kháng khuẩn Ở nồng độ 50ppm chitosan đã ức chế một phần sự phát triển

của E coli, khi tăng nồng độ chitosan lên 200ppm, E coli bị tiêu diệt gần hết Nồng

độ chitosan > 500ppm, toàn bộ E coli bị ức chế

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng nồng độ chitosan là một trong các yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả kháng khuẩn Nồng độ chitosan càng cao thì khả năng kháng khuẩn càng tốt [19, 25]

c) Thời gian xử lý của chitosan

Nhiều nghiên cứu trên Thế giới chỉ ra rằng: Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào thời gian xử lý Thời gian xử lý phải đạt một giá trị nhất định, nếu thời gian

xử lý ngắn, chitosan chưa thể khuếch tán vào trong tế bào vi sinh vật và hình thành những tương tác cần thiết để ức chế hoạt động sống của VSV

Choi và cộng sự, 2001 [19] đã quan sát tế bào vi sinh vật dưới kính hiển vi khi không xử lý COS và có xử lý COS sau thời gian 30 phút (Hình 1.6) để chứng minh rằng thời gian tác dụng của chitosan phải đủ lớn thì VSV mới bị tiêu diệt

Hình1.6.Hình ảnhcủavi sinh vậttrước(A)vàsau khi xử lýchitosan 30phút (B) [19]

Sau đó Chung và cộng sự, 2004 [49] cũng nghiên cứu mức độ hấp phụ chitosan

lên tế bào E coli theo thời gian Ông thấy rằng sau 3 – 4 giờ, sự hấp phụ chitosan lên

tế bào E coli mới đạt trạng thái cân bằng ổn định Lúc này ảnh hưởng của chitosan đối

với VSV gần như là lớn nhất Nếu tiếp tục tăng thời gian tác dụng, khả năng kháng khuẩn gần như không tăng Điều này chứng tỏ thời gian xử lý chitosan là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ức chế VSV của chitosan

d) Loại vi sinh vật

Nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng ức chế của vi khuẩn Gram (-) tốt hơn

vi khuẩn Gram (+) Kết luận này được các Nhà nghiên cứu giải thích dựa trên sự khác nhau về cấu tạo màng tế bào vi khuẩn

Chung, 2004 chỉ ra rằng mật độ điện tích (+) trên vi khuẩn Gram (+) lớn hơn vi khuẩn Gram (-) Điều này cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp phụ chitosan lên bề mặt vi khuẩn [49]

Jiang và cộng sự, 1997 cũng so sánh khả năng kháng khuẩn của chitosan đối

với vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Nghiên cứu cho rằng màng tế bào của S aureus (Gram dương) yếu và dễ phá hủy, trong khi tế bào chất của E coli (Gram âm) đặc và

màng tế bào có nhiều kẽ hở lớn Do đó, ảnh hưởng của chitosan lên các vi sinh vật khác nhau là khác nhau và cũng có thể dựa trên những cơ chế khác nhau [33]

e) Độ deacetyl (DD)

DD của chitosan thể hiện hàm lượng nhóm –NH2 trong phân tử chitosan Từ các cơ chế kháng khuẩn đã được trình bày ở phần trên, ta nhận thấy: Nhóm -NH2 ảnh hưởng rất lớn đến khẳ năng kháng khuẩn của chitosan DD càng cao thì khả năng kháng khuẩn càng tốt

Liu, 2000 nghiên cứu ảnh hưởng của DD (74 - 96)% đến khả năng kháng khuẩn Ông cũng cho rằng DD tăng thì khả năng kháng khuẩn tăng Do mật độ nhóm -NH2 tăng sẽ làm tăng nồng độ nhóm – NH3

+

, các nhóm - NH3

+

liên kết mới các nhóm chức mang điện tích âm trên bề mặt tế bào VSV, từ đó ức chế khả năng phát triển của VSV [47]

f) pH môi trường [44]

pH có ảnh hưởng đến sự ion hóa của nhóm – NH2 trên phân tử chitosan thành nhóm - NH3+, pH càng thấp thì mức độ ion hóa nhóm –NH2 càng cao, mức độ ion hóa của nhóm –NH2 càng cao thì khả năng kháng khuẩn càng lớn

Chung và cộng sự, 2003 [48] chỉ ra rằng: pH càng thấp thì khả năng kháng

E coli và S aureus càng tốt, trong đó pH = 4 thì khả năng hấp phụ chitosan lên bề mặt

tế bào vi khuẩn tốt hơn pH = 5, nên khả năng kháng khuẩn cũng tốt hơn Với

pH > 6 mức độ ảnh hưởng là là không đáng kể (Hình 1.7)

Hình 1.7 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan [48]

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng: pH dung dịch càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng lớn (Jung, 1998; No, 2001, Chung, 2004)

g) Một số tác nhân khác

Dung môi hòa tan chitosan và các hợp chất bổ sung có thể tăng cường hiệu quả kháng khuẩn của chitosan Một số nghiên cứu cho thấy xu hướng làm tăng kháng khuẩn của dung dịch chitosan nếu dùng các dung môi là acid citric, lactic và acetic [49]

Ngoài ra hiệu quả kháng khuẩn của chitosan còn phụ thuộc vào số lượng vi sinh vật trong thực phẩm và thời kỳ sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật [20]

Sự có mặt của ion kim loại trong dung dịch chitosan làm giảm khả năng ức chế

vi sinh vật của chitosan Điều này có thể giải thích dựa vào cơ chế kháng khuẩn và cấu tạo của chitosan

Chung, 2004 [49] cũng nghiên cứu ảnh hưởng của các ion Mg2+, Ca2+, Ba2+,

Zn2+ đến khả năng kháng khuẩn của chitosan Trong đó, mức độ làm giảm hoạt tính kháng khuẩn theo thứ tự sau: Zn2+ > Ba2+ > Ca2+ > Mg2+

Ngoài ra, sự có mặt của EDTA cũng ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan Sự có mặt của EDTA làm tăng khả năng kháng khuẩn của chitosan Kết luận này được thể hiện ở Hình 1.8

Thời gian tác dụng (giờ)

Thời gian tác dụng (giờ)

Hình 1.8: Ảnh hưởng của EDTA đến khả năng kháng E coli (A)

và S aureus (B) của chitosan [49]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Chitosan

Chitosan được sản xuất tại Đại học Nha Trang sử dụng làm nguyên liệu ban đầu

có các chỉ tiêu chất lượng như sau:

- Acid acetic (CH3COOH) 99%

- Muối Natriclorua (NaCl) tinh khiết

- Acetone 99%

Các hóa chất trên là hóa chất phân tích, có xuất xứ từ Trung Quốc

2.1.4 Vi sinh vật

- Vi khuẩn Gram (-): E coli, Salmonella typhi

- Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes cung cấp

bởi Bộ môn Hóa - Vi sinh - Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Thuyết minh:

Chitosan được nghiền đến các kích thước nghiên cứu Cân 5g chitosan (khối lượng khô tuyệt đối) cho vào bình tam giác 250ml, bổ sung H2O2 ở các nồng độ nghiên cứu với tỉ lệ H2O2/chitosan là 20/1(v/w), khuấy đảo và rửa ở các nhiệt độ và thời gian nghiên cứu Sau khi thủy phân xong, hỗn hợp đem lọc, phần đặc được đưa đi sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC, cho đến khi độ ẩm đạt (11 – 12)%, được các phân tử chitosan

có phân tử lượng thấp Sản phẩm này đưa đi xác định độ nhớt nội và KLPT

Phản ứng cắt mạch bằng H2O2 phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: Nồng độ

H2O2, độ deacetyl (DD) của chitosan, nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất chitosan, kích thước nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian phản ứng Tuy vậy, DD, nồng độ H2O2, nhiệt độ và thời gian phản ứng cắt mạch đóng vai trò quan trọng hơn cả

2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitosan, nồng độ H2O2, nhiệt

độ và thời gian phản ứng cắt mạch chitosan trạng thái rắn

2.2.2.1 Ảnh hưởng của kích thước chitosan nguyên liệu đến khả năng cắt mạch chitosan

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitosan thích hợp

a) Mục đích thí nghiệm: Xác định được kích thước chitosan nguyên liệu thích hợp để thu được chitosan có khối lượng phân tử thấp

bể ổn nhiệt, giữ ở nhiệt độ 35oC, trong thời gian 3h

Sau khi thủy phân xong, mẫu được đưa đi lọc thu phần đặc, rửa phần đặc qua nước cất và đưa đi sấy ở nhiệt độ (35 – 40)oC, cho đến khi độ ẩm đạt (10 – 11)% thì dừng quá trình sấy, ta thu được chitosan sản phẩm

Đưa sản phẩm đi xác định độ nhớt nội trên thiết bị AVS 470 Tính được khối lượng phân tử sản phẩm chitosan Căn cứ vào khối lượng phân tử chitosan, chọn được kích thước chitosan nguyên liệu thích hợp

2.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ H 2 O 2 đến khả năng cắt mạch chitosan

Xác định khối lượng phân tử của chitosan

a) Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ H2O2 thích hợp thủy phân chitosan trạng thái rắn để thu được chitosan có khối lượng phân tử thấp

Đưa sản phẩm đi xác định độ nhớt nội trên thiết bị AVS 470 Tính được khối lượng phân tử sản phẩm chitosan Căn cứ vào khối lượng phân tử chitosan, chọn được nồng độ H2O2 thích hợp

2.2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến khả năng cắt mạch chitosan

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp

Xác định khối lượng phân tử của chitosan

40oC

Chitosan

Cắt mạch bằng H2O2 với các nhiệt độ khác nhau trong thời gian 3h

Chọn nhiệt nhiệt độ thủy phân bằng H2O2 thích hợp

30oC

Lọc, rửa, sấy Nghiền nhỏ đến kích thước đã xác định được ở trên

a) Mục đích thí nghiệm: Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu được chitosan có khối lượng phân tử thấp

Sau khi thủy phân xong, mẫu được đưa đi lọc thu phần đặc, rửa phần đặc qua nước cất và đưa đi sấy ở nhiệt độ (35 – 40)oC, cho đến khi độ ẩm đạt (10 – 11)% thì dừng quá trình sấy, ta thu được chitosan thành phẩm

Đưa sản phẩm đi xác định độ nhớt nội trên thiết bị AVS 470 Tính được khối lượng phân tử sản phẩm chitosan Căn cứ vào khối lượng phân tử chitosan, chọn được nồng độ H2O2 thích hợp

2.2.2.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng cắt mạch chitosan

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp

Xác định khối lượng phân tử chitosan

a) Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian thủy phân thích hợp để thu được chitosan có khối lượng phân tử thấp

b) Tiến hành thí nghiệm:

Cân 5 gam chitosan dạng bột, đưa vào bình tam giác 250ml, bổ sung H2O2, tỉ lệ chitosan/ H2O2 = 1/20 (w/v) Các mẫu này được đưa vào bể ổn nhiệt, giữ ở nhiệt độ đã xác định, trong dải thời gian (1; 2; 3; 4; 5)h

Sau khi thủy phân xong, mẫu được đưa đi lọc thu phần đặc, rửa phần đặc qua nước cất và đưa đi sấy ở nhiệt độ (35 – 40)oC, cho đến khi độ ẩm đạt (10 – 11)% thì dừng quá trình sấy, ta thu được chitosan sản phẩm

Đưa sản phẩm đi xác định độ nhớt nội trên thiết bị AVS 470 Tính được khối lượng phân tử sản phẩm chitosan Căn cứ vào khối lượng phân tử chitosan, chọn được nồng độ H2O2 thích hợp

Sau khi xác định được các thông số kỹ thuật của công đoạn thủy phân, tác giả tiến hành sản xuất chitosan phân tử lượng thấp theo qui trình đề xuất và tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm đối với một số chủng vi sinh vật

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan [12, 19]

Dịch huyền phù chứa vi khuẩn

Pha loãng trong nước muối sinh lý

Cấy chuyển dịch pha loãng vi khuẩn vào môi trường chứa chitosan, chitosan PTLT đã

chuẩn bị sẵn với các nồng độ nghiên cứu

Ủ ở nhiệt độ phòng/ 90 phút, 120 và 180 phút

Cấy trên môi trường TSA và ủ trong 24h rồi đọc kết quả

Thảo luận và kết luận

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thínghiệmkiểm trahoạttính kháng khuẩn của chitosan

và chitosan PTLT