Vật liệu, phương pháp nghiên cứu vi khuẩn lao
Trang 2CHUONG 2 VAT LIEU — PHUONG PHAP
2.1 CAC KY THUAT DUNG TRONG NGHIEN CUU
2.1.1 Nuôi cấy giữ giống vi khuẩn lao
2.1.1.1 Nguyên tắc:
Nuôi cấy tế bào vi khuẩn lao trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng nhằm giữ giống nghiên cứu, cũng như tăng sinh khối tế bào trước khi thực hiện tách chiết
Do vị khuân lao cân nguôn dinh dưỡng cao nên môi trường đê nuôi vị khuân
lao thường chứa nhiêu chât hữu cơ cũng như các amino acid
2.1.1.2 Hoá chất và thiết bị:
Môi trường rắn L] . - cv t2 reret BD Benex
Môi trường lỏng MGTIÍ - c5 22c cà BD Benex
Môi trường lỏng 7H9G (xem phụ lục 2) BD Bacto Casitone
Môi trường giữ giống đông lạnh (-20°C) 7H9A BD Bacto Casitone
OADC (Oleic acid, Bovine Albumin, Dextrose, Catalase) BD Benex
Máy ly tâm mẫu (có bình chứa an toàn) ALC
Tủ cây cấp độ l 5c 2t 222 errrrrrrree Walker
2.1.1.3 Tiến hành:
- Nuôi trên môi trường răn L]:
Hút 0,5 ml dd đàm đã xử lý (xem phụ lục 1) nhỏ vào môi trường LÍ, đậy nắp kín,
đem ủ ở 37C
Đọc kết quả sau một tháng hoặc hơn
Mẫu cấy cho két qua chan đoán dương tính khi trên mặt thạch xuất hiện khuẩn lạc
đặc trưng của vi khuân lao Khuân lạc lao có màu trăng ngà, khô, xu xì, có khi gô cao trên mặt thạch
Trang 3
-45-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP
- Nuôi trên môi trường lỏng (MGTT, 7H9G):
Hut 0,5 ml dd đàm đã xử lý (xem phụ lục 1) nhỏ vào môi trường lỏng MGTIT, đậy
nắp kín, đem ủ ở 37°C
Đọc kết quả sau hai tuần hoặc hơn
Mẫu cấy cho kết quả sàng lọc dương tính khi môi trường sáng lên dưới đèn cực tím
Cần phết lam từ mẫu cay MGIT để xác định vi khuẩn kháng côn, kháng acid
Nếu tiếp tục ủ sẽ thấy vi khuẩn kết thành cụm trên thành ống hay dưới đáy ống
2.1.2 Tach chiét DNA bộ gene vi khuẩn lao bằng phương pháp
Lysosome/ CTAB
2.1.2.1 Nguyên tắc:
Vì vi khuẩn lao lây nhiễm qua đường hô hấp và tương đối nhạy với nhiệt độ
nên trước tiên cần tiêu diệt chúng ở nhiệt độ 80°C trong 20 phút Bước này đơn giản
mà không làm ảnh hưởng đến kết quả cũng như chất lượng sản phẩm DNA tách chiết [13]
Vi khuẩn lao có vách tế bào rất dày nên cần phải có tác động phá mang băng
những hoá chất biến tính protein mạnh và các enzyme phá màng như lysozyme, proteinase K Các protein cũng như các enzyme sẽ bị biến tính một lần nữa bằng chloroform, tách protein ra khỏi pha nước có chứa DNA bộ gene
DNA bộ gene trong pha nước sẽ được tủa và tỉnh sạch bằng isopropanol và
Trang 4-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP
Hexadecyltrimethylmamonium (CTAB) Sigma
TSOpropanl 0.0.00 ceccesseseccsseesccssesseserecsseveressesnrevsesess Merck
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Merck
Ethanol ccct cv v2 12x S HH HH HH ngư Merck
Nước cất khử ion -2ccc¿22222vscrstrrrkeered ELGA
Máy VOTẨ€X LH HH nH HT ng Hưng Hới Genie2
Máy ly tam lamh ooo cee ceccecscsseesecnsecsesesesseseseeseeeees Eppendorf
2.1.2.3 Tién hanh:
Tién hanh tach chiét DNA bộ gene vi khuẩn lao theo thứ tự các bước sau:
Cho 0,6m] dung dịch đệm TE vào mỗi tube có nắp vặn
Lấy toàn bộ vi khuẩn băng vòng cấy vi khuẩn bỏ vào tube có dung dịch
TE
U & 80°C trong 20 phut Đề nguội về nhiệt độ phòng
Pha dung dich lysozyme moi (10mg/ml) Thém 50u] dung dich lysozyme vao mdi tube, vortex U & 37° qua dém
Thêm 10pl proteinase K (10mg/ml) va 351 dung dich SDS 20% (W/V),
vortex Ú ở 55°C trong 30 phút
Thêm 100u1l dung dịch NaCl 5M, vortex Thêm 100H] dung dịch CTAB
5% và vortex cho đến khi dung dịch có màu trắng đục Ủ ở 65°C trong 15
phút
Đề nguội về nhiệt độ phòng rồi thêm 700u1 dung địch chloroform:isoamy] alcohol (24:1), vortex Ly tam 13000g trong 5 phút
Hút cần thận 600u] lớp nước trên cùng cho vào các eppendorf mới
Thêm 360ul (tương ứng với 0,6 thể tích) isopropanol để tủa DNA Trộn đều dung dịch bằng cách cách đảo tube vài lần, giữ ở -20°C ít nhất 30
phút
Trang 5
_47-CHUONG 2: VAT LIEU— PHUONG PHAP
- Ly tam 13000g trong 15 phut
- Bo dich néi Thém 1,0ml cén 70% lanh vào
- Ly tém 13000g trong 7 phút
- _ Cần thận loại bỏ dịch nỗi
- _ Ly tâm lại 13000g trong 2 phút Dùng tip nhỏ hút bỏ dịch nỗi còn lại
- Dé tube mở nắp ở nhiệt độ phòng hoặc hút chân không cho đến khi khô
hoàn toàn
- Thêm lượng TE phù hợp vào từng tube (25-100u1 TE) Dé mẫu tan ở
nhiệt độ phòng trong 2 giờ, hay để qua đêm ở 4°C
- - Mẫu DNA sau khi ly trích này được giữ ở -20°C
2.1.3 Định lượng DNA bằng Picogreen
Do picogreen gắn đặc hiệu với DNA mạch đôi nên sẽ ít bi ảnh hưởng nêu
trong mẫu có nhiễm các RNA hay hoá chât khác (muôi, côn, chloroform, protein, agarose)
_ 48
Trang 6-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP
2.1.3.2 Hoa chat va thiét bi:
Kit Quant-iT™ Picogreen dsÙDNA Invitrogen
Dung dich TE (phu luc 3)
Lambda DNA standard (100ug/ml) Biolab
Đĩa polystyrene 96 giếng con nen Corning Incorporated Máy đo Tecan c c St SH ng nen GENIos
2.1.3.3 Tiến hành:
Gồm bốn bước sau:
4) Pha loãng mẫu cân đo nông độ
Thực hiện pha loãng mẫu trên đĩa 96 giếng, trộn đều bằng pipet Tất cả
các mẫu được pha loãng bằng dung dịch TE
- Nếu pha loãng 400 lần: hút Iul DNA đã tách chiết cần đo nồng độ pha
trong 199u] TE Khi do, hut SOul dd pha loãng này trộn với SOul dd picogreen (PG)
- Nếu pha loãng 500 lần: hút Iul DNA đã tách chiết cần đo nồng độ pha trong 249ul TE Khi do, hut 50u] dd pha loãng này trộn với 50HL dd picogreen (PG)
- Néu pha loang 600 lan: hut lu] DNA da tach chiét cần đo nồng độ pha
trong 299ul TE Khi đo, hút 50HÌ dd pha loãng này trộn vớis 50Hl dd picogreen (PG)
b) Pha DNA dựng đường chuẩn
Để dựng đường chuẩn, trước tiên cần tiến hành pha loãng DNA lambda
(100ug/ml) thành các nông độ 800ng/ml, 400ng/ml, 200ng/ml, 100ng/ml,
50ng/mI], 25ng/ml va 12,5ng/ml Tất cả đều được pha loãng bang dung dịch
(dd) TE
_ 49
Trang 7-CHUONG 2: VAT LIEU — PHƯƠNG PHÁP
c) Chuan bi dung dich picogreen
Hoá chất của kit PG phải được giữ ở -20°C, tránh ánh sáng và tránh giải
đông nhiều lần Vì vậy, ngay lần giải đông đầu tiên, cần chia nhỏ hoá chất ra
các tube nhỏ có bọc giấy bạc
Dung dịch PG được pha loãng 200 lần với dung dịch TE (hoặc nước cất) trước khi dùng Với đĩa 96 giếng, hút 25ul dd PG pha trong 4975ul TE Pha trong falecon có bọc giấy bạc
Dung dịch PG chỉ được pha trước khi dùng nhăm tránh thời gian phơi
sáng cũng như các yếu tố có thể làm ảnh hưởng đến tính phát quang của PG
d) Chuyển lên đĩa đo nông độ
Dùng đĩa đen polystyrene 96 giếng cho phương pháp định lượng băng PG giúp việc đọc kết quả chính xác hơn
Cho vào mỗi giếng mỗi 50ul dung dịch pha loãng DNA Gồm DNA đựng
đường chuẩn cũng như DNA cần đo nông độ (như bảng 2 l)
Bảng 2.1: Cách nạp mẫu trên đĩa 96 giếng, mỗi lần đo được 40 mẫu với
độ lặp lại hai lần, cùng với thang chuẩn
Mỗi mẫu được cho vào hai giêng nên môi mâu đo có độ lặp lại hai lân
Mot lan đo bằng đĩa 96 giếng như vậy ta đo được 40 mẫu DNA
- 50 -
Trang 8CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
Thêm vào mỗi giếng 50ul dung dịch PG Dùng pipet trộn đều hai dung
dịch trong các giếng Ủ 5 phút trong tối trước khi đo bằng máy Tecan
2.1.4 Phản ứng khếch đại - PCR
2.1.4.1 Nguyên tac:
PCR là phương pháp khuyếch đại trình tự gene đích đã biết nhờ hoạt động
tong hợp mạch DNA mới dựa trên DNA mạch khuôn dưới sự hién dién Taq polymerase và cặp mỗi chuyên biệt, bắt cặp bổ sung với trình tự đó Năng lượng để hình thành phản ứng mạch mới được lẫy từ bốn loại deoxynucleotid (dATP, đTTP, dGTP, dCTP) Cac nucleotid nay cting 1a don vi để hình thành chuỗi DNA mới
Phản ứng khuyếch đại được thực hiện từ 25-40 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm ba bước
- _ Bước biến tinh tach mach: 94-96°C
- _ Bước bắt cặp của môi lên trình tự đích: nhiệt độ tuỳ từng cặp
mồi (dao động 40-70°C)
- - Bước kéo đài: được đặt ở nhiệt độ tối ưu của Taq polymerase
(thường là 72°C)
Đề thực hiện phản ứng PCR, chúng ta phải có một cặp môi đặc hiệu Phản
ứng PCR của chúng tôi dùng các cặp mỗi được đăng tải trên các tạp chí khác nhau (bảng 2.2)
2.1.4.2 Hoá chất và thiết bị:
dNTPs (dATP, đTTP, dGTP, dCTP) Roche
MgC]; 50mM - - cs-csằcséneééhhhhhtrerree Bioline
Buffer NH¿ 10X -cccScSnhhhhhhherree Bioline
Biotaq DNA polymerase 5U/HÌ : -: - Bioline
1011-2207 Proligo
-
Trang 9S]-CHUONG 2: VAT LIEU — PHƯƠNG PHAP
Nước cắt khử ion 5c 5s 2n E2 E1 ng ELGA
Eppendorf thành mỏng chịu nhiệt 0,2m1 Alpha Labs
Máy luân nhiỆt 5: cv cty, Eppendorf, Bio-Rad
May VOMteX oo eccecescesscecssecssecsscccssecnecenseseaeeesteestens Genie2
2.1.4.3 Tién hanh:
Thực hiện Blast kiểm tra các cặp môi trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu cũng như độ dài của sản phẩm tạo thành
kháng
Với mục tiêu là giải trinh tu cdc doan gene katG, inhA, ahpC (đối với chủng
H) hay các đoạn khác nhau trên gene rpoð (đối với chủng kháng R) Trước hết chúng tôi phải tìm được cặp môi thích hợp nhằm khuyếch đại đoạn gene đích có trình tự cân khảo sát
Bang 2.2: Các đoạn mỗi dùng trong PCR
(°C) khuyéch dai (bp)
katGweFl GTC CTC TAT ACC GGA CTA CGC 60 Toàn bd gene 2 899
katGweR] TCG CAC ATC CAG CAC ATT TC kaiG
katGPS GGT CGA CAT TCG CGA GACGTT 60 Vùng codon 519 katGP6 [25] CGG TGG ATC AGC TTG TAC CAG kaiG315
TB92 CCT CGC TGCCCAGAAAGGGA 66 promoter 248 TB93 [41] ATC CCC CGG TTT CCT CCG GT inhA
AhpCl GCC TGG GTG TTCGTCACTGGT 58 Vùng giữa 359 AhpC2 [39] CGC AAC GTC GAC TGG CTC ATA oxyR-ahpC
RPOBF | GGGAGC GGA TGA CCA CCC A 56 Vùng RRDR 350
trên rpo RPOBR [17] GCG GTA CGG CGT TTC GAT GAA C
-'C3F_ GAGTACGTGCCC TCGTCTGA 62 rpoBcluster3 319 -C3R_ ACT TGC GCA TCC GGT AGG TA
Trang 10
-52-CHUONG 2: VAT LIEU — PHƯƠNG PHÁP
Các PCR được thực hiện với thành phần như sau cho mỗi phản ứng:
Nông do trong phan img
Nước cât khử Ion
Buffer 10X (Bioline) 1X
Môi xuôi 2,5 uM 0,1— 0,3 uM Mỗi ngược 2,5 uM 0,1—0,3 uM
Taq polymerase (Bioline) 0,75 U DNA ban mau 15 ng Phản ứng được thực hiện với tổng thé tich 25 ul Đối với chủng kháng H chúng tôi thực hiện phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn 2899bp bao gồm toan bộ gene &z/Ớ với cặp mỗi katGwgFI — katGwgRI, đoạn 519bp trên gene katG véi cap mdi katGP5 — katGP6, đoạn 248bp trên promoter gene inhA véi cap mỗi TB92 — TB93, doan 359bp trén vung giita hai gene oxyR-ahpC với cặp mỗi AhpC] - AhpC2
Đối với chủng kháng R chúng tôi thực hiện phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn 350bp trên ving RRDR cua gene rpoB véi cap moi RPOBF va RPOBR, doan 365bp trén dau N-terminal gene rpoB véi cap méi TB146F — TB146R, doan
319bp trên vùng cluster3 gene rpoB voi cap méi RpoB-C3F — RpoB-C3R
Sau khi đã chuẩn bị toàn bộ các thành phần phản ứng trên, phản ứng
khuyếch đại sẽ được thực hiện trong máy luân nhiệt với chương trình: đầu tiên biến
tính ở 95°C trong vòng 3 phút; sau đó là 30 chu kỳ luân nhiệt với 95”C trong vòng
15 giây, nhiệt độ bắt cặp tuỳ từng cặp mỗi (Tm) trong 15 giây, 72°C trong l5 giây: cuối cùng là kéo đài ở nhiệt độ 72”C trong 2 phút Riêng với phản ứng khuyếch đại
toàn bộ gene &/Œ, bước kéo dài trong 30 chu kỳ được thực hiện ở 72”C trong 2,5 phút và bước kéo đài cuối cùng ở 72°C trong vòng 7 phút Các sản phẩm PCR sau
đó đều được bảo quản ở 4°C
Trang 11
_53-CHUONG 2: VAT LIEU —- PHƯƠNG PHAP
2.1.5 Téiwu hoa phan img PCR
2.1.5.1 Nguyên the:
Phan tmg PCR chi khuéch đại đúng trình tự đích khi có sự bắt cặp bô sung
chuyên biệt của cặp môi với trình tự DNA mạch khuôn Vi vậy, để tối ưu hoá, chúng ta phải thay đôi các điêu kiện nhằm đảm bảo cặp mỗi bắt cặp tốt và đặc hiệu
⁄ oA A a ˆ Ae ax A RYN Ầ A ae + 2 ` a x
(nhiệt độ, nông độ môi, nông độ NTPs, nông độ các tọn K”, Mg”” ) mà không làm
ảnh hưởng nhiêu đên hoạt tính của DNA polymerase (pH, các ion )
2.1.5.2 Hoá chất và thiết bị:
dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) oo Roche
i50 m0: 8= Bioline
Buffer NHÀ TÚX Le Bioline
Biotaq DNA polymerase SƯ/HỈ eo Bioline
CÁC mỖI .Q Q12 221 re Proligo
Nước cất khử 10n ác nhe ELGA
Eppendorf thành mỏng chịu nhiệt Ô,2ml Alpha Labs
Thay đôi nồng độ mồi
Nhiệt độ, nông độ MpgC|;, nông độ mỗi được chọn cần tránh tạo ra các băng không đặc hiệu, các vạch có độ dài khác sản phâm cân khuyéch dai (bang 2.1).
Trang 12CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP
2.1.6 Điện di
2.1.6.1 Nguyên tắc:
Do đặc điểm tích điện âm của nhóm phosphate trên DNA, dưới tác động của điện trường, các đoạn DNA khác nhau sẽ di chuyển về phía cực dương với vận tốc khác nhau tuỳ vào cầu trúc và kích thước của chúng
Gel agarose khi nấu chảy để đặc lại sẽ hình thành cấu trúc mạng lưới, giúp ngăn cản dòng di chuyển của DNA trong điện trường, nhờ đó các DNA có độ dài khác nhau sẽ được phân tách rõ trên bảng gel
Kết quả điện đi sẽ được xem trực tiếp trên bản gel có nhuộm ethidium bromide dưới đèn cực tím; do ethidium bromide có khả năng găn chèn giữa các
base của DNA và phát huỳnh quang màu cam khi kích thích băng tia UV
bp
1517
Dung dich dién di SBA (phu luc 3)
Ethidium bromide (EtBr) 5s cscsxeexerreeve Sigma s0
TOO
50U0⁄51?
Thang 100bp che BioLabs 40)
Hệ thống bồn điện di 5252 2cccczcczrcce2 BioRad 309
Hệ thống máy chụp hình gel : - -sc Bio Rad ø
10)
2.1.6.3 Tiến hành:
Tạo bản gel 1,5%: cân I,5g agarose hoà trong 100ml dung dịch SBA, đun sôi
và lắc đều dung dịch để agarose tan hoàn toàn Để nguội đến khoảng 50°C, thêm
vào 5ul dung dịch EtBr rồi lắc đều dung dịch Để yên khoảng 30 giây cho bớt bọt
khí rồi đỗ vào khay đã gắn lược tạo giếng Gel sẽ đặc lại sau 30 phút Lúc này ta có
thé tháo lược ra, đặt vào bôn điện di đê nap mau
Trang 13
-55-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP
Nạp mẫu và chạy điện di: hut Sul sản phâm điện di trộn đều với II dd nạp mẫu 6X Sau đó nạp các mẫu này vào từng giếng riêng biệt của bản gel 1,5% Chạy điện di các mẫu trên cùng với 6H] thang 100bp ở điện thế 120V trong 40 phút
Xem kết quả: Vì bản gel đã được nhuộm với EtBr nên có thể xem kết quả
ngay bằng cách đặt gel trên bàn đèn ỦV Các vạch có chứa sản phẩm khuyếch đại
DNA sẽ phát sáng màu cam Kích thước của sản phẩm PCR đích sẽ được kiểm tra bằng cách so sánh với kích thước của thang chuẩn 100bp Nhờ đó ta phát hiện được
các vạch ký sinh, hay các sản phẩm khuyếch đại không đặc hiệu
2.1.7 Giải trình tự
Sản phâm khuyêch đại đoạn gene mục tiêu của các mâu khác nhau được đem
tinh sạch bằng kit QIAgen
2.1.7.1 Tình sạch và định lượng sản phẩm PCR:
a Nguyên tắc:
Mục đích của bước tỉnh sạch này nhăm loại đi các thành phần trong phản
ứng PCR trước đó (như muối, mỗi, DNA polymerase v.v.) Các thành phân này được loại đi nhằm không làm ảnh hưởng đến phản ứng khuyéch dai tao ra cac doan trình tự có tín hiệu huỳnh quang (tạm gọi phản ứng PCR giải trình tự)
Sản phẩm PCR sẽ được giữ lại trên màng silica-gel khi có độ pH và điểm
đẳng điện phù hợp Những thành phần khác sẽ đi qua màng với dd rửa có cthanol Các đoạn DNA tính sạch sau đó sẽ được hoà tan trong nước và thu lại băng cách ly tâm
Để chuẩn bị cho bước PCR giải trình tự, đoạn gene khuyếch đại không
những được tinh sạch mà còn được định lượng Chúng tôi dùng phương pháp định
lượng băng điện di so sánh với thang có nông đô xác định biết trước (Mass standard
SỐ
Trang 14-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP
ladder) Phuong pháp này tuy độ chính xác không cao nhưng có thuận lợi là nhanh chóng và tránh tạp nhiễm Do lượng sản phẩm khuyếch đại cần cho vào phản ứng PCR giải trình tự có thể dao động tương đối cao nên phương pháp định lượng trên
Nước cất khử íon :55cc222ccccsrrsrrvrsrrree ELGA
QIA quick PCR purification KIt e c5 Qiagen
- _ Cột silica-gel và tube đựng dd rửa
Máy ly tâm .- (cành HH He eppendorf
c Tiến hành:
Sản phẩm PCR được trộn đều trong 5 lần thể tích dd PB Cho toàn bộ vào cột
silica-gel Ly tam 13000 vong/phut trong l phút
Để bỏ dịch ly tâm, rửa lại cột silica-gel với 0,75ml dd PE Ly tâm 13000
vòng/phút trong I phút
