NGHIÊN CỨU HIỆU ỨNG KÍCH KHÁNG BỆNH CỦA CHITOSAN CẮT MẠCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỨC XẠ ĐỐI VỚI CÁ RÔ PHI

Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được chế tạo bằng phương pháp cắt mạch bức xạ chitosan dạng bột và dung dịch chitosan 3%. Kết quả đo KLPT bằng phương pháp sắc ký gen cho thấy khối lượng phân tử giảm khi tăng liều xạ. Đối với chitosan chiếu xạ dạng bột KLPT giảm từ 120.000 Da xuống 40.000 Da khi tăng liều xạ từ 0 kGy đến 50 kGy. Đối với chitosan dạng dung dịch KLPT giảm xuống còn 6100 Da tại liều xạ 20 kGy. Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được bồ sung vào thức ăn cho cá rô phi trong vòng 45 ngày ở nồng độ 100 ppm rồi sau đó gây nhiễm bằng vi khuẩn Strep. Agalactidae để khảo sát hiệu ứng kích kháng bệnh. Kết quả cho thấy oligochitosan có hiệu ứng kích kháng bệnh tốt hơn chitosan KLPT thấp. Tỉ lệ sống sót (%) của cá rô phi được bổ sung vào thức ăn oligochitosan, chitosan KLPT thấp và mẫu đối chứng lần lượt là 73,33 ± 2,89, 63,33 ± 10,41 và 46,67 ± 10,00. Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan tới khả năng kích kháng bệnh đã được khảo sát. Kết quả cho thấy oligochitosan ở nồng độ 100 ppm có khả năng kích kháng bệnh cao nhất so với oligochitosan ở nồng độ 50ppm và 150 ppm. Tỉ lệ sống sót (%) của cá rô phi được bổ sung vào thức ăn oligochitosan tại các nồng độ 50 ppm, 100ppm, 150 ppm và mẫu đối chứng lần lượt là 61,67±2,89, 76,67±2,89, 75,00±10,00 và 43,33±10,41.

NGHIÊN CỨU HIỆU ỨNG KÍCH KHÁNG BỆNH CỦA CHITOSAN CẮT MẠCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỨC XẠ ĐỐI VỚI CÁ RÔ PHI

NGUYỄN NGỌC DUY1, ĐẶNG VĂN PHÚ1, NGUYỄN QUỐC HIẾN1, LÊ THỊ BÌNH2

1 Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Viện NLNT Việt Nam

202A, đường 11, Phường Linh xuân, Quận Thủ đức, Tp HCM

2 Bộ môn Sinh Học Thủy Sản, Trường Đại học Nông Lâm, Khu phố 6, Phường Linh trung, Quận Thủ đức Tp HCM

Email: ngocduy158@yahoo.com

Tóm tắt: Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được chế tạo bằng phương pháp cắt mạch

bức xạ chitosan dạng bột và dung dịch chitosan 3% Kết quả đo KLPT bằng phương pháp sắc ký gen cho thấy khối lượng phân tử giảm khi tăng liều xạ Đối với chitosan chiếu xạ dạng bột KLPT giảm từ 120.000 Da xuống 40.000 Da khi tăng liều xạ từ 0 kGy đến 50 kGy Đối với chitosan dạng dung dịch KLPT giảm xuống còn 6100 Da tại liều xạ 20 kGy Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được bồ sung vào thức ăn cho cá rô phi trong vòng

45 ngày ở nồng độ 100 ppm rồi sau đó gây nhiễm bằng vi khuẩn Strep Agalactidae để

khảo sát hiệu ứng kích kháng bệnh Kết quả cho thấy oligochitosan có hiệu ứng kích kháng bệnh tốt hơn chitosan KLPT thấp Tỉ lệ sống sót (%) của cá rô phi được bổ sung vào thức ăn oligochitosan, chitosan KLPT thấp và mẫu đối chứng lần lượt là 73,33 ± 2,89, 63,33 ± 10,41 và 46,67 ± 10,00 Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan tới khả năng kích kháng bệnh đã được khảo sát Kết quả cho thấy oligochitosan ở nồng độ 100 ppm có khả năng kích kháng bệnh cao nhất so với oligochitosan ở nồng độ 50ppm và 150 ppm

Tỉ lệ sống sót (%) của cá rô phi được bổ sung vào thức ăn oligochitosan tại các nồng độ

50 ppm, 100ppm, 150 ppm và mẫu đối chứng lần lượt là 61,67±2,89, 76,67±2,89, 75,00±10,00 và 43,33±10,41

Từ khóa: Oligochitosan, chitosan KLPT thấp, kích kháng bệnh, cá rô phi

I MỞ ÐẦU

Trong hai thập niên qua, trên phạm vi toàn thế giới, nuôi trồng thuỷ sản có mức tăng sản lượng cao nhất trong các lĩnh vực sản xuất lương thực thực phẩm Nuôi trồng thuỷ sản có tiềm năng phát triển nhằm đáp ứng các nhu cầu về sản phẩm thuỷ sản trên hầu hết các vùng của thế giới Tuy nhiên, một trong những bất lợi trong nuôi trồng thuỷ sản là thiệt hại do dịch bệnh Qua nhiều thập niên cho thấy bệnh dịch là nguyên nhân gây suy giảm về hiệu quả kinh tế trong nuôi thủy sản Do vậy rất cần có chiến lược quản lý hiệu quả sức khỏe vật nuôi như chẩn đoán nhanh, điều trị phòng ngừa và hệ thống an ninh sinh học

Sử dụng các chế phẩm sinh học, hạn chế sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh cho vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản là những hướng nghiên cứu và ứng dụng đang được quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Một số chất như levamisole, β-glucan, peptidoglycan, chitin, chitosan cũng như một vài dẫn xuất khác có nguồn gốc từ thực vật và động vật đã được

sử dụng để phòng và trị bệnh Chitosan là một polysacarit mạch thẳng được cấu tạo từ các D-glucosamine liên kết theo kiểu β-(1→ 4)-2-acetamido-2-deoxy–D–glucose, là sản phẩm của quá trình deacetyl hóa chitin, chitosan và các dẫn xuất là các polyme phân hủy sinh học có những ưu điểm nổi bật như có khả năng kháng khuẩn, tương hợp sinh học, làm lành vết thương nên chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như trong y học dùng làm chất mang dược phẩm, enzym, màng phủ vết thương, vết bỏng làm keo xịt tóc, kem dưỡng da,[2] Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitosan được ứng dụng làm chất bảo quản nông phẩm,

chất điều hòa sinh trưởng [2,3] Ngoài ra chitosan còn được ứng dụng trong những lĩnh vực khác như hấp thụ kim loại, xử lý nước thải [2]

Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản việc sử dụng chitosan và oligochitosan như một tác nhân phòng và trị bệnh cho vật nuôi đã được quan tâm nghiên và áp dụng ở nhiều nước trên thế giới có nghành nuôi trồng thủy sản phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật Bản, Na Uy… Kết quả nghiên cứu của A Gopalakannan và cộng sự [1] cho thấy, khi bổ sung chitosan, chitin và levamisole vào thức ăn cho cá chép trong 45 ngày thì tỷ lệ sống sót của cá sau khi được gây nhiễm cao hơn đáng kể so với mẫu cá đối chứng Tỷ lệ sống sót cao nhất ở mẫu cá được bổ sung chitosan lên tới 80%, sau đó là levamisole 66,7% và chitin là 40% Nhiều kết quả nghiên cứu khác cũng chứng minh chitosan và oligochitosan không chỉ có tác dụng trị bệnh mà còn có tác dụng làm tăng cường sức đề kháng từ đó tăng cường hệ miễn dịch của vật nuôi [3, 4, 5, 6, 7]

II THỰC NGHIỆM

1 Nguyên vật liệu hóa chất:

Chitosan được mua từ Vũng Tàu có khối lượng phân tử Mw = 120.000 Da Cá rô phi

được mua từ trại cá giống Tân Vạn, Bình Dương Chủng vi khuẩn Streptococus agalactidae

được phân lập từ cá bệnh tại Đồng Tháp, được định danh và bảo quản tại Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Môi trường tăng sinh vi khuẩn: Nutrien Broth (NB), Ấn Độ Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Nutrien Agar (NA) Ấn Độ Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, Fuchsin, Lugol, dung dịch tẩy màu

2 Phương pháp

Chế tạo chitosan KLPT thấp: Chế tạo chitosan KLPT thấp: chitosan dạng bột được

đóng gói trong túi PE  chiếu xạ tại các liều, 10, 20, 30, 50 kGy

Chế tạo dung dịch oligochitosan: Chitosan được hòa tan trong axit lactic 1,5% để được nồng độ 3% sau đó được cho vào bình thủy tinh có nút vặn thêm H2O2 ở những nồng độ khác nhau  chiếu xạ tại các liều 4, 8, 12, 16, 20 kGy

Xác định KLPT của chitosan KLPT thấp và oligochitosan: KLPT Mw được đo trên máy HP-GPC 1100, detector RI GI362A, hãng Agilent dùng cột Ultrahydrgel 250 và 500, hãng Water và chất chuẩn là pullulan có KLPT 780 – 380.000Da Dung môi sử dụng là hỗn hợp 0,25M CH3COOH/ 0,25M CH3COONa với tốc độ dòng là 1ml/phút

Xác định độ deacetyl và cấu trúc của chitosan cắt mạch bức xạ: Ðộ đề acetyl được xác

định bằng phổ hồng ngoại (IR) với kỹ thuật ép viên KBr Độ đề acetyl được tính theo công thức [8]: DDA = 100 – ([ A1320/A1420 – 0,3822]/0,03133) Trong đó A1320 và A1420 là mật độ quang tương ứng tại các đỉnh hấp phụ 1320cm-1 và 1420 cm-1 Chiều cao của đỉnh hấp phụ được xác định bằng phần mềm Photoshop CS3

Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng: Cá được làm chết bằng cách hủy não và đặt trong

lẻ và mọc trên đường cấy để pha huyền dịch vi khuẩn Hòa các khuẩn lạc đã chọn ở mỗi chủng vào ống nghiệm có nước muối sinh lý vô trùng, đo OD của huyền dịch và sử dụng huyền dịch này để ngâm cho cá

Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm: Gây nhiễm bằng phương pháp ngâm, thời gian

ngâm cá trong 60 phút Thể tích nước ngâm cá là 5 lít Trong quá trình gây nhiễm có sử dụng

hệ thống sục khí

Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: Sau khi đo huyền dịch vi khuẩn, tiến hành pha

loãng huyền dịch với độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 Từ mỗi độ pha loãng hút 0,1 ml dung dịch

nhỏ lên đĩa thạch NA (mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần), dùng que cấy trang, trang đều dung dịch trên thạch, để khô tự nhiên và đem ủ ở 30oC trong 24 giờ Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa

thạch tại mỗi nồng độ pha loãng (chỉ đếm ở các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250), dựa vào công

thức tính và liều dung dịch vi khuẩn tiêm cho cá ta suy ra mật độ vi khuẩn tiêm vào mỗi cá

- Công thức tính: A = X*1/K*V

- Trong đó: A: số khuẩn lạc mọc trên một đơn vị ml

X: số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa môi trường ở một hệ số pha loãng

V: thể tích (ml) mẫu dùng để cấy

K: hệ số pha loãng

Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm Cá sau khi gây nhiễm theo dõi trong 21

ngày Hàng ngày, tiến hành đo nhiệt độ 2 lần/ngày (lúc 7 giờ 30 phút và 15 giờ), kiểm tra DO,

pH, NH3 đo 1 lần/ngày Thay nước hàng ngày với 10% thể tích bể thí nghiệm Quan sát biểu hiện của cá, ghi nhận các biểu hiện bất thường, số liệu cá chết ở mỗi bể Khi cá chết, ghi nhận biểu hiện bên ngoài, giải phẫu ghi nhận các biểu hiện bên trong Đối với cá mới chết, cấy

phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách Số cá còn sống sau 14 ngày gây bệnh thực nghiệm được ghi nhận biểu hiện bên ngoài, bên trong và cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách

Phương pháp giải phẫu cá: Khử trùng bề mặt cơ thể cá bằng cồn 70% tại những vị trí

cần giải phẫu Giải phẫu xoang bụng trái của cá bằng 3 đường cắt: Đường xuất phát từ trước

lỗ hậu môn cắt song song với đường bụng và đường xuất phát từ trước lỗ hậu môn song song với đường bên Đường thứ 3 song song rìa nắp mang và cắt 2 đường bên Sau khi cắt xong

tách rời 1 bên xoang bụng cho thấy nội tạng bên trong Dùng 1 miếng bông gòn đã tẩm cồn lau sạch phần máu và dịch xoang bụng Quan sát và ghi nhận biểu hiện của các nội quan

III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 Khối lượng phân tử của chitosan KLPT thấp và oligochitosan theo liều xạ

1.1 Khối lượng phân tử của chitosan KLPT thấp theo liều chiếu xạ

Hình 1 Sự suy giảm KLPT của chitosan chiếu xạ tia gamma Co-60 theo liều xạ

Từ kết quả hình 1 thấy rằng chitosan KLPT thấp có thể dễ dàng chế tạo thông qua chiếu

xạ chitosan KLPT cao dạng bột hoặc là dạng vảy KLPT của chitosan giảm từ 120.699 Da xuống còn 40.747 Da khi tăng liều xạ từ 0-50 kGy

Bảng 1: Mw, Mn và chỉ số đa phân tán (PI = M w /M n ) của chitosan KLPT thấp

Kết quả PI ở bảng 1 nhận thấy rằng khi tăng liều xạ PI giảm từ 2,14 xuống giá trị 1,62 tại liều 50 kGy Kết quả này chỉ ra rằng KLPT Mw của chitosan càng nhỏ thì độ phân tán của chitosan càng hẹp Kết quả này cũng khá phù hợp với công trình của Czechowska-Biskup [8]

từ đó có thể kết luận khoảng liều xạ thích hợp để chế tạo chitosan KLPT thấp là 30 kGy đến

50 kGy với chitosan có KLPT ban đầu khoảng 120.000 Da

Liều xạ (kGy)

5 (D

Bảng 2 Giá trị DD của chitosan ban đầu và chitosan chiếu xạ từ 10-50 kGy

Liều xạ

(kGy)

DD,% 84,4  1,2 83,5  1,8 82,7  2,2 82,1  1,5 80,8  2,6 Kết quả về DD được đưa ra trong bảng 2 và phổ IR của các mẫu chitosan ban đầu và mẫu chitosan chiếu xạ tại các liều 20 và 50 kGy cho thấy chitosan chiếu xạ có hầu hết tất cả các đỉnh tương tự như chitosan ban đầu, điều này chứng tỏ cấu trúc cơ bản của chitosan chiếu

xạ dạng bột không thay đổi so với chitosan ban đầu trong quá trình chiếu xạ và DD của chitosan chiếu xạ và chitosan ban đầu có sự khác biệt không đáng kể

1.2 Khối lượng phân tử oligochitosan theo liều xạ

Hình 3 Sự thay đổi giảm KLPT của chitosan theo thời gian xử lý với H 2 O 2, tia  và

H 2 O 2/tia  (suất liều: 1,14 kGy/h)

Bảng 3 trình bày kết quả về hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan trong dung dịch bằng tia γ

và H2O2 [9] Kết quả cho thấy hiệu ứng đồng vận đạt hiệu quả cao trong khoảng liều xạ thấp Cụ thể suy giảm KLPT là 58,4; 34,5; 13,0 và 0,2% tương ứng với liều xạ 4; 8; 12 và 16 kGy

Bảng 3 Suy giảm KLPT khi cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit, tia γ và hiệu ứng

đồng vận hydroperoxit và tia γ

4 kGy (3 giờ) 8 kGy (6 giờ) 12 kGy (9 giờ) 16 kGy (12 giờ)

Hiệu ứng đồng vận D, %

* Thời gian (giờ) xử lý với H 2 O 2

** Thời gian (giờ) và/hoặc là liều xạ (kGy) xử lý với bức xạ tia γ

Cơ chế cắt mạch chitosan đã được Ulanski & von Sonntag (2000) nghiên cứu khá chi tiết [10] Các tác giả đã chỉ ra rằng gốc hydroxyl tạo ra trong quá trình chiếu xạ dung dịch chitosan là tác nhân chính gây ra sự cắt mạch chitosan (Hình 1.4)

O

C H 2 O H O

O H

N H 3

5 O

C H 2 O H O

O H

N H 3

6 O

C H 2 O H O

O H

N H 3

O

C H 2 O H O

O H

N H 3

2

O

C H 2 O H O

O H

N H 3

4

O

C H 2 O H O

O H

N H 3

3

1 O

C H 2 O H O

O H

N H 3

O H

H 2 O

Hình 4 Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl [12]

Từ kết quả hình 3 thấy rằng xử lý kết hợp H2O2 và tia  đã làm gia tăng hiệu ứng cắt mạch đối với chitosan và nồng độ H2O2 càng cao thì mức độ suy giảm Mw càng lớn tại cùng thời gian chiếu xạ (liều xạ) Nguyên nhân là do sự tạo thành gốc hydroxyl (.OH) khi phân ly bức xạ nước và H2O2 như sau [11]:

H2O e

aq, H., .OH, H2O2, H2, H3O+, (7)

Trong quá trình chiếu xạ e

aq and H. Có thể phản ứng với H2O2 như sau:

e

Hằng số tốc độ của phản ứng (8) là k = 1,1  1010 L mol1 s1 và phản ứng (9) là k = 9  107

L mol1 s1 (Buxton et al., 1988) [44] Do vậy, ngoài sự tạo thành gốc .OH do thủy phân bức xạ nước, gốc .OH còn được tạo ra qua các phản ứng (7), (8) và (9)trong quá trình chiếu xạ Như vậy chiếu xạ dung dịch chitosan với sự có mặt của H2O2 là rất hiệu quả để cắt mạch chitosan

Phổ hồng ngoại (IR) của chitosan và oligochitosan từ dung dịch 3% chitosan chứa 0,25-1% H2O2 chiếu xạ 8 kGy được biểu thị trên hình 5

tia γ tia γ

Kết quả về DD được đưa ra trong hình 5 Phổ IR của các mẫu oligochitosan có hầu hết tất cả các đỉnh tương tự như chitosan ban đầu, điều này chứng tỏ cấu trúc cơ bản của oligochitosan có Mw từ 5.000 đến 10.000 vẫn không thay đổi so với chitosan Tuy nhiên, DD của oligochitosan giảm từ 84% (chitosan ban đầu) xuống còn 77,5-74,4% đối với oligochitosan Như vậy quá trình cắt mạch chitosan đã kèm theo quá trình suy giảm nhóm – NH2 Nồng độ H2O2 càng cao thì sự suy giảm hàm lượng nhóm –NH2 của sản phẩm oligochitosan càng nhiều Do vậy, sự lựa chọn tối ưu nồng độ H2O2 và liều xạ là cần thiết để chế tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ tia  dung dịch chitosan chứa H2O2 nhằm bảo vệ nhóm –NH2

Bảng 4 Giá trị DD của chitosan và oligochitosan từ dung dịch 3% chitosan với các nồng độ

H 2 O 2 khác nhau chiếu xạ liều 8 kGy

0,25% H2O2 0,5% H2O2 1,0% H2O2 DD,% 84,4  1,2 77,5  2,8 76,4  1,9 74,4  2,2

2 Kết quả khảo sát hiệu ứng kháng bệnh của cá rô phi

2.1 Kết quả kiểm tra cá trước khi gây nhiễm

Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá trước khi thí nghiệm cho thấy cá không bị nhiễm

ký sinh trùng Kết quả kiểm tra vi khuẩn trên môi trường BHIA thì không có khuẩn lạc nào xuất hiện trên đĩa cấy phân lập vi khuẩn ở gan, thận, lách của cá trước khi thí nghiệm Như vậy nguồn cá chuẩn bị thí nghiệm hoàn toàn khỏe mạnh

2.2 Nồng độ vi khuẩn gây nhiễm

Sau khi đếm số lượng khuẩn lạc và dựa vào công thức tính chúng tôi xác định được nồng độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá là 8,47x106 cfu/ml

2.3 Kết quả phân lập vi khuẩn

Cá chết ở các nghiệm thức sẽ được phân lập gan, thận lách trên môi trường NA để xác định vi khuẩn gây bệnh

- Nghiệm thức ĐC1: không có sự hiện diện của vi khuẩn trên đĩa cấy phân lập Như vậy,

cá chết ở nghiệm thức này không do vi khuẩn gây nhiễm

- Nghiệm thức được gây nhiễm (ĐC2, NT1, NT2, NT3 ): có xuất hiện khuẩn lạc tròn,

trắng đục mọc trên đường cấy của mẫu cấy phân lập gan, thận, lách cá chết Tiếp tục chọn các

khuẩn lạc nghi ngờ để cấy thuần và định danh vi khuẩn

Hình 6: Đĩa cấy thuần vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh

2.4 Kết quả định danh

Kết quả định danh vi khuẩn trước khi gây nhiễm: Vi khuẩn bắt màu tím, hình cầu, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi trên tiêu bản nhuộm Gram; vi khuẩn không di động trên môi trường thạch bán lỏng, âm tính trong thử nghiệm với oxydase và catalase; đồng

thời thử nghiệm với test kit Api 20 Strep Kết quả khẳng định: vi khuẩn trước gây nhiễm là S

agalactidae

Vi khuẩn phân lập được từ cá chết sẽ được chọn lọc để cấy thuần, chọn vi khuẩn từ đĩa cấy thuần để định danh bằng các thử nghiệm như nhuộm Gram, oxidase, catalase và kiểm tra

bằng test Api 20 Strep Kết quả thu được vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh là S agalactidae

Như vậy, có thể kết luận vi khuẩn gây bệnh làm cho cá chết cũng chính là vi khuẩn gây nhiễm

thực nghiệm: S agalactidae

Hình 7: Mẫu nhuộm Gram vi khuẩn phân lập từ cá chết 2.5 Kết quả hiệu ứng kháng bệnh của chitosan KLPT thấp và oligochitoan

Sau 21 ngày gây bệnh thực nghiệm, tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức được ghi nhận lại:

Nghiệm thức ĐC 1 (đối chứng-không bổ sung Chitosan-không ngâm vi khuẩn) cá chết với tỷ

lệ chết trung bình là 10% Mẫu cấy phân lập cá chết không thấy có sự hiện diện của vi khuẩn gây nhiễm thực nghiệm Như vậy, cá chết ở nghiệm thức này có thể do sức khỏe cá yếu

Bảng 5 Tỷ lệ chết của cá rô phi sau 21 ngày gây nhiễm với vi khuẩn S Agalactidae

của các nghiệm thức

Tỷ lệ chết (%) 10,00 ± 5,00a 53,33 ± 10,41cd 36,67 ± 10,41bc 26,67 ± 2,89ab

Ghi chú: Giá trị trung bình ± SD

Giá trị cùng hàng giống nhau ký tự thì khác nhau không ý nghĩa thống kê (P<0,05)

ĐC 1: (không bổ sung chitosan) ngâm bằng nước muối sinh lý vô trùng

ĐC2: (không bổ sung chitosan) ngâm vi khuẩn S agalactidae

NT1: (bổ sung 100 ppm chitosan KLPT thấp) ngâm vi khuẩn S agalactidae

NT2: (bổ sung 100 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn S agalactidae

nhiễm cao hơn đáng kể so với mẫu cá đối chứng Tỷ lệ sống sót cao nhất ở mẫu cá được bổ sung chitosan lên tới 80%, sau đó là levamisole 66,7% và chitin là 40%

2.6 Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan đến khả năng kháng bệnh của cá rô phi

Bảng 6 Tỷ lệ chết của cá rô phi sau 21 ngày gây nhiễm với vi khuẩn S agalactidae

của các nghiệm thức

Tỷ lệ chết (%) 11,67 ± 2,89 a 56,67 ± 10,41 d 56,67 ± 10,41 d 23,33 ± 2,89 ab 25,00 ± 10,00 ab

Ghi chú:

Giá trị trung bình ± SD

Giá trị cùng hàng giống nhau ký tự thì khác nhau không ý nghĩa thống kê (P<0,05)

Trong đó:

ĐC 1 (không bổ sung chitosan) ngâm bằng nước muối sinh lý vô trùng

ĐC 2 (không bổ sung chitosan) ngâm vi khuẩn Strep agalactidae

NT 1 ( bổ sung 50 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep agalactidae

NT2 (bổ sung 100 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep agalactidae

NT3 (bổ sung 150 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep agalactidae

Bảng kết quả về tỷ lệ chết của cá khi được ăn thức ăn có bổ sung oligochitosan ở các nồng độ khác nhau cho thấy tỉ lệ cá chết giảm từ 38,33% ± 2,89 xuống 23,33 ± 2,89 khi tăng nồng độ oligochitsan từ 50 lên 100 ppm, tuy nhiên khi tăng nồng độ oligochitosan lên 150 ppm thì tỉ lệ cá chết thay đổi không đáng kể Từ đó có thể kết luận nồng độ tối ưu để sử dụng oligochitosan như là chất kích kháng bệnh là 100 ppm ở các nồng độ thấp hơn (50 ppm) hoặc cao hơn (150 ppm) thì hiệu quả kích kháng bệnh đều thấp hơn

IV KẾT LUẬN

Chitosan KLPT thấp và oligochitosan đã được chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 Khoảng liều chiếu xạ từ 30 đến 50 kGy là khoảng liều thích hợp để điều chế chitosan KLPT thấp (40.000 – 50.000) từ chitosan có KLPT ban đầu khoảng 120.000 và liều

xạ 12kGy là liều tối ưu để điều chế dung dịch oligochitosan có KLPT trong khoảng 5.000-7.000 (KLPT ban đầu khoảng 120.000) chứa 0,5%H2O2

Kết quả khảo sát hiệu ứng kháng bệnh của chitosan KLPT thấp và oligochitosan đối với

cá rô phi cho thấy oligochitosan có khả năng kháng bệnh tốt hơn so với chitosan KLPT thấp ở cùng một nồng độ Nồng độ tối ưu của oligochitosan sử dụng làm chất kháng bệnh cho cá rô phi là 100 ppm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] A Gopalakannan et al., Immunomodulatory effect of dietary intake of chitin, chitosan and

levamisole on the immune system of Cyprinus carpio and control of Aeromonas hydrophila infection in ponds, Aquaculture, 255, pp.179–187 (2006)

[2] K.V.H Prashanth et al., Chitin/chitosan modification and their unlimited application potential –

an overview, Trend in Food Science & Technology,18, pp.117–131 (2007)

[3] S Hirano et al., Chitosan as an ingredient for domestic animal feeds, J Agric, Food Chem, 38,

pp.1214–1217 (1980)

[4] R Huang et al., Dietary oligochitosan supplementation enhances immune status of broiler,

Journal of the Science of Food and Agriculture, 87, pp.153–159 (2007)

[5] S.H Wang, J.C Chen, The protective effect of chititn and chitosan against vibrio alginolyticus

in white shrimp litopenaeus vannamei, Fish & Shellfish Immunology, 19, pp.191–204 (2005)

[6] S.H Cha et al., Effect of chitosan – coated diet on improving water quality and innate immunity

in olive flounder, Paralichthys olivaceus, Aquaculture, 278, pp.110–118 (2008)

[7] Y Okamoto et al., Effect of chitin/chitosan and their oligomers/monomers on migration of

fibroblasts and vascular endothelium, Biomaterials, 23, pp.1975–1979 (2002)

[8] Czechowska-Biskup, R et al., Radiation-induce and sonochemical degradation of chitosan as a way to increase its fat-binding capacity Nucl Instr Meth Phys Res B 236, pp.383-390, 2005 [9] Hien, N.Q et al., Degradation of chitosan in solution by gamma irradiation in the presence of hydrogen peroxide Carbohydr Polym 87, pp.935-938, 2012

[10] Ulanski, P et al., OH-radical-induced chain scission of chitosan in the absence and presence of dioxygen J Chem Soc., Perkin Trans 2, pp.2022-2028, 2000

[11] Makuuchi, K et al., Critical review of radiation processing of hydrogel and polysaccharide Radiat Phys Chem 79, pp.267-271, 2010

STUDY ON EFFECT OF IMMUNE RESPONSE OF GAMMA-RAY

IRRADIATED CHITOSAN ON TILAPIA

Abstract: Low molecular weight chitosan (LMWC) powder and oligochitosan solution

were prepared by -irradiation method The efficiency of the degradation process was demonstrated by gel permeation chromatography (GPC) analysis of the average molecular weight of degraded chitosan Results showed that the molecular weights decreased with increasing doses For LMWC molecular weight reduces from 120,000 Da

to 40,000 Da when dose raises from 0 kGy to 50 kGy and oligochitosan reduces to 6100

Da at 20k Gy Tilapia fish, which was fed with LMWC and oligochitosan 100ppm for 45

days, was challenged with Strep Agalactidae bacteria to investigate immune response

The results also exhibited that oligochitosan has effect of immune response higher than LMWC The effect of various concentrations (50 ppm, 100 ppm, 150 ppm) was