nghiên cứu xây dựng quy trình tạo bạc nano theo phương pháp sinh học bằng fusarium oxysporum

Bằng sự phối hợp giữa 2 lĩnh vực công nghệ sinh học và công nghệ nano, các tế bào sinh vật có thể được sử dụng để sinh tổng hợp các hạt nano thông qua quá trình chuyển hóa sinh học.Trong

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO BẠC NANO THEO PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

BẰNG Fusarium oxysporum

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

, 07/2014

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

ỉnh sửa của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO BẠC NANO THEO PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

BẰNG Fusarium oxysporum

CHỦ

07/2014

Các phương pháp tổng hợp và giữ ổn định hạt kim loại nano đang được công nghệ nano quan tâm nghiên cứu, đặc biệt là các phương pháp tổng hợp “xanh”, thân thiện với môi trường Bằng sự phối hợp giữa 2 lĩnh vực công nghệ sinh học và công nghệ nano, các tế bào sinh vật có thể được sử dụng để sinh tổng hợp các hạt nano thông qua quá trình chuyển hóa sinh học.Trong khoảng 1 thập kỷ qua, quá trình tổng hợp nano kim loại ngoại bào hoặc nội bào của vi nấm và vi khuẩn được phát hiện và đang tiếp tụcđược nghiên cứu

Fusariumoxysporum là loài vi nấm với lợi thế sinh tổng hợp ngoại bào và hiệu suất tạo sinh

khối cao, đã được quan tâm nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp bạc nano từ rất sớm.Tuy nhiên, quá trình tổng hợp bac nano bằng phương pháp sinh học gặp nhiều trở ngại, tiêu biểu

là thời gian tạo sản phẩm kéo dài và nồng độ bạc nano chưa cao Chúng tôi đã thử nghiệm

phương pháp sinh tổng hợp bạc nano bằng chủng F oxysporum dựa trên phương pháp nuôi

cấy bề mặt và qua đó rút ngắn được thời gian và công sức thu bạc nano

is not surprising given that many organisms, both unicellular and multicellular, are known to produce inorganic materials either intracellularly or extracellularly.In recent decade, the extracellular or intracellular biosynthesis of metal nanoparticles in fungi and bacteria have

been explored and are being investigated Fusariumoxysporum, a fungus with the advantage

of extracellular biosynthesis and high-efficiency biomass, is attracting studying the biosynthesis of silver nanoparticles.However, the biosynthesis of silver nanoparticles is impeded because of the time-consuming process and the low concentration of silver nanoparticles We investigated the new method of biosynthesis silver nanoparticles by

culturing F oxysporum on agar surface and hence shortened the time and effort collecting

MỤC LỤC

i

1

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT v

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH SÁCH ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ viii

Phần mở đầu 1

Thông tin đề tài 0

Mục tiêu 0

Nội dung 0

Sản phẩm của đề tài 1

1 Tổng quan tài liệu Error! Bookmark not defined. 1.1 Lịch sử ứng dụng tính kháng khuẩn của hạt bạc 4

1.2 Tính chất hạt kim loại nano 5

1.2.1 Hiệu ứng bề mặt 6

1.2.2 Hiệu ứng kích thước 7

1.2.3 Tính chất quang 8

1.2.4 Tính chất điện 9

1.2.5 Tính chất từ 9

1.2.6 Tính chất nhiệt 9

1.2.7 Tính kháng khuẩn của hạt bạc nano 10

1.3 Các ứng dụng của bạc nano 11

1.3.1 Trong công nghiệp điện máy 11

1.3.2 Trong y dược 12

1.3.3 Trong nông nghiệp 13

1.3.4 Trong các sản phẩm gia dụng 15

1.3.5 Trong công nghệ xử lý nước 16

1.3.6 Trong xúc tác 16

1.4 Phương pháp tạo bạc nano 17

1.4.1 Phương pháp khử hóa học 17

1.4.2 Phương pháp vật lý 18

1.4.3 Phương pháp polyol hỗ trợ bởi nhiệt vi sóng (hóa-lý kết hợp) 19 1.4.4 Phương pháp sinh học 20

1.5 Sơ lược về F oxysporum 24

1.5.1 Phân loại học 24

1.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh dưỡng 24

1.5.3 Cơ chế sinh tổng hợp 25

1.6 Phương pháp xác định tính chất và kích thước hạt bạc nano 27

1.6.1 Phương pháp quét phổ – UV-Vis 27

1.6.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua 27

1.6.3 Kính hiển vi điện tử quét 28

2 Nội dung nghiên cứu 30

2.1 Thu nhận sinh khối F oxysporum 30

2.1.1 Hoạt hóa, làm thuần giống 30

2.1.2 Khảo sát hình thái F oxysporum 31

2.1.3 Nuôi cấy lỏng và thu sinh khối 31

2.2 Khảo sát các phương pháp sinh tổng hợp bạc nano 31

2.2.1 Phương pháp tổng hợp bạc nano trên môi trường lỏng 31

2.2.2 Phương pháp tổng hợp bạc nano trên bề mặtagar 32

2.3 Nghiên cứu phương pháp sinh tổng hợp môi trường rắn 33

2.3.1 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 33

2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AgNO3 33

2.3.3 Khả năng ổn định của dung dịch bạc nano 34

2.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc nano 34

2.4 Mô hình máng nghiêng sinh tổng hợp bạc nano 36

2.4.1 Cấu tạo và hoạt động 36

2.4.2 37

3 Kết quả - Thảo luận 39

3.1 Quan sát hình thái F oxysporum 39

3.2 Các phương pháp sinh tổng hợp bạc nano khác nhau 41

3.3 Nghiên cứu phương pháp sinh tổng hợp môi trường rắn 44

3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 44

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AgNO3 45

3.3.3 Khả năng ổn định của dung dịch bạc nano 47

3.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc nano 49

3.4 Mô hình máng nghiêng sinh tổng hợp bạc nano 51

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 53

4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Đề nghị 55

PHỤ LỤC i

TÀI LIỆU THAM KHẢO vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Chemists

EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid Tetra Sodium Salt EPA Environmental Protection Agency

FCC Fluid Catalytic Cracking

FDA Food and Drug Administration

FITI Testing and Research Institute

NADH Nicotinamide Adenine Dinucleotide

NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

PVP Poly Vinyl Pyrrolidone

SEM Scanning Electron Microscopy

SIAA Singapore Industrial Automation Association

TEM Transmission Electron Microscopy

UV-Vis Ultraviolet-Visible

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1 Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano hình cầu 7Bảng 1.2 Độ dài đặc trưng một số tính chất của vật liệu 8Bảng 2.1 Các dung dịch bạc nano thử nghiệm kháng khuẩn với các hàm lượng bạc khác nhau 35Bảng 3.1 Bảng đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch bạc nano được sinh tổng hợp trên môi trường Malt-Yeast với các phương pháp khác nhau 42Bảng 3.2 Bảng đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch bạc nano được sinh tổng hợp với các nồng độ dung dịch AgNO3 khác nhau 45Bảng 3.3 Hiệu suất kháng khuẩn của các dung dịch bạc nano 49Bảng 3.4 Đánh giá phương pháp sinh tổng hợp nuôi trong chai và máng nghiêng 52

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Các hạt bạc nano với kích thước khác nhau [4] 5

Hình 1.2 Quá trình co nguyên sinh kích thích bởi bạc nano 0,1 ppm trong 1 giờ ở Escherichia coli qua ảnh chụp TEM bên phải, ảnh trái là đối chứng [22] 10

Hình 1.3 Các sản phẩm điện máy ứng dụng công nghệ bạc nano [27] 12

Hình 1.4 Băng gạc y tế có tẩm bạc nano [24] 13

Hình 1.5 Thuốc trừ sâu MIFUM 0,6 DD [26] 14

Hình 1.6 Bình sữa Mummybear có tráng lớp bạc nano [30] 15

Hình 1.7 Thiết bị xử lý nước uống nhiễm khuẩn với cột lọc PU@Ag Polyurethan xốp tẩm bạc nano 16

Hình 1.8 Hình TEM và sự phân bố kích thước hạt bạc nano được chế tạo bằng xung laser ở 120 fs và 8 ns [1] 19

Hình 1.9 Tinh thể bạc nano trong vi khuẩn Pseudomonas stutzeri AG259 22

Hình 1.10 Cơ chế tổng hợp bạc nano ở vi khuẩn B.licheniformis [16] 23

Hình 1.11 Sợi nấm F oxysporum trên môi trường agar [31] 24

Hình 1.12 Hình thái sợi đa bào, bào tử hình liềm và bào tử hình cầu của nấm F.oxysporum 25

Hình 1.13 Giả thuyết về cơ chế quá trình sinh tổng hợp bạc nano ở F oxysporum] 26

Hình 2.1 Mô hình hoạt động của hệ thống máng nghiêng 36

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc F oxysporum nuôi trên môi trường rắn Malt-Yeast (A) và hình từ Internet (B) [31] 39

Hình 3.2 Hình thái F oxysporum dưới kính hiển vi 40

Hình 3.3 Dung dịch AgNO3 các phương pháp sinh tổng hợp bạc nano khác nhau 41

Hình 3.4 Ảnh TEM của hạt bạc nano được sinh tổng hợp với AgNO3 8mM và đồ thị sự phân bố hạt bạc nano 47

Hình 3.5Mô hình sinh tổng hợp bạc nano trên môi trường agar dạng máng nghiêng sau khi lắp ráp (A) và phủ agar (B), trải nấm F oxysporum lên bề mặt và cho AgNO3 chảy qua (C) 51

Đồ thị 3.2 Phổ UV-Vis của dung dịch thu được theo thời gian phản ứng 44

Đồ thị 3.3 Phổ UV-Vis của dung dịch bạc nano với các nồng độ AgNO3 khác nhau 45

Đồ thị 3.4 Phổ UV-Vis để kiểm tra khả năng ổn định của dung dịch bạc nano 48

Đồ thị 3.5 Đồ thị biểu diễn hiệu suất kháng khuẩn theo hàm lượng Ag 50

Đồ thị 3.6 Phổ UV-Vis của dung dịch nano bạc sinh tổng hợp trên hệ thống máng nghiêng theo thời gian lưu 52

Tên đề tài:NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO BẠC NANO

THEO PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC BẰNG F oxysporum

Chủ nhiệm đề tài/dự án: NGUYỄN HOÀNG NGỌC PHƯƠNG

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện: 11/2010 – 11/2011

Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng

Kinh phí đã cấp: 72 triệu đồng theo:

 Thực hiện sinh tổng hợp bạc nanobằng 3 cách: (A) khử Ag cho tiếp xúc trực

tiếp với sinh khối F oxysporum; (B) gián tiếp thông qua các chất vận chuyển electron ngoại bào do F oxysporum tiết ra môi trường nuôi; (C) sử dụng

phương pháp sinh tổng hợp mới: nuôi cấy trên bề mặt agar nhằm tiết kiệm công sức, hóa chất, so sánh kết quả với với hai phương pháp có trước

 Dựa trên phương pháp cải tiến (C):

- Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng, nồng độ Ag+ lên quá trình sinh tổng hợp

- Xác định kích thước và nồng độ của bạc nano sinh tổng hợp

- Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc nano sinh tổng hợp

- Xây dựng mô hình sản xuất dung dịch bạc nano bán liên tục quy mô phòng thí nghiệm

Quy trình tạo bạc nano

theo phương pháp sinh học

MỞ ĐẦU

Hiện nay các chủng vi sinh vật gây bệnh ngày càng trở nên kháng thuốc, điều này thúc đẩy các nhà khoa học, dược học quay về sử dụng bạc –

, phổ kháng rộng Các ứng dụng của bạc nano đã xuất hiện rất nhiều trên thị trường hiện nay, như bạc nano kết hợp với các polymer để tạo vật dụng kháng khuẩn như: khăn lau vệ sinh, bình sữa, hộp đựng thực phẩm, tủ lạnh, màng lọc máy điều hòa, thuốc rửa vết thương

hợp hóa – lý, nhưng chúng đều có nhược điểm là kích thước hạt bạc nano tạo

ra khá lớn: 20-100nm (tùy vào phương pháp tổng hợp), nên hiệu quả kháng khuẩn kém hơn, , chi phí đầu tư trang thiết bị tốn kém, hóa chất đắt, khó quy mô công nghiệp (đối với phương pháp vi sóng), và nhất là rất độc hại đối với môi trường

đề để phát triển hướng sử dụng vi sinh xử lý môi trường ô nhiễm kim loại nặng

Phương pháp sinh tổng hợp bạc nano trên thế giới hiện nay

nội bào hoặc ngoại bào Hướng sinh tổng hợp ngoại bào có nhiều lợi thế hơn vì có thể thu lấy hạt bạc dễ dàng từ môi trường phản ứng Tuy vậy, phương

ứng phải chờ khá lâu (trên 3 ngày), tốn nhiều công sức cho các công đoạn nuôi cấy và

ly tâm để thu đủ lượng sinh khối thực hiện phản ứng, ngoài ra môi trường phản ứng chỉ có muối bạc, bên cạnh đó, khi nồng độ bạc nano sinh tổng hợp tăng dần sẽ xuất hiện tình trạng ức chế ngược khiến vi sinh chết dần trong khi thực hiện phản ứng dẫn đến nồng độ bạc nano không cao

, đ sinh tổng hợp hạt bạc nano dựa trên pha rắn – tức là sử dụng giá thể agar có thành phần là môi

trường Malt-Yeast để làm điểm bám và cung cấp dinh dưỡng cho F oxysporum phát

triển Phương pháp này hiệu quả, tiết kiệm

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1

1.1 Lịch sử ứng dụng tính kháng khuẩn của hạt bạc

Trong y học cổ phương Đông, việc dùng bạc chữa bệnh có từ rất sớm Trong các sách đạo Phật Ấn Độ cách đây hơn 2500 năm có đoạn viết: “Người ta khử độc nước uống bằng cách nhúng vào đó một thỏi bạc nung đỏ” Trong cuốn “Chí chân yếu đại luận” (Trung Quốc) nói: “Bạc chi kiếp chi” là bạc bức bách bệnh tà phải ra ngoài Phần lớn các viên thuốc hoàn đều có lớp áo bằng vết bạc để bảo quản thuốc

từ năm này qua năm khác mà vẫn giữ nguyên chất lượng Nhiều nơi ở nước ta có tục lệ đào giếng lấy nước, trước khi sử dụng, thường ném xuống giếng một đồng bạc nhỏ để cúng Thần giếng, điều này cũng bắt nguồn từ kinh nghiệm dân gian dùng bạc để khử trùng nước[28]

Ở phương Tây, việc sử dụng bạc như một chất sát trùng đã có quá trình lịch

sử hàng nghìn năm, được ghi nhận trong lịch sử y học Châu Âu Chính Hippocrate, người được coi là cha đẻ của y học phương Tây, đã dùng bạc để chữa bệnh và khuyên nên dùng bạc như chất sát trùng Vào thế kỷ 14, một đợt dịch hạch đã cướp

đi sinh mạng của 1/4 dân số châu Âu, những người giàu đổ xô đi mua bát đĩa bạc dùng trong việc ăn uống và việc làm đó tỏ ra rất có tác dụng trong đợt dịch hạch lớn này Thậm chí ở châu Âu, tác dụng của bạc đến sức khoẻ đã đi vào thành ngữ Người Anh gọi một đứa trẻ khoẻ mạnh, béo tốt là “He was born with a silver spoon

in his mouth” (Thằng bé được sinh ra với chiếc thìa bạc trong miệng) và có tục lệ đến mừng các gia đình sinh con bằng chiếc thìa bạc để cháu nhỏ ăn bột[28]

Sau này, khi nền công nghiệp sản xuất kháng sinh ra đời những dòng thuốc giá thành bình dân, hiệu lực diệt khuẩn cao, thì vai trò kháng khuẩn của bạc dần bị quên lãng, một phần cũng vì giá thành kim loại quí này khá cao

Tuy nhiên, hiện nay các chủng vi sinh vật gây bệnh ngày càng trở nên kháng thuốc, điều này thúc đẩy các nhà khoa học, dược học quay về sử dụng bạc dưới một dạng mới - bạc nano - như một chất kháng khuẩn an toàn, phổ kháng rộng, không gây độc lên người sử dụng Những nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học thuộc Kyungpook National University ở Daegu, Korea còn cho thấy bạc nano có hiệu quả

vượt trội kháng các loài nấm kí sinh gây bệnh trên người (Candida,

Trichophyton)[17] Hiện tại, loại vật liệu này đã được NASA chọn làm chất diệt

khuẩn trên tàu vũ trụ

Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer để các hạt bạc nano không bị kết tụ Bạc ở kích thước nano có những đặc trưng rất khác so với bạc bình thường

Hình 1.1Các hạt bạc nano với kích thước khác nhau [4]

1.2 Tính chất hạt kim loại nano

Bạc nano cũng như hạt kim loại nano có hai tính chất khác biệt so với vật liệu khối đó là hiệu ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước Tuy nhiên, do đặc điểm các hạt nano có tính kim loại, nghĩa là có mật độ điện tử tự do lớn Do vậy tính chất của vật liệu còn có những đặc trưng riêng khác với vật liệu đơn thuần chỉ có hai tính chất trên, hay các vật liệu không có mật độ điện tử tự do hoặc có nhưng thấp trong thành phần cấu trúc của vật liệu

Ta xét ví dụ sau đây: Nếu gọi ns là số nguyên tử nằm trên bề mặt của vật liệu được tạo thành từ các hạt nano hình cầu, n là tổng số nguyên tử thì ta có mối liên hệ như sau ns=4n(2/3) Gọi f là tỉ số giữa số nguyên tử trên bề mặt và tổng số nguyên tử khi đó f = ns/n =4n(2/3)/n = 4n-1/3 = 4 r0/r, trong đó r0 là bán kính của nguyên tử và r

là bán kính của hạt nano Như vậy nếu kích thước của vật liệu giảm (r giảm) thì tỉ số

bề mặt sẽ tăng lên (f tăng) Do nguyên tử trên bề mặt có nhiều tính chất khác biệt so với tính chất của các nguyên tử ở bên trong lòng vật liệu nên khi kích thước vật liệu giảm đi thì hiệu ứng có liên quan đến các nguyên tử bề mặt, hay còn gọi là hiệu ứng

bề mặt tăng lên do tỉ số f tăng Khi kích thước của vật liệu giảm đến nm thì giá trị f

này tăng lên đáng kể Sự thay đổi về tính chất có liên quan đến hiệu ứng bề mặt

không có tính đột biến theo sự thay đổi về kích thước vì f tỉ lệ nghịch với r theo một

hàm liên tục[25]

Bảng 1.1Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano hình cầu

Đường kính

hạt nano (nm) Số nguyên tử

Tỉ số nguyên

tử trên bề mặt (%)

Năng lượng bề mặt (erg/mol)

Năng lượng mặt/Năng lượng tổng(%)

1.2.2 Hiệu ứng kích thước

Khác với hiệu ứng bề mặt, hiệu ứng kích thước của vật liệu nano đã làm cho vật liệu nano có những tính chất kỳ lạ hơn nhiều so với vật liệu truyền thống.Đối với mỗi vật liệu đều có một độ dài đặc trưng, tính chất của rất nhiều vật liệu đều rơi vào kích thước nm.Chính điều này đã làm nên từ “vật liệu nano” mà chúng ta thường nghe đến ngày nay.Ở vật liệu khối, kích thước của vật liệu lớn hơn rất nhiều lần độ dài đặc trưng của vật liệu, điều này đã qui định những tính chất vật lý của vật liệu như chúng ta đã biết.Nhưng khi kích thước của vật liệu có thể so sánh được với

độ dài đặc trưng của vật liệu thì tính chất vật lý của vật liệu có những thay đổi đột ngột, và chúng khác hẳn so với những tính chất mà chúng ta đã biết trước đó Trong trường hợp này không có sự chuyển tiếp từ vật liệu khối đến vật liệu nano[2]

Ví dụ, vật liệu sắt từ được hình thành từ những domain, trong lòng một domain, các nguyên tử có từ tính sắp xếp song song với nhau nhưng lại không nhất thiết phải song song với moment từ của nguyên tử ở một domain khác.Giữa hai

domain có một vùng chuyển tiếp được gọi là vách domain.Độ dày của vách domain phụ thuộc vào bản chất của vật liệu mà có thể dày từ 10-100nm Nếu vật liệu tạo thành từ các hạt chỉ có kích thước bằng độ dày vách domain thì sẽ có các tính chất khác hẳn với tính chất của vật liệu khối vì ảnh hưởng của các nguyên tử ở domain này tác động lên nguyên tử ở domain khác[2]

Bảng 1.2Độ dài đặc trưng một số tính chất của vật liệu

tử dẫn đến từ quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ Khi dao động như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho các hạt bị phân cực điện tạo thành một lưỡng cực điện Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng các yếu tố về hình dạng, độ lớn của hạt nano và môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất Ngoài ra, mật độ hạt nano cũng ảnh hưởng đến tính chất quang Nếu mật độ loãng thì có thể coi như gần đúng hạt tự do,

nếu nồng độ cao thì phải tính đến ảnh hưởng của quá trình tương tác giữa các hạt[18]

1.2.4 Tính chất điện

Tính dẫn điện của kim loại rất tốt hay điện trở của kim loại nhỏ nhờ vào mật

độ điện tử tự do cao trong đó Đối với vật liệu khối, các lí luận về độ dẫn điện dựa trên cấu trúc vùng năng lượng của chất rắn Điện trở của kim loại đến từ sự tán xạ của điện tử lên các sai hỏng trong mạng tinh thể và tán xạ dao động với nhiệt của nút mạng Tập thể các điện tử chuyển động trong kim loại dưới tác dụng của điện trường (U) có liên hệ với nhau thông qua định Ohm: U = IR, trong đó R là điện trở kim loại Định luật Ohm cho thấy đường I-U là một đường tuyến tính Khi kích thước của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm rời rạc hóa cấu trúc Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đường I-U bị nhảy bậc với giá trị mỗi bậc sai khác nhau một lượng e/2C cho U và e/RC cho I, với e là điện tích của điện

tử, C và R là điện dung và điện trở kháng nối hạt nano với điện cực[25]

1.2.5 Tính chất từ

Các kim loại quý như vàng, bạc…có tính nghịch từ ở trạng thái khối do sự

bù trừ cặp điện tử Khi vật liệu thu nhỏ kích thước thì sự bù trừ trên sẽ không toàn diện nữa và vật liệu có từ tính tương đối mạnh Các kim loại có tính sắt từ trạng thái khối như kim loại chuyển tiếp sắt, cobalt, nickel thì khi kích thước nhỏ sẽ phá vỡ trật tự sắt từ làm chúng chuyển sang trạng thái siêu thuận từ Vật liệu ở trạng thái siêu thuận từ có từ tính mạnh khi có từ trường và không có từ tính khi từ trường bị ngắt đi, tức là từ dư và lực kháng từ hoàn toàn bằng không[2]

1.2.6 Tính chất nhiệt

Nhiệt độ nóng chảy Tm của vật liệu phụ thuộc vào mức liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể Trong tinh thể, mỗi một nguyên tử có một số các nguyên tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số phối vị Các nguyên tử trên bề mặt vật liệu sẽ có số phối trí nhỏ hơn số phối vị của nguyên tử bên trong nên chúng có thể

dễ dàng tái sắp xếp để có những trạng thái khác hơn Như vậy, nếu kích thước của

hạt nano giảm, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm Ví dụ, hạt vàng 2nm có Tm = 500oC, kích thước 6nm có Tm = 950o

C[18]

1.2.7 Tính kháng khuẩn của hạt bạc nano

Có ba cơ chế kháng khuẩn của bạc nano đã được quan sát ở một số loài gây bệnh[22]:

- Kích thích sự co nguyên sinh, làm màng và vách tế bào tách rời ở vi khuẩn

Gram âm, Salmonella typhi và Escherichia coli;

- Ngăn cản quá trình hình thành vách tế bào ở Gram dương Staphylococcus

aureus;

- Hạt bạc nano tìm thấy trong tế bào chất Mycobacterium tuberculosis có thể

đã cản trở sự chuyển hóa trong tế bào chất

Các vi khuẩn Gram dương có kích thước vách tế bào dày hơn so với các vi khuẩn Gram âm nên tác động của bạc nano trên các vi khuẩn Gram dương kém hơn

so với các vi khuẩn Gram âm Hiệu quả kháng khuẩn của bạc nano thể hiện vượt

trội, cho kết quả tốt dù chỉ 1ppm đối với chủng S.typhi, E.coli, P.aeruginosa và 10ppm đối với S.aureus và M.tuberculosis[22]

Hình 1.2Quá trình co nguyên sinh kích thích bởi bạc nano 0,1 ppm trong 1 giờ ở Escherichia coli qua ảnh chụp TEM bên phải, ảnh trái là đối chứng [22]

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng: bạc nano là chất sát trùng đối với hầu hết các

chủng vi khuẩn như Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Neisseria

gonorrhea, Gardnerella vaginalis, Salmonella typhi…; là chất trừ nấm đối với

Candida albicans, Candida glabrata, và Malassezia furfur…, có thể giết các virus

trong phòng thí nghiệm [10],[13]

Về ảnh hưởng của bạc nano đến sức khoẻ con người, các nhà khoa học cho rằng bạc nano có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con nguời có được là do các vi khuẩn có lợi cho cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt bạc nano cũng

có thể diệt các vi khuẩn này và ảnh hưởng đến sức khoẻ Các cơ chế tác động của hạt bạc nano trên tế bào vi sinh vẫn có khả năng diễn ra trên tế bào động vật cấp cao Các nghiên cứu sự tiếp xúc bạc nano, muối bạc, silver - dendrimer, polymer, bạc zeolite với tế bào động vật nuôi cấy cho thấy chúng có thể gây độc cho tế bào Tuy nhiên,hầu hết các nghiên cứu được thực hiện trong điều kiện đơn giản, cho bạc tiếp xúc trực tiếp với tế bào nuôi cấy, chưa mô phỏng được các điều kiện phức tạp như trong mô cơ thể Không ai trong số các nghiên cứu chứng minh chắc chắn tác động của sản phẩm chứa vật liệu bạc nano có ảnh hưởng đến sức khỏe con người hoặc môi trường Do đó, cần nhiều nghiên cứu sâu hơn đểkhẳng địnhđộctính của bạc nano với việcứng dụng vật liệu bạc nanođã lan rộng và phát triển nhanh chóng như hiện nay [19]

1.3 Các ứng dụng của bạc nano

Do vi khuẩn ngày càng kháng thuốc, nên các nhà khoa học đang tập trung đi tìm các tác nhân mới để diệt chúng Bạc là một trong những chất được tập trung nghiên cứu nhiều Với sự phát triển của công nghệ nano, các nhà khoa học hướng tới việc sử dụng các hạt bạc có kích thước cực nhỏ để diệt khuẩn một cách hiệu quả

1.3.1 Trong công nghiệp điện máy

Dựa trên tính năng diệt khuẩn của bạc, Samsung đã đưa ra phương pháp sử dụng bạc nano trong các thiết bị dân dụng để khử trùng Trong máy giặt, bạc nano tạo thành hệ thống diệt khuẩn của máy mà không cần phải đun sôi nước Cách làm này vừa ít hao tốn điện năng nhưng vẫn bảo đảm hiệu quả Bên cạnh việc diệt khuẩn, công nghệ bạc nano cũng giúp khử mùi Các lưới lọc trong điều hòa nhiệt độ hay các khoang trong tủ lạnh cũng được áp dụng công nghệ tương tự để bảo vệ sức khỏe cho người dùng Thời gian bảo quản thực phẩm có thể lên tới 15 ngày mà không ảnh hưởng đến mùi vị[27]

Sau Samsung, công ty điện tử LG cũng công bố ứng dụng công nghệ nano để diệt khuẩn vào các thiết bị dân dụng như điều hòa nhiệt độ, tủ lạnh, máy hút bụi và máy giặt Nguyên tắc chung của diệt khuẩn, khử mùi là sử dụng các hạt bạc và các-bon siêu nhỏ Kết quả trên đã được các cơ quan có uy tín như cơ quan thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (EPA), hiệp hội công nghiệp tự động Singapore (SIAA) kiểm định[27]

Hình 1.3Các sản phẩm điện máy ứng dụng công nghệ bạc nano[27]

1.3.2 Trong y dược

-bạc nano

, không gây k[29]

[24]:

, nhanh lên

Hình 1.4Băng gạc y tế có tẩm bạc nano [24]

Trong một nghiên cứu của Honori et.al (64), sử dụng bạc nano cho thấy tỉ lệ lây nhiễm ngẫu nhiênlà 0% so với 5,2% trong việc sử dụng của sulfadiazine bạc trên những bệnh nhân bỏng Một nghiên cứu khác trên bề mặt vết bỏng, việc sử dụng nano bạc cho thấy giảm 50% trong các nhiễm trùng tại chỗ so với gạc xeroform, một phương pháp điều trị phổ biến cho bỏng bề mặt Một nghiên cứu ở những bệnh nhân hoại tử biểu bì cho thấy nano bạc có hiệu quả như bạc nitrat trong việc kiểm soát nhiễm trùng Cho đến nay, các nghiên cứu lâm sàng trên bỏng đã chứng minh rằng việc sử dụng nano bạc tốt hơn hoặc ít nhất là hiệu quả như kháng sinh Sử dụng màng trị bỏng phủ bạc giúp giảmđau đớn và rút ngắnthời gian điều trị

so với phương pháp trị bỏng thông thường [12]

1.3.3 Trong nông nghiệp

Sản phẩm thuốc trừ bệnh cây MIFUM 0,6 DD được Viện khoa học vật liệu ứng dụng sản xuất với nồng độ hạt bạc nano 1000 ppm và Chitosan 5000 ppm MIFUM 0,6 DD được khảo nghiệm trừ bệnh đạo ôn, lem lép hạt trên lúa thuộc địa

bàn tỉnh Lâm Đồng và đã chứng tỏ tính ưu việt của mình, cả 2 liều lượng: 0,5lít MIFUM-0,6-DD và 1lít MIFUM-0,6-DD/ha đều cho đạt hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh đạo ôn cổ bông, lem lép hạt trên lúa, nhất là trong giai đoạn 3-7ngày sau khi phun[26]

Hình 1.5Thuốc trừ sâu MIFUM 0,6 DD [26]

Trường Đại học Copenhaghen - Đan Mạch đã nghiên cứu nano sinh học, được gọi là “nanobiotic”, đặc biệt là những nghiên cứu về bạc nano (Nanobiotic Silver) ứng dụng trong ngành chăn nuôi gia cầm Những nghiên cứu này là công trình hợp tác của Đại học Copenhaghen với Đại học Warsaw từ năm 2007 Công nghệ nano đã tạo ra được những hạt bạc có kích thước nano (Nanobiotic-Ag) không những có tính tương hợp sinh học, hiệu lực kháng khuẩn cao, không gây lờn thuốc,

mà còn giúp tăng hoạt động chuyển hoá của tế bào, từ đó dẫn đến tăng tốc độ sinh trưởng của động vật Nanobiotic có thể thay thế kháng sinh cũng như các thuốc chống cầu trùng (coccidiostate) [23]

Một dự án công nghệ nano của Đan Mạch mang tên “Dự án bảo vệ gà mái và

gà thịt chống lại bệnh truyền nhiễm” (viết tắt là CHIP) đã được triển khai với sự tham gia của 13 đối tác thuộc khu vực nhà nước và tư nhân Mục tiêu của CHIP là

sử dụng những thành quả mới nhất của công nghệ nano và công nghệ sinh học để phá vỡ những con đường truyền bệnh và hạn chế các bệnh truyền nhiễm trong ngành chăn nuôi gia cầm Dự án nhắm chủ yếu vào vấn đề vệ sinh bằng cách thử nghiệm những thuốc vô trùng mới và những chất phủ bề mặt các thiết bị chuồng nuôi bằng chất liệu nano (nanocoating) Các chất phủ bề mặt này vừa dễ làm sạch, vừa có tính sát khuẩn[23]

Ngoài ra, Đan Mạch còn nghiên cứu hiệu quả của công nghệ nano bề mặt (nanocoating) đối với các thiết bị quạt thông gió trong chuồng nuôi Sự tiêu thụ điện của quạt đã được đánh giá theo một số loại chất phủ bề mặt khác nhau, trong đó có bạc nano Thí nghiệm sử dụng quạt phủ bạc nano đã thấy giảm 6% chi phí về điện Những ion từ bạc nano đã ngăn không cho bề mặt bị phủ bởi một lớp biofilm, nhờ vậy bụi không có cơ hội dính vào lớp biofilm này (biofilm tạm dịch là màng sinh học do sự kết tập của các vi khuẩn trên bề mặt các chất vô cơ hay hữu cơ)[23]

1.3.4 Trong các sản phẩm gia dụng

Hãng Mummybear đã giới thiệu công nghệ bạc nano được ứng dụng vào sản xuất khăn ướt, bình sữa và dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ Những sản phẩm này đều được tráng phủ bạc ứng dụng công nghệ nano, vì vậy các bà mẹ sẽ tiết kiệm được thời gian, không phải luộc bình hàng ngày mà vẫn bảo quản được thực phẩm lâu dài Theo kết quả cuộc nghiên cứu của Viện nghiên cứu và thử nghiệm Hàn Quốc

(FITI) khi so sánh sự sinh trưởng của khuẩn E.coli gây tiêu chảy và Staphyloccocus

gây bệnh ung thư trong bình sữa bạc nano cho thấy sau 5 giờ lượng khuẩn trong bình sữa thường tăng lên 84,6% còn bình bạc nano giảm 44,6% Ngoài ra, bình sữa bạc nano còn có tác dụng khử mùi hôi, tiêu độc, chống đầy hơi, trướng bụng khi trẻ

bú sữa[30]

Hình 1.6Bình sữa Mummybear có tráng lớp bạc nano[30]

Ngoài ra, hiện nay người ta còn ứng dụng bạc nano trong các sản phẩm như tất khử mùi, bàn chải đánh răng, nước rửa rau, các loại sơn, mỹ phẩm, ca uống nước… mang lại nhiều lợi ích cho cuộc sống

1.3.5 Trong công nghệ xử lý nước

Việc sử dụng các hạt bạc có kích thước nano trong công nghệ xử lý nước tương đối khá mới mẻ Do bề mặt riêng khá lớn, hạt bạc có kích thước nano có hoạt tính khá cao trong vấn đề xử lý nước nhiễm khuẩn và đã được khá nhiều nhà khoa học nghiên cứu[15]

Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano Đại học Quốc gia TP.HCM đã sử dụng vật liệu polyurethane mút xốp tẩm bạc nano (PU@Ag) để xử lý nước uống nhiễm

khuẩn E.coli Nước qua hệ lọc PU@Ag không còn vi khuẩn và uống được theo tiêu

chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới[21]

Hình 1.7Thiết bị xử lý nước uống nhiễm khuẩn với cột lọc PU@Ag Polyurethan xốp

tẩm bạc nano

1.3.6 Trong xúc tác

Bạc nano với diện tích bề mặt lớn và năng lượng bề mặt cao rất hữu ích trong việc sử dụng làm xúc tác Khi được sử dụng làm xúc tác thì các hạt bạc nano thường được phủ lên các chất mang là silica phẳng, alumina… Chúng có tác dụng làm nền giữ cho các hạt bạc nano bám trên các chất mang đồng thời có thể làm tăng

độ bền, tăng tính chất xúc tác và bảo vệ chất xúc tác khỏi bị quá nhiệt cũng như kết khối cục bộ giúp thời gian sử dụng chất xúc tác sẽ lâu hơn Ngoài ra, hoạt tính xúc

tác có thể được điều khiển bằng kích thước của các hạt bạc nano dùng làm xúc tác[8]

Xúc tác bạc nano được ứng dụng trong việc oxy hóa các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa ethylen thành ethylen oxit dùng cho các phản ứng khử các hợp chất nitro, làm chất phụ gia cải tiến khả năng xử lý khí NO và khí CO của xúc tác FCC

và ngoài ra xúc tác bạc nano còn dùng làm xúc tác trong khử thuốc nhuộm bằng NaBH4…

1.4 Phương pháp tạo bạc nano

Các phương pháp dùng sản xuất trong công nghiệp hiện nay chủ yếu là phương pháp hóa học, vật lý, hoặc hóa-lý kết hợp

dưới tác dụng của chất khử X sẽ tạo ra nguyên tử Ag0, sau đó các nguyên tử này kết hợp với nhau tạo thành các hạt bạc có kích thước nano Các tác nhân hóa học có thể sử dụng đó là: NaBH4, sodium citrate, hydrogen, hydrogen peroxide, hydroxylammine, hydrazine, formaldehyde và các dẫn xuất của nó, EDTA, và các monosaccharide Ứng với mỗi hóa chất sẽ có một phương pháp khử để điều chế hạt bạc nano, ví dụ như phương pháp khử citrate ứng với tác nhân citrate, phương pháp khử EDTA ứng với tác nhân EDTA Mỗi phương pháp đều có cơ chế cụ thể của phương pháp đó tương ứng với tác nhân khử

Cơ chế 2: 8Ag+ + BH4- + 3H2O → 8Ag + H2BO3- + 8H+

Việc lựa chọn một hóa chất phù hợp tùy thuộc vào tính kinh tế, yêu cầu của quá trình điều chế cũng như chất lượng của hạt nano vì mỗi loại hóa chất sẽ tạo ra một cỡ hạt khác nhau ví dụ như khử bằng NaBH4 có thể cho cỡ hạt từ 5nm đến 20nm[2], khử citrate cho cỡ hạt trong khoảng 30nm đến 120nm[9] Đồng thời mỗi loại hóa chất cũng cho tính bền vững của dung dịch các hạt bạc nano khác nhau và khả năng đưa bạc nano từ dung dịch nano tạo bởi các hóa chất này tùy thuộc vào sản phẩm ta cần ứng dụng, do đó khi tiến hành điều chế hạt bạc nano bằng phương pháp hóa học cần lựa chọn thật kỹ lưỡng hóa chất sử dụng

1.4.2 Phương pháp vật lý

Đây là phương pháp sử dụng các tác nhân vật lý như điện tử, sóng điện từ như tia UV, gamma, tia laser để khử ion bạc tạo thành hạt bạc nano Sơ đồ thể hiện qui trình tạo ra hạt bạc nano bằng phương pháp vật lý:

ħ٧

Ag + → Ag 0

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý, có nhiều quá trình biến đổi của dung môi và các chất phụ gia trong dung môi để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion bạc thành bạc kim loại để chúng kết tụ tạo các hạt bạc nano

Một thí dụ sử dụng phương pháp vật lý để chế tạo hạt bạc nano là dùng các tia laser xung có bước sóng 500nm, độ dài xung 6ns, tần số 10hz công suất 12-14Mj chiếu vào dung dịch AgNO3 như là nguồn kim loại và sodium dodecyl sulfate (SDS) như chất hoạt hóa bề mặt để thu được hạt bạc nano Kích thước của hạt bạc nano tạo ra bằng phương pháp laser phụ thuộc vào chiều dài bước sóng và cường độ của laser [4]

Phương pháp vật lý có nhiều ưu điểm như: đơn giản hơn phương pháp hóa học, tuy nhiên để tạo tác nhân vật lý cần thiết bị hiện đại và mắc tiền

Hình 1.8Hình TEM và sự phân bố kích thước hạt bạc nano được chế tạo bằng xung

laser ở 120 fs và 8 ns [1]

1.4.3 Phương pháp polyol hỗ trợ bởi nhiệt vi sóng (hóa-lý kết hợp)

Lò vi sóng là một thiết bị gia nhiệt, nó cung cấp một nhiệt lượng ổn định và gia nhiệt đồng đều Sử dụng lò vi sóng tiến hành khử ion Ag+ thành Ag0 theo qui trình polyol để tạo thành hạt bạc nano Trong phương pháp này muối bạc và chất khử êm dịu có tác dụng trợ giúp cho quá trình khử Ag+ về Ag0 như: C2H5OH,

C2H4(OH)2 , C3H5(OH)3, HCHO… cũng như chất ổn định hạt bạc nano khi nó tạo thành Dưới tác dụng của vi sóng các phân tử có cực như các phân tử Ag+

và các chất trợ khử sẽ nóng lên rất nhanh, nhiệt cung cấp đều cho toàn dung dịch do vậy

mà quá trình khử bạc sẽ diễn ra một cách nhanh chóng và êm dịu hơn các phương pháp khác[2]

Gia nhiệt trong lò vi sóng là phương pháp có ưu thế hơn rất nhiều so với phương pháp cơ bản khác Bởi vì gia nhiệt trên một diện tích phẳng thì sẽ có những

vị trí mà nhiệt độ trên bề mặt sẽ khác xa so với trong lòng dung dịch, đồng thời gia nhiệt trên các bề mặt sẽ dễ dẫn đến là nhiệt độ tại thành của thiết bị gia nhiệt cao

hơn rất nhiều so với nhiệt độ trung bình của dung dịch Ngược lại, gia nhiệt bằng vi sóng thì nhiệt sẽ được cung cấp trên toàn thiết bị gia nhiệt, và nhiệt độ của cả dung dịch cũng như thành thiết bị hầu như đều nhau và đây là yếu tố tới hạn để tạo ra các hạt bạc nano có kích thước đồng đều nhau và nhỏ bé hơn nhiều so với phương pháp gia nhiệt thông thường Bên cạnh đó, một ưu điểm của phương pháp này là thiết bị đơn giản và dễ sử dụng Trong phương pháp vi sóng chúng ta có thể tạo ra hạt bạc nano có kích thước khoảng 10nm[2]

Đồ thị1.1Phổ UV-Vis của phương pháp gia nhiệt bằng lò vi sóng và phương pháp gia

nhiệt thông thường

1.4.4 Phương pháp sinh học

Để tổng hợp các hạt nano kim loại với hình dạng và kích thước mong muốn, các phương pháp vật lý và hóa học đã được xây dựng Mặc dù các phương pháp trên đã sản xuất thành công hạt nano, nhưng chúng vẫn còn đắt tiền và sử dụng hoá chất độc hại Vì vậy, các phương pháp tổng hợp thân thiện với môi trường ngày càng được quan tâm phát triển Phương pháp sinh học sử dụng các tác nhân như nấm, vi khuẩn, virus và tảo có khả năng khử ion bạc tạo nguyên tử bạc kim loại Mục tiêu các phương pháp này nhắm đến là đạt hiệu quả về chi phí, tổng hợp các hạt nano kim loại khác nhau với độ ổn định cao, kích thước và hình dạng đồng đều

Sinh tổng hợp các hạt nano bằng vi sinh vật là một phương pháp hóa học

“xanh” kết nối giữa công nghệ nano và công nghệ sinh học vi sinh vật Dù các hạt nano sinh tổng hợp ổn định khá tốt, tuy vậy, nhược điểm lớn của phương pháp sinh

tổng hợp hiện nay là kích thước không đồng đều, tốc độ tổng hợp khá chậm (thường trên 3 ngày[5],[7]), tốn nhiều công sức cho các công đoạn nuôi cấy và ly tâm để thu

đủ lượng sinh khối thực hiện phản ứng, ngoài ra môi trường phản ứng chỉ có muối bạc, thiếu dinh dưỡng duy trì sức sống cho vi sinh, bên cạnh đó, khi nồng độ bạc nano sinh tổng hợp tăng dần sẽ xuất hiện tình trạng ức chế ngược khiến vi sinh chết dần trong khi nồng độ bạc nano không cao Để khắc phục những vấn đề này, phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và kỹ thuật thu nhận phải được tối ưu hóa

Cơ chế sinh hóa và cấu trúc các phân tử trung gian đang được nghiên cứu chi tiết để tăng tốc độ tổng hợp và cải thiện tính chất của các hạt nano Tiềm năng ứng dụng các vi sinh vật như nhà máy tổng hợp hạt nano vẫn chưa được nghiên cứu đầy

đủ do sự đa dạng sinh học các chủng quá lớn[20] Hiện nay, các công bố chủ yếu tập trung ở 2 nhóm vi khuẩn và vi nấm

Dựa vào vị trí của các phân tử bạc nano được tổng hợp mà người ta chia quá trình tổng hợp sinh học thành hai dạng:

- Tổng hợp nội bào: sản phẩm tạo ra nằm bên trong tế bào

- Tổng hợp ngoại bào: sản phẩm được tạo ra nằm bên ngoài tế bào vi sinh vật

So với tổng hợp nội bào, thì hướng sinh tổng hợp ngoại bào có nhiều lợi thế hơn vì có thể thu lấy hạt bạc dễ dàng từ môi trường phản ứng

Bạc là kim loại gây độc đối với rất nhiều loài vi sinh Tuy nhiên, tự nhiên cũng phát triển cơ chế để kháng lại nguyên tố này Vi khuẩn đề kháng với kim loại nặng độc hại nhờ khả năng khử độc và các bơm ion đẩy ion độc ra khỏi tế bào chínhlà các protein nằm trên màng có khả năng vận chuyển cation ngược chiều nồng độ Khả năng thay đổi tính tan ion kim loại độc cũng đóng một vai trò trong việc kháng độc.Vì vậy, hệ thống vi sinh vật có thể giải độc các ion kim loại bằng cách kết tủa các ion vô cơ hòa tan độc hại thành cáccụm nano kim loại không hòa tan và không hại Quá trình khử độc ở vi sinh vật có thể được thực hiện bằng cách gây tủa ngoại bào, tiết tác nhân sinh học tạo phức với ion ngoại bào, tạo phức, kết tủa hoặc tích lũy sinh học bên trong tế bào Sinh tổng hợp ngoại bào các hạt nano kim loại có nhiều ứng dụng thương mại trong các lĩnh vực khác nhau

Một thách thức cần giải quyết của phương pháp này là hiện tượng tạo hạt kích thước không đồng đều Do đómối quan tâm lớn hiện nay là cần tối ưu hóa các điều kiện tạo kích thước hạt đồng đềutrong quá trình sinh tổng hợp.Trong trường hợp sản xuất nội bào, các hạt tích lũy có kích thước cụ thể và tình trạng kích thước không đồng đều íthơn [20]

Các ion Ag+ được vận chuyển vào trong tế bào vi khuẩn nhờ các kênh xuyên màng tế bào Bên trong tế bào, các ion này bị kết tủa nhờ các tác nhân sinh học Các tinh thể bạc nano có hình dạng đa giác, tam giác và lục giác với kích thước tối đa

200 nm tại vùng chu chất (vùng giữa 2 màng tế bào) đã được tìm thấy ở vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri AG259, một loại vi khuẩn phân lập từ mỏ bạc.Loài vi khuẩn

này cũng sản xuất một số lượng nhỏ các tinh thể α - silver sulfide acanthite (Ag2S)

Hình 1.9 Tinh thể bạc nano trong vi khuẩn Pseudomonasstutzeri AG259

Quá trình tạo phức bạc với tác nhân sinh học (biosorption) và khửAg+ bằng tác nhân sinh học (bioreduction)trên bề mặt tế bào cũng đã được báo cáo

ởLactobacillus sp A09 ở 30°C, pH 4,5 trong 24 giờ Tương tự như vậy, các tế bào

Corynebacterium sp SH09 sản xuất các hạt bạc nano ở 60°C trong 72 h trên vách tế

bào ở kích thước 10-15 nm với phức bạc diamine [Ag (NH3)2]+

Nhìn chung, độc tính của bạc được khử bằng cách nhờcác protein vùng chu chất kết dính bạc và neo chúnglên bề mặt tế bào và nhờ các bơm gắn trên màng tế bào đẩy bạc ra khỏi tế bào Các protein gắn bạc cung cấp nhóm chứcamino acid phục vụ như nhân tinh thể cho sự hình thành của các hạt bạc nano Các peptide kết

tủa bạc (AG3 và AG4) đã được tìm thấy, có khả năng kết tủa bạc từ dung dịch nước của các ion bạc và hình thànhtinh thể bạc có cấu trúc lập phương tâm mặt (fcc)

Cơ chế của quá trình tổng hợp bạc nano nội bào ở một số loài vi khuẩn như

B licheniformis vẫn chưa được xác định cụ thể Nhưng theo nhóm tác giả

Kalimuthu (2008) thì B licheniformis có khả năng tổng hợp NADH và các enzyme

phụ thuộc vào NADH ở bên trong tế bào của nó, trong đó quan trọng nhất là enzyme nitrate reductase Enzym này có vai trò khử gốc NO3- và vận chuyển electron từ chất cho electron là NADH đến chất nhận là Ag+

để khử Ag+ thành

Ag0[16]

Hình 1.10Cơ chế tổng hợp bạc nano ở vi khuẩn B.licheniformis [16]

ChủngBacillus sp phân lập từ bầu khí quyển cũng được tìm thấy để khử ion

Ag+thành Ag0 Loài vi khuẩn này tích lũy bạc kim loại kích thước 5-15 nm trong các vùng giữa vách và màng của tế bào Một số vi khuẩn đã được báo cáo sản xuất nhiều hơn một loại hạt nano và hợp kim hai kim loại Nair và Pradeep nhận thấy

rằng Lactobacillus sp trong bơ sữa sản xuất nano vàng, bạc, và các tinh thể hợp

kim vàng - bạc bên trong tế bào mà không gây ảnh hưởng khả năng tồn tại của chúng Tinh thể vàng được tìm thấy có kích thước 20-50 nm hình dạng lục giác, hình tam giác và đôi khi tạo cụm 100 nm Sinh tổng hợp nội bào các hạt nano vàng

và bạc bởi B subtilis,vi khuẩn khử sulfate, ShewanellaalgaePediastrum boryanum,

E coli, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp.,Pseudomonas stutzeri, Corynebacterium sp., Bacillus sp đã cho thấy hình dạng khác nhau nhƣ khối, lục

Loài: F oxysporum

Hình 1.11 Sợi nấm F oxysporum trên môi trường agar[31]

1.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh dƣỡng

Nấm F oxysporum là loại nấm sống trong đất và phân bố rộng rãi trong các

loại đất trồng trọt và đất cỏ, loài nấm này có hơn 100 dạng chuyển hóa và chủng nấm này gây bệnh héo cây đối với rất nhiều loại rau, chuối, hồ tiêu, cây họ dƣa và nhiều loài cây cảnh khác Tuy nhiên, có thể kiểm soát chủng gây hại này bằng các

tác nhân sinh học đối kháng như Trichoderma asperellum, Pseudomonas

putida,Bacillus thunringensis… Nấm phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25 - 30o

C[3]

Nấm F oxysporum có sợi đa bào, màu sắc tản nấm trắng phớt hồng, sinh sản

vô tính tạo ra hai loại bào tử lớn và bào tử nhỏ Bào tử lớn cong nhẹ một đầu thon nhọn, một đầu thon gãy khúc dạng bàn chân nhỏ, thường có 3 ngăn ngang Bào tử nhỏ đơn bào hình trứng, bầu dục dài hoặc hình quả thận được hình thành trong bọc giả trên cành bào tử không phân nhánh trên sợi nấm, trong khi đó bào tử lớn hình thành từ cành bào tử phân nhiều nhánh xếp thành tầng Nấm còn sinh ra bào tử hậu hình cầu, màng nhày màu nâu nhạt Kích thước bào tử lớn 35-50 x 3,5-5,5 m và bào tử nhỏ từ 9-10 m[3]

F oxysporum phát triển tốt trong môi trường PGA, Malt - Yeast Ban đầu sợi

nấm có màu trắng, xốp, sau 5 – 6 ngày sợi nấm chuyển dần sang màu hồng hay tím nhạt là lúc bào tử đã chín [3]

Hình 1.12Hình thái sợi đa bào, bào tử hình liềm và bào tử hình cầu của nấm

F.oxysporum

1.5.3 Cơ chế sinh tổng hợp

Quá trình khử dị hóa các kim loại độc như : Pb2+, Mn4+, U6+, Se6+, Cr6+,

Hg2+… và cả Au3+, Cu2+, Ag+ đã được quan sát ở nhiều chủng vi sinh, xảy ra nội bào (cơ thể sinh vật đưa kim loại vào trong cơ thể), đóng vai trò quan trọng đối với

môi trường, giúp cô lập các kim loại độc hại ra khỏi nguồn nước, nguồn đất Đây cũng là cơ sở của phương pháp khai khoáng sử dụng vi sinh vật

Durán và cộng sựcho rằng cơ chế tạo bạc nano ngoại bào ở F oxysporum có

liên quan đến enzyme khử phụ thuộc nitrate(nitrate - dependent reductase) thông qua trung gian naphthoquinone, và anthraquinone với đặc tính khuếch tán nổi bật, đóng vai trò con thoi electron (electron shuttle) vận chuyển electron đến các kim loại không tan nằm bên ngoài tế bào[11] Tuy nhiên, cho đến nay cơ chế sinh tổng hợp bạc nano này vẫn chưa được tìm hiểu đầy đủ

Ahmad và cộng sự còn chỉ ra rằng các peptide đóng vai trò như nhân tinh thể giúp quá trình tủa bạc tạo các hạt nano có dạng hình lục giác, hình cầu, và hình tứ diện[5] Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu để tìm hiểu rõ hơn về cơ chế

sinh tổng hợp bạc nano ở Fusarium và những vi sinh vật khác

Hình 1.13Giả thuyết về cơ chế quá trình sinh tổng hợp bạc nano ở F oxysporum [11]

1.6 Phương pháp xác định tính chất và kích thước hạt bạc nano

Một vấn đề thiết yếu trong việc nghiên cứu này là xác định và nghiên cứu các phần tử bạc nano Bước đầu tiên là xác định các hạt bạc nano có được tổng hợp nên hay không Thêm vào đó, mô tả đặc điểm của chúng để khảo sát kích thước, hình dạng, số lượng cũng quan trọng Một số thiết bị sử dụng xác định các tính chất lý-hóa của các vật liệu nano: kính hiển vi lực nguyên tử (Automic Force Microscopy – AFM), kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electro Microscopy – SEM), phổ hấp thụ (Absorbance Spectroscopy), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và sự phân tán ánh sáng động lực (Dynamic Light Scattering - DLS) Trong phạm vi luận văn này, hai phương pháp phổ UV-Vis và TEM được đề cập

1.6.1 Phương pháp quét phổ – UV-Vis

Phổ tử ngoại và khả kiến, viết tắt là UV-Vis (Ultraviolet-Visible) là phương pháp phân tích được sử dụng rộng rãi từ lâu

Phương pháp này dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biết cấu trúc các chất, phân tích hỗn hợp, xác định khối lượng phân tử, dự đoán kích thước phân tử … khi tiến hành đo phổ của các mẫu thì mỗi mẫu sẽ cho ta một dạng phổ có chiều cao mũi phổ xác định và đặc trưng cho dạng hợp chất đó Trong trường hợp dịch chứa Ag, khi đo phổ hấp thu của dung dịch bạc ta sẽ thu được dạng phổ có đỉnh hấp thu cực đại ứng với bước sóng khoảng 400 - 450 nm, nhưng nếu kích thước hạt nano quá nhỏ, tính chất lượng tử của vật liệu tăng thêm, hấp thu được bước sóng có năng lượng cao hơn, vùng đỉnh hấp thu có thể bị thu ngắn lại (380nm- 420nm), đó là trường hợp của những hạt bạc nano do sinh tổng hợp[5], [6], [7] Từ kết quả đó ta sẽ xác định được sơ bộ rằng ta đã chế tạo ra dung dịch bạc nano và cũng dự đoán được kích thước hạt bạc nano theo các công trình công bố

1.6.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua

Kính hiển vi điện tử truyền qua - Transmission Electron Microscopy (TEM)

là một công cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ nano Nó cho phép quan sát chính xác cấu trúc nano với độ phân giải lên đến 0,2nm Do đó, phương