nghiên cứu phân lập hệ vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao

Quá trình lên men hạt ca cao ở nước ta còn được thực hiện theo phương pháp thủ công, chủ yếu là dựa vào kinh nghiệm, chưa có nghiên cứu hệ thống về hệ vi sinh vật trong quá trình lên men

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Võ Thị Mỹ Lộc

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

Cô TS Mai Thị Tuyết Nga và Thầy TS Nguyễn Minh Trí đã động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Các thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học cao học

Các thầy cô trong hội đồng bảo vệ đề cương luận văn đã có những ý kiến đóng góp quý báu cho em

Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Võ Thị Mỹ Lộc

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC ……….iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Tính khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1 Tổng quan về ca cao 3

1.1 Tên khoa học 3

1.2 Đặc điểm, hình dạng của cây và quả ca cao 3

1.3 Các giống ca cao 4

1.4 Tình hình trồng ca cao ở Việt Nam 5

2 Tổng quan về phương pháp lên men ca cao 6

2.1 Lên men trên nền khô 6

2.2 Lên men thành đống 7

2.3 Lên men trong rổ 8

2.4 Lên men trong thùng 8

3 Tổng quan về vi sinh vật trong lên men ca cao 9

3.1 Nấm men 11

3.2 Vi khuẩn acetic 15

3.3 Vi khuẩn lactic 16

4 Biến đổi sinh hóa trong lên men ca cao 19

4.1 Cấu tạo hạt ca cao 19

4.2 Biến đổi về nhiệt độ của khối lên men 19

4.3 Biến đổi pH của khối lên men 20

4.4 Biến đổi sinh hóa 20

1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 28

2.2 Xác định thành phần hóa học ban đầu của nguyên liệu 29

2.3 Đánh giá chất lượng hạt ca cao 29

2.4 Tiến hành đếm và phân lập các chủng vi sinh từ ca cao lên men 30

2.5 Định danh các chủng vi sinh bằng phương pháp giải trình tự gen 32

2.6 Xử lý số liệu và vẽ đồ thị 32

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

1 Chất lượng hạt ca cao sau lên men 33

2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của ca cao trước khi lên men 37

3 Kết quả nghiên cứu sự biến đổi nhiệt độ, pH của các mẫu trong quá trình lên men 41

3.1 So sánh sự biến đổi nhiệt độ của 12 mẫu nghiên cứu 41

3.2 So sánh sự biến đổi pH của 12 mẫu nghiên cứu trong quá trình lên men 44

4 So sánh sự biến đổi số lượng các nhóm vi sinh trong quá trình lên men của 12 mẫu lên men 47

4.1 So sánh sự biến đổi số lượng của nấm men trong quá trình lên men ca cao tự nhiên của 12 mẫu lên men 47

4.2 So sánh sự biến đổi số lượng của vi khuẩn acetic trong quá trình lên men ca cao tự nhiên của 12 mẫu nghiên cứu 49

4.3 So sánh sự biến đổi của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men ca cao tự nhiên của 12 mẫu nghiên cứu 52

5 Xác định đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy của nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic theo dõi trong quá trình lên men (mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12) 54

5.1 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy của nấm men có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca cao tự nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 55

5.2 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn acetic có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca cao tự nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 58

5.3 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn lactic có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca cao tự nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 61

5.4 Kết quả giải trình tự gen của các chủng vi sinh có số lượng chủ yếu phân

lập được trong quá trình lên men ca cao tự nhiên ở mẫu 12 63

5.4.1 Nấm men 63

5.3.2 Vi khuẩn acetic 65

5.3.3 Vi khuẩn lactic 67

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69

KẾT LUẬN 69

ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

I TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 70

II TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 70

III MỘT SỐ TRANG WEB 73

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các loài vi sinh vật phân lập được từ quá trình lên men ca cao 10 Bảng 1.2: Các loài vi sinh vật trong lên men hạt ca cao 13 Bảng 3.1 Bảng mô tả đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy của các chủng nấm men phân lập được trong quá trình lên men ca cao tự nhiên ở 3 mẫu 10, 11, 12 55 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái, và đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn acetic có

số lượng chủ yếu phân lập được trong 3 mẫu ca cao lên men tự nhiên 59 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái, và đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn lactic 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây ca cao, quả ca cao 4

Hình 1.2 Lên men ca cao bằng khay 7

Hình 1.3 Lên men thành đống 7

Hình 1.4 Lên men trong rổ 8

Hình 1.5: Lên men ca cao bằng thùng 9

Hình 1.6: Cấu tạo hạt ca cao [16] 19

Hình 1.7: Biến đổi sinh hóa và quá trình khuếch tán trong cơm nhầy và trong hạt trong quá trình lên men ca cao [16] 21

Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn % hạt lên men hoàn toàn của 12 mẫu lên men Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 33 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn % hạt lên men một phần của 12 mẫu lên men Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 34 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn % hạt dưới mức lên men của 12 mẫu lên men Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 35 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn % hạt không lên men của 12 mẫu lên men Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 36

Hình 3.5: Kết quả cắt hạt ca cao 37

Hình 3.6: Hàm lượng protein trong 12 mẫu lên men Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 38

Hình 3.7: Hàm lượng glucid trong 12 mẫu lên men Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 39

Hình 3.8: Hàm lượng nước của cơm nhầy trong 12 mẫu lên men Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 39

Hình 3.9: Tỷ lệ cơm/hạt của 12 mẫu lên men Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 40

Hình 3.10 Sự biến đổi nhiệt độ của các mẫu trong suốt quá trình lên men 41

Hình 3.11 Sự biến đổi pH của 12 mẫu nghiên cứu trong quá trình lên men 44

Hình 3.12 Sự biến đổi số lượng nấm men trong quá trình lên men 47

Hình 3.13Sự biến đổi số lượng vi khuẩn acetic của 12 mẫu nghiên cứu trong quá

trình lên men 50

Hình 3.14 Sự biến đổi số lượng vi khuẩn lactic của 12 mẫu nghiên cứu trong suốt quá trình lên men 52

Hình 3.15 Đặc điểm hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của nấm men 58

Hình 3.16 Hình thái dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của LA1 60

Hình 3.17 Hình thái tế bào của vi khuẩn lactic 62

Hình 3.18 Kết quả giải trình tự gen 28S của LN96hN2 (thuộc nhóm NM12.1) 63

Hình 3.19 Kết quả giải trình tự gen 28S của LN120hN1 (thuộc nhóm NM12.2) 63

Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn sự biến đổi số lượng của các chủng nấm men trong suốt quá trình lên men 64

Hình 3.21 Kết quả giải trình tự gen 16S của LA-24 h N4 (thuộc nhóm LA12.1) 65

Hình 3.22 Sự biến đổi số lượng vi khuẩn acetic trong quá trình lên men 66

Hình 3.23 Kết quả giải trình tự gen 16S của LL12.1 67

Hình 3.24 Sự biến đổi số lượng vi khuẩn lactic Lactobacillus fermentum (LL12.1)trong suốt quá trình lên men 67

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nước ta có khí hậu nhiệt đới với phát triển nông nghiệp là thế mạnh, bên cạnh đó điều kiện thiên nhiên cũng rất ưu đãi cho sự phát triển của cây công nghiệp

Để tận dụng tốt mọi tiềm lực phục vụ cho phát triển kinh tế, ngoài việc phát triển cây nông nghiệp nhà nước cũng rất chú trọng và quan tâm đến phát triển cây công nghiệp Ngoài những cây công nghiệp mang lại giá trị kinh tế lớn như cao su, tiêu,

cà phê thì cây ca cao cũng là cây đem lại giá trị kinh tế không nhỏ Nó được xem là một trong những cây công nghiệp có tiềm năng lớn đang được chính phủ quan tâm

và đầu tư

Với sản lượng 5.760 tấn hạt khô niên vụ 2010 -2011 [41], ca cao Việt Nam chỉ là “hạt bụi” so với những “đại gia” về ca cao như Bờ Biển Ngà hoặc Ghana với sản lượng cả triệu tấn mỗi năm Bên cạnh sản lượng thì chất lượng ca cao Việt Nam cũng là một vấn đề lớn cần chú ý Đối với các quốc gia trên, công nghiệp ca cao là một ngành truyền thống trong khi nước ta còn rất non trẻ Để thực hiện thành công định hướng của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, đưa cây ca cao trở thành cây công nghiệp quan trọng, mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển dịch trong cơ cấu cây trồng và tăng thu nhập cho nông dân thì cần phải chú ý nâng cao nhất lượng hạt ca cao sau lên men

Quá trình lên men hạt ca cao ở nước ta còn được thực hiện theo phương pháp thủ công, chủ yếu là dựa vào kinh nghiệm, chưa có nghiên cứu hệ thống về hệ vi sinh vật trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao và ứng dụng vào quá trình lên men, chất lượng hạt ca cao sau lên men không đồng đều, độ lên men thấp, mùi đặc trưng không rõ ràng, hạt ca cao bị nhiễm khói, có mùi lạ … trong khi đó diện tích

và sản lượng ca cao đang ngày càng gia tăng Vì vậy, việc nghiên cứu khảo sát hệ vi sinh vật trong quá trình lên men hạt ca cao, từ đó ứng dụng vào quá trình lên men nhằm ổn định chất lượng của hạt ca cao sau lên men là vấn đề cần thiết và có ý nghĩa quan trọng

Xuất phát từ thực tiễn trên, dưới sự hướng dẫn của TS Mai Thị Tuyết Nga

và TS Nguyễn Minh Trí, tôi đề xuất được thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập

hệ vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao”

2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu hệ vi sinh vật chính tham gia vào quá trình lên men tự nhiên hạt

ca cao, phân lập và định danh chúng

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập, định danh các chủng vi sinh vật chính trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao:

 Nghiên cứu phân lập và định danh các chủng nấm men chủ yếu

4 Tính khoa học và thực tiễn của đề tài

- Đề tài sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học về hệ vi sinh vật chính trong lên men tự nhiên hạt ca cao ở Việt Nam

- Đề tài cũng là bước khởi đầu phục vụ cho quá trình nghiên cứu chuyên sâu

về lĩnh vực này

Chi: Theobroma L - Theobroma

Loài: Theobroma cacao L – Cacao

(National Plant Database 2004.) [45]

1.2 Đặc điểm, hình dạng của cây và quả ca cao

Cây ca cao là loại cây rừng có nguồn gốc từ Châu Mỹ Nó là loại cây đa niên, chịu mát nhưng thích hợp với khí hậu nhiệt đới, các nước trồng nhiều như: Bờ biển Ngà, Ghana, Nigeria, Ecuador, Brazil, Malaysia, Philippines, đây là những

quốc gia nằm gần vùng xích đạo

Ca cao là cây có tán thuộc tầng trung bình, rễ chùm, sống dưới bóng những cây cổ thụ già, chiều cao của nó có thể đến 11 m Ca cao thích hợp với đất mùn xốp,

có mạch nước ngầm không quá sâu, độ cao không nên quá 700 m so với mực nước biển Nó là loại cây khá nhạy cảm với sự thay đổi đột ngột của nhiệt độ Nhiệt độ lý tưởng cho sự phát triển của cây ca cao là ban đêm không dưới 20 °C, ban ngày khoảng 30 °C Khi nhiệt độ xuống dưới 16 °C có thể dẫn tới tình trạng các mầm nụ non bị hư, gây mất mùa, thất thu

Cây có thể sống tới 15-20 năm, sau 3 năm cây bắt đầu ra hoa, kết trái và cho trái quanh năm Ca cao ra trái trực tiếp từ thân hoặc từ những cành lớn, sản lượng đạt cao nhất khi cây khoảng 9-10 tuổi, trung bình mỗi cây cho khoảng 20- 30 trái / năm Năm được mùa có thể đến 50 trái / năm

Trái ca cao khi chưa chín có màu xanh, khi chín có màu vàng, Dáng bầu dục thuôn dài, có chiều dài khoảng 15 tới 25 cm và đường kính khoảng từ 7-10 cm Trong mỗi trái có 5 dãy hạt mỗi dãy khoảng 25 tới 50 hạt (mỗi hạt khô nặng khoảng

1gram) Như thế tính trung bình mỗi năm cây có thể mang lại 3-4 kg / năm Nếu thời tiết thuận lợi cây có thể cho 5-7 kg / năm

Hình 1.1 Cây ca cao, quả ca cao

Việc thu hoạch ca cao cũng cần sự khéo léo và cẩn thận vì nếu thu hoạch không cẩn thận có thể làm ảnh hưởng và rơi rụng những nụ non đang nhú ra từ thân cây Trái ca cao sau thu hoạch sẽ được bổ ra để tách hạt phục vụ cho quá trình lên men

1.3 Các giống ca cao

Có 3 giống ca cao chính là Criollo, Forastero và Trinitario Criollo là giống cho hương vị đặc biệt, hạt ca cao Criollo thường được dùng để pha trộn vào các loại

ca cao khác khi chế biến, hoặc để dùng làm nguyên liệu để sản xuất ra những loại

chocolate đặc biệt Tuy nhiên Criollo thường hay bị bệnh tật tấn công, loại ca cao

này ngày nay được trồng rất ít trên thế giới

Forastero cho năng suất cao nên được trồng rộng rãi Ngày nay 80% ca cao

trên thế giới được trồng là ca cao Forastero

Trinitario là giống mới được cấy ghép giữa Criollo và Forastero, nó có mùi

thơm đặc biệt của Criollo và sản lượng cũng như khả năng chống chịu sâu bệnh của

Forastero Tuy nhiên do nó là giống mới nên sản lượng trên thị trường thế giới còn

ít [36, 39, 40, 41]

Ở Việt Nam, tính đến nay thì Viện khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp Tây Nguyên đã có khoảng trên hơn 60 giống ca cao, trong đó đã chọn được một số giống cho năng suất cao có nhiều triển vọng Thời gian sinh trưởng của cây có thể kéo dài từ 25-40 năm, thích nghi ở nhiệt độ 30-32 0C, tối thiểu 18-21 0C, độ ẩm thích hợp từ 70-80% Cây có thể phát triển trên nhiều loại đất khác nhau: đất triền dốc, đất cát, phù sa ven sông, nghèo dinh dưỡng nhưng có bóng che và nguồn nước,

độ pH từ 5-8, tối ưu khoảng 5,5-6,7 Được trồng phổ biến ở các vùng Tây Nguyên, duyên hải miền Trung, Đông Nam Bộ và một số tỉnh của miền Tây Nam Bộ Có thời vụ trồng từ đầu đến giữa mùa mưa Thời gian thu hoạch chính vào 2 đợt là tháng 11-12 và tháng 3-4 năm sau Một số giống được trồng phổ biến ở Việt Nam như giống CCL-01, CCL-03, CCL-05, CCL-06, CCL-07, CCL-09, CCL-10 Mỗi giống có đặc điểm hình thái khác nhau nhưng nhìn chung chúng đều có khả năng sinh trưởng mạnh, cho năng suất cao và có khả năng kháng được bệnh thối quả tốt Trong đó giống CCL-10 có năng suất cao nhất đạt 5,14 kg hạt khô / cây; 5,65 tấn hạt khô / ha và có khả năng kháng bệnh thối quả cao [41]

1.4 Tình hình trồng ca cao ở Việt Nam

Ở nước ta, cây ca cao được trồng giới thiệu vào một số vùng miền nam Việt Nam từ đầu những năm 1950, cho đến nay đã trở thành cây trồng quen thuộc và đem lại lợi ích kinh tế cao cho người nông dân Theo Bộ NN&PTNT, hiện nay cây

ca cao đã được trồng tại 15 tỉnh thành trên cả nước, với tổng diện tích khoảng 21.100 ha [4] Diện tích ca cao trồng nhiều nhất ở khu vực phía Nam, trong đó Đồng bằng sông Cửu Long chiếm trên 50% tổng diện tích (khoảng 12.100 ha) với năng suất bình quân hơn 7 tạ hạt/ha

Theo kế hoạch của Chính phủ, đến năm 2020, Việt Nam sẽ có khoảng 80.000

ha ca cao, trong đó có 60.000 ha kinh doanh, đạt năng suất bình quân 18 tạ/ha, sản lượng khô 108.000 tấn, hạt ca cao xuất khẩu đạt 86.000 tấn / năm và kim ngạch xuất khẩu đạt 100-120 triệu USD / năm [38], và trở thành quốc gia hàng đầu trên thị

trường xuất khẩu sản phẩm này Lâm Đồng sẽ là một mắt xích quan trọng trong

“bản đồ ca cao” của cả nước với quy mô vùng nguyên liệu là 4.000 ha vào năm

2015 và tiến tới 5.000 ha vào năm 2020

Năm 2011, dự án trồng và thâm canh cây ca cao đã ký hợp đồng với 12 Trung tâm Khuyến nông các tỉnh: Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông, Lâm Đồng, Bình Thuận, Đồng Nai, Bình Phước, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh và Bến Tre Kết quả năm 2011, mô hình đạt quy mô 220 ha Trong năm 2012,

dự án sẽ triển khai trồng mới 59 ha tại: Lâm Đồng 15 ha, Gia Lai 17 ha, Đăk Nông

10 ha và Bình phước 17 ha Tuy nhiên bước đầu triển khai dự án còn gặp nhiều khó khăn [43]

Thời gian gần đây, thị trường tiêu thụ của cây cao ngày càng rộng mở với hàng chục doanh nghiệp trong và ngoài nước chế biến ca cao xuất khẩu với giá thu mua ca cao hạt cho bà con nông dân trên 50.000 đồng / kg Trong năm 2011, cả nước đã xuất khẩu được 240 tấn hạt ca cao, đạt kim ngạch xuất khẩu 520.000 USD Nhiều điểm sơ chế và thu mua hạt ca cao (trái tươi và hạt khô) phát triển nhanh

chóng tại các vùng trồng ca cao [36,37,38,39,40,41]

2 Tổng quan về phương pháp lên men ca cao

Có một số phương pháp lên men như: lên men trên nền khô, lên men thành đống, lên men trong rổ, lên men trong thùng

2.1 Lên men trên nền khô [21]

Là phương pháp lên men chủ yếu ở Trung Mỹ, ở vùng này giống ca cao

được trồng phổ biến là Criollo Hạt ca cao ẩm được làm khô trực tiếp trên nền Chúng được lên men và làm khô trong cả ngày Để hạt ca cao Criollo lên men, hình thành và phát triển hương vị thì cần thời gian từ 2-3 ngày Đối với hạt Forastero thì

thời gian lên men cần để hình thành và phát triển hương vị khoảng từ 5-8 ngày Mặc

dù giống Criollo được thay thế một lượng lớn bằng giống cây trồng lai tạo với

Forastero nhưng phương pháp lên men này vẫn tồn tại Phương pháp lên men này

tạo hương vị tốt cho hạt Criollo nhưng nó không phù hợp với giống Forastero,

giống này cần thời gian lên men dài hơn để hương vị có thể phát triển tốt nhất

Phương pháp lên men này thuận tiện, tuy nhiên có một số bất lợi như chúng tạo điều kiện cho nấm mốc nguy hiểm lây nhiễm, phát triển và tạo ra các hương vị không mong muốn

Hình 1.2 Lên men ca cao bằng khay

2.2 Lên men thành đống [21]

Là một phương pháp lên men phổ biến ở Ghana và một số nước trồng ca cao khác ở châu Phi, thỉnh thoảng phương pháp này được áp dụng ở vùng Amazon của Brazil Phương pháp này không yêu cầu vị trí lên men cố định, nó phù hợp cho lên men theo qui mô nhỏ ở hộ gia đình Lên men thành đống thường cho hạt ca cao chất lượng cao Đống lên men dao động trong khoảng từ 25 kg đến 1000 kg Trên mỗi đống lên men được phủ kín bằng lá chuối, khối lên men được kiểm tra định kỳ để đảm bảo chất lượng và hạn chế sự phát triển của nấm mốc Thời gian lên men của phương pháp này từ 4-7 ngày

Hình 1.3 Lên men thành đống

2.3 Lên men trong rổ [21]

Được sử dụng chủ yếu ở Nigeria, vùng Amazon, Philippines và một số vùng của Ghana Ca cao được đựng trong các rổ rồi phủ lá lên để lên men Bề mặt của rổ được bao phủ bởi lớp lá chuối Quá trình lên men cũng xảy ra tương tự như đối với lên men các đống nhỏ, với phương pháp này, không nên sử dụng với khối lượng hạt nhỏ hơn 25 kg

Hình 1.4 Lên men trong rổ

2.4 Lên men trong thùng [21]

Phương pháp này cải tiến hơn các phương pháp khác Nó được sử dụng cho các khu vực có diện tích trồng ca cao lớn do lượng ca cao sử dụng trong lên men phải lớn và ổn định Mặc dù kích thước của các thùng lên men có khác nhau nhưng chúng đều được thiết kế theo một tiêu chuẩn chung

Thùng lên men có thể riêng lẻ cũng có thể được thiết kế thành hình chữ nhật lớn, sau đó chúng được chia thành các ngăn nhỏ với diện tích khoảng 1 x 1 m Ở các kích thước khác nhau thì lượng ca cao lên men chứa trong thùng khác nhau

Mỗi thùng lên men chứa khoảng từ 600 kg đến 700 kg hạt ca cao tươi Các thùng lên men được đặt bên trên, phía dưới có các rãnh cho phép dịch cơm nhầy bị phân giải sau lên men thoát ra ngoài

Thùng lên men được làm từ các tấm gỗ ghép lại, chúng có các lỗ hoặc các rãnh giữa các tấm ván để nước dễ dàng rút đồng thời cho không khí lưu thông

Thông thường người ta sử dụng kết hợp các thùng lên men nhỏ (0,4 x 0,4 m hoặc 0,4 x 0,5 m) với nhau tạo thành một dãy từ 20 đến 30 thùng, và xếp thành 3 đến 5 dãy theo hình bậc thang Đến thời gian đảo hạt người ta chỉ mở nắp thùng và

làm hạt từ thùng bên trên rơi xuống dãy thùng bên dưới, phương pháp này đảm bảo cho không khí di chuyển vào bên trong khối hạt được đều hơn

Hình 1.5: Lên men ca cao bằng thùng

Lượng hạt chứa trong các thùng lên men phải cách đỉnh thùng ít nhất 10 cm

và được che phủ bằng lá chuối hoặc bao tải giúp cho nhiệt của khối lên men không thoát ra ngoài và ngăn chặn hiện tượng bề mặt khối lên men bị khô

Ở Malaysia, quả ca cao sau khi thu hoạch được bảo quản 15 ngày để ổn định thành phần trước khi tách hạt để lên men Quá trình lên men quyết định đến hương thơm, sự thay đổi màu sắc bên ngoài và bên trong hạt Khi quá trình này kết thúc, hạt được phơi khô hoặc sấy khô

3 Tổng quan về vi sinh vật trong lên men ca cao

Quá trình lên men bắt đầu ngay khi hạt được tách ra khỏi trái ca cao, rất nhiều loại vi sinh vật từ bề mặt trái ca cao, dao, găng tay, các xô chứa hạt sau khi tách, từ bề mặt thùng (khay, nền khô, hoặc rổ) lên men và từ lá chuối Sau khi vi sinh vật xâm nhập, chúng tiến hành lên men cơm nhầy khối hạt và làm thay đổi thành phần khối hạt Cơm nhầy của hạt chưa khoảng 85% nước, 2,7% pentosans, 0,7% saccarose, 10% glucose và fructose, 0,6% protein, 0,7% acid và 0,8% muối

vô cơ, chúng là một môi trường giàu chất dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển [21]

Lên men hạt là công đoạn đầu tiên trong sản xuất chocolate Có rất nhiều vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men ca cao, tuy nhiên các nhóm vi sinh xuyên suốt trong quá trình lên men hạt ca cao là nấm men, vi khuẩn sinh acid lactic, vi khuẩn sinh acid acetic [21] Điều kiện khí hậu ảnh hưởng đến chủng loại vi sinh vật trong quá trình lên men [27]

Theo nghiên cứu xác định loài vi sinh vật trong lên men ca cao ở phía Đông

Java, Indonesia (giống Criollo và Trinitario), trong 2-3 ngày đầu của quá trình lên

men các loài vi sinh vật khác nhau thuộc các nhóm nấm men, vi khuẩn sinh acid

lactic, vi khuẩn sinh acid acetic được tìm thấy như Kloeckera apis, Saccharomyces

cerevisiae, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus plantarum và Acetobacter pasteurianus [23]

Dưới đây là một số loài vi sinh vật được tìm thấy trong quá trình lên men ca cao ở một số nước như Ghana, Malaysia, Beleze [18]

Bảng 1.1: Các loài vi sinh vật phân lập được từ quá trình lên men ca cao [20]

Lactobacillus plantarum Lactobacillus fermentum Lactobacillus brevis Lactobacillus buchneri Lactobacillus cellobiosus Lactobacillus casei subsp pseudoplantarum Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus

fructivorans Lactobacillus kvàleri Lactobacillus gasseri Leuconostoc

messenteroides Leuconostoc paramesenteroides Leuconostoc oenos

Acetobacter spp

Gluconobater oxydans

Hanseniaspora spp

Candida boidinii Candida cocoai Candida intermedia Candida guilliermondii Candida krusei

Candida reukaufii Kloeckera javanica Pichia

membranaefaciens Sacharomyces cerevisiea Sacharomyces chevalieri Sacharomyces spp

Schizosascharomyces malidevorans

“Nghiên cứu phân lập và định tên một số nòi nấm men trong quá trình lên men hạt

ca cao”, sau khi dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy, sinh lý của khuẩn

lạc và tế bào nấm men rồi so sánh với khóa phân loại nấm men, nhóm tác giả đã dự

đoán tên của 4 loài nấm men phân lập được như sau Hansenia spora uvarum,

Galactomyces reessii, Candida sorboxylosa, Candida fructus [7]

Theo Nielsen và cộng sự, nấm men có mặt ngay trong giai đoạn đầu của quá trình lên men Từ số lượng ban đầu tính theo log (CFU/g) = 6,07-7,45 sau 12 h số lượng nấm men tăng lên log (CFU / g) = 7,24-8,03 [9] Trong khi theo Ardhana & Fleet, số lượng tế bào nấm men lúc đầu là 104-105 CFU/g, và sau 24-36 h lên men chúng phát triển đến số lượng cực đại là 107-108 CFU/g, sau đó số lượng bị giảm nhưng vẫn duy trì cho đến khi quá trình lên men kết thúc [17]

Theo Luc De Vuyst và cộng sự, nấm men có mặt trong suốt giai đoạn đầu của quá trình lên men (24 - 48 h lên men) [16] Đối với lên men đống, số lượng tế bào nấm men đếm được tối đa là 9,1×107 Một số loài chiếm ưu thế trong phương

pháp lên men này là Candida krusei, P membranifaciens, P kluyveri,

Hanseniaspora guilliermondii và Trichosporon asahii [13]

Theo Nielsen và cộng sự và Ardhana & Fleet (2003), trong 24 h đầu thì H

guilliermondii là loài chiếm ưu thế Sau đó, thỉnh thoảng mới thấy sự có mặt của H guilliermondii, còn Candida zemplinina (Sipiczki, 2003) được tìm thấy trong suốt

quá trình lên men

Theo Ardhana & Fleet nghiên cứu hệ vi sinh vật trong lên men ca cao ở

Indonesia cho thấy trong 24-36 h đầu Kloeckera apis là loài chiếm ưu thế (chiếm

70-90% tổng số nấm men trong suốt giai đoạn đầu), sau đó nó giảm xuống nhanh

chóng Sau Kloeckera apis, là Saccharomyces cerevisiae và Candida tropicalis,

chúng có vai trò quan trọng trong quá trình lên men Các loài nấm men này phát triển mạnh ở giai đoạn đầu và chiếm ưu thế trong suốt giai đoạn sau của quá trình lên men (48-120 h) [23]

Theo các nghiên cứu trên cho thấy ở mỗi nghiên cứu khác nhau thì thời điểm phát triển cũng như các loài vi sinh vật khác nhau Điều này chứng tỏ sự đa dạng và phong phú về chủng loại vi sinh, cũng như sự khác nhau về thời điểm xuất hiện Bảng 2 sẽ thể hiện sự khác nhau đó

Bảng 1.2: Các loài vi sinh vật trong lên men hạt ca cao [35]

Giờ lên men

Vi sinh vật

0 24 48 72 96 120 144 Nấm men

Trong một số nghiên cứu về điều kiện phát triển của nấm men thì theo Doyle

và cộng sự, chủng S.cerevisiae có khả năng phát triển ở nhiệt độ 40 0C, Kloeckera

apis phát triển ở 37 0C và phát triển yếu ở 40 0C Tất cả các chủng S cerevisiae và

các loài nấm khác phát triển tốt trong môi trường có ethanol từ 7% đến 10% Các

loài Kloeckera phát triển được ở ethanol 5%, nhưng không phát triển được ở nồng

độ cao hơn [21]

Theo Gálvez và cộng sự thì trong 43 chủng nấm men phân lập được thuộc

các chi Candida, Hanseniaspora, Pichia và Yarrowia Các loài khác nhau thì có vai trò khác nhau như loài Candida insconspicua được chứng minh là có khả năng đồng hóa acid lactic Các loài Hanseniaspora guillermondii lên men đường tạo thành

ethanol Đa số các loài nấm men phân lập được đều có thể đồng hóa ethanol Các

loài Pichia fermentans fermentans var, Yarrowia lipolytica và chủng nấm men

Candida có vai trò thủy phân (Carr, 1982; Cascante và cộng sự, 1994; Schwan,

1997) [34]

Nấm men chuyển hóa đường (saccarose, glucose, và / hoặc fructose) tạo thành rượu (ethanol) trong điều kiện nồng độ carbohydrate cao (điều kiện đặc trưng của khối hạt ca cao tươi), oxy hạn chế (do quá trình lên men được ủ đậy kín) và độ

pH dưới 4,0 (do acid citric trong khối hạt ca cao cao) Ban đầu số lượng chúng chỉ 2-7 và phát triển đến mức tối đa là 7-9 log CFU/g ca cao lên men Dưới tác dụng của enzyme invertase, saccarose còn lại được tạo thành glucose, fructose, và 18,8 kJ nhiệt/1 mol saccarose được thủy phân Tuy nhiên, nồng độ saccarose phụ thuộc vào

độ chín của quả và hoạt động của invertase Hơn nữa, glucose được chuyển hóa thành ethanol bằng cách lên men kỵ khí, để lại một phần lớn fructose chưa lên men [18]

Nồng độ ethanol khoảng 2,5% là kết quả của quá trình lên men dưới tác dụng của nấm men Ethanol tạo thành đi kèm với sự gia tăng nhiệt độ ở mức độ vừa phải

do có quá trình tỏa nhiệt khi chuyển đổi đường thành ethanol (và carbon dioxide), nhiệt độ của khối lên men tăng từ 25 – 30 °C đến 35 – 40 °C trong vòng 48 giờ Ethanol biến mất khi xuất hiện quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn acetic, sản phẩm hình thành trong quá trình lên men khuếch tán vào lá mầm, làm nóng hạt, và bay hơi [18]

Bên cạnh ethanol, nấm men còn sinh ra các sản phẩm khác như acid acetic, acid malic, và acid succinic, chúng tạo nên một hệ đệm trong cơm nhầy ca cao Cũng như rượu, các acid béo và các este acid béo, chúng góp phần tạo nên hương

vị, các hợp chất tiền sinh hương của ca cao (Schwan và Wheals, 2004) Bên cạnh

đó, hoạt động của nấm men là nguyên nhân làm giảm độ nhớt và làm thoát nước của khối ca cao lên men do chúng tiết ra các enzyme pectin làm phá vỡ cấu trúc cơm nhầy (Gauthier và cộng sự 1977; Sanchez và cộng sự 1984, 1985; Schwan và cộng sự 1995, 1997; Ardhana & Fleet 2003; Jespersen và cộng sự 2005) Khoảng trống được tạo thành giữa các hạt do cơm của khối hạt bị lên men tạo điều kiện cho không khí xâm nhập vào bên trong, thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn acetic và vi

khuẩn lactic

3.2 Vi khuẩn acetic

Vi khuẩn acetic hoạt động trong khoảng từ 24 đến 112 h của quá trình lên men Quá trình này là quá trình lên men hiếu khí, nó xảy ra từ giai đoạn đầu của quá trình lên men và tiếp tục kéo dài trong những giai đoạn sau cho đến khi kết thúc, khi

đó điều kiện cho hoạt động của vi khuẩn acetic là tối ưu nhất Khi một lượng lớn cơm nhầy được chuyển hóa và lượng nước mất đi cũng lớn, không khí bên trong khối hạt tăng lên, và khi nhiệt độ tăng trên 37 °C, vi khuẩn acetic chịu nhiệt phát triển với số lượng ban đầu từ 3-5 tăng lên tối đa là 5-8 log (CFU / g) ca cao lên men [18]

Theo Nielsen và cộng sự thì thỉnh thoảng vi khuẩn acetic được tìm thấy trong

12 h đầu của quá trình lên men Từ 24 h trở đi vi khuẩn acetic phát triển với một số lượng lớn và sau 36-48 h lên men, số lượng của chúng đạt log (CFU / g) = 7,7-7,8,

ở những giai đoạn sau số lượng của chúng giảm

Bên cạnh đó theo nghiên cứu quá trình lên men ca cao ở Indonesia cho thấy trong 12 h đầu của quá trình lên men số lượng vi khuẩn acetic đạt tối đa là 105-106CFU/g (Ardhana & Fleet, 2003) [10] Tuy nhiên, theo một số tài liệu thì ban đầu số lượng vi khuẩn acetic là 103-104 CFU / g, trong quá trình lên men số lượng chúng tăng lên 106-107 CFU / g (Lopez, 1972; Samah và cộng sự, 1993; Schwan, 1998) [21]

Ở vùng Trinidad, người ta thấy vi khuẩn sinh acid acetic chiếm khoảng 90% tổng số vi sinh vật sau 2 ngày lên men ca cao [20] Theo báo cáo của Carret và cộng sự (1979) vi khuẩn acetic là một trong những vi sinh vật đặc biệt quan trọng trong việc lưu thông khí bên trong khối lên men, chúng có vai trò oxy hóa ethanol

80-do nấm men sản xuất ra để tạo thành acid acetic [19] Một số loài vi khuẩn acetic

được phân lập như Glucononbacter oxydans, Acetobacter aceti và Acetobacter

pasteurianus nhưng chưa có thông tin xác định sự sinh trưởng, phát triển của loài

này (Carret và cộng sự, 1979; Carr & Davies, 1980; Ardhana & Fleet, 2003) [12]

Theo các thử nghiệm của Frateur, tất cả các chủng phân lập được đều thuộc

loài Acetobacter lovaniensis, chúng chuyển hóa ethanol tạo acid acetic, sau đó có

thể dùng acid acetic để tạo CO2 và H2O Trong đó loài A lovaniensis là loài duy

nhất được phân lập có khả năng oxy hóa acid acetic [34]

Vi khuẩn acetic có vai trò quan trọng đối với chất lượng hạt ca cao sau lên men Nó chuyển hóa đường và acid hữu cơ tạo thành các aldehyde, ceton và các sản phẩm dễ bay hơi khác (Drysdale và Fleet, 1988), nó tạo ra hương thơm đặc trưng cho hạt sau lên men (Bainbridge và Davies, 1912; Knapp, 1937; Roelofsen và Gies Berger-, 1947) [12] Tuy nhiên nó cũng có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của hạt [20]

Hoạt động chính của vi khuẩn acetic là oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic Quá trình oxy hóa này tạo ra một lượng lớn nhiệt (khoảng 496 kJ/mol ethanol bị oxy hóa), quá trình này chủ yếu làm tăng nhiệt độ của khối lên men, có thể đạt 45-

50 °C hoặc cao hơn [18], hạn chế được sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác [20] Nồng độ ethanol giảm đi kèm với sự giảm nồng độ acid lactic, cho thấy quá trình oxy hóa đồng thời ethanol tạo acid acetic và acid lactic chuyển hóa thành CO2

và nước Nồng độ acid acetic ở mức cao nhất khoảng 2%, sau đó chúng giảm có thể

là do nhiệt độ của khối lên men cao làm acid acetic chuyển thành CO2, nước và nhiệt lượng (1754 kJ/mol acid acetic được oxy hóa) Ngoài ra quá trình oxy hóa acid acetic và acid lactic còn làm pH của khối lên men tăng [18]

Khi ethanol đã bị oxy hóa hoàn toàn để tạo thành acid acetic, CO2, H2O thì quá trình lên men lắng xuống và nhiệt độ của khối lên men cũng giảm xuống một cách nhanh chóng [20]

Trong quá trình lên men có đảo trộn khối lên men, việc đảo hạt này tạo điều kiện cho vi khuẩn acetic phát triển (số lượng tế bào, nồng độ acid acetic) và tăng nhiệt độ của khối lên men (Carr và cộng sự1979; Nielsen và cộng sự 2007a; Camu

và cộng sự 2008a) Bên cạnh đó, đối với khối lên men nhỏ việc đảo trộn này làm nồng độ acid acetic tăng quá cao, kết quả là hạt ca cao sau lên men có chứa một lượng lớn acid acetic, chúng làm vị chua trong chocolate tăng lên (Camu và cộng sự 2008a, 2008b.) [16]

đến tối đa là 7-9 log CFU/g ca cao lên men Điều này xảy ra đồng thời với sự suy

giảm một cách nhanh chóng số lượng nấm men [16]

Theo Carr và cộng sự (1979), vi khuẩn lactic chiếm số lượng chủ yếu trong suốt quá trình lên men Trong các nghiên cứu về hệ vi sinh vật lên men ca cao ở Indonesia và Brazil cho thấy vi khuẩn lactic là các vi sinh vật chiếm ưu thế sau khi

lên men từ 36-48 h (Schwan và cộng sự, 1995; Ardhana & Fleet, 2003) [10]

Theo nghiên cứu của Ostovar và Keeney (1973) ở Trinidad, Carr và cộng sự (1979), Carr và Davies (1980) ở Malaysia và Ghana, Passos và cộng sự (1984) ở Brazil cho thấy trong giai đoạn đầu của quá trình lên men (36-48 h) số lượng tế bào

vi khuẩn lactic đạt 106-108 CFU/g, sau đó giảm dần [18]

Lúc bắt đầu lên men, Lb pseudomesenteroides và Lb plantarum chiếm ưu thế trong nhóm vi khuẩn lactic nhưng sau 12-24 h Lb fermentum chiếm ưu thế hơn

[10]

Ostovar và Keeney, 1973; Carr và cộng sự, 1979 đã phân lập được một số

loài như A aceti, A pasteurianus và Gluconobacter oxydans Chúng có khả năng

phát triển cùng lúc với quá trình lên men hoặc ngay sau khi nấm men phát triển, số lượng của chúng khoảng 106-109 CFU/g tuỳ theo mức độ đảo trộn hạt và thông khí

[15]

Đối với lên men ở Brazil, trong suốt 48 giờ đầu của quá trình lên men, số lượng vi khuẩn lactic phổ biến hơn số lượng nấm men, chúng hình thành một lượng lớn acid lactic Acid lactic không dễ bay hơi nên được giữ lại trong chocolate thành

phẩm [19]

Trong quá trình lên men hạt ca cao ở Brazil xuất hiện cả 2 loại vi khuẩn lactic là vi khuẩn lactic đồng hình và dị hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình

bao gồm Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii,

Lactobacillus acidophilus, Pediococcus cerevisae, Pediococcus acidilactici và Streptococcus (Lactococcus) lactic Loài lên men dị hình là Leuconostoc

mesenteroides và Lactobacillus brevis [19]

Lactobacillus cellobiosus là loài chiếm ưu thế nổi trội nhất ở tất cả các vùng

nghiên cứu Một loạt các loài vi khuẩn khác phát triển trong suốt quá trình lên men, nhưng số lượng của chúng không vượt quá 105-106 CFU/g Nổi bật trong số này là:

Staphylococcus capitis, Staphylococcus aureus và Micrococcus kristinae; S

capitis, S hominii, M kristinae và Pseudomonas cepacea; S aureus, M kristinae

và P cepacea, với L plantarum chiếm ưu thế nhất [19]

Cùng với các nghiên cứu trước đây đã được công bố (Carr và cộng sự, 1979; Carr và Davies, 1980; Passos và cộng sự, 1984; Schwan và cộng sự, 1995; Thompson và cộng sự, 2001; Ardhana và Fleet, 2003) các kết quả thu được trong nghiên cứu của Nielsen và cộng sự nghiên cứu hệ vi sinh vật của lên men ở Ghana

đã chỉ ra rằng Lb fermentum và Lb plantarum có mặt trong lên men ca cao trên

toàn thế giới [9]

Vi khuẩn lactic lên men một loạt các loại đường (chủ yếu là glucose và fructose) và chuyển hóa một số acid hữu cơ (như acid citric, acid malic) tạo thành sản phẩm chính, sản phẩm cuối cùng là acid lactic Quá trình chuyển đổi này phụ thuộc vào chủng loại vi khuẩn lactic Hầu hết các loài LAB thường sử dụng glucose như là nguồn năng lượng, nhưng cũng có một số loài LAB sử dụng fructose như là một nguồn thay thế điện tử bên ngoài và chuyển chúng thành mannitol (Camu và cộng sự 2007, 2008a) Tỷ lệ tương đối của tất cả các sản phẩm khi kết thúc quá trình lên men sẽ thay đổi thành phần cơm nhầy của khối lên men và do đó nó có thể

ảnh hưởng đến sự hoạt động của các vi sinh vật tiếp theo

Theo Barel (1998), vi khuẩn lactic ít được mong muốn hoặc không mong muốn xuất hiện trong tất cả các thời điểm của quá trình lên men ca cao Nếu vi khuẩn lactic chiếm một số lượng lớn trong quá trình lên men hạt ca cao thì nồng độ acid lactic sẽ cao do cacbonhydrat sẽ được chuyển hóa chủ yếu thành acid (lượng acid lactic tạo thành do vi khuẩn lactic sinh ra cao và hàm lượng ethanol do nấm men tạo thành ít) trong ca cao lên men Acid lactic được tạo thành không dễ bay hơi, nó tồn tại trong chocolate, ảnh hưởng đến hương vị chocolate (Holm và cộng

sự 1993; Jinap 1994; Jinap và Zeslinda 1995) Do đó nếu vi khuẩn lactic sinh trưởng phát triển quá tốt trong quá trình lên men thì chất lượng hạt ca cao sau lên men không được cao, và có sự hợp tác không cạnh tranh giữa nấm men và vi khuẩn

lactic tồn tại trong khối lên men (Camu và cộng sự 2007) [16]

Khi tất cả ethanol được oxy hóa thành axit acetic và sau đó tiếp tục oxy hóa thành CO2 và nước thì quá trình lên men dừng lại vì nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng của vi sinh vật đã cạn, nhiệt độ của khối lên men tăng cao cho phép một số loại vi sinh vật có lợi tồn tại Nếu kéo dài quá trình lên men có thể tạo nên một số

hương vị không tốt và thối rữa khối lên men do xuất hiện một số vi khuẩn không mong muốn Có thể kết thúc quá trình lên men khi thấy nhiệt của khối lên men giảm

[21]

4 Biến đổi sinh hóa trong lên men ca cao

Hạt ca cao được bọc bởi một lớp cơm nhầy trắng Ở hạt Forastero chúng chiếm khoảng ½ trọng lượng khô, ở hạt Trinitario chúng chiếm khoảng 1/3 trọng

lượng khô, và bị phân giải trong suốt quá trình lên men, tạo dịch lỏng thoát ra ngoài

thông qua các lỗ bên thân thùng lên men [19]

4.1 Cấu tạo hạt ca cao

Hạt gồm có 2 phần cơ bản: vỏ lụa bao quanh bên ngoài hạt, bên trong hạt có

2 lá mầm và phôi nhỏ Lá mầm là nơi chứa chất dinh dưỡng của hạt Vỏ lụa không

bị các phân tử có khối lượng lớn ngấm qua (acid citric, polyphenol, alkaloid) Tuy nhiên các phân tử nhỏ dễ bay hơi như ethanol và acid acetic lại có thể ngấm vào bên trong một cách dễ dàng Lá mầm được tạo nên từ các thành phần cơ bản như các tế bào chứa lipid / protein / tinh bột, các tế bào chứa polyphenol có màu tía, với dạng như mô mềm huyết tương tạo thành một mạng lưới giữa 2 loại tế bào (Hình 1.5) [16]

Hình 1.6: Cấu tạo hạt ca cao [16]

4.2 Biến đổi về nhiệt độ của khối lên men

Trong nghiên cứu của Michael, nhiệt độ khối lên men tăng từ 25 oC lên 50

o

C trong quá trình lên men, sự gia tăng hơn 20 oC của khối lên men có tác động vô

cùng lớn đến hoạt động của enzyme Nếu nhiệt độ tăng thấp thì hoạt động của enzyme giảm, dẫn đến các hợp chất sinh hương hình thành ít, chúng làm cho hương

vị chocolate sau này kém [19]

Theo nghiên cứu của Nielsen và cộng sự, nhiệt độ của khối lên men tăng từ

28 oC (bắt đầu lên men) đến 46-48 oC ở giai đoạn giữa và cuối quá trình lên men Nhiệt của khối lên men tăng do trong quá trình chuyển hóa các chất có sinh nhiệt lượng Đối với các khối lên men cần tiến hành đảo trộn trước 48 h để tạo điều kiện cho quá trình chuyển hóa đường và acid acetic [12]

4.3 Biến đổi pH của khối lên men

Lúc bắt đầu lên men pH của khối lên men là 3,7-3,9, ở cuối quá trình lên men pH tăng lên 4,8-4,9, trong khi pH của hạt giảm từ 6,3-6,5 xuống 5,0-5,1 [12]

pH thay đổi là do vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic sinh ra các acid hữu cơ ngấm vào bên trong hạt [15] Nếu pH lá mầm có hàm lượng acid cao quá sớm (pH < 4,5),

nó sẽ làm giảm các hợp chất tiền sinh hương và cho hàm lượng acid bên trong hạt

ca cao sau lên men cao [16]

Như thế nếu hàm lượng acid hữu cơ trong suốt quá trình lên men thấp, pH của lá mầm không phù hợp với hoạt động tối thích của enzyme, nó làm ảnh hưởng đến hương vị cuối cùng của hạt ca cao Tuy nhiên nếu hàm lượng acid quá cao chúng sẽ ảnh hưởng đến hương vị của chocolate [19]

4.4 Biến đổi sinh hóa

Trong quá trình lên men, dưới tác động của vi sinh vật, có nhiều phản ứng diễn ra dẫn đến sự biến đổi về đặc tính sinh hóa của hạt (Timbie et al, 1978; Gill et

al, 1984; Lagunes-Ga lvez et al, 2007) [28]

Dưới tác dụng của vi sinh vật, hàm lượng acid acetic tăng cao là nguyên nhân chính làm chết hạt, ngoài ra hàm lượng ethanol và nhiệt độ tăng cũng là nguyên nhân góp phần làm hạt bị chết (Hoskin & Dimick, 1994; Jinap, 1994; Lopez, 1986; Quesnel, 1965) [20]

Theo nghiên cứu của D.S.Nielsen, 2006, trong 24 h đầu tiên, khoảng 80% số đường bị chuyển hóa tạo ethanol, acid acetic, acid lactic Sau 24-36 h, nồng độ cồn của dịch lên men đạt cao nhất (5-6%) [10] Theo Fabienne luna và cộng sự, 2002, sau 60-72 h thì nồng độ acid acetic đạt khoảng 2%, vào cuối quá trình lên men chúng giảm xuống còn 0,7-1% [12]

Độ ẩm của lá mầm trong suốt quá trình lên men khoảng 35% Khi độ ẩm đạt khoảng 6-8% thì mọi hoạt động của enzyme gần như kết thúc [15]

Việc hạt ca cao bị chết có vai trò vô cùng quan trọng đến biến đổi sinh hóa bên trong hạt Hạt ca cao bị chết quyết định sự thành công của quá trình lên men bởi

vì những biến đổi trên làm phát triển các hợp chất tiền sinh hương và giảm vị chát,

vị đắng của hạt [20]

Sự tác động của các thành phần tạo thành trong quá trình lên men lên hạt cacao được thể hiện trong hình vẽ dưới đây [16]

Hình 1.7: Biến đổi sinh hóa và quá trình khuếch tán trong cơm nhầy và trong

hạt trong quá trình lên men ca cao [18]

Biến đổi sinh hóa bên trong hạt ca cao bắt đầu khi vi sinh vật phân giải cơ chất tạo thành một số hợp chất, sau đó các chất được tạo thành từ quá trình phân giải sẽ tương tác với nhau Sự thay đổi sinh hóa của quá trình lên men xảy ra bên trong lá mầm xảy ra 2 giai đoạn đó là giai đoạn thủy phân xảy ra trong môi trường

kị khí và giai đoạn oxy hóa (Lopez, 1986) [20]

Cơm nhầy bị phân giải làm nước trong cơm nhầy bị thoát ra, chúng bao phủ bên ngoài hạt Phần nước này có chứa nhiều chất dinh dưỡng, nhiều enzyme khác nhau, là cơ chất cho quá trình hoạt động của enzyme [20]

Trong suốt giai đoạn đầu của quá trình lên men, dưới tác dụng của enzyme thủy phân, oxy khuếch tán vào bên trong lá mầm, tuy nhiên số lượng của chúng còn

hạn chế Cấu trúc của polyphenol bị biến đổi, sau đó chúng kết hợp với protein để tạo thành hợp chất mới, do đó khả năng hòa tan của chúng giảm (Bonvehi & Coll, 1997) [20]

Dưới tác dụng của các enzyme thủy phân như invertase, glycosidases và protease sẽ xảy ra một số phản ứng sinh hóa như phản ứng Maillard, melanoidin [17], hình thành các hợp chất sinh hương, các hợp chất tạo vị và tạo màu nâu cho hạt trong quá trình rang như các acid amin tự do, peptides, các sản phẩm đường và polyphenol ngoài ra ở công đoạn này còn xảy ra một số phản ứng phi enzyme tạo hương vị, màu sắc cho chocolate Nếu hạt chưa được lên men trước khi rang sẽ làm mất các tiền chất sinh hương, gây ảnh hưởng đến hương vị

chocolate [19]

Thời gian của giai đoạn xảy ra quá trình thủy phân đủ để làm biến đổi các hợp chất tiền sinh hương trước khi xảy ra quá trình oxy hóa Nếu quá trình oxy hóa xảy ra ngay sau khi hạt bị chết, trước khi kết thúc phản ứng thủy phân thì hoạt động của enzyme thủy phân sẽ bị hạn chế vì vậy các hợp chất tạo hương cho chocolate sẽ không đảm bảo Nếu kéo dài quá trình lên men kị khí thì sản phẩm của quá trình lên men sẽ ngấm vào bên trong hạt quá mức, chúng làm cho hương vị của hạt xấu đi Tuy nhiên nếu giai đoạn oxy hóa quá ngắn thì tanning và polyphenol chưa được oxy hóa, do đó vị đắng và vị chát trong hạt sẽ rất cao (Lopez, 1986) [20]

Hàm lượng polyphenol và alkaloid có trong hạt ca cao tươi phụ thuộc vào mùa vụ Trong quá trình lên men epicatechin và theobromine khuếch tán ra khỏi lá mầm vì vậy hàm lượng của chúng giảm, polyphenol bị oxy hóa và ngưng tụ Lượng polyphenol còn lại sẽ tạo vị se đắng cho chocolate thành phẩm [17]

Các hợp chất methylxanthines caffeine, theobromine, polyphenolic, proanthocyanidins và flavan-3-ols (epicatechin và catechin), tạo vị đắng và vị chát cho hạt ca cao Tuy nhiên, trong quá trình lên men vị đắng và vị chát bị giảm đáng

kể do có sự khuếch tán các alkaloid (giảm 30%) và polyphenol (giảm 20%) ra môi trường bên ngoài [17]

Trong quá trình bảo quản, protein bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme endoprotease aspartic và carboxypeptidase trong điều kiện pH và nhiệt độ tối thích khác nhau hình thành các oligopeptide ưa nước và các gốc acid amin kị nước tự do Đường sacarose bị thủy phân tạo thành glucose và fructose do hoạt động của

enzyme invertase trong lá mầm [17]

4.4.1 Hoạt động của enzyme [20]

Vai trò chính trong hoạt động của enzyme là tạo nên những hợp chất tiền sinh hương và làm biến đổi cấu trúc của polyphenol trong suốt quá trình lên men Endoprotease, aminopeptidase, cacboxypeptidase, invertase (có trong lá mầm và trong cơm nhầy), polyphenol oxydase và glycosidase là những enzyme chủ yếu phục vụ cho quá trình tiền sinh hương trong suốt quá trình lên men và giai đoạn đầu của quá trình làm khô (Hansen và cộng sự, 1998; Lopez, 1986; Biehl và cộng sự, 1993) Theo Hansen và cộng sự (1998) nghiên cứu về hoạt động của enzyme trong quá trình lên men cho thấy aminopeptidase, invertase (trong cơm nhầy), và polyphenol oxydase bị ức chế trong suốt quá trình lên men Trong khi đó cacboxypeptidase chỉ bị ức chế một phần, endoprotease và glycosidase là những enzyme hoạt động chính Polyphenol oxydase gần như không hoạt động trong quá trình làm khô

Tuy nhiên trong nghiên cứu gần đây của Hansen và cộng sự (2000), cho thấy không có sự phụ thuộc giữa các hợp chất tiền sinh hương và mức độ hoạt động của enzyme trong hạt ca cao chưa lên men Mức độ hoạt động của enzyme có mặt trong hạt ca cao chưa lên men không phải là yếu tố làm hạn chế sự hình thành các hợp chất tiền sinh hương trong suốt quá trình lên men Theo Later Misnawi và cộng sự (2002a, 2002b, 2000) cho thấy enzyme polyphenol oxydase, protease, invertase vẫn còn hoạt động ở mức thấp trong hạt ca cao chưa lên men khô, và ở hạt ca cao dưới mức lên men khi bảo quản ở 45 oC, pH từ 3,5 đến 4,5 thì quá trình oxy hóa polyphenol tạo các hợp chất tiền sinh hương vẫn tồn tại

Polyphenol Oxidase

Polyphenol oxidase là một enzyme quan trọng trong quá trình oxy hóa polyphenol của hạt ca cao Nó hoạt động trong quá trình lên men và tiếp tục hoạt động trong quá trình sấy khô hạt Chúng làm giảm vị đắng và vị chát bên trong hạt, làm cho hạt có màu nâu khi kết thúc quá trình lên men (Hansen và cộng sự, 1998; William, 1971)

Enzyme protease

Enzyme protease hoạt động trong suốt quá trình lên men kị khí Theo nghiên cứu của Biehl và cộng sự (1993), có 2 loại enzyme protease hoạt động trong suốt quá trình lên men hạt ca cao là endopeptidase và exopeptidase; endopeptidase là một aspartic protease và exopeptidase là một cacboxypeptidase

Theo nghiên cứu của Voigt và cộng sự (1994a, 1993), và Biehl, Passern (1982), enzyme protease tham gia vào quá trình phân giải protein trong suốt quá trình lên men hạt ca cao là aspartic endoprotease và cacboxypeptidase Tuy nhiên theo nghiên cứu của Hansen và cộng sự (1998), trong quá trình lên men một phần enzyme cacboxypeptidase bị bất hoạt, điều đó đồng nghĩa với việc aspartic endoprotease là enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình này Theo Voigt, Biehl và cộng sự, pH tối thích của 2 enzyme này là 3,5 và 5,8 Trong suốt giai đoạn đầu của quá trình lên men trong điều kiện kị khí, aspartic endoprotease là enzyme đầu tiên cắt mạch protein của hạt ca cao

Cacboxypeptidase là enzyme có vai trò quan trọng trong việc tạo nên hương thơm đặc biệt cho hạt ca cao lên men

Enzyme Invertase và Glucosidase

Hàm lượng saccarose, glucose, fructose và đường tổng số có mặt trong hạt ca cao chưa lên men khoảng 24,8, 0,7, 0,9 và 27,1 g / kg hạt (Berbert, 1979) Trong quá trình lên men saccarose bị thủy phân tạo glucose và fructose dưới tác dụng của enzyme invertase có mặt trong hạt (Rohan & Stewart, 1967b; Puziah và cộng sự, 1998a) Dưới tác dụng của vi sinh vật, chúng phân giải polysaccharides để tạo thành sorbose, manitol, inositol (Reineccius và cộng sự, 1972; Rohan & Stewart, 1967b)

Glucose và fructose tăng trong suốt quá trình lên men sau khi hạt chết Sau 6 ngày lên men, hàm lượng saccarose và đường tổng số giảm còn 0,1 và 8 g / kg hạt sau lên men Tuy nhiên fructose và glucose lại tăng lên 5,4 và 1,2 g / kg hạt sau lên men (Berbert, 1979) Theo nghiên cứu của Reineccius và cộng sự đối với hạt ca cao

đã lên men cho thấy fructose, sorbose, glucose, manitol, và đường tổng số giảm còn

260, 44, 214, 40, 558 mg / 100g hạt Tuy nhiên theo nghiên cứu của Berbert (1979) cho thấy hàm lượng đường saccarose, fructose, glucose và đường tổng số trong hạt

ca cao đã lên men là 10, 540, 120 và 800 / 100g hạt Theo nghiên cứu của Puziah và

cộng sự (1998b) cho thấy saccarose và đường tổng số sau khi lên men hạt ca cao giảm khoảng 89% và 75% so với nguyên liệu ban đầu

4.4.2 Biến đổi màu sắc hạt

Biến đổi sinh hóa xảy ra bên trong lá mầm trong suốt quá trình lên men hạt

ca cao là nguyên nhân làm thay đổi cấu trúc polyphenol Anthocyanins, polyphenol

là những hợp chất tạo màu tía (đỏ và lam) cho hạt ca cao trước khi lên men Trong quá trình lên men, chúng bị thủy phân tạo thành anthocyanidins, galactose và arabinose (Kim & Keeny, 1984; Foursyth & Quesnel, 1963, 1957) [20]

Các polyphenol oxidase chuyển hóa các polyphenol (chủ yếu là epicatechin

và anthocyanidins tự do) thành các quinon Polyphenol và quinon tạo hợp chất với các polyphenol khác, với protein và các peptid làm giảm vị chát và làm biến đổi màu của hạt sau lên men thành màu nâu [17]

Cơ chế để chuyển từ màu tía sang màu nâu phụ thuộc vào mức độ của quá trình lên men Kết quả cắt hạt là cơ sở để đánh giá mức độ lên men Phân tích kết quả cắt hạt, hạt ca cao có 50 % hoặc hơn 50 % có màu tía thì được xếp vào nhóm dưới mức lên men (SIRIM, 1995) Những hạt này có vị chát (se đầu lưỡi) và vị đắng rất cao, bên cạnh đó các hợp chất tạo hương thơm cho hạt rất thấp Do vậy những hạt này không được dùng để sản xuất chocolate (Misnawi và cộng sự, 2000a; Rohan, 1963) [20]

Bên cạnh những biến đổi về màu sắc hạt trong quá trình lên men thì các hợp chất tiền sinh hương cũng được tạo thành trong quá trình này và quá trình sấy khô [19] Do đó, cần phải có sự cân bằng giữa thời gian của quá trình lên men, yếu tố môi trường bên ngoài, và hoạt động của vi sinh vật, hoạt động của enzyme lên lá mầm của hạt Hơn nữa, sự không đồng nhất giữa lên men khối lớn và khối nhỏ, sự khác nhau về số lượng vi sinh và hàm lượng đường có trong quá trình lên men có thể tạo nên các hợp chất tiền sinh hương nhất định trong hạt ca cao Điều này có thể tạo nên một sự khác biệt lớn đối với hương vị chocolate hình thành (Camu và cộng

sự 2008a, 2008b) [16], kiểm soát quá trình lên men là có thể kiểm soát được hương

vị của chocolate [19]

Chất lượng hạt ca cao sau lên men có thể được kiểm tra bằng cách cắt kiểm tra sự thay đổi màu sắc của lá mầm trong suốt quá trình lên men [17]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu trên 12 mẫu ca cao lên men Ca cao sử dụng trong quá trình nghiên cứu được mua từ một hộ nông dân ở tỉnh Đăk Lăk

Chọn mua những quả ca cao chín đều (có màu vàng, đỏ đều), không bị sâu bệnh, dập nát, khối lượng mỗi quả khoảng 0,5-0,8 kg

Quả được lên men sau khi thu hoạch không quá 7 ngày để tránh hiện tượng hạt bên trong quả bị mất nước quá độ, gây ảnh hưởng đến quá trình lên men hạt ca cao

Hình 2.1 Ca cao nguyên liệu 1.2 Dụng cụ dùng trong lên men ca cao

Ca cao được lên men trong thùng xốp, sử dụng lá chuối lót xung quanh thùng, nhằm mục đích giữ nhiệt cho khối lên men đồng thời cung cấp hệ vi sinh cho khối lên men

Ca cao sau khi thu mua từ vùng nguyên liệu được vận chuyển cẩn thận, tránh tình trạng bị dập nát, thối úng trước khi lên men

1.3 Lên men ca cao

Sau đó quả ca cao được đập bỏ vỏ, tách hạt để phục vụ cho quá trình lên men Hạt ca cao được lên men tự nhiên trong thùng xốp, mỗi mẻ 3,5 kg hạt tươi, thời gian lên men 6 ngày, đảo trộn sau khi lên men 48 h và 96 h

Quá trình này kéo dài trong 6 ngày, không nên lên men với thời gian dài hoặc ngắn hơn 6 ngày vì chúng sẽ ảnh hưởng đến chất lượng hạt ca cao sau lên men

Nếu kết thúc quá trình lên men sớm, phần cơm nhầy chưa được chuyển hóa hết sẽ ảnh hưởng đến hàm lượng các chất ngấm vào bên trong hạt ca cao thông qua

lá mầm, do đó chất lượng hạt ca cao thấp

Tuy nhiên nếu kéo dài thời gian lên men thì các nhóm vi sinh vật có lợi cho quá trình lên men sau khi chuyển hóa hết cơ chất sẽ chết, do vậy nấm mốc có cơ hội phát triển, chúng làm mốc hạt, làm chất lượng hạt sau lên men kém

1.4 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm men, vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic chủ yếu (chiếm ưu thế)

trong quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên

Môi trường nuôi cấy vi sinh

Tùy từng nhóm vi sinh khác nhau mà có môi trường nuôi cấy đặc trưng khác nhau Dưới đây là môi trường đặc trưng được sử dụng cho các nhóm vi sinh khác nhau:

Môi trường phân lập nấm men [11]

Sử dụng môi trường MEA (Malt Extract Agar, Half Strength, ATCC Medium 2418) Thành phần trong 1 lít môi trường gồm: Agar 15g, Malt Extract 10g, pepton 2.5 g, chloramphenicol 100mg/l, chlortetracycline 50mg/l

Môi trường phân lập vi khuẩn acetic [19]

Vi khuẩn sinh acid acetic sử dụng môi trường GYC Agar với thành phần: glucose 50g/l, yeast extract 10g/l, calcium carbonat 30g/l, agar 20g/l, pH = 5,6 chứa 0,1% cyclohexamide để ức chế nấm men và 50mg/l penicillin để ức chế vi khuẩn lactic Ủ khoảng 5-8 ngày ở 25 °C (Drysdale & Fleet, 1988; Ardhana & Fleet, 2003)

Môi trường phân lập vi khuẩn lactic [19]

Đối với vi khuẩn sinh acid lactic, sử dụng môi trường thạch MRS (Merck) nuôi (ủ) trong túi polyethylene kín, 3-4 ngày, 30 °C

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Quả ca cao sau khi thu mua được đập bỏ vỏ, tách hạt để phục vụ cho quá trình lên men Lấy từ khối hạt trên một phần mẫu nhỏ để xác định thành phần nguyên liệu ban đầu, phần còn lại được đưa đi lên men, thời gian lên men 6 ngày

Trong quá trình lên men, sau 24h lại lấy mẫu một lần để phân tích vi sinh, các chủng vi sinh sau khi được phân lập thì được đưa đi giữ chủng để phục vụ cho quá trình nghiên cứu

Sau khi lên men hạt được ngâm trong nước 2h với mục đích làm giảm độ chua của hạt Sau đó hạt được đưa đi phơi khô và cuối cùng là cắt hạt để đánh giá chất lượng hạt sau lên men

Thời gian phơi hạt 6-8 ngày Không nên kéo dài thời gian này vì nó sẽ làm hạt bị mốc, giảm chất lượng hạt sau lên men Tuy nhiên cũng không nên làm khô trong một thời gian quá ngắn vì nó làm hạt bị khô không đều, chất lượng hạt không đảm bảo

Ca cao

Xác định thành phần nguyên liệu ban đầu

Làm khô tự nhiên Lên men

Đánh giá chất lượng

Ngâm trong nước (2h)

Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 24 giờ

Giữ chủng Đếm và phân lập các chủng vi sinh

2.2 Xác định thành phần hóa học ban đầu của nguyên liệu

Đập quả, tách hạt, lên men tự nhiên trong thùng xốp Lấy một phần hạt ca cao tươi trước khi lên men để xác định thành phần hóa học ban đầu

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định một số thành phần, tính chất

của nguyên liệu

Xác định một số thành phần hóa học chính của cơm nhầy trước khi lên men như xác định hàm lượng nước trong cơm nhầy, xác định hàm lượng glucid, hàm lượng đạm tổng số, tỷ lệ cơm/hạt ban đầu và đo độ pH, nhiệt độ của khối hạt

- Xác định hàm lượng ẩm của hạt ca cao theo phương pháp sấy [2]

- Xác định hàm lượng chất khô theo phương pháp nung [2]

- Xác định hàm lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl [2]

- Xác định hàm lượng glucid bằng phương pháp Bertran [2]

Theo dõi (tần suất 24 h) sự biến động về nhiệt độ, độ pH trong suốt quá trình lên men Sau đó vẽ đồ thị thể hiện sự biến đổi của nhiệt độ, độ pH của khối hạt

Đánh giá chất lượng hạt theo phương pháp cắt hạt [24], làm cơ sở cho việc đánh giá sự ảnh hưởng của nguyên liệu và các biến đổi của nhiệt độ, độ pH đến chất

lượng hạt ca cao sau lên men

2.3 Đánh giá chất lượng hạt ca cao

Kiểm tra chất lượng hạt sau lên men theo phương pháp cắt hạt [24]

Xác định tỷ lệ cơm/hạt ban đầu

Xác định hàm lượng glucid

Việc kiểm tra chất lượng hạt có thể được thực hiện bằng cách kiểm tra một

số đặc tính như kích thước hạt, độ ẩm của khối hạt, sự tổn thương vật lý, sự xâm nhập của côn trùng, màu sắc của bề mặt cắt [24]

Sau đó chúng được phân loại như sau: màu nâu hoàn toàn (lên men hoàn toàn), màu nâu một phần, màu tím một phần (lên men một phần), tím (dưới mức lên men), chai xám (không lên men), bị hư hỏng, bị mốc, hoặc nảy mầm [24]

2.4 Tiến hành đếm và phân lập các chủng vi sinh từ ca cao lên men

2.4.1 Phân lập vi sinh

Chọn ngẫu nhiên 25 g hạt ca cao đang ủ lên men, pha loãng trong 225 ml dung dịch muối sinh lý vô trùng, cấy bề mặt trên đĩa thạch đặc trưng đã chuẩn bị, nuôi cấy ở nhiệt độ thường từ 3-5 ngày Chọn ngẫu nhiên 10 khuẩn lạc trên môi trường đặc trưng khác nhau, định danh sơ bộ xác định tỷ lệ các chủng vi sinh B%

Mật độ M của các nhóm vi sinh (CFU / g) được tính theo công thức sau [8]

M (CFU / g) = (Ai x Di / V) x B Trong đó Ai: là số khuẩn lạc trung bình / đĩa ở độ pha loãng Di

Di: là độ pha loãng cấy kiểm tra

V : là thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa (ml)

Bố trí thí nghiệm phân lập các nhóm vi sinh

Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm đếm và phân lập nấm men, vi khuẩn acetic, vi

khuẩn lactic

Các quá trình trên được tiến hành theo trình tự sau:

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy khác nhau cho các nhóm vi sinh vật khác nhau

Mẫu ca cao sau

Giữ chủng

- Lấy mẫu, chuẩn bị nước cất và pha loãng chúng đến nồng độ 10-6

- Lấy 1ml dịch pha loãng cấy trên các đĩa thạch đã được chuẩn bị sẵn, mỗi nhóm cấy 2 đĩa, đem nuôi và đếm số lượng khuẩn lạc

- Xác định thời điểm vi sinh vật của từng nhóm có số lượng lớn nhất

- Phân lập các chủng vi sinh vật chủ yếu trong giai đoạn đó, giữ chủng trên ống thạch nghiêng, sau đó tiến hành định danh chúng

- Xác định thời gian phát triển của nấm men, vi khuẩn trong lên men ca cao bằng phương pháp đếm số lượng tế bào [8]

- Phân lập vi sinh bằng kỹ thuật pha loãng [8]

- Kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật bằng phương pháp cấy ria và soi kính hiển vi [8]

- Giữ giống vi sinh vật bằng phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường [8]

- Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch [8]

2.4.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy các chủng vi sinh

Nấm men

Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào:

- Quan sát khuẩn lạc bằng mắt thường

- Quan sát đặc điểm hình thái tế bào bằng kính hiển vi ở dạng tế bào sống, tế bào chết nhuộm metylen xanh

Dựa vào đặc tính nuôi cấy:

Nấm men được nuôi trên môi trường dịch thể sau 24 h lấy ra quan sát sự phát triển của nấm men trong môi trường dịch thể (tạo thành váng phủ kín, hay không phủ kín, hay lắng xuống dưới, phần lắng có dạng xốp hay dạng nhầy, hay dạng rắn chắc (nếu dùng tay đập nhẹ vào đáy ống nghiệm mà cặn nổi lên thì là cặn xốp, nếu

cặn không nổi lên thì cặn rắn)

Dựa vào khả năng lên men saccarose bằng môi trường nước chiết giá đậu