PHÂN LẬP GEN LTP Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG ĐỀ TÀI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC PHÂN LẬP GEN LTP Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠ

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG

ĐỀ TÀI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

PHÂN LẬP GEN LTP Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH

CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Lệ

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2012

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

NỘI DUNG BÁO CÁO

1 MỞ ĐẦU

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

M Đ U Ở Ầ

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

- Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek): kinh tế và dinh

dưỡng

- Cải tạo đất

xanh

của cây đậu xanh là vấn đề cần thiết

- Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính chịu hạn của cây trồng rất phức tạp do nhiều gen quy định, trong

đó có gen LTP (Lipid Transfer Protein)

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn M Đ U M Đ U Ở Ầ Ở Ầ

- LTP tham gia vào quá trình sinh tổng hợp biểu bì ở thực vật giúp hạn chế sự mất nước trong điều kiện khô hạn

- Gen LTP điều khiển và tổng hợp nên protein tương ứng tham gia xúc tác sự vận chuyển phospholipid giữa các lớp màng tế bào, hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp cây hạn chế mất nước

- Nhằm xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu hạn ở gen LTP nên chúng tôi tiến hành đề tài

“Phân lập gen LTP ở hai giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau”.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn MỞ ĐẦU

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Phân lập gen LTP ở hai giống đậu xanh địa phương có

khả chịu hạn khác nhau từ genome

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tách DNA tổng số từ lá non của hai giống đậu xanh TS (Tân Sơn) và BK (Bắc Kạn)

- Khuếch đại gen LTP bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

- Tách plasmid tái tổ hợp mang gen LTP ở hai giống đậu xanh TS và BK

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Kạn (BK)

Hình 2.1 Hình ảnh hai giống đậu xanh TS va BK

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp tách DNA trực tiếp từ lá non đậu

xanh (theo Gawel và Jarret, 1991)

2.2.2 Khuếch đại gen LTP đặc hiệu bằng phản ứng PCR (theo Mullis và cs, 1985)

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi khuếch đại gen LTP

Gen Cặp mồi Trình tự mồi Kích thước sản

phẩm PCR (bp)

LTP LTP – F

LTP – R

ATGGCTAGCCTGAATGTTGC TTACTTGATGTTAGCGCAGTT

350

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

STT Thành phần Thể tích (µl)

9 Tổng thể tích 25

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

Các bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng

52 0 C

72 0 C

30 giây

1 phút

1 phút

30

Biến tính

Gắn mồi

Tổng hợp chuỗi

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.3 Thôi gel bằng bộ kit của hãng Bioneer

2.2.4 Tách dòng gen LTP

Quy trình tách dòng gen được thực hiện như sau:

Gắn gen LTP vào vector tạo dòng pBT

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α

Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR

Hình 2.2 Sơ đồ tách dòng gen LTP ở đậu xanh

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

STT Thành phần Thể tích (µl)

Tổng thể tích 20,0 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT

Lai ở 220C trong 1,5 giờ tạo vector tái tổ hợp

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng

đúng 1 phút

- Nuôi khuẩn: Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong

môi trường LB lỏng, có bổ sung ampicilin, qua đêm

Kiểm tra sản phẩm chọn dòng

2.2.5 Tách plasmid tái tổ hợp bằng bộ kít của hãng

Bioneer

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DNA TRỰC TIẾP TỪ LÁ NON ĐẬU XANH

1.TS, 2 BK

Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số của hai giống đậu xanh TS và BK

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI GEN LTP BẰNG PHẢN ỨNG PCR

←350 bp

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LTP của hai giống

đậu xanh TS và BK

M Marker 1kb; 1 TS; 2 BK

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.3 KẾT QUẢ TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR

← 350 bp

Hình 3.3 Hình ảnh điện di kết quả thôi gel của hai giống đậu xanh TS và BK

Marker 1kb; 1 TS; 2 BK

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.4 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN LTP Ở ĐẬU XANH

← 350 bp

Hình 3.4 Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen LTP của hai giống

đậu xanh TS và BK

Marker 1kb; 1.TS; 2 BK

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.5 KẾT QUẢ TÁCH PLASMID TÁI TỔ HỢP

Hình 3.5 Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp mang gen LTP

ở hai giống đậu xanh TS và BK

1 TS, 2 BK

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN

- Đã tách chiết thành công DNA tổng số từ lá non của hai giống đậu xan TS và BK

- Khuếch đại thành công gen LTP ở hai giống đậu xanh

TS và BK bằng phản PCR với kích thước khoảng 350 bp

- Chọn được dòng vi khuẩn E.coli DH5α mang vector

tái tổ hợp (pBT –LTP) và tách được plasmid mang

đoạn gen LTP ở hai giống đậu xanh TS và BK

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.2 KIẾN NGHỊ

Xác định trình tự gen LTP của các giống đậu xanh đã

tách dòng để tìm kiếm chỉ thị phân tử liên quan đến tính

chịu hạn của cây đậu xanh nhằm phục vụ công tác chọn

tạo giống đậu xanh chống chịu tốt

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn