nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận phlorotannin từ một số loài rong nâu sargassum vùng biển nam trung bộ, đạt tiêu chuẩn làm dược liệu

Vì vậy để thu được sản phẩm khác ngoài sản phẩm chính là polysaccharide từ rong nâu và có thể đánh giá một cách toàn diện nguồn lợi rong biển, định hướng cho việc khai thác sử dụng nguồn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ MINH ĐỨC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN

PHLOROTANNIN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU

SARGASSUM VÙNG BIỂN NAM TRUNG BỘ, ĐẠT

TIÊU CHUẨN LÀM DƯỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ MINH ĐỨC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN

PHLOROTANNIN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU

SARGASSUM VÙNG BIỂN NAM TRUNG BỘ, ĐẠT

TIÊU CHUẨN LÀM DƯỢC LIỆU

Chuyên ngành : Công nghệ Sau thu hoạch

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Lê Minh Đức

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, Viện nghiên cứu ứng dụng và công nghệ Nha Trang sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường và Viện trong thời gian vừa qua

Sự biết ơn sâu sắc của tôi xin được gửi tới Cô: TS Trần Thị Thanh Vân và Thầy: PGS - TS Ngô Đăng Nghĩa đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin được cảm ơn ThS Đặng Xuân Cường, ThS Võ Mai Như Hiếu cùng các bạn công tác tại Phòng thí nghiệm Sinh - Hóa của Viện đã tận tình hướng dẫn và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Đề tài này

Tôi xin được đặc biệt cảm ơn toàn thể Thầy Cô, gia đình và các bạn học đã luôn là chỗ dựa vững chắc, động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 Tổng quan về nguồn nguyên liệu rong biển 4

1.1.1 Phân loại rong biển 4

1.1.2 Sự phân bố và nguồn lợi rong biển 4

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển 5

1.1.4 Tình hình sử dụng, chế biến rong biển ở Việt Nam 6

1.2 Giới thiệu về đặc điểm sinh học và sự phân bố của rong nâu và rong mơ (Sargassum) 8

1.2.1 Đặc điểm và sự phân bố của rong nâu 8

1.2.2 Thành phần hóa học của rong nâu 10

1.2.3 Đặc điểm và sự phân bố của rong mơ (Sargassum ) [4] 12

1.3 Tổng quan về phlorotannin 14

1.3.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực của đề tài 14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.4 Giới thiệu về quá trình trích ly 18

1.4.1 Nguyên lý 18

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 21

1.4.3 Tổng quan về dung môi chiết 21

1.4.4 Tìm hiểu một số loại dung môi chiết trong đề tài 23

1.5 Giới thiệu về một số phương pháp làm sạch và tinh chế phlorotannin 25

1.5.1 Làm sạch phlorotannin bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng 25

1.5.2 Tinh chế phlorotannin bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silicagel 26

1.5.3 Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm tinh bằng phương pháp sắc kí bản mỏng và HPLC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 27

1.6 Tổng quan về quá trình tách chiết 27

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU30

2.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Quy trình dự kiến để nghiên cứu tách chiết phlorotannin 31

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 32

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Xác định một số thành phần hóa học chủ yếu của rong nguyên liệu 37

3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết phlorotannin từ rong nâu 37

3.2.1 Xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa 37

3.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi ethanol : nước 40

3.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 42

3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 44

3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian chiết 46

3.3 Khảo sát quá trình tinh chế phlorotannin 47

3.3.1 Tinh chế phlorotannin bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng 48

3.3.2 Tinh chế phlorotannin bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp thụ là silicagel .50

3.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 52

3.4.1 Phân tích HPLC 52

3.4.2 Phân tích LC-MS 53

3.4.3 Xác định hoạt tính chống oxi hóa của sản phẩm 54

3.5 Định hướng sử dụng chế phẩm làm dược liệu 55

3.6 Sơ đồ quá trình tinh chế 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO i

PHỤ LỤC 1 - CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU iv

PHỤ LỤC 2 - CÁC CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM xi

PHỤ LỤC 3 – BẢNG SỐ LIỆU THU ĐƯỢC SAU THÍ NGHIỆM xviii

PHỤ LỤC 4 – HÌNH ẢNH MỘT SỐ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM xviii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Sản lượng rong biển trên thế giới phân bố theo khu vực 5

Bảng 1.2 Các giống loài rong nâu tìm thấy và phân bố .9

Bảng 1.3 Diện tích rong nâu mọc tự nhiên ở một số tỉnh .10

Bảng 3.1 Thành phần hóa học chính của rong nguyên liệu 37

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa của chất chiết 39

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi ethanol: nước đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa tổng số (tính theo mg AcB) và hoạt tính khử (tính theo mg Fe) của chất chiết xiv

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa tổng số (tính theo mg AcB) và hoạt tính khử (tính theo mg Fe) của chất chiết xiv

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa tổng số (tính theo mg AcB) và hoạt tính khử (tính theo mg Fe) của chất chiết xv

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa tổng số (tính theo mg AcB) và hoạt tính khử (tính theo mg Fe) của chất chiết xv

Bảng 3.7 Thành phần hóa học chính của cao ethanol từ rong nâu 48

Bảng 3.8 Hoạt tính phlorotannin, hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn chiết khác nhau 48

Bảng 3.9 Hệ dung môi rửa giải và khối lượng các phân đoạn 50

Bảng 3.10 Hệ dung môi rửa giải và khối lượng các phân đoạn khi làm sạch bằng sắc kí cột lần 2 51

Bảng 3.11 Hoạt tính chống oxi hóa của phlorotannin và acid ascorbic, butylated hydroxitoluene (BHT) tính theo mg chất 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của phloroglucinol (i) và phlorotannins [tetrafucol A (ii), tetraphlorethol B (iii), fucodiphlorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi),

phlorofucofuroeckol (vii)] (modified after Ragan and Glombitza, 1986) .15

Hình 2.1 Rong mơ Sargassum mcclurei 30

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu 31

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hàm lượng phlorotannin của chất chiết 41

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hoạt tính chống oxi hóa của chất chiết 41

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến hàm lượng phlorotannin trong chất chiết 43

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến đến hoạt tính chống oxi hóa trong chất chiết 43

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng phlorotannin trong chất chiết 45

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxi hóa của chất chiết 45

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng phlorotannin trong chất chiết 46

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của chất chiết 46

Hình 3.9 Sắc kí lớp mỏng của cao phân đoạn EtOAc từ rong Sarrgassum mcclurei 49

Hình 3.10 Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn thu được (từ SEF1 đến SEF10) 51

Hình 3.11 Sắc kí lớp mỏng các phân đoạn thu được (từ SEF72 đến SEF78) 52

Hình 3.12 Mẫu chuẩn phloglucinol (Nga) 53

Hình 3.13 Mẫu tinh chế từ rong S.mcclurei 53

Hình 3.14 Kết quả trên LC-MS của Phloroglucinol (Standart – PIBOX, Russian) 54

Hình 3.15 Kết quả LC-MS của phân đoạn SEF 7.2, SEF 7.3 và SEF 7.4 từ rong Sarrgassum mcclurei 54

Hình 3.16 Sơ đồ quy trình tinh chế phlorotannin từ rong Sarrgassum vùng biển Nam Trung Bộ 56

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AcB : Acid ascorbic BHT : Butylated hydroxitoluene

DM : Dung môi DPPH : Diphenyl-1-picrylhydrazyl HPLC-MS : Sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ NMR :Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NL : Nguyên liệu STT : Số thứ tự

MỞ ĐẦU

Rong biển được xếp vào nhóm tảo thuộc ngành thực vật bậc thấp, có nhiều chủng loại và là thực phẩm rất tốt cho sức khỏe, có thể dự trữ được trong nhiều năm Ngày nay, rong biển đã và đang trở nên phổ biến ở nhiều nước trên thế giới

Đã từ rất nhiều năm trước đây nhân dân vùng ven biển nước ta đã biết khai thác rong biển làm thức ăn thay rau xanh hàng ngày hoặc nấu thành thạch để giải khát

Thông dụng nhất là một số loài trong chi rong cải biển (Ulva), chi rong mơ (Sargassum), chi rong câu (Gracilaria), chi rong mứt (Porphyra) và chi rong đông (Hypnea) Tuy nhiên số lượng khai thác sử dụng không nhiều và chưa thực sự trở

thành hàng hoá Nhưng từ những năm 1960 trở lại đây thì mức độ khai thác và sử dụng rong biển đã tăng lên rất nhanh do kết quả của các công trình nghiên cứu xác định giá trị kinh tế và công nghệ chế biến một số loài rong biển Các loài rong thực phẩm đã được phơi khô, rửa sạch bán trên thị trường Một số loại rong nguyên liệu chiết suất keo công nghiệp như agar, alginate đã được khai thác với số lượng lớn, hàng trăm tấn khô mỗi năm Những năm đầu 1990 sản lượng rong câu khô đạt trên dưới 2000 tấn khô/năm Rong dược liệu đã được các cơ quan chuyên ngành nghiên cứu sử dụng Một

số loài được dùng làm thức ăn gia súc với mức khai thác đáng kể Cho dù chưa có quy hoạch xứng tầm, nhưng nguồn tài nguyên biển Việt Nam là điều mơ ước của nhiều nhà đầu tư, trong đó có việc nuôi trồng rong biển sản xuất thực phẩm, thức uống, làm nguyên liệu công nghiệp và nhiên liệu sinh học

Rong mơ Sargassum là một giống tảo lớn (macroalgae) thuộc họ rong mơ

Sargassaceae sống trôi nổi trong nước Trong điều kiện tự nhiên các loài rong mơ phát

triển dưới mực thủy triều, chân bám vào các nền đá gần bờ, vào các rạn san hô hay các bãi đá cuội Nhưng khi bị sóng cuốn lên mặt nước chúng vẫn tiếp tục sống, sinh sản vô tính, và rồi trôi dạt vào bờ Đặc biệt trong mấy năm gần đây rong mơ được chú ý như nguồn sinh khối khổng lồ, dễ nuôi trồng, mau phát triển và lại cũng dễ khai thác khả dĩ làm nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học

Phlorotannin là một trong những hợp chất chuyển hóa thứ cấp phổ biến nhất trong 4 nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp được tìm thấy trong rong biển Chúng khác với 3 nhóm chất còn lại là ở chỗ chỉ được tìm thấy trong rong nâu và có hàm lượng lớn nhất, biến đổi từ 20-250 mg/g rong khô tùy theo vị trí địa lý và điều kiện môi trường

mà cây rong sinh sống Theo các nghiên cứu trên thế giới, các hợp chất phlorotannin

không chỉ được biết đến như là một chất chống oxi hóa mà kết quả thử hoạt tính chống vi sinh vật của chúng trên 02 dòng vi khuẩn Gr (+) và Gr (-) cho thấy chúng còn

có khả năng kháng khuẩn mạnh

Nước ta có nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú với hơn

100 loài, phân bố tại các thủy vực khác nhau dọc theo hơn 3.200 km bờ biển và có thể

tự tái tạo lại được bằng phát triển tự nhiên Tuy nhiên những nghiên cứu về rong nâu

ở nước ta nói chung và rong mơ nói riêng chủ yếu tập trung vào điều tra, di giống, phân loài, công nghệ thu nhận alginate, fucoidan, iod và có rất ít các công trình công

bố về các chất chuyển hóa thứ cấp trong đó có phlorotannin là những chất bị loại bỏ khi sản xuất alginate, fucoidan, ethanol từ rong nâu Những nghiên cứu ban đầu về phlorotannin mới chỉ tập trung vào phân tích định lượng, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ đến khả năng tổng hợp phlorotannin

và so sánh hàm lượng phlorotannin của các loài rong nâu tại các vùng biển khác nhau trên thế giới Vì vậy để thu được sản phẩm khác ngoài sản phẩm chính

là polysaccharide từ rong nâu và có thể đánh giá một cách toàn diện nguồn lợi rong biển, định hướng cho việc khai thác sử dụng nguồn lợi rong biển hợp lý ở nước ta thì một trong những yêu cầu cấp thiết được đặt ra và cần được tiến hành đó là nghiên cứu cấu trúc, xây dựng qui trình tách chiết và sàng lọc các hoạt tính sinh học của phlorotannin từ rong nâu Từ kết quả thu được là cơ sở để xây dựng công nghệ tích hợp và nâng cao hiệu quả chế biến rong nâu tạo ra sản phẩm dược liệu

Cho đến thời điểm này, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề nói trên Vì

vậy, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận phlorotannin từ một số loài rong

nâu Sargassum vùng biển Nam Trung bộ, đạt tiêu chuẩn làm dược liệu” là cần thiết, góp

phần mở rộng nguồn nguyên liệu về dược liệu, công nghệ sinh học và nông nghiệp

Tính khoa học của đề tài

- Kết quả của đề tài là tập hợp có hệ thống các thông số chiết tách dịch chiết

phlorotannin từ một số loài rong mơ (Sargassum)

- Kết quả của đề tài cũng cung cấp hệ thống các giá trị khoa học mới về dịch chiết

của loài rong mơ (Sargassum) có hoạt tính kháng oxi hóa từ đó định hướng sử dụng

làm dược liệu

Tính thực tiễn của đề tài

- Thành công của đề tài sẽ góp phần cung cấp dữ liệu mới về dược tính của rong biển cho ngành y học, sinh học, công nghệ thực phẩm và nông nghiệp, góp phần đa

dạng hóa sản phẩm và mở rộng thị trường dược liệu từ rong biển đồng thời khắc phục tình trạng nhập khẩu dược liệu hiện nay, hạn chế sự lãng phí nguồn nguyên liệu rong biển Việt Nam

- Ngoài ra, thành công của đề tài cũng góp phần giải quyết tình trạng ô nhiễm môi trường hiện nay của Việt Nam, cung cấp thêm các thông số khoa học bổ sung vào các tài liệu phục vụ cho giảng dạy ngành Công nghệ Thực phẩm, ngành Công nghệ Sinh học và là cơ sở cho các công trình nghiên cứu về dược tính rong biển tiếp theo

Mục tiêu của đề tài

- Đưa ra được quy trình tinh chế phlorotannin từ chi rong mơ (Sargassum) Việt Nam

- Thử một số hoạt tính (hoạt tính chống oxi hóa) của chế phẩm phlorotannin chiết

từ rong mơ Việt Nam, định hướng sử dụng chế phẩm làm dược liệu

Nội dung nghiên cứu

- Xác định một số thành phần hóa học chủ yếu của nguyên liệu và của chất chiết khô

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chiết phlorotannin

- Nghiên cứu các thông số thích hợp cho quá trình chiết – tách và tinh chế

phlorotannin từ rong nâu Sargassum, từ đó tối ưu hóa quy trình tinh chế

- Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm thu được

- Thử hoạt tính chống oxi hóa của chế phẩm phlorotannin thu được, từ đó có định hướng sử dụng làm dược liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về nguồn nguyên liệu rong biển

1.1.1 Phân loại rong biển

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành 9 ngành sau:

1 Ngành rong silic (Bacillariophyta)

2 Ngành rong lục (Chlorophyta)

3 Ngành rong kim (Chrysophyta)

4 Ngành rong nâu (Phaeophyta)

5 Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

6 Ngành rong lam (Cyanophyta)

7 Ngành rong vàng (Xanthophyta)

8 Ngành rong khuê (Bacillareonphyta)

9 Ngành rong giáp (Pyrophyta)

Trên thế giới có khoảng 6000 loài rong biển đã được xác định Trong 09 ngành

rong nói trên, 03 ngành có giá trị kinh tế cao là rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Phaeophyta) và rong đỏ (Rhodophytes) Trong 03 ngành rong kinh tế kể trên thì rong

nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng được lưu ý nhất nhờ khả năng cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học quý báu như các polyme sinh học (fucoidan, laminaran, polyuromannan, alginate) và các chất chuyển hóa thứ cấp như alkaloids, phlorotannin, acetogenins, và terpenes Ước tính tổng trữ lượng rong biển ven bờ tây vịnh Bắc Bộ đạt khoảng 65.000 tấn Trữ lượng nguồn tài nguyên rong biển ước tính đạt hàng trăm nghìn tấn/ năm Riêng rong câu nâu trữ lượng khoảng 10.000 tấn khô/năm

1.1.2 Sự phân bố và nguồn lợi rong biển

1.1.2.1 Sự phân bố

Rong biển thường phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triều sâu và vùng biển cạn,…Rong đỏ và rong nâu là 02 đối tượng được nghiên cứu với sản

lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và đời sống

Các yếu tố sinh thái biển có ảnh hưởng đến đời sống rong biển như: địa bàn sinh trưởng, nhiệt độ, ánh sáng, độ muối, độ pH, muối dinh dưỡng, khí hòa tan, mức triều, sóng , gió, hải lưu Các yếu tố này chính là các điều kiện xác định vùng phân bố

của các loài rong tảo biển khác nhau trong cùng một chi

1.1.2.2 Nguồn lợi rong biển trên thế giới

Nguồn lợi rong biển trên thế giới là rất lớn, song sản lượng rong được khai thác

và sử dụng hàng năm không đều Sản lượng rong biển trên thế giới phân bố theo khu vực được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Sản lượng rong biển trên thế giới phân bố theo khu vực [6]

Tên khu vực Sản lượng rong biển để sản xuất các loại keo (tấn)

Alginate Agar Carrageenan và fucellaran Châu Á 4570 18088 17900

1.1.2.3 Nguồn lợi rong biển ở Việt Nam

Theo thống kê Việt Nam có khoảng 794 loài rong, được phân bố ở vùng biển miền Bắc 310 loài, ở miền Nam 484 loài và 156 loài đã phát hiện thấy ở cả hai miền

Trong đó 90 loài đã sử dụng, cho chế phẩm công nghiệp 24 loài, dược liệu 18 loài,

thực phẩm 30 loài, thức ăn gia súc 10 loài và phân bón 8 loài Nguồn rong mọc tự nhiên chủ yếu là rong nâu Theo ước tính tổng trữ lượng rong biển ven bờ tây vịnh Bắc

Bộ đạt khoảng 65.000 tấn Trữ lượng nguồn tài nguyên rong biển ước tính đạt hàng trăm nghìn tấn/ năm Riêng rong câu nâu trữ lượng khoảng 10.000 tấn khô/năm

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển

Việt Nam có nhiều loài rong biển, hiện đã tìm thấy gần 700 loài rong biển có

kích thước lớn, trong đó họ rong biển Sargassum (hay còn gọi là tảo mơ) là loài có sản

lượng tự nhiên cao nhất và thành phần loài phong phú nhất

Rong biển Sargassum có khả năng tích luỹ hàng loạt các nguyên tố với hệ số

tập trung cao, nồng độ của các nguyên tố này trong tro của chúng có thể gấp hàng vạn lần so với nước biển Có 23 nguyên tố là Al, Si, Mg, Ca, Sr, Ba, Fe, V, Mor, Ti, Co,

Ni, Cr, Sn, As, Bi, Cu, Pb, Zn, Ga, Be, Na và K

Những nghiên cứu của Phân viện Khoa học vật liệu Nha Trang về hàm lượng

trong rong biển Sargassum ở vùng Hòn Chồng, Nha Trang năm 1995 cho thấy nguyên

tố Mg có hàm lượng khá cao từ 2,92 đến 9,45 x 10-3g/g; sắt có hàm lượng cỡ 10-4, còn

lại Cr, Mr, Co, Ag có hàm lượng cỡ 10-6 Ðặc biệt trong rong có chứa một lượng khá lớn nguyên tố strontium (Sr), cỡ 10-3g/g từ nước biển với lượng tích tụ cao hơn khoảng

100 lần hàm lượng trong nước biển Người ta còn phát hiện chất natri alginate chiết từ

rong biển Sargassum có thể chữa được bệnh nhiễm phóng xạ vì chất này uống vào sẽ

hấp thu Sr phóng xạ đã bị nhiễm trong cơ thể rồi thải ra ngoài

Ngoài ra còn có một loại đường khác là mannitol ở trong vách tế bào có tác

dụng trong chữa bệnh tiểu đường Hàm lượng protein trong rong biển Sargassum

chiếm từ 5 – 15% tổng lượng khoáng chiếm từ 20 – 40% bao gồm các nguyên tố cần

thiết như iod có hàm lượng từ 0,08 đến 0,34% làm cho rong biển Sargassum có đặc

tính có thể chữa bệnh bướu cổ

Rong Sargassum còn có các phospholipit dùng trong y dược và các hợp chất có

hoạt tính sinh học khác được nhân dân ven biển dùng để nấu canh hay kho với thịt cá như một loại rau Vào mùa nóng ngư dân nấu nước pha đường uống như một thứ

nước giải nhiệt Trong Đông y, rong biển Sargassum khô là một loài dược thảo

Chúng được ngâm vào nước nóng và uống như trà để chữa bệnh bướu cổ và cung cấp các nguyên tố vi lượng khác

Do có giá trị dinh dưỡng và phòng chữa bệnh cao nên ngày nay nhiều nước đã

và đang phát triển công nghiệp chế biến rong thành các sản phẩm thực phẩm, thuốc để bán rộng rãi trong các cửa hàng thực phẩm và hiệu thuốc Sự chú ý lớn được hướng tới

là chất lượng của các loài rong biển cũng như các sản phẩm cuối cùng và bán thành phẩm dựa trên cơ sở của chúng Chính điều này đang mở ra một triển vọng to lớn cho một lĩnh vực chế biến hải sản mới là chế biến rong biển Điều đang được quan tâm lớn

là cần thiết phải nghiên cứu các đặc tính sinh hóa và khả năng nhạy cảm của nguyên liệu rong để xác định công nghệ chế biến và chế tạo ra các máy móc thiết bị chế biến phù hợp

1.1.4 Tình hình sử dụng, chế biến rong biển ở Việt Nam

1.1.4.1 Tình hình sử dụng và chế biến rong biển nói chung

Mặc dù được thiên nhiên ưu đãi về biển nhưng sự đầu tư phát triển nuôi trồng, chế biến khai thác rong biển còn hạn chế và chưa có hiệu quả Ngành công nghiệp chế biến rong biển chưa phát triển, hiện nay chỉ mới có nhà máy cá hộp Hạ Long - Hải Phòng sản xuất với công suất nhỏ Năm 1985, Bộ Thủy sản xuất khẩu được 150 tấn và năm 1986 được 100 tấn rong khô cho Nhật Bản Nhu cầu alginate và agar ngày càng

tăng, có nhiều cơ sở công nghiệp phải mua alginate của Nhật Bản với giá khá cao Trong thời gian tới nền công nghiệp càng phát triển thì nhu cầu về alginate, agar và các keo rong khác sẽ còn tăng gấp bội Nếu được đầu tư và phát triển đúng mức, công nghệ rong biển sẽ mang lại hiệu quả lớn cho nền kinh tế nước nhà

1.1.4.2 Chất lượng quy trình công nghệ sản xuất rong tại Việt Nam

Chất lượng quy trình công nghệ ở Việt Nam nhìn chung mới sản xuất được các chế phẩm thô, chưa có công nghệ sản xuất chế phẩm tinh Một số nghiên cứu gần đây của trường Đại học Nha Trang, Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang, đã tập trung vào giải quyết các vấn đề này Tuy nhiên có rất ít các công trình được triển khai thực tế, còn phần lớn dừng lại ở qui mô phòng thí nghiệm

1.1.4.3 Tình hình chế biến thực phẩm từ nguồn nguyên liệu rong biển ở Việt Nam

và một số ứng dụng của nó trong việc phòng và chữa bệnh

Rong biển là nguồn nguyên liệu quý, có khả năng giúp cho cơ thể phòng chống được một số loại bệnh Do vậy nhiều nước trên thế giới giành khoản ngân sách khá lớn cho việc nghiên cứu ứng dụng sản xuất thực phẩm từ rong biển

Rong biển là thức ăn rất giàu bột đường, chất xơ, đạm, sinh tố và chất khoáng Hàm lượng sinh tố A trong rong biển cao gấp 2-3 lần so với cà rốt, hàm lượng canxi cao gấp 3 lần so với sữa bò, vitamin B2 cao gấp 4 lần trong trứng Rong biển ở Nhật Bản được biết đến như là một thực phẩm giúp con người có thể trường thọ

Những loài rong biển thực phẩm nổi tiếng như kombu (Laminaria) của Trung Quốc, wakame (Undaria pinnatifida) của Hàn Quốc đều có giá bán rất cao, đặc biệt loại rong nori (Porphyra) của Nhật Bản có giá xấp xỉ 20.000 USD một tấn

Hiện nay trên thị trường sản xuất rất nhiều chế phẩm từ rong biển dạng thuốc như rong xoắn Spirulina L-Carnitine (khoáng chất), BluBio; rong xoắn Spirulina Diat Drink, BluBio; rong xoắn Spirulina Selen, BluBio; rong lục greengem; rong Beauty Spirulina các chế phẩm dạng khác như thực phẩm chức năng ăn kiêng Spirulina thực phẩm Diat Drink (Spirulina Diet Drink) ngoài ra còn có chất chiết từ tảo còn được dùng trong một số sản phẩm như thuốc đắp, thuốc làm mặt nạ, kem hoặc dùng để tắm

Riêng rong đỏ Asparagopsis có tính năng diệt khuẩn và nấm, giúp chống mụn và hiện

tượng gàu

Ở nước ta, thực phẩm từ rong biển chưa thực sự được chú ý, là một vấn đề còn đang bỏ ngỏ Một số cơ sở chế biến nhỏ tại gia đình như: làm gỏi, nấu thạch, đông sương, mứt, kẹo, chè rong biển, …món ăn đặc sản được chế biến từ rong biển như gỏi,

nộm, canh rong biển, rong biển xào tôm thịt, rong biển hầm sườn non, rong biển chiên… Tuy nhiên các sản phẩm này chưa nhiều, chưa phổ biến, rất ít người dân biết đến các loại thực phẩm đặc biệt này

Một số ứng dụng trong phòng chữa bệnh của rong biển cần phải kể tới như:

- Làm sạch ruột, ngừa táo bón- Giảm huyết áp: Trong rong biển hàm chứa một lượng chất khoáng rất phong phú Thực tế, khoa học đã chứng minh rằng rong biển hấp thu từ nước biển hơn 90 loại khoáng chất với hàm lượng muối thấp và canxi cao Chính vì lẽ đó mà rong biển là thực phẩm được ưu tiên hàng đầu đối với những người

bị cao huyết áp

- Giảm cholesterol: Cuộc sống ngày nay ai cũng sợ các thực phẩm giàu cholesterol, nguyên nhân gây nên bệnh béo phì Vậy nên các thực phẩm với hàm lượng calo thấp, nhưng vẫn đảm bảo ngon miệng như rong biển đang rất được coi trọng

- Diệt khuẩn, làm sạch máu: Thành phần quan trọng nhất có trong rong biển là fertile clement Đây là chất có tác dụng điều tiết máu lưu thông, tiêu độc, loại bỏ các cặn bã có trong cơ thể Thêm vào đó, nó còn là chất không thể thiếu của tuyến giáp trạng, nơi tiết ra hooc-môn sinh trưởng, giúp cơ thể phát triển

Đặc biệt, gần đây, đã có một số công trình công bố về hoạt tính chống viêm nhiễm, kháng vi sinh vật kiểm định, chống dị ứng, chống ung thư, kháng vi rút HIV và điều hòa đường huyết của chất chiết phlorotannin từ rong biển, mở ra tiềm năng rất lớn trong việc chế biến tạo ra các sản phẩm dược liệu để chữa một số bệnh

Mặc dù rong biển được biết đến là nguồn nguyên liệu có giá trị dinh dưỡng và phòng chữa bệnh cao nhưng các sản phẩm ứng dụng chế biến từ rong biển, đặc biệt là các sản phẩm làm dược liệu chưa nhiều Do đó cần phải có kế hoạch phát triển mạnh hơn tiến tới ứng dụng chế biến rong biển phải phong phú hơn, sản xuất theo qui mô công nghiệp trong điều kiện vệ sinh an toàn cao để phục vụ tiêu dùng nội địa và xuất khẩu

1.2 Giới thiệu về đặc điểm sinh học và sự phân bố của rong nâu và rong mơ

(Sargassum)

1.2.1 Đặc điểm và sự phân bố của rong nâu

Ngành rong nâu (Phaeophyta): Có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở

biển Số chi, loài tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm

Rong có cấu tạo nhiều tế bào dạng màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn thành dạng cây

có gốc, rễ, thân, lá Rong sinh trưởng ở đỉnh (apical), ở giữa, ở gốc các lóng Ngoài ra,

do các tế bào rong dạng phiến chia cắt sinh trưởng khuyếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt [4]

Theo số liệu nghiên cứu nguồn lợi rong nâu có giá trị ở vùng biển Quảng Nam,

Đà Nẵng, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận cho thấy khu vực miền Trung và Nam Trung Bộ trữ lượng rong lớn và chất lượng cao Các giống loài rong nâu tìm thấy và

trữ lượng ở vùng biển một số địa phương miền Trung Việt Nam thể hiện trên bảng 1.2

Bảng 1.2 Các giống loài rong nâu tìm thấy và phân bố [6]

Khánh Hòa

Ninh Thuận

1 Sargassum mcclurei x x x x

2 Sargassum graminifolium (rong mơ tro lá nhánh) x

tìm thấy ở Việt Nam) x

4 Sargassum siliquosum

5 Sargassum congkinhii x x

6 Sargassum crassifolium x

7 Sargassum patens var vietnamese Dai x

8 Sargassum quinhonense Dai x

9 Sargassum polycystum x x

10 Sargassum kjellmanianum x x

11 Sargassum microcystum x

12 Turbinaria ornata (rong cùi bắp) x x

13 Padina australis (rong cánh quạt) x x

14 Padina tetrastromatica (rong quạt 4 lớp) x

Rong nâu phân bố tại vùng biển Quảng Nam - Đà Nẵng không nhiều so với vùng biển Khánh Hòa và Ninh Thuận Quảng Nam- Đà Nẵng tuy có nhiều triền đá dốc, bãi đá cội, bãi san hô chết nhưng có chiều ngang rất hẹp (1 đến 10m) nên diện tích phân bố rất nhỏ, trữ lượng không cao

Khánh Hòa có nhiều vùng rong như Hòn Chồng, Bãi Tiên, bán đảo Cam Ranh, Hòn Tre và một số đảo khác Trong đó vùng Hòn Chồng, Bãi Tiên là hai vùng tiếp giáp nhau có các điều kiện thuận lợi cho rong mọc với mật độ khá dày đặc, sinh lượng trung bình khá cao p0 lên tới hơn 5,5 kg/m2 Vùng Hòn Chồng, Bãi Tiên là vùng rong lớn, dễ khai thác nhất, nó nằm ngay bên cạnh đường lộ và rong mọc tập trung gần bờ

Sinh lượng rong mọc tại chỗ đo được đều có xu hướng giảm dần từ tháng 3 đến tháng 5 Nhưng về độ trưởng thành thì ngược lại Vào tháng 3 rong hãy còn non, thể hiện ở kích thước còn bé, chưa phóng thích các bào tử, thành phần các chất tích lũy được hãy còn thấp Đa phần các loài rong trưởng thành vào tháng 4 đầu tháng 5, do vậy tốt nhất là nên thu hoạch rong vào tháng 4 và những tháng sau đó để rong đã trưởng thành, phóng thích các giao tử, nhằm duy trì và bảo vệ nguồn lợi rong cho những năm sau

Sản lượng rong nâu trung bình 18.000 tấn tươi/vụ Diện tích rong nâu mọc tự nhiên ở một số tỉnh duyên hải miền Trung thể hiện trên bảng 1.3

Bảng 1.3 Diện tích rong nâu mọc tự nhiên ở một số tỉnh [6]

Các địa danh Diện tích

(m 2 )

Năng suất sinh lượng

(kg/m 2 )

Mùa vụ (tháng)

Sắc tố trong rong nâu là diệp lục tố (chlorophyl), diệp hoàng tố (xantophyl), sắc

tố màu nâu (fucoxanthin), sắc tố đỏ (caroten) Tùy theo tỉ lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục Nhìn chung sắc tố của rong nâu khá bền

Mannitol tan được trong alcol, dễ tan trong nước, có vị ngọt, hàm lượng từ 14 đến 25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý nơi sinh sống

Trong quá trình bảo quản rong khô, có hiện tượng xuất hiện các đốm trắng trên thân cây rong, đó là hỗn hợp muối và đường mannitol theo tỉ lệ: muối 60 - 80%, mannitol

20 - 40% Rong bảo quản không tốt, độ ẩm cao làm cho mannitol bị phá hủy

b Polysaccharid

- Alginate: là một polysaccharide tập trung ở vách tế bào, là thành phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong nâu

Hàm lượng alginate trong các loại rong nâu khoảng 2 – 4% so với rong tươi và

13 – 15% so với rong khô Hàm lượng này tùy thuộc vào loài rong và vị trí địa lý, môi trường mà rong sinh sống

Hàm lượng alginate trong rong nâu ở các tỉnh miền Trung Việt Nam thường cao nhất vào tháng 4 trong năm, dao động từ 12,3 đến 35,9% so với trọng lượng rong khô tuyệt đối, tùy thuộc vào loài và vùng địa lý Nếu so sánh các vùng biển thì rong biển vùng biển Khánh Hòa có hàm lượng alginic cao hơn cả (từ 26,2 đến 39,4% rong khô tuyệt đối) [6]

- Acid fuccinic: có tính chất gần giống acid alginic Acid fuccinic tác dụng với acid sunfuric tạo hợp chất có màu phụ thuộc vào nồng độ acid sunfuric Nhờ có tính chất này mà acid fuccinic được ứng dụng vào sản xuất tơ sợi màu, phim ảnh màu

Muối của acid fuccinic với kim loại gọi là fucxin Fuccinic tác dụng với iod cho sản phẩm màu xanh

- Fucoidin: là loại muối giữa acid fucoidinic với các kim loại hóa trị khác nhau như: Ca, Cu, Zn Fucoidin có tính chất gần giống alginate, nhưng hàm lượng thấp hơn alginate

- Laminarin: là tinh bột của rong nâu, thường ở dạng bột, không màu, không mùi, có 2 loại: loại hòa tan và loại không hòa tan trong nước

Laminarin được hình thành từ các gốc D-glucans kết hợp với nhau bằng các liên kết β-1 đến 3 và một ít liên kết β-1 đến 6, gốc đường cuối mạch của một số phân

tử có thể có các gốc manitol (M-series) hoặc vẫn là glucose (G-series) Laminarin có hàm lượng từ 10 - 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc loài rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong nâu

- Cellulose: là thành phần tạo nên cây rong, hàm lượng cellulose trong rong nâu nhiều hơn trong rong đỏ

1.2.2.3 Protein

Protein của rong nâu không cao lắm nhưng khá hoàn hảo Do vậy, rong nâu có thể sử dụng làm thực phẩm Protein của rong nâu thường ở dạng kết hợp với iod tạo iod hữu cơ như: monoiodinzodizin, diiodinzodizin Iod hữu cơ rất có giá trị trong y học Do vậy, rong nâu còn được dùng làm thuốc phòng chống và chữa bệnh bướu cổ (Basedow) Hàm lượng protein trong rong nâu vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05 – 21,11% so với trọng lượng rong khô [6] Hàm lượng acid amin cũng đáng kể và có giá trị cao trong protein của rong biển

1.2.2.4 Chất khoáng

Hàm lượng các chất khoáng trong rong nâu thường lớn hơn nước biển Chẳng hạn: iod của rong nâu lớn hơn nước biển từ 80 - 90 lần, hàm lượng bari lớn hơn trong nước biển 1800 lần Một số loài rong nâu có khả năng hấp thụ một số chất phóng xạ,

do đó có thể dùng rong nâu để xác định độ nhiễm phóng xạ của một vùng địa lý nào

đó Hàm lượng khoáng của các loài rong nâu Nha Trang dao động từ 15,51- 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ, thời kỳ sinh trưởng Trong rong nâu có đầy đủ các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng như: Na, K, Ca, Fe, Mg, Mn, Cu,…

Trong rong nâu, iod là thành phần khoáng vi lượng được quan tâm nhất Iod trong rong nâu tồn tại chủ yếu ở dạng hợp chất hữu cơ, một phần ở dạng vô cơ Các hợp chất iod trong rong nâu có tính tan trong nước nên khi rong bị dập nát rất dễ bị hao tổn iod Hàm lượng iod trong một số loài rong nâu dao động từ 0,05 - 0,16% so với rong khô tuyệt đối Sự biến đổi hàm lượng iod khá rõ rệt, thường vào mùa đông, rong nâu có hàm lượng iod cao hơn mùa hè

1.2.2.5 Hỗn hợp phenolic

Theo Ragan và Glombitza [23], hợp chất phổ biến trong rong nâu thuộc nhóm phlorotanninic là phlorotannin Phlorotannin là chất chuyển hóa thứ cấp, xuất hiện chủ yếu ở các mô, tại đó, nồng độ có thể tới 20% so với khối lượng tịnh của rong biển Schoenwaelder (2002) [25] chỉ ra một số chức năng của chúng như tăng tính liên kết

và độ chắc cho thành tế bào phlorotanninorotannin hấp thụ bước sóng UV, chủ yếu là UVC và một phần UVB, với cực đại tại 195nm và 265nm

1.2.3 Đặc điểm và sự phân bố của rong mơ (Sargassum ) [4]

Rong mơ Sargassum là một giống tảo lớn (macroalgae) thuộc họ rong mỡ

Sargassaceae sống trôi nổi trong nước

Mô tả: Rong mọc thành bụi lớn, cao 40-60cm, hoặc hơn, màu nâu vàng hay nâu ôliu Thân chính dạng trục tròn, dài 0,7-1,2m, có nhiều mấu lỗi nhỏ Nhánh chính trụ dẹp, các nhánh thứ cấp trụ tròn, dài 5-6cm, mọc theo kiểu lông chim không theo quy luật về hai phía của nhánh chính, trên đó mọc ra nhiều chùm nhánh bên nhỏ, ngắn Lá hình bầu dục dài hay dạng kim lớn, số lượng nhiều, đặc biệt là phần ở gốc; thường chia nhánh, dài 3,5 - 6,5cm, rộng 3 - 8mm; mép nhẵn hay có răng cưa, đôi khi có răng cưa kép, có ổ lông, có gân giữa Thân cây có dạng trụ gần tròn, màu từ xanh ô liu đến nâu, có khi mọc dài đến một vài mét bao gồm một chân bám, một bộ cuống dài phân nhánh và bộ lá mang theo các túi sinh dục (noãn, phấn) Nơi một số loài mọc ra nhiều túi khí hình cầu giúp cây đứng thẳng nhờ đó bộ lá dễ dàng quang hợp Nơi một số loài khác có thân khá nhám để bấu vào nhau nhằm giữ cho cây khỏi bị cuốn trôi nơi dòng chảy mạnh Trong điều kiện tự nhiên các loài rong mơ phát triển dưới mực thủy triều, chân bám vào các nền đá gần bờ, vào các rạn san hô hay các bãi đá cuội Nhưng khi bị sóng cuốn lên mặt nước chúng vẫn tiếp tục sống, sinh sản vô tính, và rồi trôi dạt vào bờ

Ở nước ta, số loài rong mơ nơi vùng biển phía Bắc nhiều hơn, bao gồm các loài

quen thuộc như rong mơ sừng dài Sargassum sliquarum, rong mơ mảnh S grucillium, rong mơ tro S glaucescens, rong mơ thỏi gai S cinereum, rong mơ chổi S virgatum và rong mơ lá dài S augustifolium Nhưng trữ lượng rong mơ lại lớn hơn nhiều lần nơi

các vùng bờ miền Trung, miền Nam và nơi vùng hải đảo Đặc biệt chúng phát triển rất mạnh với mật độ cá thể cao ở Hòn Chồng và Bãi Tiên thuộc tỉnh Khánh Hòa, và ở Sơn

Hải, Cà Ná, Mỹ Tân thuộc tỉnh Ninh Thuận với hai loài chính là S polycystum và S

kjillmanianum tức loài S muticum đang được nhiều nước nuôi trồng khai thác kinh tế

Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang đã chủ trì thực hiện đề tài

“Đánh giá hiện trạng và nghiên cứu giải pháp bảo vệ nguồn lợi rong mơ (Sargassum)

tại Khánh Hòa” do Bùi Minh Lý làm chủ nhiệm đã cho thấy: điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của rong mơ như nhiệt độ từ 24-310C, độ mặn từ 25-34,5‰, nền đáy cứng là đá tảng và san hô chết phân bố phổ biến; rong mơ là loài ưu thế nhất ở các khu vực được thể hiện qua các thông số như trữ lượng chiếm 98% tổng trữ lượng của bãi rong, độ bao phủ trung bình đạt 43,71%, mật độ cây trung bình 43,8±20,2 cây/m2

và sinh lượng trung bình đạt 456.1±64,2 g khô/m2; các quần thể rong mơ có một kiểu chu trình phát triển, chúng chỉ có một thời điểm cho sinh lượng và sinh sản cao nhất trong năm; diện tích phân bố các thảm rong mơ được ước tính là 1167,33 ha, trữ lượng 7302,12 tấn khô/năm, tập trung ở 4 khu vực chính như sau: Vịnh Vân Phong, đầm Nha

Phu, vịnh Nha Trang và vịnh Cam Ranh; người dân ven biển chỉ khai thác khoảng 60% tổng trữ lượng rong mơ trong năm 2008; sự tương quan giữa chiều dài với trọng lượng các thể của các loài rong mơ có giá trị trung bình là 0,7 và giữa chiều dài với sinh lượng là 0,78 Rong mơ phân bố phổ biến từ 0 m hải đồ cho đến chiều sâu 15 m nước; mùa vụ khai thác rong mơ được phân làm 3 thời điểm theo 3 vùng: vùng bãi rong cạn, sâu và cạn ngầm; khi cắt rong mơ chừa thân chính 10 cm là tốt nhất để rong

mơ có khả năng tái phát triển và hình thành thêm thỏi sinh sản

1.3 Tổng quan về phlorotannin

1.3.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực của đề tài

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về phlorotannin từ thực vật trên đất liền đã

và đang được triển khai tại các Viện nghiên cứu, trường đại học cũng như các cơ sở sản xuất như: Đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh, Đại học Đà Nẵng, Viện Hóa học công nghiệp… Đối tượng nghiên cứu được quan tâm nhiều nhất là polyphenol từ lá trà

Ngược lại với polyphenol từ thực vật trên cạn, các nghiên cứu về phlorotannin từ thực vật biển nói chung và rong biển nói riêng rất ít, chỉ có một vài công bố của nhóm nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang trong vài năm gần đây đề cập đến hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dung dịch chiết cồn và quy trình

chiết phlorotannin từ loài rong nâu thuộc chi Dictyota

Bùi Minh Lý và cộng sự [6] đã đưa ra quy trình chiết phlorotannin từ loài rong

Dictyota dichotoma tối ưu để thu được hiệu suất chiết phlorotannin cao nhất như sau:

Tỉ lệ dung môi (cồn ethanol : nguyên liệu) thích hợp là 2,5:1 đến 3:1, nhiệt độ chiết

500C sau 24 giờ

Trong báo cáo Trần Thị Thanh Vân và cộng sự [7] đã đưa thành phần của dịch

chiết ethanol của rong nâu thuộc 03 chi (Sargassum, Dictyota, và Turbinaria) bao

gồm: phlorotannin, iod hữu cơ, acid béo và lượng nhỏ các chất terpenoid, alkaloid,

….Đặc biệt với dịch chiết ethanol từ chi rong Dictyota có chứa các chất terpenoid,

alkaloid nhiều hơn hai chi còn lại Điều này gợi ra hướng công nghệ chiết phân đoạn dịch chiết này để có thể thu được các chất có hoạt tính khác trong rong nâu

Nói chung, ở nước ta, tình hình nghiên cứu chiết rút các thành phần hoá học phổ biến trong rong nói chung thì rất nhiều, nhưng thu nhận phlorotannin và thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng, định hướng sử dụng làm dược liệu còn rất ít

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.3.2.1 Đặc điểm và cấu trúc phlorotannin

Mặc dù đã được biết đến từ năm 1986 với tên là “phlorotannin” do trong thành phần của chúng gồm các monome phloroglucinol nhưng những nghiên cứu ban đầu về phlorotannin mới chỉ tập trung vào phân tích định lượng, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ đến khả năng tổng hợp phlorotannin

và so sánh hàm lượng phlorotannin của các loài rong nâu tại các vùng biển khác nhau trên thế giới

Theo Ragan M A [23] thì phlorotannin được định nghĩa như sau: chúng là polyme sinh học được hình thành từ gốc phloroglucinol (1,3,5 trihydroxibenzen) (Hình 1.1, i) và có thể cấu thành lên đến 15% trọng lượng khô của rong nâu (Ragan Glombitza, 1986; Targett và Arnold, 1998)

Các gốc phloroglucinol này liên kết với nhau bằng nhiều cách khác nhau Chính

vì vậy mà chúng tạo nên nhiều dạng cấu trúc khác nhau và đôi khi có trọng lượng phân

tử lên đến 650 KDa Cho đến nay, trên thế giới có một số cấu trúc của các hợp chất thuộc nhóm phlorotannin từ rong nâu đã được xác định và nhiều dịch chiết thô của chúng đã được khảo sát hoạt tính sinh học Tuy nhiên, rất ít công trình công bố một cách đầy đủ các cấu trúc của tất cả các dẫn xuất của phloroglucinol trong dịch chiết phlorotannin thô được chiết từ một loài rong cụ thể và hoạt tính của chúng và các công trình này chỉ được công bố trong 10 năm trở lại đây

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của phloroglucinol (i ) và phlorotannins [tetrafucol A (ii), tetraphlorethol B (iii), fucodiphlorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi), phlorofucofuroeckol (vii)] (modified after Ragan and Glombitza, 1986) [27]

Phần lớn các nghiên cứu về cấu trúc của phlorotannin không đề cập đồng thời đến hoạt tính của chúng hoặc là chỉ xác định cấu trúc của một vài hợp chất mà chúng

có hoạt tính Sử dụng các phương pháp hóa học (chiết, acetyl hóa toàn phần, sắc kí gel, sắc

kí bản mỏng) và các phương pháp vật lý (Phổ NMR, HPLC, FAB-MS), Karl-Werner Glombitza và cộng sự [19] đã xác định được cấu trúc của phlorotannin chiết từ loài rong

Carpophyllum angustifolium bao gồm các cấu trúc trihydroxiheptaphlorethol-A

octadecaacetate, trihydroxioctaphlorethol-A eicosaacetate và trihydroxioctaphlorethol-B eicosaacetate Sử dụng phương pháp nghiên cứu tương tự như trên, nhóm tác giả này tiếp

tục đưa ra 03 dạng cấu trúc khác nhau của phlorotannin chiết từ loài rong Cystophora

retroflexa Dạng 1: difucol hexa-acetate, dạng 2: phlorethols (có 03 chất), dạng 3:

fucophlorethol (có 10 chất như: tetraphlorethol-E nona-acetate, pentaphlorethol-B undeca-acetate, hexaphlorethol-A trideca-acetate, fucotriphlorethol-G dodeca-acetate, fucotriphlorethol-H, ) Trong công trình của mình, Koki Nagayama và cộng sự [20]

đã đưa ra đồng thời cả hoạt tính và cấu trúc của một số hợp chất thuộc nhóm

phlorotannin được chiết từ loài rong Ecklonia kurome Cấu trúc của chúng như sau:

eckol (trimer, 9%), phlorofucofuroeckol A (pentamer, 28%), dieckol (hexamer, 24%), 8,8′-bieckol (hexamer, 7%) và các chất còn lại chưa xác định (khoảng 30%) Để có thể đưa ra tương đối đầy đủ cả cấu trúc và hoạt tính này các tác giả dựa trên các công bố trước đó vài năm Tương tự như vậy các nhà khoa học Hàn Quốc cũng đưa ra cấu trúc

đầy đủ của các dẫn xuất của phloroglucinol chiết từ loài rong Ecklonia cava bao gồm:

phloroglucinol (1), eckol (2), fucodiphloroethol G (3), phlorofucofuroeckolA (4), phloroglucinol eckol (5), dieckol (6), và 6,60-bieckol (7), và hoạt tính của chúng

7-1.3.2.2 Hoạt tính sinh học của phlorotannin

Hoạt tính sinh học của phlorotannin được công bố nhiều nhất là hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính này được nghiên cứu thông qua khảo sát khả năng quét các gốc DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrasyl), gốc hydroxil (-OH), các anion như superoxide anion (O2), khử sắt (III), tạo phức chelat với các ion hóa trị (II) và oxi hóa lipid của chúng

Các nhà khoa học Mexico đã xác định khả năng quét các gốc DPPH, anion

O2- và hoạt tính khử của hỗn hợp các chất thuộc nhóm phlorotannin được chiết từ một

số loài rong nâu sinh trưởng tại vùng biển nhiệt đới tại Mexico Họ đã thu các phlorotannin bằng chiết lạnh, sử dụng dung môi là dichloromethanol : methanol (2:1) trong 20 giờ Kết quả thu được cho thấy tất cả tổng phlorotannin được chiết từ các

loài rong (Lobophora variegata, Padina gymnospora, Dictyota cervicornis và một số loài rong thuộc chi Sargassum, chi Turbinaria) đều có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị

SC50 của gốc DPPH tương ứng là như sau: Lobophora variegata: 0,32±0,01 mg/ml,

Padina gymnospora: 3,45 mg/ml, chi Sargassum: từ 6,64 đến 7,14mg/ml, chi Turbinaria:

8,85 mg/ml và chi Dictyota: 6,42 mg/ml Ngoài ra tổng phlorotannin chiết từ loài

Lobophora variegata còn thể hiện khả năng quét gốc anion O2-và tính khử mạnh

Để xác định hoạt tính chống oxi hóa của phlorotannin chiết từ 03 loài rong

Sargassum marginatum, Padina etrastomatica và Turbinaria conoides sinh trưởng tại

bờ biển Ấn Độ, S Kumar Chandini và cộng sự [28] đã sử dụng phương pháp chiết phlorotannin hoàn toàn khác với công trình của các nhà khoa học Mexico Chiết 03 lần với các dung môi khác nhau tại nhiệt độ phòng để thu được các nhóm chất phân cực nhẹ, phân cực và không phân cực Sau đó gộp cả 03 lần chiết vào làm một, rồi cô cạn và cuối cùng hòa tan bằng cồn metanol 900 Hỗn hợp phlorotannin tan trong methanol của tất cả các loài rong nâu nêu trên đều thể hiện khả năng quét gốc DPPH và gốc hydroxil

Ngoài hoạt tính chống oxi hóa Takashi Kuda và cộng sự [28] còn xác định

cả ảnh hưởng của điều kiện chiết như dung môi, nhiệt độ và trọng lượng phân tử của

phlorotannin chiết từ loài rong Petalonia binghamiae (J agaradh) lên hoạt tính chống

oxi hóa của chúng Tính chất oxi hóa của dung dịch phlorotannin chiết bằng nước cao hơn hẳn so dịch chiết bằng cồn ethanol Các phân đoạn phlorotannin có trọng lương phân tử > 100 KDa, trong khoảng 10 đến 30 KDa và < 5KDa đều thể hiện khả năng quét gốc DPPH và O2- cũng như khả năng khử ion Fe rất cao so với phân đoạn phlorotannin có trọng lượng phân tử trong khoảng 30-100 KDa Tại nhiệt độ chiết

1210C khi sử dụng dung môi chiết là nước, hoạt tính chống oxi hóa tăng lên nhiều lần

so với khi chiết tại nhiệt độ 500C và 850C Áp dụng quy trình này nhóm tác giả [28] tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của phlorotannin chiết từ 03 loài rong nâu

tại Nhật Bản dưới dạng sản phẩm thương mại là Scytosiphon lomentaria nori), Papenfussiella kuromo (Kuromo) và nemacystus decipiens (Mozuku) Phân

(Kayamo-đoạn chiết bằng nước có hoạt tính mạnh trong khi phân (Kayamo-đoạn chiết bằng cồn ethanol

có hoạt tính rất yếu

Gần đây, đã có một số công trình công bố về hoạt tính chống viêm nhiễm, kháng vi sinh vật kiểm định, chống dị ứng, chống ung thư, kháng vi rút HIV và điều hòa đường huyết của phlorotannin

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của phlorotannin chiết từ loài rong

Ecklonia kurome tại Nhật Bản đã được Koki Nagayama và cộng sự [20] công bố năm

2002 Để thử hoạt tính kháng vi sinh vật của phlorotannin, nhóm tác giả đã sử dụng phương pháp chiết phlorotannin bằng cồn methanol Hỗn hợp thu được sau khi chiết bằng cồn được chiết lại với ethyl acetate và cuối cùng được tách trên sắc kí bản mỏng

Tất cả các các phân đoạn thu được đều được thử hoạt tính trên 25 chủng vi sinh vật kiểm định thuộc 02 nhóm Gr(+) và Gr(-) Kết quả là tất cả các phân đoạn đều thể hiện hoạt tính kháng 25 chủng vi sinh vật đem thử

Năm 2004 Kang K và các cộng sự [21] đã phát hiện phlorotannin chiết từ cùng

chi Ecklonia là loài Ecklonia cava nhưng sinh trưởng tại Hàn Quốc thể hiện hoạt tính

chống viêm nhiễm

Không sử dụng hỗn hợp phlorotannin (bao gồm các polyme, oligome của phloroglucinol), các nhà khoa học Ý và Nhật Bản sử dụng ngay phloroglucinol để thử hoạt tính và chính monome này đã có hoạt tính chống ung thư và trị bệnh tiểu đường

Trên cơ sở phlorotannin thô chiết từ loài rong Ecklonia cava các nhà khoa học

Hàn Quốc đã xác định được nhiều hoạt tính sinh học khác của chúng Tất cả các dẫn xuất của phloroglucinol phân lập được (fucodiphloroethol G, dieckol , 6,6 bieckol, phloroeckol và phlorofucofuroeckol A) đều thể hiện hoạt tính ức chế các enzyme matrix metalloproteinase (MMP), alpha-glucosidase, alpha-amylase và ức chế quá trình giải phóng histamin Kết quả này định hướng cho việc sử dụng chúng để hỗ trợ điều trị các bệnh tiểu đường, thấp khớp, viêm nhiễm kinh niên, chống dị ứng Trong khi đó chỉ 1 dẫn xuất của phloroglucinol là 6,6’ - bieckol có hoạt tính kháng vi rút HIV

Trong vài thập kỷ trở lại đây, các dịch chiết từ rong biển nói chung và rong nâu nói riêng được coi như là nguồn nguyên liệu mới để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cho công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng

Nói chung trên thế giới cũng chưa nhiều nghiên cứu về tách chiết các hoạt chất

từ rong biển Nghiên cứu các chất chuyển hóa (trong đó chiếm tỉ lệ lớn nhất là

phlorotannin) của rong biển nói chung và rong nâu Sargassum nói riêng là bước mở

đầu hợp lý cho bài toán kinh tế trong tương lai

1.4 Giới thiệu về quá trình trích ly

1.4.1 Nguyên lý

Bản chất của quá trình trích ly (quá trình chiết) là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán giữa các chất có nồng độ khác nhau

Trích ly (chiết) là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Trường hợp thường gặp nhất là sự chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung môi hữu cơ Khi trộn lẫn hai pha nước và dung môi hữu cơ với nhau, dung môi có tỉ trọng nhỏ hơn sẽ ở lớp trên như: ete, benzene, các hydrocacbua,… dung môi có tỉ trọng lớn hơn sẽ ở lớp dưới như: chloroform, tetracloriccacbon, dicloetan,… Pha này có thể khuếch tán một ít sang pha

kia nhưng về cơ bản một pha vẫn là nước và pha kia vẫn là dung môi hữu cơ Khi lắc hai pha lại với nhau, thể tích hai pha khi lắc không bằng đúng như thể tích trước khi lắc Tuy nhiên để cho đơn giản, giả thiết rằng thể tích của pha là không đổi khi lắc Trích ly nhằm mục đích điều chế hay phân tích

Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng gọi là trích ly lỏng, trích ly chất hòa tan trong chất rắn là trích ly chất rắn

Phương pháp tách chiết là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách chiết Một phương pháp tách chiết thích hợp chỉ có thể được hoạch định một khi

đã biết rõ thành phần của các chất cần trích ly Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi Vì vậy không thể có một phương pháp tách chiết chung áp dụng cho tất cả hợp chất thiên nhiên

Phương pháp cổ điển trích ly một hợp chất thiên nhiên là dùng một dãy dung môi bắt đầu từ không phân cực đến phân cực mạnh để trích ly, phân đoạn các hợp chất

ra khỏi hợp chất thiên nhiên Ví dụ: dãy dung môi: ete dầu, ete, chloroform, cồn và cuối cùng là nước

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn trích ly

- Trong phân đoạn trích ly ete và ete dầu sẽ có các hydrocacbua béo hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như monotecpen, các chất không phân cực như chất béo, carotene, các sterol, các chất màu thực vật, clorophyl

- Trong dịch trích ly chloroform sẽ có mặt sesquiterpen, diterpen, cumarin, quinon, các aglycol do glycoside thủy phân tạo ra, một số ancaloid base yếu,…

- Trong dịch trích ly nước sẽ có các glycoside, tannin, các đường, các hợp chất hidrat cacbon phân tử vừa pectin, các protein thực vật và muối vô cơ

Khi cần trích ly lấy toàn bộ thành phần trong hợp chất thiên nhiên thì dung môi thích hợp nhất là cồn 80% Cồn, nhất là metanol được xem là dung môi vạn năng Nó hòa tan được các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác [3]

Dịch trích ly cồn đem bốc hơi dung môi sẽ được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất thiên nhiên Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng một dãy dung môi không hòa lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh Ví dụ dãy dung môi: ete dầu, ete, chloroform, etyl acetate, buthanol

Có hai cách trích ly với điều kiện nhiệt độ khác nhau, đó là: trích ly ở nhiệt độ thường và trích ly nóng Mỗi cách trích ly có dung môi và thiết bị riêng

- Hai cách trích ly thông thường ở nhiệt độ thường là ngâm kiệt và ngâm phân đoạn Phương pháp ngâm kiệt cho kết quả tốt hơn vì trích ly được nhiều hoạt chất và ít tốn dung môi, nhất là khi áp dụng cách trích ly ngâm kiệt ngược dòng

- Trích ly nóng: nếu dung môi là các chất bay hơi thì áp dụng cách trích ly liên tục và trích ly hồi lưu Nếu dung môi là nước thì sắc hoặc hãm phân đoạn

Dụng cụ trích ly liên tục thông thường là bình Soxhlet Có thể tự lắp lấy dụng

cụ trích ly liên tục Nếu trích ly nóng hồi lưu thì nên trích ly phân đoạn ít nhất là hai lần để trích ly hết hoạt chất

Tính phân cực của hợp chất thiên nhiên có liên quan đến vấn đề trích ly hợp chất thiên nhiên Một yếu tố khác cũng có ảnh hưởng đến vấn đề trích ly là các enzyme vốn luôn có mặt trong nguyên liệu Trong quá trình chế biến, trích ly nếu không khống chế được hoạt tính của men thì các glycoside có thể bị thủy phân một phần hoặc toàn phần làm thay đổi tính phân cực, do đó thay đổi độ hòa tan của hợp chất đối với dung môi

Dung môi dùng để trích ly các hợp chất khỏi các hợp chất thiên nhiên rất đa dạng và thay đổi tùy theo bản chất của mỗi loại hợp chất thiên nhiên Cơ sở để lựa chọn một dung môi trích ly là tính phân cực của hợp chất chứa trong hợp chất thiên nhiên và của dung môi

Có 3 kiểu trích ly: trích ly đơn, trích ly lặp và trích ly ngược dòng

Trích ly đơn (chiết một lần) thường cho hiệu suất thấp

Trích ly lặp (chiết nhiều lần): nếu hệ số phân bố không đủ lớn để trích một lần thì phải trích thêm nhiều lần Nghĩa là sau khi chiết một lần, trong dung dịch còn lại một lượng chất tan đáng kể thì thường người ta thêm một lượng dung môi chiết mới và chiết một hay nhiều lần nữa Hiệu suất cao hơn hiệu suất chiết đơn nhưng tốn dung môi, thời gian và công suất

Trích ly ngược dòng: phương pháp này dựa trên nguyên tắc cho dung môi trích

ly vào dung dịch cần trích ly chạy ngược chiều nhau Hai pha tiếp xúc chặt chẽ, pha trộn và di chuyển ngược chiều nhau Đây là một quá trình liên tục Mục tiêu của sự phân chia ngược dòng là tách hai hay nhiều chất tan ra bằng một loạt sự phân chia giữa hai pha lỏng - lỏng

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

- Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuếch tán Vì vậy sự chênh lệch nồng độ giữa 2 pha (gradient nồng độ) chính là động lực của quá trình Khi chênh lệch nồng độ lớn, lượng chất trích ly tăng, thời gian trích ly giảm, ta thực hiện bằng cách tăng tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu

- Với các loại nguyên liệu rắn cần tăng diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi Điều này thực hiện bằng cách nghiền nhỏ, thái nhỏ, băm nhỏ vật liệu Nó còn làm phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình tiếp xúc triệt để giữa dung môi và vật liệu Tuy nhiên, kích thước và hình dạng của vật liệu khi làm nhỏ cũng có giới hạn vì nếu chúng quá mịn sẽ bị lắng đọng, làm tắc các ống mao dẫn hoặc bị dòng dung môi cuốn vào dòng mixen (hỗn hợp) làm cho dung dịch có nhiều cặn gây khó khăn cho quá trình

xử lý tiếp theo

- Tính chất của vật liệu cũng làm ảnh hưởng lớn tới hiệu suất trích ly Vật liệu

là hỗn hợp lỏng – lỏng hoặc hỗn hợp rắn – lỏng cộng với một dung môi hoặc tập hợp một số loại dung môi Chúng có độ hòa tan khác nhau, nồng độ các chất khác nhau và

có tác dụng tương hỗ, khuếch tán vào nhau Như khi trích ly dầu nếu độ ẩm nguyên liệu giảm, tốc độ trích tăng lên, vì độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào nguyên liêu, làm chậm quá trình khuếch tán

- Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, phần tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phần tử dung môi Tuy nhiên nhiệt

độ là một yếu tố có giới hạn Khi nhiệt độ quá cao có thể xảy ra các phản ứng khác không cần thiết, gây khó khăn cho quá trình công nghệ

- Yếu tố thời gian cũng ảnh hưởng tới quá trình trích ly Khi thời gian tăng lên, lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn Vì khi đã đạt được mức

độ trích ly cao nhất, nếu kéo dài thời gian sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế

1.4.3 Tổng quan về dung môi chiết

* Dung môi: là môi trường (thường ở thể lỏng, hoặc thể khí) có tính năng hòa tan các chất rắn, lỏng hay khí khác Dung môi có thể là các chất phân cực như nước, cồn, hoặc các chất không phân cực như dầu, dung môi hữu cơ,… Dung môi có thể

có độ nhớt rất khác nhau hoặc có thể có khả năng bay hơi dưới điều kiện bình thường cũng khác nhau Tùy thuộc vào các ứng dụng cụ thể mà người ta dùng dung môi thích

hợp Dung môi là để chiết các hợp chất ra khỏi nguyên liệu và thay đổi tùy theo bản chất của mỗi loại nguyên liêu Cơ sở để lựa chọn một dung môi chiết là tính phân cực của hợp chất chứa trong nguyên liệu và của dung môi

+ Dung môi phân cực và không phân cực

Quá trình hình thành một dung dịch là phụ thuộc vào đặc tính của chất hòa tan

và dung môi Để hiểu về tính phân cực của dung môi, ta có thể so sánh giữa 2 chất ete

và nước

- Hằng số điện môi của nước ở 200C là 80,4 trong khi của ete là 4,34

- Nguyên tử hydro của phân tử nước có khả năng liên kết với một nguyên tử mang điện âm của một hợp chất khác, hình thành liên kết hydro trong dung dịch nước, trong khi ete không có sự liên kết này

- Liên kết hydro hình thành ảnh hưởng đến tính hòa tan của hợp chất đối với dung môi

- Nước có tác dụng vừa như một acid, vừa như một base còn ete chỉ là một base rất yếu và không hoạt động như một acid

Do những đặc tính trên, nước được xem là một dung môi phân cực mạnh, còn ete là một dung môi không phân cực Các dung môi phân cực mạnh ngoài nước ra còn

có các ancol bậc thấp như: methanol, ethanol, propanol, buthanol,…Các dung môi không phân cực ngoài ete còn có các hydrocacbua như ete dầu, benzen, toluen, hexane, heptan,…Các chất nằm giữa 2 nhóm này gọi là các chất phân cực yếu hoặc vừa như ethylacetat, chloroform, acetone, diethylclorua

* Các chất tan trong nước và dung môi phân cực

Các chất điện ly như các muối vô cơ đều tan trong dung môi phân cực Các hợp chất hữu cơ nói chung không ion hóa nhưng nếu chúng có chứa các nhóm hoặc nguyên

tử mang điện âm có thể hình thành liên kết hydro với phân tử nước thì chúng sẽ tan được trong nước Những nhóm có khả năng tạo liên kết hydro như: -OH, -CO, -NO, -

NH2, và các halogen gọi là nhóm phân cực Càng có nhiều nhóm phân cực trong công thức cấu tạo thì phân tử ấy càng dễ hòa tan trong nước Nhưng nếu mạch hydro cacbon của phân tử càng dài thì độ hòa tan càng giảm

Thực nghiệm cho thấy, một nhóm phân cực trong phân tử có khả năng hình thành liên kết hydro với phân tử H2O sẽ làm cho phân tử ấy tan được trong nước nếu

số cacbon của mạch không quá 5 hoặc 6 nếu phân tử có thêm mạch nhánh Nếu phân

tử có nhiều nhóm phân cực (2 nhóm trở lên) thì tỉ lệ này giảm xuống Một nhóm phân cực có 3 hoặc 4 cacbon trong mạch thì phân tử ấy tan được trong nước

* Các chất tan trong ete và dung môi không phân cực

Các hợp chất hữu cơ không chứa nhóm phân cực gọi là các chất không phân cực Nói chung chất không phân cực đều tan trong ete và dung môi không phân cực Đồng thời chúng không tan trong nước và các dung môi phân cực khác Các chất mà phân tử chỉ có một nhóm phân cực yếu cũng có thể tan trong ete Hầu hết các chất hữu

cơ tan trong nước thì đều không tan trong ete Nếu chất vừa tan trong nước, vừa tan trong ete thì các chất đó phải là chất không ion hóa, có số C không quá 5, có một nhóm phân cực tạo liên kết hydro với nước nhưng không phải là nhóm phân cực mạnh

1.4.4 Tìm hiểu một số loại dung môi chiết trong đề tài

1.4.4.1 Nước

Phân tử nước được cấu tạo từ một phân tử oxy và hai phân tử hydro, mà đôi electron trong môi trường liên kết này bị kéo lệch về phía oxy nên phân tử nước có tính phân cực, do đó nước dễ liên kết với các nguyên tử, phân tử hoặc chất khác Mặt khác, các phân tử nước liên kết với nhau bằng các liên kết hydro (liên kết kém bền) nên các phân tử, các nguyên tử hoặc các chất khác dễ bẻ gẫy các liên kết đó để tạo nên chất mới

Nước sử dụng là nước được cung cấp từ nhà máy nước của thành phố Nước đạt các tiêu chuẩn cho phép của nước dùng trong sinh hoạt và chế biến thực phẩm của Việt Nam theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế

1.4.4.2 Ethanol

Ethanol hay còn gọi là ethyl alcohol, công thức phân tử: CH3CH2OH, là một trong những chất hữu cơ có nhiều ứng dụng nhất như: dung môi, chất sát trùng, thức uống, chất chống đông, nhiên liệu, chất ức chế và đặc biệt là chất trung gian để sản xuất những chất hữu cơ khác Ethanol ở điều kiện thường là một chất lỏng, dễ bay hơi,

dễ cháy, trong suốt, không màu Ethanol giảm thể tích khi pha với nước và tăng thể tích khi pha với gasoline Một thể tích ethanol pha với một thể tích nước thành 1,92 thể tích hỗn hợp Ethanol được sử dụng là cồn tuyệt đối, cồn được đóng trong bao bì nhựa, đảm bảo các yêu cầu như:

- Tiêu chuẩn an toàn: Theo COA

- Tiêu chuẩn kỹ thuật: Purity > 99,5 %

1.4.4.3 Acetone

Acetone (CH3COCH3) là ketone đơn giản và quan trọng nhất Nó là một chất lỏng không màu, có mùi cay và thơm nhẹ, tan vô hạn trong nước và hầu hết trong các dung môi hữu cơ Acetone là một dung môi được dùng trong nhiều lĩnh vực như: keo dán, sáp nhựa, chất béo, thuốc nhuộm và cellulosic Nó được dùng làm chất mang cho acetylen trong sản xuất sơn, nhựa và cũng được dùng như là một vật liệu thô cho quá trình tổng hợp nhiều sản phẩm như: ketene, methyl methacrylate bisphenol, diacetone alcohol, Acetone cũng được ứng dụng nhiều trong quá trình chiết các chất hữu cơ khác và trong sản xuất chất không bụi Nó là một dung môi rửa trong sản xuất sợi thủy tinh, là một dung môi để lau chùi trong công nghiệp điện tử, dung môi tẩy nhờn cho len và lụa Ngoài ra acetone còn có khả năng kết hợp với nhiều chất trung gian khác làm tăng tính khả dụng của nó và các chất khác Hàng năm một lượng lớn acetone được sử dụng trong những ứng dụng nhỏ như sản xuất chất chống oxy hóa, thuốc diệt

cỏ, những ketone cao hơn, ngưng tụ với formaldehyde, Acetone được sử dụng là loại tinh khiết, được đựng trong lọ thủy tinh có nắp vặn kín và được bảo quản ở điều kiện thích hợp Nó đảm bảo các yêu cầu như:

- Tiêu chuẩn an toàn: Theo COA

- Tiêu chuẩn kỹ thuật: Purity > 99,5 %

1.4.5.4 Methanol

Methanol, cũng gọi là methyl alcohol, alcohol gỗ, hay rượu mạnh gỗ, là một hợp chất hóa học với công thức phân tử CH3OH (thường viết tắt MeOH) Đây là chất lỏng trong suốt, rượu đơn giản nhất, nhẹ, dễ bay hơi, không màu, dễ cháy với ngọn lửa không phát sáng với một mùi đặc trưng, tan hoàn toàn trong nước Ở nhiệt độ phòng,

nó là một chất lỏng phân cực, và được sử dụng như một chất chống đông, dung môi, nhiên liệu, và như là một chất làm biến tính cho ethanol Methanol để trong không khí, tạo thành carbon dioxide và nước: 2 CH3OH + 3 O2 → 2 CO2 + 4 H2O

Do có tính độc hại, methanol được dùng làm phụ gia biến tính cho ethanol trong sản xuất công nghiệp Methanol thường được gọi là "cồn gỗ" (wood alcohol) bởi vì methanol là một sản phẩm phụ trong quá trình chưng cất khô sản phẩm gỗ

Methanol là chất rất độc, với lượng nhỏ gây mù, nhiều hơn có thể tử vong dễ dàng Methanol được sử dụng là loại tinh khiết, đựng trong lọ thủy tinh có nắp vặn kín

và được bảo quản ở điều kiện thích hợp Nó đảm bảo các yêu cầu như:

- Tiêu chuẩn an toàn: Theo COA

- Tiêu chuẩn kỹ thuật: Purity > 99,5 %

1.5 Giới thiệu về một số phương pháp làm sạch và tinh chế phlorotannin

1.5.1 Làm sạch phlorotannin bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

1.5.1.1 Nguyên lý

- Nguyên tắc: Nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ chiết, như phễu chiết, bình chiết Hệ số phân bố nhiệt động của cân bằng chiết

là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiết và tiếp đến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, môi trường acid Chiết theo kiểu này có hai cách là chiết tĩnh và chiết theo dòng chảy liên tục Trong phân tích, kiểu tĩnh được ứng dụng nhiều hơn bởi sự đơn giản của nó

- Điều kiện chiết: Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo được các yêu cầu nhất định sau đây:

* Dung môi chiết phải tinh khiết cao, để không làm nhiễm bẩn thêm các chất phân tích vào mẫu

* Dung môi chiết phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng lại không hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu

* Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho việc chiết được triệt để

* Cân bằng chiết nhanh đạt được và thuận nghịch

* Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt các pha

* Phải chọn môi trường acid, pH, loại acid thích hợp,

* Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá trình

* Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình chiết xẩy ra được tốt

Quá trình chiết lỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỉ số nồng

độ trong hai pha là một hằng số

[A]hc

KA=

[A]n

KA : hằng số phân bố [Ahc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ

[An]: nồng độ của chất A trong pha nước

1.5.1.2 Phương pháp tiến hành

Sau khi thu được dịch chiết phlorotannin thô có chứa các chất hữu cơ như màu, acid béo, các chất hữu cơ đi kèm dạng phân cực và không phân cực Để loại chất đi kèm trong quá trình chiết phlorotannin, tiến hành phương pháp chiết lỏng-lỏng Đây

là phương pháp làm sạch chất thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao

Sử dụng các chất chiết theo mức độ tăng dần độ phân cực của chúng như:

hexan, chloroform, ethylaxetat, butanol

Lựa chọn hệ chiết lỏng-lỏng:

Phlorotannin hòa tan trong nước sau đó khảo sát các hệ chiết

Phlorotannin(nước)/ hexan – Xác định hệ số phân bố

Phlorotannin(nước)/ dicloetan - Xác định hệ số phân bố

Phlorotannin (nước)/ ethyl axetat - Xác định hệ số phân bố

Phlorotannin(nước)/ butanol - Xác định hệ số phân bố

Từ đó tìm hệ chiết thu được phlorotannin độ sạch kỹ thuật

1.5.2 Tinh chế phlorotannin bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silicagel

1.5.2.1 Nguyên lý

Sắc kí (Chromatography) là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …) Trong hệ thống sắc kí chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc kí Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ

Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có

thể tách và làm sạch các chất qua quá trình sắc kí

Trong các phương pháp phân tách hiện nay, sắc kí là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi một hỗn hợp, ngay cả những hỗn hợp phức tạp về thành phần và khác nhau về hàm lượng trọng hỗn hợp như dịch chiết từ các hợp chất từ cây

cỏ Từ khi phương pháp sắc kí ra đời (1903) cho tới nay rất nhiều kỹ thuật sắc kí cũng như các cải tiến về pha tĩnh, thiết bị và phương pháp phát hiện đã được phát triển và áp

dụng trong thực tế để phân tích định tính, định lượng và chiết tách các chất, đặc biệt là thành phần hóa học của cây cỏ

Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc kí khác: một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxid).Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo các dải riêng biệt có vị trí khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau, làm cơ sở cho việc phân tích định tính và định lượng

1.5.3 Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm tinh bằng phương pháp sắc kí bản mỏng và HPLC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Sau khi thu được phlorotannin tinh chế, chế phẩm này sẽ phải được kiểm tra độ tinh sạch để có thể định hướng sử dụng Phương pháp được áp dụng để kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm tinh là phương pháp sắc kí bản mỏng và HPLC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

1.6 Tổng quan về quá trình tách chiết

- Rong nguyên liệu

Rong khô thu mua đã được xử lý và có nguồn gốc rõ ràng Mẫu rong đã thu thập được rửa sạch các chất bẩn cơ học và phơi khô trong bóng râm

Mục tiêu lựa chọn rong khô: Hàm lượng ẩm trong rong nhỏ góp phần ức chế sự phát triển của vi sinh vật sống trên rong, ức chế quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa trong rong, từ đó rong được bảo quản tốt hơn, đảm bảo cho quá trình thực hiện không gặp gián đoạn về vấn đề nguyên liệu Đồng thời khi hàm lượng ẩm nhỏ, tốc độ trích ly

tăng lên (do độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán)

- Chiết rút:

Phlorotannin là hợp chất hữu cơ có khả năng tan trong một số dung môi phân cực và không phân cực Các yếu tố dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết đều có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của phlorotannin trong quá trình chiết Vì vậy, tại công đoạn chiết, ta sẽ tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chiết của phlorotannin

+ Xác định ảnh hưởng của các dung môi khác nhau đến khả năng chiết

phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa

Dung môi khảo sát: nước, methanol 50 %, ethanol 50 %, hexane,

dichlomethane, buthanol, acetone, ethylaxetat Tìm ra dung môi thích hợp Lựa chọn dung môi theo 02 tiêu chí: Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa

+ Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi

Khảo sát các tỉ lệ sau: 1:5, 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30; 1:35; 1:40; 1:45; 1:50

để xác định khả năng chiết rút của rong nguyên liệu vơí các lượng dung môi khác nhau, từ đó tìm ra tỉ lệ thích hợp nhất theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, khối lượng chất chiết, hàm lượng phlorotannin

+ Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết

Xác định nhiệt độ chiết hợp lý bằng cách khảo sát khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết ở các nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C, 700C, 800C, 900C,

1000C, tìm ra nhiệt độ chiết thích hợp theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, khối lượng chất chiết, hàm lượng phlorotannin

+ Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết

Khảo sát các khoảng thời gian: 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 phút Tìm ra thời gian chiết thích hợp theo 02 tiêu chí: hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa

kí cột

- Làm sạch bằng sắc kí cột:

Mục đích của đề tài là thu phlorotannin theo định hướng sử dụng làm dược liệu,

do đó đòi hỏi chế phẩm phải có độ tinh sạch nhất định Phương pháp làm sạch bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silicagel là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi hỗn hợp, thu lấy chế phẩm tinh theo yêu cầu

CHƯƠNG II:

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hình 2.1 Rong mơ Sargassum mcclurei

Loài rong mơ Sarrgassum mcclurei ở Việt Nam, chủ yếu ở vùng biển Nam Trung

bộ Rong khi thu nhận đã được rửa qua nước biển và phơi khô trong bóng râm đến độ ẩm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình dự kiến để nghiên cứu tách chiết phlorotannin

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu

- Kiểm tra sản phẩm bằng HPLC-MS

- Thử nghiệm hoạt tính Làm tinh sạch bằng sắc kí cột

Chế phẩm Phlorotannin

Sấy phun Đánh giá sản phẩm