nghiên cứu gen dreb5 mã hóa protein liên quan đến quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở cây đậu tương [glycine max (l.) merrill]

Cho đến nay ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu tìm hiểu cơ sở phân tử của các đặc tính chịu hạn Trần Thị Phương Liên và cs, 1999; Chu Hoàng Mậu 2001; Nguyễn Thu Hiền 2005, tạo

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

NGUYỄN HIỆP HÒA

NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN

Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

NGUYỄN HIỆP HÒA

NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN

Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

LỜI CẢM ƠN

Vớp tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng

Mậu, người đã hết lòng giúp đỡ động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Di truyền học – trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô và các bạn Viện khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiên cho tôi học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn, đồng nghiệp và những người thân trong gia đình đã giúp đỡ động viên tôi hoàn thành luận văn này

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các kết quả, số liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công

bố trong bất cứ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Hiệp Hòa

MỤC LỤC

trang

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục 1

Danh mục các chữ viết tắt 4

Danh mục các bảng 5

Danh mục các hình 6

MỞ ĐẦU 7

1 Đặt vấn đề 7

2 Mục tiêu đề tài 8

3 Nội dung nghiên cứu 9

4 Ý nghĩa khoa học

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÁ SINH HẠT ĐẬU TƯƠNG 10

1.1.1 Sơ lược về cây đậu tương 10

1.1.2 Thành phần hoá sinh hạt đậu tương 12

1.1.2.1 Protein dự trữ và thành phần axit amin 12

1.1.2.2 Lipit, vitamin và một số chất khác 13

1.2 ĐẶC TÍNH CHỊUHẠN CỦA THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƯƠNG 13

1.2.1 Cơ sở liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật 14

1.2.2 Cơ chế sinh lý học và di truyền học đối với hiện tượng chống chịu hạn ở thực vật 16

1.2.3 Nghiên cứu khả năng phản ứng của cây đậu tương đối với hạn 17

1.2.3.1 Sự phản ứng của cây đậu tương đối với hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm 19

1.2.3.2 Sự phản ứng của cây đậu tương đối với hạn ở giai đoạn cây non 22

1.3 NGHIÊN CỨU NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB 23

1.3.1 Gen DREB 23

1.3.2 Nghiên cứu về DREB5 bằng phương pháp RT-PCR 26

Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28

2.1.1 Vật liệu thực vật 28

2.1.2 Các hoá chất và thiết bị 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.2.1 Phương pháp sinh lý 29

2.2.1.1 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo 29

2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 31

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 30

2.2.2.2 Kỹ thuật RT-PCR 32

2.2.2.3 Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR 34

2.2.2.4 Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng 35 2.2.2.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37

2.2.2.6 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) 37

2.2.2.7 Tách chiết plasmid 37

2.2.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotit 38

2.3.1 Phương pháp xử lí số liệu 38

2.3.1.1 Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel 38

2.3.1.2 Phương pháp xử lý trình tự gen 39

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 KẾT QUẢ PHÂN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KÍCH THƯỚC, KHỐI LƯỢNG 40

3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thước, khối lượng của 6 giống đậu tương 40

3.1.2 Tỷ lệ thiệt hại 42

3.1.3 Chỉ số chịu hạn tương đối 43

3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN DREB5 TỪ ĐẬU TƯƠNG 46

3.2.1 Tách chiết RNA từ lá mầm của các giống 46

3.2.2 Kết quả RT-PCR tạo DNA 47

3.2.3 Kết quả dòng hóa sản phẩm gen DREB5 trong vector tách dòng 48

3.2.4 Kết quả giải trình tự gen mã hóa DREB5 49

3.2.5 So sánh trình tự nucleotit giữa DREB5 của Xanh tiên đài Việt Nam và DREB5 của EF 583447 trong ngân hành gen có nguồn gốc từ Trung Quốc bằng phần mềm Bioedit 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

1 KẾT LUẬN 57

2 KIẾN NGHỊ 67

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG trang

Bảng 2.1 Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu 28

Bảng 2.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RT-PCR 26

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 33

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR 34

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pCR® 2.1-TOPO®……… 35

Bảng 3.1 Mầu sắc, khối lượng, kích thước hạt đậu tương nghiên cứu 41

Bảng 3.2 Tỷ lệ thiệt hại của 6 giống đậu tương ở giai đoạn cây non 3 lá (%) 42

Bảng 3.3 Chỉ số chịu hạn tương đối của các giống đậu tương 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

trang

Hình 1.1: Cơ chế biểu hiện của DREB1A khi lúa gặp hạn hán 25

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp cDNA 26

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo vector pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) 36

Hình 3.1 Hình dạng hạt đậu tương nghiên cứu 40

Hình 3.2 Đậu tương trước khi xử lí hạn 43

Hình 3.3 Đậu tương sau khi xử lí hạn 9 ngày 44

Hình 3.4 Đậu tương sau khi xử lí hạn 15 ngày 44

Hình 3.5 Ảnh điện di RNA tổng số trên gel agarose 1%

46 Hình 3.6 Ảnh điện di DNA sản phẩm của RT-PCR 47

Hình 3.7: Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh 48 Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm tách plasmit cắt bằng Hind III 49

Hình 3.9 Hình ảnh Sequence chuỗi DREB5 51

Hình 3.10 Trình tự gen DREB5 ở đậu tương Xanh Tiên Đài – Việt Nam 52

Hình 3.11 So sánh trình tự gen DREB5 của đậu tương Xanh tiên đài của Việt nam và EF 583447 có trong ngân hàng gen quốc tế từ giống đậu tương của Trung quốc

55 Hình 3.12 So sánh trình tự axit amin của DREB5 ở giống đậu tương Xanh Tiên Đài Việt Nam và giống đậu tương có mã số EF 583447.1 của Trung Quốc có trong ngân hàng gen quốc tế 56

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương có tên khoa học là (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu

(Fabaceae), đây là một trong những cây lương thực có tầm quan trọng bậc nhất trên thế giới cũng như ở Việt Nam Để có vị trí như vậy, nhờ đậu tương có những đặc tính ưu việt hơn những giống đậu khác đó là: Hàm lượng protein và lipit trong hạt cao: protein từ 32% đến 40%, lipit từ 12% đến 25%, gluxit (10-15%), chứa nhiều loại vitamin Các sản phẩm rất quen thuộc của đậu tương như đậu phụ, tương, dầu ăn có vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện đậu tương có vai trò chữa và điều trị bệnh nam y như ung thư, tim mạch Đậu tương còn có thể giải quyết một phần vấn đề hết sức nóng bỏng hiện nay trên thế giới là năng lượng từ các sản phẩm của nó Ngoài ra đậu tương là cây họ đậu nên có tác dụng cải tạo đất thông qua việc cố định đạm trên các nốt sần ở rễ, góp phần làm giảm lượng phân hóa học bón xuống đất, đây là một trong những nguyên nhân gây thoái hóa đất

Trên thế giới đậu tương được ứng dụng và sản xuất trên quy mô lớn và phát triển mạnh mẽ nhất ở các nước Nam Mỹ như Brazil, Argentina, Canada nhưng lớn nhất phải kể đến Mỹ và gần đây là Trung Quốc Hàng năm họ sản xuất và đưa

ra thị trường thế giới hàng triệu tấn/năm, điều này đã góp phần giải quyết các vấn

đề được coi là nóng của thế giới đó như năng lượng, ô nhiễm

Ở Việt Nam, tuy là nước trồng đậu tương lâu đời nhưng sản lượng hàng năm còn thấp và ngành sản xuất đậu tương ở nước ta vẫn là mức thấp so với thế giới Nguyên nhân của vấn đề này là chúng ta còn sử dụng những giống trong

canh tác có năng suất chưa cao, khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh còn thấp Nước ta có điều kiện địa hình phức tạp, diện tích đồi núi lớn, thường xuyên xảy ra khô hạn Đậu tương thuộc nhóm cây chịu hạn kém Do vậy việc nghiên cứu nhằm cải tạo khả năng chịu hạn của đậu tương ở nước ta là hết sức cần thiết

Cho đến nay ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu tìm hiểu cơ sở phân tử của các đặc tính chịu hạn (Trần Thị Phương Liên và cs, 1999; Chu Hoàng Mậu 2001; Nguyễn Thu Hiền 2005), tạo nền tảng cho việc ứng dụng các biện pháp nhằm tăng cường khả năng chịu hạn của cây đậu tương

Quá trình phiên mã của gen chịu hạn chịu tác động của những yếu tố, trong

đó có protein DREB Việc nghiên cứu về DREB đã thành công trên các đối tượng như khoai tây, cà chua, hoa cúc, lúa mì , nhưng đối với cây đậu tương các công trình về gen DREB còn ít được công bố Vì vậy việc nghiên cứu với vai trò tăng cường khả năng biểu hiện của gen chịu hạn được chúng tôi quan tâm nghiên cứu

Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu

gen DREB5 mã hóa protein liên quan đến quá trình phiên mã của nhóm gen

chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill]”

2 Mục tiêu đề tài

So sánh khả năng chịu hạn của các giống đậu tương và xác định đặc điểm

về cấu trúc của gen DREB5 ở cây đậu tương

3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây đậu tương non 3 lá chét;

- Thu thập thông tin về gen DREB5, thiết kế mồi để nhân gen DREB5;

- Tách chiết RNA tổng số, phiên mã ngược tạo cDNA và khuếch đại gen DREB5 bằng kỹ thuật PCR;

- Tách dòng và đọc trình tự gen DREB5 ở cây đậu tương;

- So sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương nghiên cứu với trình tự đã công bố trên GenBank

4 Ý nghĩa khoa học

Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen DREB5 ở đậu tương nhằm cải thiện tính chịu hạn.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÁ SINH HẠT ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Sơ lược về cây đậu tương

Đậu tương có tên khoa học là (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu

(Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có bộ NST 2n = 40, có nguồn gốc

từ Trung Quốc, là loại cây trồng hàng năm, không thấy xuất hiện ở loài hoang dại Các giống đậu tương địa phương của nước ta hiện nay được du nhập từ Trung Quốc đã từ lâu [3] Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu [3] Các công trình nghiên cứu cho thấy những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác dụng cải tạo đất Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, lá đậu tương là lá kép với 3 lá chét, nhưng đôi khi cũng có 4-5 lá chét Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn, quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông khi chín có màu vàng hoặc xám Hạt đậu tương không có nội nhũ mà chỉ có một lớp

vỏ bao quanh một phôi lớn Hạt có hình tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa

số là hạt màu vàng Khối lượng hạt rất đa dạng dao động từ 20-400 mg/ hạt Màu sắc rốn hạt ở các giống là khác nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng của giống Cây đậu tương có 2 loại hình sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn và sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia ra nhóm chín sớm, trung bình và muộn

Theo thời gian sinh trưởng Piper và Mosse đã cho ra các giống đậu tương chín rất sớm (75-90 ngày), các giống chín sớm (90-100 ngày), các giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120 ngày), các giống chín muộn (130-140 ngày), các giống chín rất muộn (140-150 ngày) thời gian sinh trưởng là một yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh xen vụ Một điểm nổi bật là ở rễ cây đậu tương thường có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm, cho nên trồng đậu tương ngoài việc thu hạt phục vụ đời sống của con người, động vật còn có tác dụng cải tạo đất sau các vụ trồng các giống khác nhau Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tương

có những giống chỉ trồng vào vụ hè, có những giống chỉ trồng vào vụ đông, có những giống trồng ở vụ xuân hè và có những giống trồng thích hợp với vụ thu đông [8]

Trên thế giới có 8 loại cây lấy dầu quan trọng là: đậu tương, bông, lạc, hướng dương, cải dầu, dừa và cọ ( chiếm 97% cây lấy dầu ) trong đó đậu tương là cây cung cấp dầu quan trọng nhất Hiện nay qua thống kê của FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng suất và diện tích Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới [8]

Ở Việt Nam, trước cách mạng tháng tám năm 1945 diện tích gieo trồng đậu tương khoảng 32 ha, năng suất đạt 4,1 tạ/ha [3], [10] Sau khi thống nhất đất nước diện tích trồng đậu tương tăng nhanh lên tới 39954 ha, năng suất được cải thiện lên 5,1 tạ/ha, hiện nay đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [8]

Cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển

Tuy nhiên việc sản xuất đậu tương ở trong nước vẫn chưa được đầu tư cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông học của các giống địa phương và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phương pháp truyền thống kết hợp với hiện đại

sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó cũng là chiến lược quan trọng

về sự phát triển cây đậu đỗ ở nước ta

1.1.2 Thành phần hoá sinh hạt đậu tương

1.1.2.1 Protein dự trữ và thành phần axit amin

Hàm lượng protein trong hạt chiếm từ 12,55%, trên thực tế cho thấy kiểu gen và điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhưng chúng vẫn chứa hàm lượng protein lớn hơn các loài thực vật khác [8] Protein được dự trữ trong các bào quan, có chức năng cung cấp nguồn axit amin và nitơ cho quá trình nẩy mầm của hạt, protein dự trữ chủ yếu trong hạt đậu tương là albumin và globulin

Dựa vào hệ số lắng người ta chia protein của hạt đậu tương thành 3 loại: legumin, vixilin, enzim và chất ức chế enzim có bản chất protein Trong hạt đậu tương protein dự trữ chiếm tới 70%, ngoài ra là các enzim, các chất ức chế proteaza và lectin Thành phần của protein gồm có albumin (9,5%), globulin tan trong nước (75,8%), globulin tan trong NaCl là 3%, glutelin tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [6], [10]

Protein của cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng được coi là chất lượng tốt nhất trong các loại protein thực vật, chúng chứa tất cả các axit amin không thay thế cần thiết cho cơ thể người và động vật Một điều đáng chú ý ở đây

là tỷ lệ lyzin một loại axit amin rất quan trọng cho con người và động vật ở đậu

tương rất cao so với protein của các loại ngũ cốc khác Qua nhiều nghiên cứu cho thấy hàm lượng các axit amin chứa gốc SH như methyonin, systein còn thấp [3], [8]

1.1.2.2 Lipit, vitamin và một số chất khác

Lipit là hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không tan trong nước, nhẹ hơn nước nhưng tan tốt trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, benzene, toluene….Lipit là thành phần quan trọng cấu tạo lên màng sinh học, là nguồn năng lượng quan trọng cung cấp cho cơ thể sống Ở đậu tương hàm lượng lipit chiếm từ 12-25% khối lượng khô, chất lượng lipit ở hạt đậu tương rất tốt, vì vậy nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm Hạt đậu tương còn có vitamin tan trong lipit, đặc biệt là vitaminE=200mg/100glipit [8], ngoài ra trong hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như cacbohiđrat, muối khoáng, axit nucleic, kích thích sinh trưởng [3]

Tóm lại, hạt đậu tương có giá trị rất cao về dinh dưỡng, giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protein và lipit, trong đó hàm lượng protein

dự trữ và chất lượng của chúng là yếu tố quan trọng đã quyết định vai trò và vị thế của cây đậu tương so với các cây ngũ cốc khác, đậu tương đã trở thành loài thực vật cung cấp nguồn thực phẩm quan trọng cho người và gia súc, hạt đậu tương có thể chế biến tới 600 sản phẩm khác nhau, ngoài ra đậu tương còn dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt và lành tính trong đó đậu tương có mầu đen có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực này

1.2 ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƯƠNG

Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cơ thể thực vật Hạn cũng như những yếu tố ngoại cảnh khác khi tác động lên cơ thể, gây ra các phản ứng của cơ thể, tuỳ theo từng loài, giống mà mức độ phản ứng của cơ thể cũng như thiệt hại do khô hạn gây ra khác

nhau: một số bị chết, một số bị tổn thương, một số khác bị ảnh hưởng, còn một số khác có thể không bị ảnh hưởng…

Khô hạn có thể phân biệt thành hai trường hợp:

(1) Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở giai đoạn nhất định của chu kì sống ở thực vật (hạt,tạo phấn, bào tử) Hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây Đây là quá trình biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di truyền [13] Trong giai đoạn hình thành hạt, tế bào bị mất nước, khả năng chịu hạn tăng lên, khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và có chiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt các điều kiện bất lợi khác như nhiệt

-Hạn đất thường xảy ra ở những vùng có khí hậu hay thổ nhưỡng đặc thù, hạn tác động mạnh lên bộ rễ của cây Sự tác động này được biểu hiện qua sự điều tiết của các hoocmon giúp cây chống chịu được điều kiện cực đoan của ngoại cảnh

-Hạn nhiệt độ và không khí: thường xảy ra ở những vùng gió, nóng, nhiệt

độ cao Hạn không khí thường tác động chủ yếu lên các bộ phân bên trên mặt đất như lá, hoa Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất nước trong cây ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau

Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, vừa là sản phẩm khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hóa sinh học.Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra,do vậy việc cung cấp nước cho cây trồng và hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng

là mục tiêu tạo giống chống chịu thường xuyên được quan tâm Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì càng ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển cảu cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi

bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng hạn ảnh hưởng đến hai quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đó là giai đoạn cây non và giai đoạn ra hoa

Như vậy ảnh hưởng cực đoan của nóng, của hạn bất cứ ở giai đoạn sinh trưởng nào của cây trồng cũng ảnh hưởng đến các yếu tố cấu thành năng suất làm giảm năng suất cây trồng

1.2.1 Cơ sở phân tử liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

Đặc tính chịu hạn ở thực vật được hình thành trong quá trình tiến hóa dưới tác động của chọn lọc tự nhiên Nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lý, sinh và cấu trúc tế bào người ta nhận thấy hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở những mức độ khác nhau, trong các giai đoạn phát triển khác nhau Điều này chứng tỏ tính chống chịu của thực vật do nhiều gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây trồng Cho đến nay vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào đó thực sự quyết định tính chịu nóng, chịu hạn, mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu nóng, chịu hạn của cây trồng

Nghiên cứu cơ sở phân tử của tính chống chịu người ta có thể tiếp cận theo hai hướng:

(1) Khả năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động của điều kiện cực đoan Đó là vai trò của nhóm chất Protein sốc nhiệt (heat shoock protein - HSP), trong đó có các chất môi giới phân tử (MGPT) - Moleculer chperone, ubiquitin, proteaza, amilaza [13], LEA (late embryogeis abudant protein) - protein được tổng hợp với

số lượng lớn trong quá trình hình thành phôi [14] Những nhóm chất này có liên quan đến sự bảo vệ các enzim, các cấu trúc trong tế bào, đồng thời đào thải các chất bị biến tính có khả năng gây độc cho tế bào khi gặp phải các yếu tố cực đoan (2) Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT) có liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh của tế bào rễ cây đối với đất Trong điều kiện ASTT tăng lên giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước từ đất Bằng cơ chế như vậy, thực vật có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ [1] Về phương diện này nhóm chất được quan tâm bao gồm: Các axit amin như prolin, estoin, glycinebetain, alaninebetain, saccoza, fructoza [16]

Khi tế bào mất nước, các chất hòa tan trong cơ thể thực vật sẽ được tích lũy dần trong tế bào chất nhằm tăng khả năng giữ nước của nguyên sinh chất Hầu hết các loại chất hữu cơ hòa tan có tác dụng điều chỉnh ASTT được sinh ra ngay trong quá trình đồng hóa và trao đổi chất Những thay đổi hóa sinh khác do hạn gây ra cũng đã được nghiên cứu, chẳng hạn như giảm cố định CO2, giảm protein và axit nucleic, tăng hoạt tính ribonucleaza, làm tăng hàm lượng prolin, tăng nồng độ các chất hoà tan như betaine [1], [16]

Một số công trình nghiên cứu về cơ chế chịu hạn của cây trồng đã cho thấy vai trò của một số chất đối với khả năng tăng cường chống chịu ở điều kiện cực đoan [1], [13]

1.2.2 Cơ chế sinh lý học và di truyền học đối với hiện tượng chống chịu hạn ở thực vật

Cơ chế sinh lý giải thích hiện tượng đáp ứng của cây trồng đâí với hạn, và nhằm mục đích cải tiến cấu trúc, hoạt động sinh lý, sinh hoá của cây, giúp cây thoát khỏi, hoặc né tránh hoặc chống chịu sự thiệt hại do hạn gây ra Theo Bùi Chí Bửu có hai phương pháp liên quan đến cải tiến giống cây trồng chống chịu hạn:

(1)Phương pháp dựa trên kinh nghiệm: được bắt đầu từ việc khai thác biến

dị di truyền, kết hợp với nguồn vật liệu cung cấp gen chống chịu tốt nhất của giống cây trồng hoặc của loài hoang dại Nguồn vật liệu lý tưởng nhất đối với tính chống chịu được phân lập và xem xét gen điều khiển tính chống chịu thông qua phân tích QTL đối với quần thể dòng con lai đang phân ly, trên hai kiểu hình chống chịu cao và chống chịu thấp Mặc dù cơ chế sinh lý vẫn được xem là cơ chế chính, được ưu tiên nghiên cứu, nhưng sự di truyền tính trạng chống chịu này đến giống cây trồng mới là một tiến hành vô cùng cần thiết, với yêu cầu chọn lọc khắt khe và tích luỹ những alen có lợi

(2) Phương pháp lai tạo giống có kiểu hình lý tưởng, trong đó đặc điểm về hình thái học và sinh lý học đều phải có khả năng tham gia vào mục tiêu cải tiến giống trong điều kiện bị hạn Gen mục tiêu từ giống cây trồng và từ loài hoang dại đều được quan tâm khai thác, để chuyển nó vào giống cây trồng mới

Khi thực hiện hai phương pháp này, người ta phải sử dụng những kỹ thuật lai, kỹ thuật chồng gen kháng nhờ maker phân tử, nhằm xác định alen có lợi

Trường hợp hạn khô, hạn lạnh, hạn mặn, những hiện tượng này có chức năng về sinh lý thực vật liên quan đến nhau, trên cơ sở điều tiết áp suất thẩm thấu của tế bào Nhiều chiến lược nghiên cứu nhằm cải tiến tính chống chịu này mang tính chất đa ứng dụng Chúng bao gồm hiện tương điều tiết áp suất thẩm thấu ở rễ,

lá nhằm duy trì nước, loại bỏ các yếu tố rào cản có tính kỵ nước trong rễ và lá, cải

tiến sự thông thương mạch dẫn nhằm thúc đẩy sự truyền nước trong cây Những

cơ chế tránh né, thoát và chống chịu có nét rất giống nhau đối với khô hạn, mặn và lạnh Thí dụ như cải tiến tính trạng rút ngắn thời gian từ gieo đến trỗ ở lúa, tính trạng rễ phát triển mọc sâu hơn trong đất, tính trạng nhạy cảm trong phản ứng co nguyên sinh của tế bào khi gặp hạn

Di truyền tính chống chịu đối với hạn thường được kiểm soát bởi đa gen và rất phức tạp, các gen kiểm soát tính chống chịu có thể trùng lặp nhau đối với các hạn khác nhau, tuy nhiên không phải tất cả các trường hợp chống chịu của cây trồng đều do đa gen điều khiển mà có nhiều trường hợp phải do một gen mang tính chủ lực điều khiển

Khả năng chống chịu của các loài hoang dại có quan hệ gần với cây trồng được đánh giá rất cao, trong chiến lược du nhập gen mục tiêu từ loài hoang dại vào cây trồng, nhằm gia tăng tính chống chịu một cách có hiệu quả

Tóm lại chúng ta có thể khẳng định rằng muốn giải quyết hoặc cải tạo tính chống chịu của cây trồng trước những điều kiện ngoại cảnh thay đổi nói chung và hạn nói riêng, cần có sự cải tiến bộ máy điều tiết cơ thể thực vật sao cho có sự giảm tác động hoặc chống lại sự tác động của điều kiện bất lợi Cơ chế điều khiển này mang tính phân tử, nghĩa là sự điều tiết đó phải do gen điều khiển và thường

là đa gen nhưng cũng có thể là do một gen chủ lực nào đó tác động là chủ yếu Chính vì vậy chúng ta cần phải tác động, cải tạo chúng thông qua phương pháp phân tử, đó là tìm kiếm và chuyển gen mục tiêu quan tâm vào cây trồng

1.2.3 Nghiên cứu khả năng phản ứng của cây đậu tương đối với hạn

Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác Đó chính là trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500 - 530 kg nước Trong quá

trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của cây đậu tương cũng khá cao - 50%, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26%

Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Tính chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: như sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triến của cây Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành 2 nhóm:

-Nhóm chịu được sự mất nước trong giai đoạn phat triển của cây

-Nhóm chiu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây

Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu tương có thể dễ vươt qua hơn, còn ở nhưng giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể

Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi nghiên cứu sâu hơn về tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương Maitra và Cushman (1994) đã phân lập được cDNA của dehydrin từ lá đậu tương khi bị mất nước, ngoài ra các tác giả còn phân lập được cDNA của LEA nhóm D-95 từ lá và

rễ cây đậu tương khi bị hạn

Phôi mầm của hạt đậu tương đang chín ở điều kiện bình thường và dưới áp suất thẩm thấu (ASTT) cao có thể HSP tăng dần lên trong quá trình hình thành hạt

và giảm đi khi hạt nảy mầm Trong quá trình chín của hạt, HSP được nghiên cứu đồng thời với sự gia tăng của hydrat cacbon dễ tan, kết quả cho thấy HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào khi bị mất nước vào thời điểm oligosaccarit chưa được tổng hợp đủ lượng để thực hiện chức năng này Nhưng HSP không thể thay thế được chức

năng của các hydrat cacbon dễ tan đó Như vậy, vai trò của các oligosaccarit ngày càng được sáng tỏ

Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [4] , nghiên cứu phân lập , xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103 [6] , phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên và cs (1999) [7] , nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm của Chu Hoàng Mậu (2001) [9]

1.2.3.1 Sự phản ứng của cây đậu tương đối với hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm

Cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác và là cây chịu hạn kém Đó chính là do trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500-530 kg nước Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [9]

Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lí

và di truyền đã cho thấy, các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Tính chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: như sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây

Trong môi trường khô hạn, cây có thể chống lại sự mất nước hoặc nhanh chóng

bù lại phần nước đã bị mất nhờ hoạt động của bộ rễ và sự điều chỉnh ASTT của tế bào

Ngoài ra, cây còn có thể chống chịu hạn bằng những biến đổi về hình thái như lá

có nhiều lông, lớp cutin dày, lá cuộn lại thành ống để giảm thoát hơi nước

Phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên cứu đều cho rằng khi cây gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, hoạt độ các enzym, axit hữu cơ giảm phức hợp CO2, protein và các axit nucleic [1], [12] Sự tổng hợp và tích luỹ các chất trên diễn ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước, với hai chức năng là (1) sự điều chỉnh ASTT nhờ khả năng giữ nước và lấy nước vào tế bào và (2) ngăn chặn sự

của các chất đó Chúng có thể thay thế vị trí nước nơi xảy

ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipit hoặc protein trong màng, ngăn chặn

sự phá hủy màng và các phức protein trong màng Quá trình này liên quan đến sự biểu hiện của các gen, hàng loạt các gen nghỉ được hoạt hóa tổng hợp các chất cần thiết để chống lại sự khô hạn [1] Wan và Li (2006), nghiên cứu về cây

Arabidopsis thaliana đã kết luận rằng, khi cây gặp hạn sự tích lũy ABA được tăng

cường và ở cây lạc các tác giả cũng chứng minh rằng NAA có tác dụng tăng cường tổng hợp ABA dẫn đến sự biểu hiện của gen AhNCED1

Nhiều nghiên cứu sử dụng tác động của ngoại cảnh, thổi khô, hạn sinh lý để khảo sát sự phản ứng đối với hạn của các giống cây trồng ở giai đoạn hạt nảy mầm

Enzyme là chất xúc tác sinh học có hiệu quả cao Trong giai đoạn hạt nảy mầm quá trình chuyển hoá các chất diễn ra mạnh, sự hoạt động của các enzyme cũng diễn ra mạnh Ở giai đoạn này hai enzym có vai trò quan trọng là enzyme  - amylase và enzym protease

Enzyme α-amylase là một trong những enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân tinh bột thành dextrin và mantose Sự tăng hoạt độ enzyme α-amylase làm tăng hàm lượng đường tan trong cây

Nguyễn Thị Thúy Hường (2005) thấy rằng, ở đậu tương hàm lượng đường tan trong cây liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu của cây trồng Đường tan là một trong những chất tham gia điều chỉnh ASTT trong tế bào Sự gia tăng hoạt độ enzyme α-amylase sẽ làm tăng hàm lượng đường tan do đó làm tăng ASTT và tăng khả năng phản ứng đối với hạn [5]

Hà Tiến Sỹ (2007) khi nghiên cứu về các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng rút ra nhận xét, hoạt độ của enzyme α-amylase và hàm lượng đường tan có mối tương quan thuận chặt chẽ, liên quan đến khả năng nảy mầm của hạt và sự sinh trưởng của mầm Giữa các giống có sự thay đổi về hoạt độ của enzyme α-amylase và hàm lượng đường tan khác nhau liên quan đến khả năng phản ứng đối với hạn của từng giống [13]

Khi nghiên cứu ở cây lúa, lạc…các tác giả cũng rút ra kết luận tương tự [12], [7]

Trong điều kiện thiếu nước, các enzym protease sẽ hoạt động một cách tích cực phân giải các protein để tạo ra các polypeptit ngắn tan trong môi trường nội bào làm tăng ASTT và tăng khả năng phản ứng đối với hạn

Trần Thị Phương Liên (1999) khi nghiên cứu về một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng hạn đã nhận xét rằng, hoạt độ enzym protease trong quá trình nảy mầm của hạt ở tất cả các giống nghiên cứu rất đa dạng, có hoạt tính cao, có khả năng phân giải hoàn toàn protein dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho cơ thể mới [6]

Đinh Thị Ngọc (2008) khi nghiên cứu về một số giống đậu tương ở Tây Nguyên đã rút ra nhận xét ở giai đoạn hạt nảy mầm, trong điều kiện bổ sung sorbitol nồng độ 7%, hoạt độ của protease và hàm lượng protein tan biến đổi theo

xu hướng tăng dần và đạt cực đại vào ngày thứ 7 bắt đầu giảm ở giai đoạn 9 ngày hạn Hàm lượng protein và protease có mối tương quan thuận Trong giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, 7 và 9 ngày tuổi khi không xử lý bởi sorbitol hoạt độ protease và

hàm lượng protein đều thấp hơn so với hoạt độ protease và hàm lượng protein trong hạt nảy mầm khi xử lý bởi sorbitol 7% Như vậy, áp suất thẩm thấu cao có ảnh hưởng rất rõ lên hoạt độ protease [11]

Một số nghiên cứu trên các đối tượng khác như: lúa, đậu xanh, lạc cho thấy trong điều kiện hạn sinh lý có sự gia tăng hoạt độ enzym protease và có mối tương quan thuận giữa hàm lượng protein và hoạt độ protease thể hiện khả năng phản ứng đối với hạn khác nhau giữa các giống [7]

1.2.3.2 Sự phản ứng của cây đậu tương đối với hạn ở giai đoạn cây non

Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính đó là: làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, vừa là nguyên liệu khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh học Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra, do vậy việc cung cấp nước cho cây trồng và hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu của quá trình tạo giống chống chịu và thường xuyên được quan tâm Thiếu nước trước tiên sẽ ảnh hưởng đến sự mất cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý khác như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng và cuối cùng ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì càng ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hoá tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, hạn ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, phát triển của cây đó là cây non và giai đoạn ra hoa

Theo thông báo của Chen và Murant (2002), sức chống chịu của thực vật tăng lên khi được chuyển các gen mã hóa enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp

proline trong tế bào Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tích lũy proline có thể tăng từ 10 đến 100 lần ở thực vật dưới tác động của ASTT

Nguyễn Thị Thúy Hường (2005) khi gây hạn nhân tạo ở cây đậu tương địa phương của tỉnh Sơn La nhận thấy, có sự tăng nhanh về hàm lượng prolin và giảm hàm lượng protein của các giống nghiên cứu, hàm lượng proline của mỗi giống cao hơn so với đối chứng Khả năng chịu hạn của cây đậu tương phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline Điều đó, chứng tỏ cây đậu tương đã có phản ứng một cách tích cực trước sự thay đổi của điều kiện môi trường [5]

Hà Tiến Sỹ (2007) khi nghiên cứu về khả năng chịu hạn của các giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng, Đinh Thị Ngọc (2008) nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống đậu tương trồng ở vùng Tây Nguyên cũng rút ra những nhận xét tương tự như vậy [11], [13] Kết quả này cũng nhận được khi nghiên cứu

mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạt nhanh sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều kiên bất lợi của môi trường như hạn hán, mặn và lạnh, nhưng nhân tố phiên mã DREB hoạt động không cần thông qua sự tác động của ABA (Lê Thị Thu Hiền và cs) [5]

DREB đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ XX, tập trung vào các giống cây trồng như cây hoa cúc, lạc, hướng dương… và đã thu được những thành quả nhất định cho khoa học trong việc cải thiện khả năng chống chịu của thực vật trước điều kiện môi trường

khắc nghiệt và biến đổi khí hậu như hiện nay Các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu và giải trình tự gen DREB trên loài cúc và hướng dương, lúa mì; đã so sánh trình tự gen của các loài cây trồng và hoang dại thấy rằng có sự sai khác giữa chúng từ đó họ đã đề xuất phương án cải thiện khả năng chống chịu thông qua việc cải tiến ở mức phân tử của cơ chế chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường sống đó là chuyển gen mục tiêu từ loài chống chịu tốt vào loài chống chịu kém

Zhaoshi và cs (2008), phân tích chức năng của gen GmDREB3, trong đậu

tương (Glycine max L.), K Shahrokhabadi và cs (2008), đã xác định các gen trong

họ gen DREB ở cây đậu tương, JG Dubouzet và cs (Nhật Bản) nghiên cứu chức năng gen DREB trên đối tượng là lúa, Dubouzet et al (2003) cho rằng gen OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, gặp lạnh, OsDREB2A được biểu hiện khi mất nước và nồng độ muối cao Các OsDREB1A và OsDREB2A tạo protein liên quan đến yếu tố DRE và kích hoạt phiên mã của gen GUS tham gia vào quá trình chống chịu hạn Theo Yang et al (2007) ông đã phân lập được phân họ DREB trên đối tượng hoa cúc, theo đó phân họ gồm DmDREBa

và DmDREBb, những gen này mã hai cho hai protein có 191 amino acid và 185 amino acid với dự đoán trọng lượng phân tử của 21,66 và 20,99 kDa, các protein của 2 gen này được biểu hiện khi cây hoa cúc bị hạn lạnh Theo Li et al (2005) phân lập gen trên đối tượng cây đậu tương và đã chia thành các phân họ DREB gồm: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, ngoài ra còn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5, mỗi gen có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều khi đậu tương gặp các điều kiện hạn

Hình 1.1: Cơ chế biểu hiện của DREB1A khi lúa gặp hạn hán

Có thể nói việc nghiên cứu về DREB hiện nay đang là vấn đề thời sự bởi lẽ mặc dù DREB không trực tiếp tham gia vào quá trình chống chịu hạn nhưng nó đã quyết định việc chống chịu có đạt hiệu quả hay không bằng cách kích hoạt đồng thời sự biểu hiện của gen chống chịu Nghiên cứu DREB sẽ giúp cải thiện sự chống chịu của cây trồng đối với hạn thông qua việc chuyển gen

1.3.2 Nghiên cứu về DREB5 bằng phương pháp RT-PCR

Phản ứng RT-PCR (PCR ngược)

Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân trình tự DNA từ khuôn RNA, gồm 2 giai đoạn:

(1) Tổng hợp trình tự DNA từ sợi RNA làm khuôn

(2) Trình tự DNA 2 sợi làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR

Phản ứng biến đổi RNA thành DNA phải nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse-trancriptase) được gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở nhiệt

độ 500

-550 trong 30 phút Sau đó có sản phẩm DNA 2 sợi thì phản ứng tiếp theo là PCR thông thường gồm 3 giai đoạn RT-PCR được sử dụng để nhân RNA của retrovirus hoặc mRNA tách từ tế bào chất

-Giai đoạn 2 (RT) 1 chu kì thực hiện sao chép ngược từ RNA sợi đơn sang DNA sợi kép ở nhiệt độ 500-550C, trong 30 phút

-Giai đoạn 2 (PCR): (1) Biến tính ở nhiệt độ 940-950C/1 phút

cDNA : mRNA

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp cDNA

Việc phân lập một gen nào đó thường sử dụng phản ứng PCR, tuy nhiên PCR thu được sản phẩm chứa đoạn không mã hóa protein (intron), để không có đoạn intron người ta dùng phản ứng RT-PCR đi từ khuôn ban đầu là RNA

Trên thế giới đặc biệt những nước có nền khoa học phát triển mạnh như

Mỹ, Đức, Nhật bản và hiện nay là Trung quốc đang có những quan tâm lớn đến vấn đề này, các nhà khoa học đang tìm lời giải hữu hiệu cho vấn đề hạn hán của cây trồng do trái đất đang nóng dần lên Các công trình nghiên cứu về gen DREB

ở cây trồng thông qua phản ứng RT-PCR tiêu biểu có thể kể đến Yanwen Xiong (2007) phân lập gen DREB1A trên đối tượng lúa, Stolf-Moreira et al (2009) đã phân lập thành công gen DREB1 và DREB2 trên đối tượng đậu tương suy đoán các gen này mã hóa protein có khối lượng lần lượt là 24,2 và 37,7 kDa, Chen, M et al (2007) đã đọc trình tự thành công gen DREB5 trên đối tượng đậu tương đây cũng là chuỗi gen DREB duy nhất công bố ở Genbank

Ở Việt Nam vấn đề nghiên cứu DREB vẫn còn rất mới mẻ, chưa có công trình nào công bố liên quan đến gen DREB chính vì vậy việc nghiên cứu gen DREB hiện nay là rất cần thiết tạo nguyên liệu cơ bản cho các nghiên cứu ứng dụng và chuyển gen ở cây đậu tương

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu thực vật

Sử dụng 6 giống đậu tương có chất lượng tốt do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Viện Ngô Trung Ương cung cấp có tên là: Xanh Tiên Đài, Bản Dốc, Khánh Hòa, Lâm Đồng và 2 giống được sử trồng nhiều ở miền Bắc

là VX93 và ĐT-84 (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu

K3Fe(CN)6, Na2C03, CuS04, C4H406KNa.4H20, axit ninhydrin