Salihah*, Bùi Thế Vinh*, Trần Công Luận* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xác định và phân lập các thành phần hóa học có tác dụng chống oxi hóa trong lá Chùm ngây Đối tượng – Phương pháp
Trang 1PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN CÓ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA
TRONG LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.)
Salihah*, Bùi Thế Vinh*, Trần Công Luận*
TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Xác định và phân lập các thành phần hóa học có tác dụng chống oxi hóa trong
lá Chùm ngây
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Lá Chùm ngây tươi thu hái tại Tri tôn, An Giang được chiết
bằng phương pháp ngâm với cồn 96% thu được cao cồn toàn phần Chiết phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần: Dietyl eter, cloroform, etyl acetat, thu được các cao phân đoạn Định lượng phenolic toàn phần trong cao cồn toàn phần và các cao phân đoạn bằng phương pháp Folin – Ciocalteu với chất chuẩn là acid gallic Xác định các thành phần có hoạt tính oxi hóa trong cao etyl acetat bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phát hiện bằng cách phun thuốc thử DPPH Sau đó phân lập các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký nhanh – cột khô và sắc ký cột cổ điển Xác định cấu trúc của các chất phân lập được bằng các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, phổ MS và so sánh với các thông số phổ NMR của các hợp chất đã công bố
Kết quả: Từ 10 kg lá tươi, thu được 600g cao cồn toàn phần Chiết phân đoạn thu được 168 g cao eter,
2,63 g cao cloroform, 28,4 g cao etyl acetat và 120g cao nước Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao cồn toàn phần là 108,011 g/mg Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 44,528 g/mg, 110,914 g/mg, 271,822 g/mg và 90,881 g/mg tính theo acid gallic chuẩn Trong phân đoạn etyl acetat, xác định được 6 vết chất có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị Rf lần lượt là 0,45; 0,29; 0,27; 0,16; 0,12; 0,1 với hệ dung môi: Etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13) Từ phân đoạn etyl acetat phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa là chủ yếu là isoquercitrin (200 mg) và vitexin (25 mg)
Kết luận: Lá Chùm ngây chứa nhiều hợp chất phenolic có hoạt tính chống oxi hóa Trong đó đã phân
lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa chủ yếu là vitexin và isoquercitrin Vitexin là một flavon C-glycosid được tìm thấy lần đầu tiên từ lá cây này
Từ khoá: chùm ngây, chống oxy hoá
ABSTRACT
ISOLATING THE ANTIOXIDANT COMPOUNDS FROM LEAVES OF MORINGA OLEIFERA
LAM
Salihah, Bui The Vinh, Tran Cong Luan
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012: 163 - 168
Objects: To define and isolate the antioxidants from leaves of Moringa oleifera Lam.
Materials and Methods: Moringa oleifera fresh leaves collected from Tri ton - An Giang province were
extracted with 96% alcohol The crude alcohol extract was separated using three solvents: Diethyl ether, chloroform, and ethyl acetate Total phenolic contents of extracts were measured with Folin-Ciocalteu reagent using gallic acid as a standard
Defining the antioxidants from ethyl acetate extract using thin layer chromatography with DPPH reagent
Trang 2Then, those antioxidants were isolated by dry-column flash chromatography method and open- column chromatography method The structure elucidations were based on analyses of spectroscopic data including 1D- and 2D-NMR, and MS
Results: 600 g crude alcohol extract macerated from 10 kg fresh leaves of M oleifera was fractionated to 168
g diethyl ether, 2.63 g chloroform, 28.4 g ethyl acetate and 120 g water fraction, respectively Total phenolic contents of extracts were (1)- alcohol crude extract: 108.011 g GAE/mg, (2)- diethyl ether extract: 44.528 g GAE/mg, (3)- chloroform extract: 110.914 g GAE/mg, (4)- ethyl acetate extract: 271.822 g GAE/mg, (5)- water extract: 90.881 g GAE/mg Six spots on chromatogram having antioxidant activity were defined in ethyl acetate fraction with Rf values of 0.45, 0.29, 0.27, 0.16, 0.12 and 0.1 with solvent system as etyl acetat – metanol – water (100: 17: 13) Two antioxidants isolated from ethyl acetate fraction were isoquercitrin (200 mg) and vitexin (25 mg)
Conclusion: Two antioxidants of phenolic compounds islolated from M oleifera leaves are vitexin and
isoquercitrin, in which vitexin is found from those leaves at the first time
Keywords: Moringa oleifera, antioxidant
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) được gọi
là cây “Thần Diệu” vì nó chứa rất nhiều chất
dinh dưỡng quan trọng như: Vitamin C,
β-caroten, protein, các acid amin, và nhiều hợp
chất có tác dụng sinh học như: Zeatin, flavonoid
(quercetin, kaempferol ), α-sitosterol, axit
caffeoylquinic, niazirinin, niaziminin A và B,
benzyl isothiocyanat (7,8) Chính vì thế, nó đã
được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong
thực phẩm, y dược học tại nhiều quốc gia trên
thế giới như: Ấn Độ, Pakistan, Ghana, Malaysia,
Thái Lan(4,6) Nhưng tại Việt Nam, Chùm ngây
chưa được quan tâm và nghiên cứu nhiều,
chúng chỉ mọc hoang ngoài tự nhiên, sống rải
rác ở một số vùng từ Quảng Nam đến Phú
Quốc, các bộ phận của cây như quả, lá non, hoa
các nhánh non chỉ dùng làm rau ăn trong dân
gian(8) Gần đây người ta cũng đã quan tâm và tổ
chức trồng ở một số nơi như Tri tôn - An Giang,
Long Khánh - Đồng Nai và đã có một số chế
phẩm ở dạng thực phẩm chức năng được lưu
hành trên trị trường Nhằm góp phần phát triển
cây Chùm ngây như là một nguồn nguyên liệu
tiềm năng cho các dạng thuốc hay thực phẩm
chức năng trong chăm sóc sức khỏe cho cộng
đồng, chúng tôi tiến hành phân lập các hợp
chính có tác dụng chống oxy hóa trong lá Chùm
ngây
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Lá Chùm ngây được thu hái tại Tri Tôn, An Giang vào đầu tháng 8/2010 Mẫu sử dụng bao gồm cả cuống lá và lá chét còn tươi
Chiết xuất dược liệu
10 kg lá tươi được chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng, với dung môi chiết là cồn 96%, theo tỉ lệ 6: 1 và chiết 6 lần Cô dưới áp suất giảm thu được cao cồn toàn phần, chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: Dietyl eter, cloroform, etyl acetat, nước thu được các cao phân đoạn: Cao
eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước Định lượng phenolic toàn phần
Bằng phương pháp Folin – Ciocalteu theo Waterman và Mole (1994)(2) Dựng đường chuẩn acid gallic với giai mẫu 10 g, 20 g, 30 g, 40
g, 50g, dựa và phương trình đường chuẩn để xác định hàm lượng phenolic toàn phần trong mẫu thử Hàm lượng phenolic toàn phần được tính bằng g đương lượng acid gallic có trong 1
mg mẫu thử (g GAE/ mg) Tiến hành thí nghiệm như sau: Hút một thể tích xác định mẫu (Chất chuẩn acid gallic hoặc mẫu cần định lượng được pha loãng ở nồng độ thích hợp) cho vào bình định mức 10 ml.Thêm 6 ml nước cất, lắc đều Cho vào bình 0,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, lắc đều Để yên trong 5 phút.Thêm 1,5
Trang 3ml Na2CO3, lắc đều Thêm nước cho vừa đủ
10ml Để yên trong tối 2h Sau đó tiến hành đo
độ hấp thu ở bước sóng 758 nm
Xác định các thành phần có hoạt tính
chống oxi hóa trong phân đoạn etyl acetat
Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ
dung môi khai triển: etyl acetat – metanol –
nước (100: 17: 13)(1) Sau khi khai triển, bản mỏng
được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365
nm Sau đó phun thuốc thử DPPH 0,05% lên bề
mặt của bản mỏng và ủ ở nhiệt độ phòng trong
10 phút Những thành phần có hoạt tính chống
oxi hóa sẽ tạo những vạch màu vàng trên nền
tím của bản mỏng, do chất chống oxi hóa làm
mất màu tím của thuốc thử DPPH Chứng
dương là vitamin C So sánh bằng mắt thường
độ mất màu của vạch chứng dương và các vạch
có hoạt tính khác để xác định mức độ mạnh yếu
của hoạt tính Những vạch có hoạt tính chống
oxi hóa được ghi nhận lại bằng giá trị Rf của
chúng
Sắc ký nhanh – cột khô (7)
Sử dụng phễu Buchner thành cao đường
kính trong 10 cm, bình tam giác, máy hút chân
không áp suất 70 mmHg Chất hấp phụ là
silicagel hạt vừa 40 – 60 m Chiều cao cột chất
hấp phụ 5 cm Nạp mẫu ở dạng bột khô, khối
lượng mẫu 20 g Hệ dung môi rửa giải:
Cloroform 100%, etyl acetat 100%, etyl acetat –
metanol (50: 50) Thể tích phân đoạn rửa giải:
500 ml Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp
mỏng với hệ dung môi etyl acetat – metanol –
nước (100: 17: 13) Các phân đoạn giống nhau
được gộp chung Cô đến cắn và cân khối lượng
Sắc ký cột cổ điển
Chất hấp phụ là silicagel hạt vừa (40 – 60
m) Khối lượng chất hấp phụ 350g Quy cách
cột 4 x 50 cm Khối lượng mẫu 6 g Nạp mẫu
bằng phương pháp nhồi bột khô Dung môi rửa
giải là etyl acetat: metanol Tốc độ dòng 20 giọt/
phút Thể tích mỗi phân đoạn 20 ml
Xác định cấu trúc của các chất phân lập được bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, và phổ MS
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chiết xuất dược liệu
Từ 10 kg lá Chùm ngây tươi, chiết bằng cồn 96% thu được 600 g cao cồn toàn phần, độ ẩm cao là 19,8 % Hiệu suất chiết là 5,88 %
Kết quả lắc phân đoạn thu được khối lượng cao theo bảng 1
Bảng 1: Kết quả thu cao phân đoạn
cao (g)
Độ ẩm cao (%)
Hiệu suất chiết
Định lượng phenolic toàn phần
Hình 1: Phương trình đường chuẩn acid gallic
Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic toàn phần với phương trình hồi quy: y = 0,014x – 0,0021 và R2 = 0,9955
Bảng 2: Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao
cồn toàn phần và cao phân đoạn
Mẫu
Khối lượng cao (mg)
OD 758 nm
Hàm lượng phenolic toàn phần (g GAE/mg)
Ghi chú: GAE: Gallic acid equivalent (tương đương với acid gallic)
Trang 4Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao
cồn toàn phần là 108,011 g GAE/ mg và trong
các cao phân đoạn: Cao eter, cao cloroform, cao
etyl acetat và cao nước lần lượt là 44,528 g
GAE/mg, 110,914 g GAE/mg, 271,822 g
GAE/mg và 90,881 g GAE/mg Trong đó cao etyl acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa nhất và được lựa chọn để tiếp tục phân lập các chất có hoạt tính chống oxi hóa trong lá Chùm ngây
Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa trong phân đoạn etyl acetat
Hình 2: Kết quả sắc ký lớp mỏng phân đoạn etyl acetat, hệ EtOAc – MeOH – H 2 O (100:17:13)
Khi bắt đầu phun thuốc thử DPPH lên bản
mỏng, vitamin C ngay lập tức làm mất màu của
DPPH và tạo vết vàng trên sắc đồ Đối với các
vết chất trong phân đoạn etyl acetat cũng có tình
trạng tương tự, không cần ủ 10 phút mà các vết
ngay lập tức làm mất màu DPPH Điều này cho
thấy hoạt tính chống oxy hóa của các thành
phần trong phân đoạn này là rất cao Trong phân đoạn etyl acetat có 6 vết chất có màu vàng, thể hiện hoạt tính chống oxy hóa Chúng có giá trị Rf lần lượt là 0,45 ; 0,29 ; 0,27 ; 0,16 ; 0,12; 0,1 ở
hệ EtOAc – MeOH – H2O (100:17:13) và đều hiện màu với thuốc thử FeCl3
Sắc ký nhanh – cột khô
Bảng 3: Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô
CHCl 3
kém phân cực
EtOAc
chống oxy hóa EtOAc – MeOH
Thành phần có hoạt tính chống oxy hóa
Cao EtOAc Cao EtOAc Cao EtOAc Vitamin C Cao EtOAc
Trang 5Phân đoạn E4 được chọn để tiến hành sắc ký
cột cổ điển, phân tách các hợp chất có hoạt tính
chống oxi hóa trong lá Chùm Ngây
Sắc ký cột cổ điển
Bảng 4: Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển
Hệ dung
môi
Phân đoạn
tập hợp
Phân đoạn
Khối lượng cao (g)
Thành phần
EtOAc
100%
1
tạp
chất II
chất II + tạp phía dưới EtOAc –
MeOH
(95:5)
chất III
Từ phân đoạn MO3, để qua đêm, xuất hiện
tủa màu vàng lắng dưới đáy Tách riêng tủa và
rửa tủa bằng metanol, thu được chất I Từ phân
đoạn MO5 và MO6 để qua đêm, xuất hiện kết
tinh hình kim màu vàng Tách riêng kết tinh,
làm sạch bằng cách cho tái kết tinh trong dung
môi etyl acetat, thu được chất II
Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập
được
Chất I và chất II được đo và giải phổ NMR
(phổ H, phổ C, DEPT, HSQC, COSY, HMBC) và
khối phổ MS Dựa vào kết quả phổ NMR một
chiều và 2 chiều, dự đoán cấu trúc của chất I là
vitexin và chất II là isoquercitrin Phổ H và phổ
C của chất I và chất II được đối chiếu với phổ
của chất chuẩn đã được công bố
Bảng 5: Thông số phổ 1 H (500 MHz, DMSO-d 6 ) và
13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) của chất I đối chiếu
với vitexin (9)
δ (ppm) δ(ppm) δ (ppm) δ (ppm)
2
163,85
102,37
181,97
155,90
98,08
164,98
162,49 104,55 160,32 103,96 121,54 128,81 115,73 161,03 115,73 128,81 73,31 70,82 78,62 70,54 81,72 61,26
3 102,37 6,77 102,51 6,94 (1H, s, H-3)
5 155,90 13,16 155,64 13,17 (1H, s, 5-OH)
1’
1
2’ 128,81 8,03 128,99 8,26 (1H, d, J = 8,7
Hz, H-2’) 3’ 115,73 6,90 115,01 7,05 (1H, d, J= 8,7
Hz, H-3’)
5’ 115,73 6,88 115,01 7,05 (1H, d, J= 8,7
Hz, H-5’) 6’ 128.81 8,01 128,99 8,26 (1H, d, J = 8,7
Hz, H-6’) 1” 73,31 4,93 73,93 4,94 (1H,d, J = 9,8
Hz, H-1’’)
Bảng 6: Kết quả phổ 1 H (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) của chất II đối chiếu với isoquercitrin (3)
δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm)
Trang 6Chất II isoquercitrin
Hz, H-6)
Hz, H-8)
1’
2’ 115,15 7,56 115,1 7,56 (1H, br s, H-2′)
5’ 116,19 6,83 116,1 6,83 (1H, d, J = 9,0
Hz, H-5′)
6’ 121,51 7,58 121,5 7,58 (1H, d, J = 9,0
Hz, H-6′) 1” 100,96 5,45 100,8 5,45 (1H, d, J = 6,9
Hz, H-1″)
Cấu trúc chất I là vitexin (C21H20O10: (1S)-1,5-anhydro- 1-[5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-8-yl]-D-glucitol) và chất II là isoquercitrin (C21H20O12: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-3-yl β-D-glucopyranosid)
Cấu trúc của chất I - vitexin Cấu trúc của chất II - isoquercitrin
Hình 3: Cấu trúc của vitexin và isoquercitrin
KẾT LUẬN
Lá Chùm ngây chứa nhiều hợp chất có
hoạt tính chống oxi hóa, các hợp chất này liên
quan đến nhóm hợp chất phenolic Trong đó
hai hợp chất flavonoid có hoạt tính chống oxi
hóa chủ yếu của lá đã được xác định là vitexin
và isoquercitrin Vitexin là một flavon
C-glycosid được phân lập từ lá cây này lần đầu
tiên
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bhattarai H D., Babita P., Hong S.G., Lee H.K., Yim J.H
(2008), Thin layer chromatography analysis of antioxidant
constituents of lichens from Antarctica, Journal of Natural
Medicine, 62, pp 481 – 484
2 Chumark P., Panya K., Yupin S., Srichan P., Noppawan M
(2008), The in vitro and ex vitro antioxidant properties,
hypolipidaemic and antitherosclerotic activities of water
extract of Moringa oleifera Lam leave, Journal of
Ethnopharmacology, 119, pp 439 – 436
3 Deepralard K., Kawanishi K., Moriyasu M., Thitima P., Suttisri R (2009), Flavonoid glycosides from the leave of
Uvaria rufa with advanced glycation end – products
inhibitory activity, Thai J Pharm Sci., 33, pp 84 – 90
4 Fahey J.W (2005), Moringa oleifera: A Review of the Medical
Evidence for Its Nutritional, Therapeutic, and Prophylactic Properties Trees for Life Journal,1: pp 5
5 Monzon R.B (1995), Traditional medicine in the treatment of
parasitic diseases in the Philippines, Southeast Asian Journal
of Tropical Medicine and Public Health, 26(3): pp 421-428
6 Sabale V., Patel V., Paranjape A., Arya C., Sakarkar S N and Sabale P.M (2008), Moringa Oleifera (Drumstick): An Overview, Pharmacognosy Reviews, 2(4), pp 7-13
7 Trần Hùng (2006), Phương pháp chiết xuất dược liệu, Bộ môn
Dược liệu, Khoa Dược- Đại học Y Dược, Tp HCM, tr 119 -
127
8 Võ Văn Chi, (1999), Tự điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y Học,
tr 248
9 Zhou X., Peng J., Fan G.(2005), Isolation and purification of
flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed
counter-current chromatography by stepwise increasing the
flow-rate of the mobile phase, J Chromatoqr A., 1092 (2), pp
216 – 221
