MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo định hướng đến năm 2020, thủy sản là ngành xuất khẩu chủ lực của Việt Nam, góp phần quan trọng đưa nền kinh tế nông, lâm, ngư nghiệp phát triển bền vững với tốc độ tăng trưởng khoảng trên 7%/năm, giá trị xuất khẩu dự kiến đạt mức 10-10,5 tỷ USD. Năm 2012, theo thống kê của VASEP (Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers) mặc dù đã đạt được mức độ tăng trưởng cao nhưng giá trị xuất khẩu hàng hóa các sản phẩm thủy sản lại không tăng. Do đó, việc nâng cao giá trị xuất khẩu của các sản phẩm thủy sản đã được đặt ra và cần phải giải quyết, trong đó thức ăn là một khâu quan trọng, mang tính đột phá đối với ngành nuôi trồng thủy sản (NTTS). Hiện nay, ngoài thức ăn nhân tạo thì nguồn thức ăn sống như vi tảo biển (VTB) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự phát triển của hầu hết các đối tượng nuôi thủy sản. VTB rất giàu dinh dưỡng, rẻ tiền, dễ tiêu hóa và là nguồn cung cấp các axít béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs-Polyunsaturated fatty acids) như axít docosahexaenoic (DHA, C22:6n-3), axít eicosapentaenoic (EPA, C20:5n-3) và axít arachidonic (AA, C20:4n-6) rất cần thiết cho sự phát triển của vật nuôi ở giai đoạn ấu trùng. Một số loài VTB được sử dụng rộng rãi và phổ biến làm thức ăn sống trong NTTS như Isochrysis galbana, Chaetoceros gracilis, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis chuii. Tuy nhiên, hầu hết các trại NTTS ở Việt Nam đều chưa nuôi chủ động được nguồn thức ăn sống nêu trên mà chủ yếu vẫn là bơm nước biển tự nhiên vào bể nuôi. Ngoài ra, các giống tảo sử dụng trong NTTS đa phần có nguồn gốc nhập ngoại, khó thích nghi với điều kiện khí hậu tự nhiên của Việt Nam. Do đó, các giống này sau một thời gian nuôi trồng không có khả năng nhân nhanh sinh khối, dễ bị tạp nhiễm và cuối cùng bị thoái hóa và mất giống. Để chủ động cung cấp nguồn giống VTB thuần chủng, giàu dinh dưỡng theo định hướng làm thức ăn sống cho các đối tượng NTTS, cần phải phân lập, lựa chọn được các chủng giống thích nghi với khí hậu của Việt Nam, có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn và cho năng suất, chất lượng sinh khối cao. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài vi tảo biển quang tự dƣỡng thuộc hai chi Isochrysis và Nannochloropsis phân lập ở Việt Nam với mục đích ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản” 2. Mục tiêu của đề tài - Phân lập, lựa chọn, định tên khoa học và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các loài vi tảo biển thuộc hai chi Isochrysis và Nannochloropsis; - Chọn 2 loài vi tảo biển thuộc 2 chi nêu trên có khả năng lưu giữ thuần chủng, nhân nhanh sinh khối, nuôi trồng trên quy mô lớn và sinh khối giàu dinh dưỡng làm thức ăn cho một số đối tượng NTTS. 3. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các loài vi tảo biển thuộc 2 chi Isochrysis và Nannochloropsis từ vùng biển của Việt Nam có khả năng sử dụng làm thức ăn sống trong NTTS; 2. Định tên khoa học các chủng vi tảo biển phân lập được dựa trên các đặc điểm hình thái, đọc và so sánh trình tự của đoạn gen 18S rRNA; Đăng ký trình tự đoạn gen 18S rRNA của các chủng này trên Ngân hàng gen (Genbank); 3. Nghiên cứu lưu giữ các chủng giống VTB có được với sự hỗ trợ của một số chất bảo quản ở nhiệt độ thấp hoặc nhiệt độ phòng, xác định khả năng hoạt hóa chúng; 4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dưỡng của chủng Isochrysis galbana HP1 và Nannochloropsis oculata HP2; 5. Đánh giá khả năng chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi của các chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 so với các chủng phân lập ở Singapore; 6. Nhân nuôi sinh khối trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài tự nhiên các chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 để làm thức ăn sống cho các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851); hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) và tu hài (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844). 4. Những đóng góp mới của luận án 1. Phân lập thành công và dựa trên các đặc điểm hình thái và giải mã đoạn gen 18S rRNA đã xác định được tên 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2; 2. Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chính, thành phần dinh dưỡng và khả năng chống chịu với điều kiện nuôi bất lợi của các chủng tiềm năng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 so với các chủng có nguồn gốc nhập ngoại; 3. Lần đầu tiên đã thành công trong nuôi sinh khối chủng N. oculata HP2 ở hệ thống nuôi kín dạng ống tự thiết kế (với điều kiện không sử dụng bơm chỉ dùng máy nén khí) có dung tích 20 L, đạt mật độ tế bào cao (gần 200 triệu tb/mL); 4. Đã sử dụng sinh khối chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 cùng với sinh khối các loài VTB khác làm thức ăn sống cho một số đối tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre, hầu Thái bình dương và tu hài, góp phần quan trọng trong việc sản xuất giống thủy sản sạch bệnh, chất lượng cao và thúc đẩy nghề nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này là cơ sở khoa học để nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh học của 2 chủng VTB I. galbana HP1 và N. oculata HP2 phân lập được từ vùng biển Việt Nam và bổ sung cơ sở dữ liệu cho tập đoàn giống VTB có nguồn gốc của Việt Nam; cung cấp số liệu khoa học cho phép khẳng định tính chống chịu cao với điều kiện bất lợi của các chủng phân lập được từ Việt Nam so với nhập ngoại; khả năng sử dụng hệ thống nuôi kín tự thiết kế trong việc cung cấp giống ban đầu cho nuôi trồng VTB ở các hệ thống nuôi hở. Các kết quả của luận án có ý nghĩa thực tiễn đối với các trại sản xuất giống NTTS ở Việt Nam trong việc chủ động lưu giữ, nuôi trồng và thu sinh khối 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 làm thức ăn sống cho một số loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre, tu hài và hầu Thái bình dương. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 133 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 30 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23 trang, kết quả 57 trang, bàn luận 17 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang, danh mục các công trình đã công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 12 trang với 167 tài liệu tham khảo, tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh 9 trang. Trong luận án có 30 Bảng và 48 Hình.
Trang 1MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Theo định hướng đến năm 2020, thủy sản là ngành xuất khẩu chủ lực của Việt Nam, góp phần quan trọng đưa nền kinh tế nông, lâm, ngư nghiệp phát triển bền vững với tốc độ tăng trưởng khoảng trên 7%/năm, giá trị xuất khẩu dự kiến đạt mức 10-10,5 tỷ USD Năm 2012, theo thống kê của VASEP (Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers) mặc dù đã đạt được mức độ tăng trưởng cao nhưng giá trị xuất khẩu hàng hóa các sản phẩm thủy sản lại không tăng Do đó, việc nâng cao giá trị xuất khẩu của các sản phẩm thủy sản đã được đặt ra và cần phải giải quyết, trong đó thức ăn là một khâu quan trọng, mang tính đột phá đối với ngành nuôi trồng thủy sản (NTTS)
Hiện nay, ngoài thức ăn nhân tạo thì nguồn thức ăn sống như vi tảo biển (VTB) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự phát triển của hầu hết các đối tượng nuôi thủy sản VTB rất giàu dinh dưỡng, rẻ tiền, dễ tiêu hóa và là nguồn cung cấp các axít béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs-Polyunsaturated fatty acids) như axít docosahexaenoic (DHA, C22:6n-3), axít eicosapentaenoic (EPA, C20:5n-3) và axít arachidonic (AA, C20:4n-6) rất cần thiết cho sự phát triển của vật nuôi ở giai đoạn
ấu trùng Một số loài VTB được sử dụng rộng rãi và phổ biến làm thức ăn sống
trong NTTS như Isochrysis galbana, Chaetoceros gracilis, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis chuii Tuy nhiên, hầu hết các trại NTTS ở
Việt Nam đều chưa nuôi chủ động được nguồn thức ăn sống nêu trên mà chủ yếu vẫn là bơm nước biển tự nhiên vào bể nuôi Ngoài ra, các giống tảo sử dụng trong NTTS đa phần có nguồn gốc nhập ngoại, khó thích nghi với điều kiện khí hậu tự nhiên của Việt Nam Do đó, các giống này sau một thời gian nuôi trồng không có khả năng nhân nhanh sinh khối, dễ bị tạp nhiễm và cuối cùng bị thoái hóa và mất giống
Để chủ động cung cấp nguồn giống VTB thuần chủng, giàu dinh dưỡng theo định hướng làm thức ăn sống cho các đối tượng NTTS, cần phải phân lập, lựa chọn được các chủng giống thích nghi với khí hậu của Việt Nam, có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn và cho năng suất, chất lượng sinh khối cao Xuất phát từ những vấn
đề nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một
số loài vi tảo biển quang tự dƣỡng thuộc hai chi Isochrysis và Nannochloropsis
phân lập ở Việt Nam với mục đích ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản”
2 Mục tiêu của đề tài
- Phân lập, lựa chọn, định tên khoa học và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các
loài vi tảo biển thuộc hai chi Isochrysis và Nannochloropsis;
- Chọn 2 loài vi tảo biển thuộc 2 chi nêu trên có khả năng lưu giữ thuần chủng, nhân nhanh sinh khối, nuôi trồng trên quy mô lớn và sinh khối giàu dinh dưỡng làm thức
ăn cho một số đối tượng NTTS
3 Nội dung nghiên cứu
1 Phân lập các loài vi tảo biển thuộc 2 chi Isochrysis và Nannochloropsis từ vùng
biển của Việt Nam có khả năng sử dụng làm thức ăn sống trong NTTS;
2 Định tên khoa học các chủng vi tảo biển phân lập được dựa trên các đặc điểm
hình thái, đọc và so sánh trình tự của đoạn gen 18S rRNA; Đăng ký trình tự đoạn
gen 18S rRNA của các chủng này trên Ngân hàng gen (Genbank);
Trang 22
3 Nghiên cứu lưu giữ các chủng giống VTB có được với sự hỗ trợ của một số chất
bảo quản ở nhiệt độ thấp hoặc nhiệt độ phòng, xác định khả năng hoạt hóa chúng;
4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dưỡng của chủng Isochrysis galbana HP1 và Nannochloropsis oculata HP2;
5 Đánh giá khả năng chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi của các
chủng I galbana HP1 và N oculata HP2 so với các chủng phân lập ở Singapore;
6 Nhân nuôi sinh khối trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài tự nhiên các
chủng I galbana HP1 và N oculata HP2 để làm thức ăn sống cho các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851); hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) và tu hài (Lutraria rhyncheana
Jonas, 1844)
4 Những đóng góp mới của luận án
1 Phân lập thành công và dựa trên các đặc điểm hình thái và giải mã đoạn gen 18S
rRNA đã xác định được tên 2 chủng I galbana HP1 và N oculata HP2;
2 Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chính, thành phần dinh dưỡng và khả năng
chống chịu với điều kiện nuôi bất lợi của các chủng tiềm năng I galbana HP1 và N
oculata HP2 so với các chủng có nguồn gốc nhập ngoại;
3 Lần đầu tiên đã thành công trong nuôi sinh khối chủng N oculata HP2 ở hệ thống
nuôi kín dạng ống tự thiết kế (với điều kiện không sử dụng bơm chỉ dùng máy nén khí) có dung tích 20 L, đạt mật độ tế bào cao (gần 200 triệu tb/mL);
4 Đã sử dụng sinh khối chủng I galbana HP1 và N oculata HP2 cùng với sinh khối
các loài VTB khác làm thức ăn sống cho một số đối tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre, hầu Thái bình dương và tu hài, góp phần quan trọng trong việc sản xuất giống thủy sản sạch bệnh, chất lượng cao và thúc đẩy nghề nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này là cơ sở khoa học để nghiên
cứu sâu về đặc điểm sinh học của 2 chủng VTB I galbana HP1 và N oculata HP2
phân lập được từ vùng biển Việt Nam và bổ sung cơ sở dữ liệu cho tập đoàn giống VTB có nguồn gốc của Việt Nam; cung cấp số liệu khoa học cho phép khẳng định tính chống chịu cao với điều kiện bất lợi của các chủng phân lập được từ Việt Nam
so với nhập ngoại; khả năng sử dụng hệ thống nuôi kín tự thiết kế trong việc cung cấp giống ban đầu cho nuôi trồng VTB ở các hệ thống nuôi hở
Các kết quả của luận án có ý nghĩa thực tiễn đối với các trại sản xuất giống NTTS ở Việt Nam trong việc chủ động lưu giữ, nuôi trồng và thu sinh khối 2 chủng
I galbana HP1 và N oculata HP2 làm thức ăn sống cho một số loài động vật thân
mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre, tu hài và hầu Thái bình dương
6 Bố cục của luận án
Luận án gồm 133 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 30 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23 trang, kết quả 57 trang, bàn luận 17 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang, danh mục các công trình đã công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 12 trang với 167 tài liệu tham khảo, tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh 9 trang Trong luận án có 30 Bảng và 48 Hình
Trang 3CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Từ lâu vi tảo nói chung và VTB nói riêng được coi là nguồn thực phẩm chức năng quan trọng cho con người và động vật; nguồn phân bón; cung cấp các chất có hoạt tính sinh học được dùng làm thuốc, mỹ phẩm, dược phẩm; có vai trò bảo vệ môi trường và cố định CO2 Trong đó, ứng dụng phổ biến nhất hiện nay của vi tảo vẫn là làm thức ăn sống cho các đối tượng NTTS
VTB I galbana và N oculata đều có kích thước nhỏ, dao động 2-4 µm, dễ
tiêu hóa, không độc, giàu dinh dưỡng và là nguồn cung cấp PUFAs như DHA và
EPA (Brown et al., 2002) Cụ thể, hàm lượng DHA ở loài I galbana có thể dao
động 9-11% so với tổng số axit béo (Total fatty acids, TFA), thậm chí có thể lên tới
17,5% so với TFA (Liu et al., 2013), hàm lượng EPA ở loài N oculata có thể dao
động 24,5-40% so với TFA, hàm lượng PUFAs có thể thay đổi tùy theo điều kiện
nuôi cấy VTB I galbana không phải là loài có khả năng thích nghi với sự biến động rộng của môi trường còn N oculata thì ngược lại, do đó chúng có khả năng hỗ
trợ lẫn nhau về mặt sinh trưởng trong quá trình nhân nuôi, đảm bảo cung cấp sinh khối giàu dinh dưỡng cho đối tượng nuôi Chính vì vậy, sinh khối của 2 loài VTB nói trên đã được sử dụng phổ biến làm thức ăn sống cho hầu hết các đối tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ, góp phần nâng cao khả năng sống sót và chất lượng ấu trùng nuôi
Hiện nay, nhu cầu sử dụng 2 loài N oculata và I galbana làm thức ăn sống
cho các đối tượng NTTS khác nhau ngày càng tăng cao do giá trị dinh dưỡng của chúng, đặc biệt là nguồn cung cấp PUFAs Do vậy, cần phải có những giải pháp về
kỹ thuật nuôi trồng tảo có chất lượng cao với giá thành thấp Trên thế giới, hệ thống nuôi kín đã được sử dụng để nuôi sinh khối hai loài nêu trên nhằm nâng cao năng suất cũng như hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học như DHA, EPA (Briassoulis
et al., 2010; Feng et al., 2011; Patil et al., 2007) Ở Việt Nam cho tới nay việc nuôi trồng các loài VTB trong các hệ thống nuôi kín còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn là nuôi trong các hệ thống nuôi hở (túi nilong, bể composit,…) Do vậy, năng suất và chất lượng sinh khối vi tảo thu được không đảm bảo, gây ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng sản xuất tại các trại NTTS
Gần đây, các nghiên cứu tìm kiếm, lựa chọn, thay thế và chủ động nguồn thức
ăn ngoại nhập bằng các nguồn trong nước rẻ tiền, giàu dinh dưỡng đang được tiến
hành ở Việt Nam VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 có khả năng tổng
hợp một lượng lớn PUFAs, hàm lượng lipit tổng số chiếm gần 40-70% sinh khối khô, tổng số axít béo có thể chiếm trên 90% so với lipit tổng số, hàm lượng DHA và DPA chiếm đến 50-60% so với TFA (Đặng Diễm Hồng và cs., 2008) Do vậy, để chủ động nguồn giống tảo cung cấp cho các đối tượng NTTS thì việc phân lập, lưu
giữ, nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng VTB thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis ở Việt Nam với định hướng ứng dụng làm thức ăn sống cho các động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851); hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) và tu hài (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844) là rất cần thiết; kết quả nghiên cứu thu được sẽ góp phần
đáp ứng được các yêu cầu thực tế của ngành NTTS phát triển bền vững và có chất lượng cao đang được đặt ra ở Việt Nam
Trang 4- Các mẫu VTB thuộc các chi Isochrysis và Nannochloropsis sau khi phân lập được
nuôi cấy ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm, lưu giữ trên môi trường thạch, lỏng và cung cấp giống thuần để thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án
- Hai chủng VTB N oculata LB2164 và I galbana LB2307 phân lập ở vùng biển
Singapore (do TS Đoàn Thị Thái Yên, khoa Khoa học và kỹ thuật môi trường, Trường Đại học quốc gia Singapore cung cấp) được lưu giữ trong bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, VAST
- Ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851) được thu tại bãi nuôi ở vùng biển xã
Giao Xuân, huyện Giao Thuỷ, Nam Định do doanh nghiệp tư nhân Cửu Dung cung
cấp Hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) được nuôi tại trại
NTTS của phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3
(Nha Trang, Khánh Hòa) Tu hài (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844) được nuôi tại
trại NTTS của Trung tâm phát triển nghề cá và đa dạng sinh học vịnh Bắc Bộ thuộc Viện Nghiên cứu Hải sản, thị trấn Cát Bà, huyện Cát Hải, thành phố Hải Phòng
- Sinh khối VTB dị dưỡng S mangrovei PQ6 được sử dụng làm thức ăn sống cho tu
hài bố mẹ và hầu Thái bình dương do Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH nuôi trồng
và bảo quản ở 0ºC cho tới khi sử dụng
- Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen 18S rRNA với kích thước khoảng 1100 bp do Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH thiết kế được sử dụng với Primer F: 5’-TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG-3’(24 nu) và Primer R: 5’- GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’ (22 nu)
2.2 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là thông dụng trong phòng thí nghiệm, đạt độ tinh khiết cần thiết cho các nghiên cứu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phân lập các loài vi tảo biển thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis: theo
Andersen (2005) và có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam
2.3.2 Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học (Light Microcope) và kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope –SEM); cố định mẫu bằng glutaradehyde trước khi chụp ảnh dưới kính JEOL, JSM-6400 (Nhật Bản)
2.3.3 Lưu giữ, bảo quản các mẫu vi tảo phân lập được ở nhiệt độ phòng (trong môi trường lỏng và môi trường thạch) và nhiệt độ thấp (-80C) có sử dụng 10% DMSO
2.3.4 Các phương pháp sinh học phân tử: đọc và so sánh trình tự nucleotide đoạn
gen 18S rRNA của các chủng Isochrysis sp HP1 và Nannochloropsis sp HP2 tiềm
năng được tiến hành theo Sambrook và Rusell (2001) Các chương trình phần mềm chuyên dụng như DNA Club, ClustalX 1.83, DNASTAR, MEGA4 và BLAST được
sử dụng cho phân tích, so sánh và xây dựng cây phát sinh chủng loại của các mẫu
Isochrysis sp và Nannochloropsis sp trong nghiên cứu
Trang 52.3.5 Xác định sinh trưởng của các chủng Isochrysis sp và Nannochloropsis sp
bằng đo mật độ quang ở bước sóng 680nm, đếm mật độ tế bào (MĐTB) sử dụng buồng đếm Burker-Turk (Đức), xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng (Guillard and Sieracki, 2005) sinh khối khô (sấy ở 105C), hàm lượng chlorophyll a và carotenoit
2.3.6 Phân tích thành phần và hàm lượng dinh dưỡng, kim loại nặng, lipit và các axit béo trong sinh khối chủng I galbana HP1 và N oculata HP2
- Xác định hàm lượng lipit trong sinh khối tảo: theo phương pháp của Bligh and
Dyer (1959) có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam
- Thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối của chủng I galbana HP1
và N oculata HP2: được xác định bằng máy sắc kí khí HP-6890 theo mô tả của
Đặng Diễm Hồng và cs., (2007)
- Phân tích thành phần dinh dưỡng và kim loại nặng của các chủng nói trên được
tiến hành theo Horwitz (2000)
2.3.7 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng I galbana HP1 và N oculata HP2: nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng (với ba
môi trường Walne, F/2 và Erd), nồng độ muối (dao động từ 5 - 60‰), nhiệt độ (15 -
40C), ánh sáng (60 - 800 mol/m2/s), pH (3 - 11) lên sinh trưởng và phát triển của
các chủng VTB nói trên (với chu kỳ sáng tối là 12:12h) (Durmaz, 2007)
2.3.8 Nghiên cứu khả năng chống chịu với các điều kiện môi trường nuôi bất lợi của chủng I galbana HP1 và N.oculata HP2 phân lập từ vùng biển Việt Nam và Singapore: so sánh khả năng chống chịu của chủng N oculata HP2 và LB2164, ở
điều kiện môi trường nuôi cực trị như: nhiệt độ (11 và 55°C), ánh sáng (500
mol/m2.s), pH (3 và 11) và nồng độ muối (2 và 70‰) lên sinh trưởng của tảo và khả năng phục hồi của chúng sau 5 ngày được nuôi trong điều kiện thích hợp cho
sinh trưởng Tương tự, đối với chủng I galbana HP1 và LB2307 - nhiệt độ (11 và
45°C), ánh sáng (400 mol/m2/s), pH (3 và 11) và nồng độ muối (5 và 70‰) lên sinh trưởng của tảo và khả năng phục hồi của chúng sau 5 ngày được nuôi trong điều kiện thích hợp cho sinh trưởng Sinh trưởng của các chủng này được đánh giá thông
qua xác định mật độ quang ở bước sóng 680nm hoặc đếm MĐTB
2.3.9 Phương pháp nuôi 2 chủng I galbana HP1 và N oculata HP2 ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot; thiết kế và nuôi thành công chủng N oculata HP2 trong
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài VTB thuộc chi
Isochrysis và Nannochloropsis
3.1.1 Phân lập các loài VTB thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis dựa trên
các đặc điểm hình thái
Trang 66
Từ các mẫu nước thu được ở các vùng biển Hải Phòng, Nam Định, Quảng
Ninh, Nha Trang- Khánh Hòa, chúng tôi đã phân lập được 3 mẫu Isochrysis spp và
3 mẫu Nannochloropsis spp Hình thái tế bào của các mẫu Isochrysis spp có dạng
đơn bào, hình cầu hoặc elip, màu nâu vàng, có 2 roi bằng nhau, dài 7 µm, có khả năng chuyển động hoặc đứng yên, có kích thước chiều dài 4,4 - 5,3 μm; chiều rộng
2,7 – 3,5 μm; chiều dầy 2,1 – 3,0 μm Tế bào của các mẫu Nannochloropsis spp có
dạng đơn bào, dạng hình trứng, không có roi, màu xanh, kích thước dao động khoảng 2,6 - 3,6 μm (Hình 3.1 và Hình 3.2)
Hình 3.1 Hình thái tế bào của 6 mẫu Isochrysis spp và Nannochloropsis spp
phân lập ở vùng biển Việt Nam dưới kính hiển vi quang học
Dựa trên các đặc điểm hình thái (quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính hiển
vi điện tử quét), chúng tôi đã phân lập được 3 chủng Isochrysis spp và 3 chủng Nannochloropsis spp ở các vùng biển Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh và Nha
Trang - Khánh Hòa trong năm 2008-2009
x 10000
x 10000
Isochrysis sp HP1 Isochrysis sp NĐ1 Isochrysis sp NT1
x 10000
Nannochloropsis sp HP2 Nannochloropsis sp QN1 Nannochloropsis sp NT2
Hình 3.2 Hình thái tế bào của 6 mẫu Isochrysis spp và Nannochloropsis spp
dưới kính hiển vi điện tử quét
Trang 73.1.2 Lưu giữ các chủng VTB thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis
3.1.2.1 Lưu giữ giống ở nhiệt độ phòng
Việc lưu giữ được các chủng giống Isochrysis spp và Nannochloropsis spp
sau khi phân lập được trong điều kiện phòng thí nghiệm có ý nghĩa quan trọng, góp phần bổ sung cho bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo Ở nhiệt độ phòng, chúng tôi đã lưu giữ được các chủng này trên môi trường lỏng Mẫu được cấy chuyển với chu kỳ 1-2 tháng/lần tùy thuộc vào đặc điểm sinh học của từng chủng và lưu giữ ở cả 3 đợt cấy chuyển liên tiếp (3 thế hệ) Giữ giống VTB trong môi trường lỏng có ưu điểm dễ tiến hành và có khả năng hoạt hóa mẫu nhanh Tuy nhiên, do phải cấy chuyển thường xuyên nên khả năng mẫu bị nhiễm khuẩn, nhiễm chéo là rất lớn, ngoài ra tốn diện tích lưu giữ, môi trường nuôi, thời gian và công sức khi cấy chuyển Vì vậy, để khắc phục và đảm bảo cung cấp nguồn giống ổn định lâu dài, chúng tôi tiến hành lưu giữ các chủng giống phân lập được trên môi trường thạch có
bổ sung 1,2% agar (Hình 3.3)
3.1.2.2 Lưu giữ giống ở nhiệt độ thấp
Chúng tôi đã lưu giữ được chủng Nannochloropsis sp HP2 ở - 80°C có bổ
sung 10%DMSO Kết quả sau 24 ngày hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ phòng, các chủng này có tỉ lệ sống sót cao nhất, đạt 62,45% (ngày thứ 18 sau khi hoạt hóa) trong khi
đó tỷ lệ sống sót tự nhiên của chúng chỉ đạt có 35,44% (Hình 3.4)
Isochrysis sp HP1 Isochrysis sp NĐ1 Isochrysis sp NT1
Hình 3.3 Khuẩn lạc của các chủng Isochrysis spp và
Nannochloropsis spp phân lập được trên môi trường thạch
Nannochloropsis sp HP2 Nannochloropsis sp QN1 Nannochloropsis sp
NT2
Hình 3.4 Tỷ lệ sống sót của chủng Nannochloropsis sp HP2 ở
nhiệt độ - 80°C có sử dụng 10% DMSO
Trang 88
Kết quả bảo quản chủng Isochrysis sp HP1 ở -80°C có bổ sung 10% DMSO
đã cho thấy sau 7 ngày hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ sống sót của chúng chỉ đạt 7,3%; tế bào bị vỡ và hầu như không có khả năng phục hồi trở lại ở nhiệt độ
phòng Vì vậy, chúng tôi chỉ tiến hành lưu giữ chủng Isochrysis sp HP1 phân lập
được trong môi trường lỏng và ở nhiệt độ phòng
3.1.2.3 Sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng cho nuôi trồng thủy sản
Các chủng VTB phân lập ở vùng biển Việt Nam được sử dụng làm thức ăn sống cho NTTS cần phải hội tụ được một số đặc điểm như: sinh trưởng nhanh, giàu dinh dưỡng và có khả năng nuôi trồng trên qui mô lớn Dựa trên khả năng sinh trưởng của các chủng đã phân lập được trong môi trường lỏng (đánh giá qua MĐTB, thời gian đạt mật độ cực đại và tốc độ sinh trưởng đặc trưng), thành phần dinh dưỡng (hàm lượng protein, lipit và hydratcacbon), chúng tôi đã chọn được 2 chủng
tiềm năng Isochrysis sp HP1 và Nannochloropsis sp HP2 phân lập từ vùng biển
Hải Phòng làm đối tượng nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo
3.1.3 Định tên khoa học các chủng thuộc chi Isochrysis và Nannochloropsis
bằng kỹ thuật đọc và so sánh trình tự nuleotit của đoạn gen 18S rRNA
* Kết quả tách dòng đoạn gen 18S rRNA của chủng tiềm năng Isochrysis sp HP1 và Nannochloropsis sp HP2 được trình bày ở Hình 3.5
* Trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA của chủng Isochrysis sp HP1
Độ phần trăm tương đồng của gen 18S rRNA của các loài thuộc chi Isochrysis khá cao từ 81,5% đến 99,5% Hai loài Crypthecodinium cohnii (Seligo) Chatto và Fucus distichus Linnaeus được sử dụng làm nhóm ngoại của chi Isochrysis Trên cây phát sinh chủng loại của chi Isochrysis được chia thành 2 nhánh, nhánh thứ nhất
là loài C cohnii có độ tương đồng so với các loài thuộc chi Isochrysis đạt 81,5%; nhánh thứ 2 được chia thành 2 nhánh phụ, nhánh phụ thứ nhất là loài F distichus (độ tương đồng đạt 84%) và nhánh phụ thứ 2 là các loài thuộc chi Isochrysis Trong
đó, chủng Isochrysis sp HP1 phân lập được từ vùng biển Hải Phòng có tỷ lệ phần trăm tương đồng cao nhất là 99,5% với loài I galbana Parke (AJ246266), tiếp theo đến loài Isochrysis sp CCAP 927/14 (DQ79859) đạt 99,4% và thấp nhất là loài Isochrysis sp MIBC 10557 (AB183617) đạt 98,0% Do vậy, dựa trên các đặc điểm
hình thái, tỷ lệ phần trăm tương đồng và cây phát sinh chủng loại của các loài thuộc
chi Isochrysis, chúng tôi có thể kết luận chủng Isochrysis sp HP1 phân lập từ vùng biển Hải Phòng có thể là loài Isochrysis galbana Parke 1949 (hình 3.6)
Hình 3.5 Tách dòng đoạn gen 18S rRNA của chủng Isochrysis sp HP1 và
Nannochloropsis sp HP2
A: DNA tổng số của chủng HP1 và HP2 (lane 1 và 2); B: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 18S rRNA của chủng HP1 và HP2 (lane 3 và 4); C: Sản phẩm PCR tinh sạch của chủng HP1 và HP2 (lane 5 và 6); D: PCR checking của chủng HP1 (lane 7, 8 và 9) và chủng HP2 (lane 10, 11, 12) M: Thang DNA chuẩn 1 Kb Plus Ladder
A B C D
Trang 9* Trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp
HP2
Độ tương đồng của các loài thuộc chi Nannochloropsis dao động từ 84,0% đến 99,0% Trong đó, chúng tôi sử dụng các chi Aphanochaete, Bulbochaete, Chaetophora, Oedogonium là nhóm ngoại - đây là các chi có quan hệ gần gũi với chi Nannochloropsis Chủng Nannochloropsis sp HP2 phân lập ở Hải Phòng có độ tương đồng cao nhất với loài N oculata (AF045045) đạt 99,0%, tiếp theo là N granulate (AF045043) đạt 98,7% và thấp nhất là loài N gaditana (AF133819) đạt
97,5% Kết hợp tỷ lệ phần trăm tương đồng và cây phát sinh chủng loại (Hình 3.6),
chúng tôi có thể kết luận chủng Nannochloropsis sp HP2 phân lập được từ vùng biển Hải Phòng thuộc về loài N oculata vì chúng có độ tương đồng đạt 99,0% với loài N oculata (Droop) Hibberd 1981 có mã số (AF045045)
3.1.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chính của chủng I galbana HP1 và N
oculata HP2
3.1.4.1 Đặc điểm sinh học chính của chủng I galbana HP1
Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng I galbana HP1 là
môi trường dinh dưỡng F/2, độ mặn 30‰, nhiệt độ 25C, CĐAS 100 μmol/m2/s, pH
7 Thành phần axít béo trong sinh khối của chủng HP1 ở các pha khác nhau trên đường cong sinh trưởng đã được xác định (Bảng 3.1)
Bảng 3.1 Thành phần và hàm lượng các axít béo của chủng I galbana HP1 ở
các pha sinh trưởng khác nhau (% so với TFA)
Axít béo Tên khoa học
Pha sinh trưởng theo hàm số
mũ (log)
Pha sinh trưởng tuyến tính
Pha cân bằng sớm
Pha cân bằng muộn
Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại của chủng Isochrysis sp HP1 (A) và
Nannochloropsis sp HP2 (B) phân lập từ vùng biển Hải Phòng
A
B
Trang 102,9±0,3 3,0±0,3 2,7±0,2 3,2±0,4
C22:6n-3
Axít docosahexaenoic (DHA)
Trang 11/PUFA
Ghi chú: - Không phát hiện
Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy hàm lượng DHA và các axít béo chiếm ưu thế
như myristic (14:0), palmictic (16:0), oleic (18:1n-9) , α-Linolenic (ALA, 18:3n-3)
và docosapentaenoic (DPA, 22:5n-3) của chủng HP1 đều tăng dần từ pha log đến pha cân bằng sớm và giảm dần ở pha cân bằng muộn Hàm lượng PUFAs chiếm tỉ lệ cao từ 30,7 - 48,2% so với TFA Chủng HP1 có giá trị dinh dưỡng cao nhất ở pha cân bằng sớm Khi đó hàm lượng SFA (saturated fatty acid – axít béo bão hòa) và MUFA (Mono unsaturated fatty acid – axít béo không bão hòa 1 nối đôi) đạt 52,0%
so với TFA, PUFAs đạt 48,2% so với TFA Ngoài ra, hàm lượng DHA, EPA và DPA cũng đạt giá trị cao nhất là 14,7 ± 0,8%; 1,7 ± 0,2% và 2,7 ± 0,2% so với TFA, tương ứng Tỷ lệ axít béo n-3/n-6 đạt giá trị 5,14 - đây được xem là nguồn dinh dưỡng phù hợp cho các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau
Hàm lượng protein tổng số, lipit và hydratcacbon của chủng HP1 đạt 27,98 ± 0,89%, 9,78 ± 0,12%, 25,26 ± 0,79% sinh khối khô (SKK), tương ứng, và rất giàu các khoáng đa và vi lượng Hàm lượng các kim loại nặng như As, Cd, Hg và Pb có trong sinh khối chủng HP1 đều nằm dưới ngưỡng cho phép đối với các mẫu thủy sản
và sản phẩm thủy sản theo quy chuẩn Việt Nam (2011)
3.1.4.2 Đặc điểm sinh học chính của chủng N oculata HP2
Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng N oculata HP2 là
môi trường dinh dưỡng Erd, độ mặn 30‰, nhiệt độ 25 - 30C, CĐAS 100 μmol/m2/s, pH 7 Thành phần axít béo trong sinh khối chủng HP2 đã được xác định
ở các pha khác nhau trên đường cong sinh Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy các axít béo của chủng HP2 gồm 14:0 (chiếm 0,54 - 2,42%), 16:0 (14,65–27,68%), 18:1n-9 (7,99 – 10,12%); 18:2n-6 (7,15 - 8,30%), 18:3n-3 (15,92 – 22,65%), 20:4n-6 (0,28 – 1,78%), 20:5n-3 (20,5 – 24,7%) Các PUFAs chiếm ưu thế là ALA và EPA Hàm lượng PUFAs chiếm tỉ lệ cao từ 44,10 -53,48% so với TFA Giá trị dinh dưỡng của chủng HP2 đạt cao nhất ở pha cân bằng sớm Cụ thể hàm lượng EPA, SFA+MUFA
và PUFAs đạt 24,70±1,42%; 45,50% và 52,8% so với TFA, tương ứng Tỷ lệ axít béo n-3/n-6 đạt giá trị 4,42 – được coi là nguồn dinh dưỡng phù hợp cho các đối tượng NTTS trong đó có các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ
Bảng 3.2 Thành phần và hàm lượng các axít béo của chủng N oculata HP2 ở
các pha sinh trưởng khác nhau (% so với TFA)
Axít béo Tên khoa
học
Pha sinh trưởng theo hàm
số mũ (log)
Pha sinh trưởng tuyến tính
Pha cân bằng sớm
Pha cân bằng muộn
Trang 12C18:1n-9 Axít oleic 10,12±2,02 9,75±1,95 8,90±1,87 7,99±1,84
C18:1n-7 0,24±0,05 0,35±0,05 0,40±0,05 0,36±0,05 C18:2n-6 7,50±0,90 8,00±1,43 8,30±1,99 7,15±1,00
C18:3n-3 ALA 22,65±0,13 21,27±1,32 17,70±1,66 15,92±1,18
C20:1n-7 0,53±0,09 0,82±0,19 1,20±0,24 0,74±0,19 C20:3n-6 0,53±0,13 0,65±0,16 0,70±0,18 0,25±0,03 C20:4n-6 AA 1,78±0,45 1,02±0,23 0,60±0,13 0,28±0,06
Ghi chú: - Không phát hiện
Hàm lượng protein, lipít và hydratcacbon đạt 8,20 ± 1,64%; 18,72 ± 1,74% và 34,77 ± 2,30% SKK, tương ứng và rất giàu các khoáng đa và vi lượng Hàm lượng các kim loại nặng có trong sinh khối chủng HP2 đều nằm dưới ngưỡng cho phép đối với các mẫu và sản phẩm thủy sản theo quy chuẩn Việt Nam (2011)
3.1.5 So sánh khả năng chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi của các loài VTB phân lập từ vùng biển Việt Nam và Singapore
3.1.5.1 Khả năng chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi của chủng N oculata HP2 và N oculata LB2164
