NGHIÊN cứu ĐÁNH GIÁ sự ổn ĐỊNH của VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS SAU THỜI GIAN bảo tồn

Bảo tồn vi sinh vật nói chung và bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn nói riêng đã và đang được quan tâm do chúng có thể phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sinh học và công nghệ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA THÚ Y

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ỔN ĐỊNH CỦA VI KHUẨN

BACILLUS SUBTILIS SAU THỜI GIAN BẢO TỒN

HÀ NỘI, 2014

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA THÚ Y

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ỔN ĐỊNH CỦA VI KHUẨN

BACILLUS SUBTILIS SAU THỜI GIAN BẢO TỒN

HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN

Thời gian được học tập và rèn luyện dưới mái trường Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã giúp tôi có những hành trang để mình bước những bước chân đầu tiên vào trường đời Tôi đã nhận được sự dạy dỗ tận tình, sự quan tâm của các Thầy giáo,

Cô giáo đặc biệt là các Thầy, Cô khoa Thú y đã truyền đạt các kiến thức chuyên môn cũng như tư cách đạo đức để trở thành một Bác sỹ thú y

Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Bác sỹ thú y- với tất cả lòng kính trọng, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các Thầy, Cô giáo – những người đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại Học viện Nông nghiệp VN cũng như trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận này

Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy giáo TS Phạm Hồng Ngân và

cô giáo Th.S Cam Thị Thu Hà, cô giáo Th.S Vũ Thị Thu Trà, Bộ môn Thú Y Cộng Đồng, Khoa Thú Y – Học Viện Nông Nghiệp VN, người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Chân thành cảm ơn ban quản lý

đề tài cấp Bộ Mã số B2014-11-11 GEN đã hỗ trợ cho nghiên cứu này

Xin được cảm ơn các bạn lớp TYC-K55 đã chia sẻ cũng tôi những vui buồn trong thời gian học đầy những kỉ niệm ấy

Cuối cùng, xin được cảm ơn gia đình và những người thân yêu đã tin tưởng, đã hỗ trợ và động viên tôi đến ngày hôm nay

Trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Sinh viên

Hồ Thị Thanh Loan

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

PHẦN I 1

MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI 2

PHẦN II 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện 3

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 4

2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.1.5 Đặc điểm sinh hóa 5

2.1.6 Cấu trúc kháng nguyên 6

2.1.7 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh 7

2.1.8 Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 8

2.1.9 Độc tính của Bacillus subtilis 11

2.1.10 Một số nghiên cứu ứng dụng của Bacillus subtilis 12

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BẢO TỒN, LƯU GIỮ GIỐNG VI KHUẨN TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 13

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 13

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

2.3 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ BẢO TỒN, LƯU GIỮ GIỐNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 21

2.3.1 Định nghĩa về bảo tồn 21

2.3.2 Bảo tồn, lưu giữ giống Bacillus subtilis bằng hai phương pháp lạnh đông và đông khô 23

2.3.3 Vai trò, ý nghĩa của bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn 27

PHẦN III 27

NỘI DUNG – NGUYÊN VẬT LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 NỘI DUNG 27

3.1.1 Đánh giá sự ổn định về số lượng và mức độ an toàn của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 28

3.1.2 Đánh giá sự ổn định về đặc tính nuôi cấy và một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 28

3.1.3 Bảo tồn và lưu giữ nguồn genBacillus subtilis 28

3.2 NGUYÊN LIỆU 28

3.2.1 Môi trường, hóa chất 28

3.2.2 Trang thiết bị 28

3.2.3 Vi khuẩn 28

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.3.1 Phương pháp đánh giá sự ổn định về số lượng và mức độ an toàn của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 29

3.3.2 Phương pháp đánh giá sự ổn định về đặc tính nuôi cấy và đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 30

3.3.3 Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen Bacillus subtilis 30

3.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 34

3.4.1 Thời gian 34

3.4.2 Địa điểm 34

PHẦN IV 35

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA VỀ SỰ ỔN ĐỊNH SỐ LƯỢNG VÀ MỨC ĐỘ AN TOÀN CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS SAU THỜI GIAN BẢO TỒN 35

4.1.1 Kết quả kiểm tra số lượng của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 35

Tiến hành lấy 20 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis sau 12 tháng bảo tồn, gồm 10 ống giống được đông khô (sữa tách bơ) bảo quản ở nhiệt độ 4 – 6oC và 10 ống giống ở môi trường TSB + Glyceril bảo quản ở nhiệt độ -20oC để tiến hành kiểm tra số lượng của vi khuẩn Bacillus subtilis Kết quả được trình bày ở bảng sau: 35

4.1.2 Kết quả kiểm tra ô nhiễm nấm trong vi khuẩn được bảo tồn 36

4.2 KẾT QUẢ KIỂM TRA MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, ĐẶC TÍNH NUÔI CẤY VÀ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 37

4.2.1 Kết quả kiểm tra một số đặc điểm hình thái, đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn Bacillus subtilis 37

4.2.2 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis 39

4.3 BẢO TỒN, LƯU GIỮ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 45

PHẦN V 48

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 48

5.1 KẾT LUẬN 48

5.2 ĐỀ NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis 6

Bảng 2.2 Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis 10

Bảng 2.3 Cách bảo quản giống trên môi trường gelatin 25

Bảng 4.1 Số lượng của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 35

Bảng 4.2 Kết quả ô nhiễm nấm trong vi khuẩn Bacillus subtilis sau bảo tồn 36

Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 38

Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn 39

Bảng 4.5 Tỷ lệ sống của vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi đông khô 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 3

Hình 2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường nước thịt 5

Hình 2.3 Quá trình tạo bào tử 8

Hình 2.4 Cấu tạo của bào tử 9

Hình 4.1 Bacillus subtilis trên môi trường thạch nghiêng TSA 40

Hình 4.2 Hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis 41

Hình 4.3 Bacillus subtilis trên môi trường thạch TSA 41

Hình 4.4 Bacillus subtilis trên môi trường thạch khoai tây 42

Hình 4.5 Bacillus subtilis trên môi trường TSI 43

Hình 4.6 Bacillus subtilis trên môi trường nước thịt 43

Hình 4.7 Phản ứng Indol của Bacillus subtilis 44

Hình 4.8 Phản ứng MR của vi khuẩn Bacillus subtilis 44

Hình 4.9 Phản ứng catalase của vi khuẩn Bacillus subtilis 45

Hình 4.10 Các ống đông khô vi khuẩn Bacillus subtilis 47

Hình 4.11 Các ống vi khuẩn Bacillus subtilis lạnh sâu 47

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

IMViC : Indole, Methyl Red, Voges Proskauer và CitrateTSA : Tryptic soya agar

TSB : Tryptic soya broth

TSI : Tryple sugar iron agar

BHI : Brain Heart Infusion broth

Bảo tồn vi sinh vật nói chung và bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn nói riêng

đã và đang được quan tâm do chúng có thể phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sinh học và công nghệ sinh học để tạo ra các sản phẩm đa dạng phục vụ cho đời sống

Bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn là bảo tồn các vi khuẩn sống hoàn chỉnh hay bộ phận sống của chúng mang thông tin di truyền sinh học có khả năng tạo

ra hay tham gia tạo giống mới của vi khuẩn nhằm phục vụ các công nghệ sinh học sản xuất các sản phẩm của giống được bảo quản Bảo quản và lưu giữ giống

vi khuẩn ở trạng thái sống, thuần khiết và ổn định là việc làm khó khăn vì các chủng vi khuẩn có đặc điểm sinh học riêng và các đặc điểm này có thể thay đổi theo thời gian bảo quản do sự mất dòng tế bào hay sự xâm nhiễm của các vi sinh vật Vì vậy việc lưu giữ ổn định và bảo tồn tất cả các đặc tính sinh học của vi khuẩn trong suốt thời gian lưu giữ là cực kỳ quan trọng

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, của các công trình nghiên cứu, thì hiện nay, ngoài những phương pháp bảo tồn vi khuẩn đơn giản như cấy truyền,

bảo tồn trong cát…thì đã có các phương pháp bảo tồn đạt hiệu quả tối ưu hơn Nhờ khoa học, nhờ nghiên cứu, hai phương pháp bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn là lạnh đông (lạnh sâu) và đông khô đang được sử dụng ngày càng phổ biến, mang lại hiệu quả cho công tác bảo tồn phục vụ hữu ích cho công việc nghiên cứu.

Bacillus subtilis là một vi khuẩn được nhắc đến nhiều, được đề cập nhiều

trong các công trình nghiên cứu Đặt ra một vấn đề cho chúng ta là lưu giữ, bảo tồn giống vi khuẩn này phục vụ cho công tác nghiên cứu được thuận tiện hơn

Để đánh giá được mức độ ổn định của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian

bảo tổn chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đánh giá sự ổn

định của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn”.

1.2 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI

- Kiểm tra được mức độ ổn định về số lượng, đặc điểm nuôi cấy, đặc tính

sinh hóa, khả năng sinh bào tử của Bacillus subtilis.

- Hệ thống hóa các thông tin dữ liệu của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.

- Cung cấp thông tin, chủng vi sinh vật cho các đơn vị, trung tâm nghiên cứu, giảng dạy, sản xuất vacxin phòng bệnh

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ

chức y học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đầu ở Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949-1957, khi Henry và các cộng sự tách được những chủng thuần khiết của

Bacillus subtilis Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là “thuốc subtilis” ra đời có

tác dụng trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy cho rối loạn tiêu hóa Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu,2005)

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis

 Đặc điểm phân loại:

Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Bộ: Eubacteriales

Họ: Bacillaceate

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis

 Đặc điểm phân bố:

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được

phân bố hầu hết trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng

sa mạc, vùng đất hoang vu thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn của sông cũng như nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ

Thị Thứ, 1996)

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram (+), kích thước 0,5-

0,8 µm x 1,5-1,3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng

di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000)

2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy

 Điều kiện phát triển: Hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37oC

 Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả

năng phát triển trong môi trường thiếu oxy

 Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0- 7,4

 Môi trường:

- Môi trường thạch đĩa TSA: Khuẩn lạc dạng tròn,rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3-5mm Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi nâu

- Môi trường thạch nghiêng TSA: Dễ mọc, tạo thành màu xám nhạt,rìa nhăn gợn sóng, xù xì, bề mặt khô

- Môi trường gelatin: Phát triển và làm tan chảy gelatin, có những mảng lớn màu trắng, khi lắc khó tan, không làm vẩn đục môi trường

- Thạch khoai tây: Phát triểu đều, màu vàng lấm tấm hạt, khi cấy theo đường ziczac thì khuẩn lạc mọc lan rộng ra khỏi đường cấy tạo thành hình cành cây khô.

- Môi trường nước thịt: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường,

tạo thành màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mấy ở đáy, lắc lên khó tan đều

Hình 2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường nước thịt

2.1.5 Đặc điểm sinh hóa

- Bacillus subtilis có khả năng lên men không sinh hơi các loại đường:

glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinose

- Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), Catalase (+), amylase (+), casein (+), Citrat (+), di động (+)

Bảng 2.1 Đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis

Hoạt tính catalase Sinh Indol

MR

VP

Sử dụng citrate Khử Nitrate Tan chảy genlatin

Di động Phân giải tinh bột Arabinose

Xylose Saccharose Mannitol Glucose Lactose Maltose

+-++++++++++++-+

(Holt, 1994; TríchLý Kim Hữu, 2005)

2.1.6 Cấu trúc kháng nguyên

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D

và L-acid glutamic Ngoài ra, Bacillus subtilis có khả năng sản sinh kháng sinh

subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

2.1.7 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh

Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng

chịu đựng được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hóa trong đường ruột Chúng còn

có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột

 Với các vi sinh vật gây bệnh

Môi trường nuôi cấy mầm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với

một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế

 Với đồng loại

Các chuyên gia tại đại học Havard- Mỹ cho biết: Khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “Ngủ

đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài Bacillus subtilis thực hiện điều đó

bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm.Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai

đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng

sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn đang bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ

Theo các nhà nghiên cứu, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược Do đó vi khuẩn sẽ cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt

Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh

2.1.8 Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi như: Môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích hợp, môi trường tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm

để trở về dạng tế bào sinh dưỡng

Hình 2.3 Quá trình tạo bào tử

Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc

và tạo thành tiền bào tử (prospore) Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử.

Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡngphân giải và bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra Sau đó vỏ của chúng bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành

tế bào mới Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004)

 Cấu tạo của bào tử

Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học

cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỷ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới Phía ngoài của nguyên sinh chất được bao bọc bởi nhiều lớp màng

Hình 2.4 Cấu tạo của bào tử

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu tạo chủ yếu là lipoprotein

Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử có cấu trúc nhiều lớp, bề mặt của các lớp này xù xì, thành phần hóa học là protein và có sự tham gia của keratin, đây là những lớp có khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi

Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).

Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hóa học, tính chất sinh lý

Bảng 2.2 Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus

subtilis

Đặc tính, thành phần hóa học Tế bào sinh dưỡng Bào tử

Cấu trúc Tế bào G(+), điển hình Vỏ bào tử dày, khó thấm

nước

 Sự này mầm của bào tử

Quá trình chuyển bào tử từ trạng thái nghỉ sang trạng thái tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử

Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1998)

 Sức đề kháng của bào tử

Bào tử có sức đề kháng cao với các yếu tố vật lý và hóa học như: Nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và chất sát trùng

- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.

- Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca+ và acid dipicolinic, protein của bào

tử kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với nhiệt độ

- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài

- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử

2.1.9 Độc tính của Bacillus subtilis

 Đối với con người

Một số chủng Bacillus subtilis cũng như những họ hàng gần của nó là B

licheniformis, B pumulis, B megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một

enzyme có khả năng phá vỡ màng tế bào động vật hữu nhũ Tuy nhiên, vẫn chưa

có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người

Một số nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis cũng liên quan đến vài trường

hợp ngộ độc thực phầm

Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có

độc tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như viêm da, viêm đường hô hấp…

Bacillus subtilis có độc tính rất thấp đối với người vì nó sản xuất ra enzyme

ngoại bào và các tác nhân gây độc không đủ để có thể gây hại cho người Ngoại trừ những trường hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miến dịch của người đang quá suy yếu Trong một số trường hợp, người ta vẫn phát hiện

Bacillus subtilis ở những bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe

khi lắp bộ phận giả Tuy nhiên tỉ lệ các trường hợp này là rất hiếm, chỉ có 2

trong 24 trường hợp nhiễm Bacillus (trong 1034 ca nhiễm khuẩn) là do Bacillus

subtilis (Edberg,1991).

 Đối với động vật

Bacillus subtilis được phát hiện trong một số trường hợp bò và cừu bị sẩy

thai Tuy nhiên, Bacillus subtilis vẫn không được cho là nguyên nhân gây bệnh

Bacillus subtilis nhiễm vào và gây bệnh cho muỗi Anophelis aulicifacies

gây sốt rét ở Ấn Độ (Gupta và Vyas, 1989) và được sử dụng như 1 tác nhân kiểm soát sinh học trong nghiên cứu về bệnh này

 Đối với thực vật

Bacillus subtilis gây phân hủy pectin và polysaccharides của mô thực vật

dẫn đến thối củ ở khoai tây, có thể gây những vết viêm loét trên một số cây rừng

2.1.10 Một số nghiên cứu ứng dụng của Bacillus subtilis

Các đặc tính có ích của Bacillus subtilis:

- Sản sinh enzyme amylase, pectinase, protease, lipase, trypsin, urearase, manase…

- Sản sinh ra các acid hữu cơ: acid lactic, acid acetic làm giảm pH đường ruột

- Sản sinh vitamin nhóm B

- Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh

- Sản xuất các kháng sinh ức chế vi sinh vật gây bệnh

- Bacillus subtilis còn được xem là tác nhân gây kích thích miễn dịch

trong điều trị một số bệnh

 Trong công nghiệp

Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất ra enzyme và

một số chất hóa học cho công nghiệp như amylase, protease, inosine, aminoacid Trong đó, protease được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy rửa

Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Furasium sp., Pylicularia oryzae, ngoài ra còn ứng dụng

nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch

Bacillus subtilis được ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm nhằm làm giảm

tái phát bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với điều trị bằng kháng sinh

 Trong y học

Việc trao đổi giữa những chủng thuộc Bacillus subtilis khi chúng cùng phát

triển trong đất đã được biết đến khá lâu Klier và cs (1983) đã chứng minh khả

năng trao đổi plasmid giữa Bacillus subtilis và Bacillus thuringensis Một số nghiên cứu chỉ ra rằng Bacillus subtilis chuyển gen có khả năng kích ứng hay

làm ức chế khả năng biểu hiện độc tố hay một số thành phần độc tố trong các vi khuẩn trong các bệnh ho gà, bạch hầu, viêm phổi, điều này có ý nghĩa rất lớn với

y học Tuy nhiên, cũng tồn tại một vấn đề là Bacillus subtilis hoàn toàn có thể

nhận các gen quy định tính độc từ các vi khuẩn độc có quan hệ tương đối gần về mặt di truyền và gây hại

Bacillus subtilis cũng được sử dụng để làm chế phẩm men tiêu hóa, dùng

hỗ trợ điều trị trong việc loạn khuẩn ở đường tiêu hóa

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BẢO TỒN, LƯU GIỮ GIỐNG VI KHUẨN TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Bảo tồn vi sinh vật nói chung và bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn nói riêng

đã và đang được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm do chúng có thể phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sinh học và công nghệ sinh học để tạo

ra các sản phẩm đa dạng phục vụ cho đời sống

Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật là bảo tồn các vi sinh vật sống hoàn chỉnh hay bộ phận sống của chúng mang thông tin di truyền sinh học có khả năng tạo

ra hay tham gia tạo ra giống mới của vi sinh vật nhằm phục vụ các công nghệ

sinh học sản xuất các sản phẩm của nguồn gen được bảo quản.

Bảo quản và lưu giữ vi sinh vật, giống vi khuẩn ở trạng thái sống, thuần khiết và ổn định là việc làm khó khăn vì các chủng vi sinh vật có các đặc điểm sinh học riêng và các đặc điểm này có thể thay đổi theo thời gian bảo quản, lưu giữ do sự mất dòng tế bào, đột biến hay tái tổ hợp Vì vậy việc lưu giữ ổn định, bảo toàn tất cả các đặc tính sinh học quý của vi sinh vật trong suốt thời gian bảo tồn, lưu giữ là vấn đề cấp thiết hiện nay

Mỗi loài vi sinh vật nói chung, vi khuẩn nói riêng thường có một điều kiện nuôi cấy, phương pháp bảo quản khác nhau, phù hợp để có thể tồn tại và giữnguyên đặc tính sinh học và các đặc tính khác Hiện tại, các bảo tàng giống trên thế giới đã lưu giữ vi sinh vật, vi khuẩn bằng các phương pháp bảo quản, lưu giữ khác nhau Các phương pháp đó có thể là bảo quản dưới lớp dầu khoáng, trên giá thể (silicagen, cát thủy tinh, giấy…), với virus, vi khuẩn thường áp dụng biện pháp bảo quản lạnh đông (lạnh sâu) hoặc đông khô, như tại NCTC (National collection of type culture) của Vương quốc Anh sử dụng phương pháp đông khô để bảo quản tới 5000 chủng vi khuẩn Tại ACTC (American type culture collection) lưu giữ hơn 1800 chủng vi khuẩn thuộc 750 chi, là bảo tàng

có số lượng chủng lớn nhất trong các bảo tàng giống vi sinh vật trên thế giới Tại CBS (central buzeau voor schimelculture) có bộ sưu tập độc đáo gồm các chủng vi khuẩn mang gen đột biến, có giá trị lớn trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng Bảo tàng giống chuẩn Liên bang Nga VKM hiện đang lưu giữ trên

10000 chủng vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi bằng nhiều phương pháp khác nhau

Hiện nay có nhiều trung tâm bảo tồn vi sinh vật khác trên thế giới như:

- American Type Collection (ATCC), USA

- Bioresources Collection and ResearchCenter (BCRC), Taiwan

- Collection of Aquatic Important Microorganisms (CAIM), Mexico

- Marine Biotechnology Institute Culture Collection (MBIC), Japan

- Microbial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC), India

- National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), UK

- National Collections of Yeast Culture (NCYC), UK

- Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), USA

Trung tâm nuôi cấy, lưu giữ virus Trung Quốc (China Center for Virus Culture Collection-CCVCC) được thành lập vào năm 1979 dưới sự bảo trợ của Viện khoa học Trung Quốc là tổ chức tham gia bảo tồn, phân loại, quản lý và nghiên cứu virus CCVCC đã thu thập và bảo quản hơn 600 chủng có nguồn gốc

từ côn trùng, thực vật, vi khuẩn và virus động vật CCVCC cũng đã thành lập ngân hàng dữ liệu virus CCVCC đã cung cấp một số chủng virus và kháng huyết thanh cho các chuyên gia của nhiều nước

Cùng với sự phát triển của các trung tâm bảo tồn, các phương pháp bảo quản nguồn gen cũng ngày càng được phát triển và đầu tư hơn

Phương pháp bảo quản bằng cách làm khô chân không Vi khuẩn được làm khô trong chân không và được lưu trữ trong tủ lạnh trong thời gian dài

Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ rất thấp, tăng trưởng vi sinh bị ức chế trong môi trường có nhiệt độ rất thấp, dùng chất dinh dưỡng có chứa glycerol 15% hoặc sữa không béo với glucose 7,5% Sự ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn được tiến hành trong điều kiện đông lạnh và bảo quản tại -15oC đến -30oC hoặc trong nitơ lỏng

Phương pháp tiếp theo là đông khô hoặc đông Lyophilization Đây là phương pháp hiệu quả nhất và đáng tin cậy để lưu trữ vi khuẩn trong các môi trường có thể đến 10 năm Trong phương pháp này, các vi khuẩn trong ống được đông lạnh hơn bên trong bề mặt của lọ thuốc bằng cách cho xoay trong hỗn hợp của nước đá khô và rượu ở -78oC Tế bào đông lạnh ngay lập tức được sấy khô trong chân không

Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống có chứa vi khuẩn

Bacillus subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng

ống và viên nang

Năm 1962, Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị

tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn tính, trộn thêm các vi khuẩn lên men lactic khác chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả

Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm

kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus.

Roman và cộng sự đã nghiên cứu Bacillus subtilis (ATCC_6633,

ATCC_9372) làm giảm đi 40 - 50% aflatoxin trong dịch chứa aflatoxin trong vòng 20 ngày

Bogia và cs (1976) đã nghiên cứu α-amilaza của Bacillus subtilis , đó là

loại enzim điển hình chịu được cả nhiệt độ cao lẫn pH axit Đây là loại enzim quan trọng trong công nghiệp sản xuất bia (Trích Nguyễn Duy Khánh, 2006)

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhận rõ nguồn gen thực vật, động vật là nguồn tài nguyên quốc gia và là một bộ phận hợp thành quan trọng trong việc bảo vệ tính đa dạng sinh học phục

vụ cho hoạt động nghiên cứu và phát triển khoa học kinh tế của các ngành nông nghiệp, lâm nghiệp, thủy sản, công nghiệp thực phẩm Chính phủ đã ban hành quy chế về quản lý và bảo tồn nguồn gen thực vật, động vật và vi sinh vật Nội dung công tác quản lý về bảo tồn và lưu giữ nguồn gen bao gồm:

- Điều tra khảo sát và thu thập các nguồn gen thích hợp với tính chất và đặc điểm của từng vi sinh vật trong thú y

- Bảo tồn lâu dài và an toàn các nguồn gen đã thu thập được thích hợp với đặc tính sinh học của từng đối tượng cần giữ, trình độ kỹ thuật, khả năng thiết bị của cơ quan có nhiệm vụ lưu giữ, qui mô cần bảo tồn.

- Đánh giá được các nguồn gen theo các chỉ tiêu sinh học cụ thể phù hợp với đối tượng

- Tư liệu hóa các nguồn gen: sau khi đánh giá đều phải tư liệu hóa các nguồn gen dưới các hình thức như phiếu điều tra, phiếu mô tả, phiếu đánh giá, bản đồ phân bố, chụp ảnh, ấn phẩm thông tin, catalog hoặc xây dựng cơ

sở dữ liệu tin học

- Trao đổi thông tin tư liệu và nguồn gen cần được tiến hành thường xuyên giữa các cơ quan tham gia trong hệ thống bảo tồn, lưu giữ đồng thời cung cấp thông tin tư liệu về nguồn gen cho các cơ quan khoa học, sản xuất kinh doanh khi có nhu cầu, trường hợp cần thiết có thể trao đổi với nước ngoài Nhận rõ tầm quan trọng của vấn đề, ở Việt Nam nhiều cơ sở nghiên cứu đã tiến hành bảo tồn, lưu giữ các nguồn gen theo mục đích phù hợp

- Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam thuộc đại học quốc gia Hà Nội là nơi lưu giữ số lượng lớn nhất các chủng loại vi sinh vật, tổng cộng có 2089 chủng vi sinh vật Các chủng này được bảo quản bằng nhiều phương pháp khác nhau như cấy chuyển trên thạch, dưới lớp dầu khoáng, đông khô hoặc lạnh sâu trong nitơ lỏng

- Năm 1992, đề tài cấp nhà nước “quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp” do viện Khoa học kĩ thuật nông nghiệp Việt Nam chủ trì, đã tiến hành thu thập, phân lập và tuyển chọn hơn 30 chi vi sinh vật bao gồm vi khuẩn nấm sợi, nấm

men và xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose, tinh bột, kích thích sinh trưởng, phòng trừ sâu hại Tới năm 2000, quỹ gen này đã bảo quản lưu giữ được

473 chủng vi sinh vật Tất cả các chủng này đều được đánh giá về các đặc tính sinh học, các đặc tính khác và có phương pháp bảo quản phù hợp tương tự như ở bảo tàng ATCC

- Từ năm 1993 viện công nghệ sinh học, viện khoa học và công nghệ Việt Nam là một đơn vị khoa học đã tiến hành lưu giữ bảo quản nguồn gen vi sinh vật với 250 chủng vi khuẩn Các giống vi sinh vật này được ứng dụng trong nông nghiệp, y học và bảo về môi trường

- Năm 2007-2009 viện quân y đã tiến hành đề tài “nghiên cứu xây dựng ngân hàng gen các mầm bệnh sinh học và kháng huyết thanh phục vụ kiểm soát tác nhân sinh học” Đề tài đã thu thập được hơn 2000 chủng vi sinh vật và đưa vào bảo quản 1430 chủng vi sinh vật phục vụ công tác nghiên cứu bệnh lý, chẩn đoán và giảng dạy

- Trung tâm Khảo nghiệm thuốc thú y TW1- cơ quan thực hiện việc thu thập, lưu giữ, bảo quản, tuyển chọn, đánh giá, phân loại, tư liệu hóa và nghiên cứu khai thác và sử dụng có hiệu quả nguồn gen vi sinh vật phục vụ cho việc phòng chống bệnh dịch trong chăn nuôi, hiện đang lưu giữ trên 41 nguồn gen vi khuẩn, virus, các bệnh trong chăn nuôi phục vụ công tác nghiên cứu tạo vacxin phòng chống bệnh dịch trong chăn nuôi

- Trong hoạt động chuyên môn sâu của ngành thú y, một số cơ quan, tổ chức đã và đang tiến hành bảo tồn các chủng vi khuẩn, virus phân lập được từ các ổ dịch gia súc, gia cầm ở Việt Nam Viện Thú y Quốc gia đang bảo tồn các chủng vi khuẩn, virus gây bệnh chính ở gia súc, gia cầm phân lập được trong quá trình tiến hành nghiên cứu Tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia đang lưu giữ các chủng vi khuẩn phục vụ nghiên cứu và thử nghiệm chế tạo vacxin phòng bệnh cho động vật nuôi

Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đưa vào bảo tồn thuộc đối tượng

nguồn gen phục vụ nghiên cứu tồn dư kháng sinh trong thực phẩm nguồn gốc động vật nhằm chuẩn hóa phương pháp vi sinh sinh vật kiểm tra tồn dư kháng sinh trong thịt, sữa, trứng và thức ăn chăn nuôi

Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis là các chủng vi sinh vật được cung

cấp bởi Trường Đại Liege, Vương quốc Bỉ trên cơ sở chương trình hợp tác song phương giữa Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được sử dụng làm nguyên liệu chuẩn hóa phương pháp kiểm tra tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật Các chủng trên đang được lưu giữ tại Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Trong kháng chiến chống Pháp, Bacillus subtilis được các giáo sư Đặng

Đức Trạch, Hoàng Thủy Nguyên (là các bác sỹ quân y) đã nghiên cứu sản xuất

ra chế phẩm Bacillus subtilis đưa ra chiến trường để nhằm chữa trị bệnh tiêu

chảy

Năm 1958- 1960, bác sỹ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm

Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột Hay khoa Vệ sinh y học bệnh viện

Bạch Mai đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng trị bênh

tiêu chảy ở người Tạo một hướng đi mới cho công tác điều trị bệnh đồng thời giúp hạn chế hiện tượng khác thuốc kháng sinh của các vi sinh vật trong đường tiêu hóa

Năm 1971, Trần Minh Hùng và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất ra chế

phẩm Bacillussubtilis dạng viên nuôi cấy trên môi trường đậu tương, cua