nghiên cứu sản xuất limo ni trích từ hạt neem azadirachtin indica dùng để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đồng thời nâng cao hiệu quả phân đạm và thương mại hóa sản phẩm

Mục tiêu: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Limo NI Nitrification inhibitor trích từ hạt neem Azadirachta indica L.Juss dùng bao phân đạm, để khi bón vào đất phần lớn phân đạm không bị thất

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG 6

DANH SÁCH HÌNH 7

PHẦN MỞ ĐẦU 8

I TỔNG QUAN 11

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI 11

1.1.1 Đặt vấn đề 11

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 13

1.1.4 Tính cần thiết của đề tài 14

14

1.2.1 Giới thiệu về cây neem 14

1.2.2 Hoạt chất limonoid trong cây neem 17

19

II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT NEEM VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ARL KHỬ MẠNH NHẤT VI SINH VẬT NITRIT HÓA PHÂN ĐẠM 20

2.1.1 Mô tả nội dung 20

2.1.2 Phương pháp 20

2.2 NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ CHẾ PHẨM LIMO NI 24

2.2.1 Nội dung và phương pháp 24

2.2.2 Thử độ bền nhiệt và bền nhũ của Limo NI 25

2.3 NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT 25

2.3.1 Mô hình thử nghiệm 25

2.3.2 Chỉ tiêu theo dõi 25

2.3.3 Phương pháp 25

2.4 NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ

ĐO LƯỢNG NITRAT BỊ THẤT THOÁT 26

2.4.1 Thay đổi tỷ lệ trộn Limo NI và urê 26

2.4.2 Đo hàm lượng nitrat đối với mỗi nghiệm thức 26

2.5 NỘI DUNG 5: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU 26

2.5.1 Mô hình thử nghiệm 26

2.5.2 Phương pháp thử nghiệm 26

2.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÀM TĂNG NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG CỦA LIMO NI – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ XÁC ĐỊNH NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG DƯA CHUỘT, CẢI NGỌT) 27

2.6.1 Mô hình thử nghiệm 27

2.6.2 Phương pháp thử nghiệm 28

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT NEEM AZADIRACHTA INDICA 29

3.1.1 Ly trích hoạt chất ARL trong hạt neem 29

3.1.2 Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp 34

3.1.3 Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp theo phương pháp kháng sinh đồ 39

3.2 NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ LIMO NI 47

3.2.1 Ly trích 3 hoạt chất azadirachtin, salannin, nimbin trong nhân hạt neem 47

3.2.2 Điều chế chất làm bền ESO 55

3.2.3 Điều chế chất tạo nhũ sucroester 58

3.2.4 Lập công thức pha chế Limo NI bền nhiệt và bền nhũ 60

3.2.5.Giá thành sản phẩm 66_Toc387343560 3.2.6 Xác định LD50 của hoạt chất ARL trong Limo NI đối với chuột bạch 69

3.3 NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT 70

3.3.1 Mô hình thử nghiệm 70

3.3.2 Định lượng nitrat 70

3.4 NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ

ĐO LƯỢNG NITRAT BỊ THẤT THOÁT 72

3.4.1 Mô hình thử nghiệm 72

3.4.2 Kết quả định lượng nitrat 72

3.5 NỘI DUNG 5: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU 75

3.5.1 Xây dựng mô hình thử nghiệm 75

3.5.2 Kết quả thử nghiệm 77

3.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÀM TĂNG NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG CỦA LIMO NI – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ VÀ XÁC ĐỊNH NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG (DƯA CHUỘT, CẢI NGỌT) 79

3.6.1 Xây dựng mô hình thử nghiệm 79

3.6.2 Kết quả thử nghiệm 84

3.6.3 Hiệu quả kinh tế 88

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 91

1 - ………97

13 - ……… 98

1 - ……….99

13 - azadirachtin……… 100

……… 101

5b salannin T salannin ………101

……… … 102

……… 103

……… 104

= f(c ……….….105

……… 106

……106

……….107

(SGT)… 108

……… 109 /urê (%) ……….110 /urê (%) … 111

Colony Forming Unit Collaborative International Pesticides Analytical Council Máy cộng hưởng từ hạt nhân phổ 13C

Dung dịch Environment Protection Agency Epoxidised Soybean oil

Máy khối phổ bắn phá tự do nguyên tử Máy cộng hưởng từ hạt nhân phổ 1H Máy sắc ký hiệu năng cao, ghép máy quang phổ tử ngoại Máy khối phổ có độ phân giải cao

Lethal dose Limonoid Nitrification Inhibitor Nimbin

Nguyên vật liệu Octadecyl silica gel Peak area

Retention time Salannin Cột sắc ký tách chất rắn Sau gia tốc

Trích ly Trước gia tốc Máy quang phổ tử ngoại hiệu Cary 50

Vi sinh vật

Bảng 3.1: Thuốc thử biệt tính để xác định các nhóm chứa hóa học

Bảng 3.2: Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của 5 loại cao TL

Bảng 3.3 : Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrosomonas sp

Bảng 3.4: Mật độ chủng Nitrosomonas sp thay đổi theo thời gian nuôi cấy ở

pH = 7 và t o = 30 o C

Bảng 3.5: Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrobacter sp

Bảng 3.6: Mật độ chủng Nitrobacter spsau 5 ngày nuôi cấy ở pH = 7 và t o

theo tỷ lệ bao Limo NI/urê

Bảng 5.1: Hàm lượng c(N) và c(NO 3 – ) trong cây cải ngọt thay

đổi theo tỷ lệ bao NI/urê

Bảng 5.2: Hàm lượng c(N) và c(NO 3 – ) trong trái dưa chuột thay

đổi theo tỷ lệ bao NI/urê

Bảng 6.1: Một số chỉ tiêu về thời tiết, khí hậu trong vụ Hè Thu 2013 tại

Ninh Thuận

Bảng 6.2: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến chiều cao và số lá của cây

cải ngọt thay đổi theo số ngày sau gieo hạt (NSG)

Bảng 6.3: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến năng suất thu hoạch

của cây cải ngọt

Bảng 6.4: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến năng suất thu hoạch

Hình 3.2 : Máy ép dầu neem

Hình 3.3 : Trích hoạt chất ARL trong bánh neem trong hình Soxhlet

Hình 3.4 : Tách dung môi trong máy cô quay dưới áp suất thấp

Hình 3.5: Hình dạng khuẩn lạc Nitrosomonas sp

Hình 3.6: Hình dạng khuẩn lạc Nitrobacter sp

Hình 3.7: Đường kính vòng vô khuẩn của ARL1, ARL4, ARL5 đối với chủng

Nitrosomonas spso với mẫu trắng

Hình 3.8: Đường kính vòng vô khuẩn của ARL1, ARL4, ARL5 đối với

chủngNitrobacter sp so với mẫu trắng

Hình 3.9: Quy trình ly trích azadirachtin trong nhân hạt neem

Hình 3.10: Máy HPLC-UV dùng để đo hàm lượng azadirachtin

Hình 3.11: Quy trình ly trích salannin trong nhân hạt neem

Hình 3.12: Máy UV Cary 50 dùng để đo hàm lượng salannin, nimbim và

ARL

Hình 3.13 Quy trình ly trích nimbin trong nhân hạt neem

Hình 3.14: Quy trình điều chế ESO

Hình 3.15: Quy trình điều chế sucroester

Hình 3.16: Dung dịch nhũ dầu trong nước (o/w) của Limo NI

Hình 3.17: Thùng thử nghiệm đo nitrat trong nước

Hình 3.18: Chảo quay bao urê với Limo NI

Hình 5.1: Hình cây cải ngọt được bón phân Limo NI/urê 0,6% và Limo NI/

urê 0% đối chứng

Hình 5.2: Hình cây dưa chuột được bón phân Limo NI/urê 0,6% và Limo

NI/ urê 0% đối chứng

Hình 6.1: Hình cây cải ngọt được bón phân Limo NI/urê 0,6%, 0,4% và 0%

23 0% đối chứng

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tên đề tài:Nghiên cứu sản xuất Limo NI trích từ hạt neem Azadirachta indica

dùng để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đồng thời nâng cao hiệu quả phân đạm và thương mại hóa sản phẩm

Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Trần Kim Qui

Cơ quan chủ trì : Viện Công Nghệ Hóa Sinh ứng dụng

Thời gian thực hiện đề tài: 18 tháng (từ tháng 01/2012 đến tháng 7/2013)

Kinh phí được duyệt: 580.000.000đ

Kinh phí đã cấp: 350.000.000đ theo TB số: 180/TB-SKHCN ngày 15/12/2011

: 172.000.000đ theo TB số: 25/TB-SKHCN ngày 31/10/2013

2 Mục tiêu:

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Limo NI (Nitrification inhibitor) trích từ hạt neem

Azadirachta indica L.Juss dùng bao phân đạm, để khi bón vào đất phần lớn phân đạm không

bị thất thoát dưới dạng nitrat làm ô nhiễm môi trường, như thế nâng cao được hiệu quả sử dụng phân đạm

3 Nội dung nghiên cứu:

 Chiết xuất hoạt chất limonoid ARL trong hạt neem Azadirachta indica dùng để sản xuất chế phẩm Limo NI

 Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm giảm lượng nitrat hòa tan trong nước gây ô nhiễm nguồn nước

 Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm giảm lượng nitrat được cây trồng hấp thu gây ô nhiễm nguồn thực phẩm

 Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm tăng năng suất một số cây trồng như dưa chuột, cải ngọt… do làm tăng hiệu quả sử dụng phân đạm

3.1 Những nội dung thực hiện ở giai đoạn 1 (đối chiếu với hợp đồng đã ký)

1 Nghiên cứu ly trích hoạt chất ARL trong

hạt neem Azadirachta indica

Xác định được 3 hoạt chất ARL trích từ hạt neem có tác dụng khử mạnh nhất VSV nitrit hóa phân đạm

2 Nghiên cứu xác định công thức điều chế

chế phẩm Limo NI

Chế phẩm Limo NI với 3 hoạt chất ARL

có tính bền nhiệt và tạo nhũ tốt

3 Xây dựng mô hình thử nghiệm do lượng

nitrat hòa tan trong nước thấm sâu vào

đất

Thiết kế mô hình thử nghiệm dùng để đo hàm lượng nitrat thất thoát và thấm vào đất

4 Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI

với urê và đo lượng nitrat bị thất thoát

Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm giảm thấp nhất lượng nitrat bị thất thoát

5 Viết báo cáo giám định và giám định đề

1 Xây dựng mô hình thử nghiệm đo lượng

nitrat được cây trồng hấp thu

Xây dựng mô hình thử nghiệm đo lượng nitrat được cây trồng hấp thu

2 Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI

với urê và đo lượng nitrat được cây trồng

hấp thu

Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm giảm thấp nhất lượng nitrat được cây trồng hấp thu

3 Xây dựng mô hình thử nghiệm xác định

khả năng làm tăng năng suất cây trồng

của Limo NI

Mô hình thử nghiệm dùng để đo khả năng làm tăng năng suất cây trồng của Limo NI

4 Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI

với urê và xác định năng suất cây trồng

(dưa chuột, cải ngọt)

Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm tăng cao nhất năng suất cây trồng (dưa chuột, cải ngọt)

5 Nghiệm thu đề tài cấp cơ sở Báo cáo được Hội đồng nghiệm thu cấp cơ

sở thông qua

6 Nghiệm thu đề tài cấp thành phố Báo cáo được Hội đồng nghiệm thu cấp

thành phố thông qua

4 Sản phẩm của đề tài

1 Báo cáo tổng hợp Đạt yêu cầu của một báo cáo khoa học, đạt

mục tiêu đề xuất của đề tài

Đảm bảo các yêu cầu của Sở KH&CN

2 Phương pháp ly trích và định lượng hoạt

chất limonoid trong hạt neem

Phương pháp có tính khoa học, dựa vào các quang phổ kế hấp thu hiện đại như HPLC-UV, NMR1H, 13C

3 Quy trình công nghệ điều chế Limo NI Chế phẩm NI có những tính chất sau:

 Hàm lượng hoạt chất tan trong CH3OH

≥ 15%

 Tỷ trọng d = 0,91 – 0,98 g/cc

 Hàm lượng C% > 70 (w/w)

 Ẩm độ M% ≤ 20 (w/w)

4 Báo cáo kết quả xác định chế phẩm Limo

NI làm giảm lượng nitrat hòa tan trong

nước và trong rau đồng thời tăng năng

suất cây trồng (dưa chuột, cải ngọt)

Kết quả phân tích có độ chính xác cao, xác định được:

 Tỷ lệ bao Limo NI/urê để hàm lượng nitrat trong nước và trong rau thấp nhất, giảm thiểu ô nhiễm môi trường

 Lương urê bao Limo NI sử dụng thấp hơn nhưng năng suất tăng cao hơn so với đối chứng

5 Báo cáo khoa học Đăng trên tạp chí trong nước, hội nghị

khoa học trong nước và quốc tế

urease

Chỉ có một phần nhỏ NH3 được cây trồng hấp thu dưới dạng NH4+, còn phần lớn

NH3 bị thất thoát do bốc hơi vào không khí và bị nitrit hóa thành nitrit NO2– do các vi khuẩn

Nitrosomonas sp trong đất,sau đó thành nitrat NO3- do vi khuẩn Nitrobacter sp theo các

phương trình sau đây: [4,5,6]

NH3 NH2OH NO2–

NO2–NO3–

Nitrosomonassp là một loại vi khuẩn hóa tự dưỡng hình cầu, một ít hình bầu dục,

hoạt động háo khí biến NH4+ và NH3 thành NO2– trong điều kiện to= 20-35oC và

pH=6,0-9,0 Nitrosomonas sử dụng điện tử sinh ra trong phản ứng oxid hóa để tạo ra năng lượng và

hấp thu CO2 để cấu tạo tế bào [7,8]

Nitrobactersp cũng là một vi khuẩn hóa tự dưỡng háo khí hình cầu sống cộng sinh với Nitrosomonassp, oxid hóa NO2– thành NO3– ở nồng độ oxy ≥ 0,5ppm, to= 30-40oC, pH=7,5-8,5 [9,10]

Nitrat có tính hòa tan tốt trong nước nên một phần nitrat sinh ra bị nước kéo theo thấm sâu vào đất làm ô nhiễm nguồn nước ngầm; một phần nitrat khác được cây trồng hấp thu làm ô nhiễm nguồn thực phẩm [11, 12] VSV khử nitrit dùng nguồn C làm thực phẩm để sống và hấp thu oxy trong các hợp chất nitrat để hoạt động và phát triển Phản ứng khử nitrit xảy ra mạnh nhất trong điều kiện háo khí ở pH=7,0-8,5 , to=5-30oC [13,14]

Nitrat vào cơ thể con người từ nguồn thực phẩm và nước uống, trong hệ tiêu hóa nitrat được khử thành nitrit là chất chuyển hemoglobin trong máu thành chất methemoglobin không hoạt động làm giảm hô hấp của tế bào và ảnh hưởng đến hệ tuyến

Nitrobacter sp Nitrosomonas sp

giáp, gây đột biến và phát triển khối u dẫn đến bệnh ung thư.Theo WHO và cộng đồng kinh

tế Châu Âu, giới hạn hàm lượng nitrat trong thực phẩm và nước uống là 50ppm [15,16]

Quá trình phân giải phân đạm trong đất do VSV kết thúc trong vòng 15 – 20 ngày, trong lúc này cây trồng chỉ có thể hấp thu được khoảng 45 – 50% lượng phân đạm bón vào đất dưới dạng NH4+

, phần còn lại bị thất thoát vào không khí dưới dạng NH3, N2 và dưới dạng NO3-trong đất làm ô nhiễm môi trường nước và thực phẩm [17,18]

Sơ đồ chu trình phân giải phân đạm trong đất:

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhằm giảm thất thoát phân đạm làm ô nhiễm môi trường và gây ra nhiều vụ ngộ độc

và bệnh hiểm nghèo như bệnh ung thư , một số nhà nghiên cứu trong nước đã điều chế phân nhả chậm để điều chỉnh lượng phân đạm cung cấp cho cây trồng Theo hướng này có các nhà nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ Hóa học Tp.Hồ Chí Minh đã tổng hợp được phân bón ure formaldehyd (UF) với tỷ lệ ure và formaldehyd thay đổi Kết quả cho thấy sản phẩm

UF nhả nitơ chậm hơn và đều hơn so với ure đối chứng, lượng nitơ nhả ra càng chậm khi hàm lượng formaldehyd trong UF càng cao[29]

Năm 2004, chất Agrotain [25,26] được đưa từ Mỹ sang Việt Nam Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long khảo nghiệm Agrotain trên cây lúa ở Cần Thơ và Sóc Trăng, Viện KHKTNN miền Nam cũng khảo nghiệm trên cây lúa và các cây trồng cạn như dưa chuột, mướp đắng, cải bẹ xanh ở các tỉnh miền Đông Kết quả cho thấy nếu phối trộn Agrotain vào ure để bón cho cây trồng thì giảm được khoảng 25-30% lượng ure mà năng xuất cây trồng vẫn cao hơn đối chứng (tức cây trồng bón đủ 100% urê) Với những kết quả khảo nghiệm

NO2– Nitrobacter sp NO3– Hòa tan trong nước Phân đạm urease NH3

Thất thoát vào không khí

Nitrosomonas sp

NH4+

Cây trồng hấp thu

(nitrat)

Thấm sâu vào đất (nitrit)

nói trên Công ty Phân bón Bình Điền ở huyện Bình Chánh Tp Hồ Chí Minh nhập độc quyền Agrotain từ công ty Agrotain International LLC (Mỹ) để phối chế ra phân bón NPK đầu trâu TE+ Agrotain và phân đạm hạt vàng 46A+ bán ra thị trường từ năm 2010 [30] Nhưng do giá bán cao nên không được nông dân ưa chuộng

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Để giải quyết các vấn đề thất thoát phân đạm trong đất dưới dạng NO3– làm ô nhiễm môi trường nước và thực phẩm đồng thời làm giảm lượng phân đạm sử dụng, nhiều nhà hóa học trên thế giới đã nghiên cứu dùng 1 trong 2 biện pháp sau đây:

– Khử enzyme urease để ngăn chặn quá trình thủy giải phân đạm trong đất

– Khử các chủng vi sinh vật Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp để ngăn chặn các quá

trình nitrit hóa NH4+ và NH3 do phân đạm sinh ra trong đất

Nhiều hóa chất đã được tổng hợp để trộn vào phân đạm nhằm khử enzyme urease hoặc khử các vi sinh vật gây ra quá trình nitrit hóa NH4+ và NH3 Một số hóa chất đã được thử nghiệm có kết quả tốt và đang được thương mại hóa trên toàn thế giới như:

 Nitrapyrin tên hóa học 2-chloro-6-(trichloromethyl) pyridine do Công ty Dow Chemical sản xuất, được cơ quan Bảo vệ Môi trường (EPA) Mỹ cho phép sử dụng trên toàn liên bang dùng để khử các VSV nitrit hóa [19]

 Dicyandiamide (DCD) tên hóa học dicyanodiamide do Công ty SKW Trostberg

AG (Anh) sản xuất dùng để khử các VSV nitrit hóa [20,21,22]

 DMPP tên hóa học 3,4-dimethylpyrazole phosphate do Công ty The International Fertilizer (Mỹ) sản xuất dùng để khử các VSV nitrit hóa [23,24]

 nBTPT còn gọi Agrotain, tên hóa học N-(n-butyl)thiophosphoric triamide do Công

ty Summit-Quinphos Ltd (Mỹ) sản xuất dùng để khử enzyme urease [25,26]

Trong những năm gần đây một số nhà hóa học Ấn Độ ly trích hoạt chất từ hạt neem

Azadirachta indica dùng để ngăn chặn sự nitrit hóa phân đạm do vi sinh vật trong đất Kết

quả là đã giảm được khoảng 10% phân đạm bón vào đất mà năng xuất cây trồng lại tăng khoảng 10–15% [27]

Công ty phân bón NICO ORGO của Ấn Độ nghiên cứu sản xuất chế phẩm N–Guard

với hoạt chất trích từ cao hạt neem Azadirachta indica để bao phân đạm theo tỷ lệ 0,6%, kết

quả là đã giảm được lượng phân đạm sử dụng khoảng 25% mà năng xuất cây trồng trong 3 mùa vụ tăng đến 55% Kết quả này được công bố tại Hội nghị Quốc tế về "Các biện pháp nâng cao hiệu quả sử dụng phân bón" tổ chức tại Miami, FL, USA tháng 3 năm 2010 [28]

1.1.4 Tính cần thiết của đề tài

Như đã trình bày trên đây, phân đạm đặc biệt urê một loại phân bón quan trọng nhất được nông dân sử dụng để tăng năng suất cây trồng Nhưng khi bón vào đất, phân đạm này

bị các enzym thủy phân urease và cặp vi khuẩn nitrit hóa Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp

tác dụng sinh ra nitrat NO3– làm thất thoát khoảng 45-50% lượng phân đạm trong thời gian ngắn khoảng 15-20 ngày, làm ô nhiễm nguồn nước ngầm do có chứa nhiều chất nitrat sinh

ra các bệnh như ung thư… đồng thời làm ô nhiễm nguồn thực phẩm do làm tăng hàm lượng nitrat trong các loại rau, củ, quả dẫn đến nhiều chứng bệnh khác về gan, thận… rất nguy hại [15,16]

Mặc khác, chu kỳ sinh trưởng của cây trồng thường kéo dài từ 30-100 ngày mà phân đạm chỉ có thể tồn tại trong đất khoảng 15 ngày nên cây trồng chỉ sử dụng được khoảng 50-55% lượng đạm bón vào đất trong thời gian ngắn 15 ngày ban đầu, sau đó cây trồng không còn đạm để sử dụng Người nông dân phải mua một lượng lớn phân đạm, giá ngày càng tăng để bón thêm mà năng suất cây trồng vẫn không cao như mong muốn Nhà nước cũng phải bỏ ra một lượng lớn ngoại tệ để nhập siêu mỗi năm hơn 3 triệu tấn phân urê và các loại phân đạm khác

Với mục đích nâng cao hiệu quả sử dụng phân đạm đồng thời bảo vệ môi trường nhiều nhà hóa học trên thế giới đã tổng hợp một số hóa chất có giá thành cao để khử cặp vi khuẩn nitrit hóa phân đạm như Nitrapyrin, DCD, DMPP nói ở phần trên nhưng bản thân các hóa chất này cũng làm ô nhiễm không ít môi trường nước, đất và cũng không phải hoàn toàn

vô hại đối với các vi sinh vật hữu ích trong đất Một số nhà khoa học Ấn Độ đã nghiên cứu

sử dụng hoạt chất ly trích từ hạt neem để điều chế chất N-Guard nhằm khống chế sự nitrit

hóa do cặp vi khuẩn Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp, nhưng các tác giả này cũng chỉ

công bố tác dụng của N-Guard là đã giảm được 25% lượng phân đạm sử dụng và năng xuất cây trồng tăng được khoảng 5–15% Các vấn đề khác như phương pháp điều chế, thành phần của chế phẩm N-Guard và nhất là các tác động tích cực của N-Guard đến môi trường thì không được đề c p đến Trong nước ta thì chưa ai nghiên cứu vấn đề này

Do đó việc nghiên cứu sản xuất một chế phẩm từ cây neem như các nhà khoa học Ấn

Độ đang làm,nhằm ngăn chặn sự nitrit hóa phân đạm sinh ra chất NO3– gây ô nhiễm môi trường đất, nước và nguồn thực phẩm, đồng thời làm tăng năng suất cây trồng và giảm lượng phân đạm sử dụng là rất cần thiết đối với chúng ta hiện nay

1.2

1.2.1 Giới thiệu về cây neem

Cây neem tên khoa học Azadirachta indica A Juss, họ xoan (Meliaceae) xuất xứ từ

Ấn Độđược trồng đại trà thành rừng khắp nước này và là nguồn l i rất lớn cho Ấn Độ [31]

Neem là cây thân gỗ to, cao 5-10 m, ở điều kiện thích hợp đạt độ cao khoả

- chịu hạn tốt Nó là loại cây có lá xanh quanh năm, phát triển tốt ngay trên đất cát nghèo kiệt, khô cằn

Cây có nhánh rộng, tán lá hình oval hay tròn đường kính khoảng 15-20 cm

Thân cây ngắn, thẳng, vỏ cây cứng, xù xì, có nhiều rãnh nứt, bên ngoài màu xám và

đỏ lợt bên trong, có mùi tỏi, vị rất đắng Đặc điểm bên ngoài và độ dày của vỏ phụ thuộc vào tuổi của cây và điều kiện môi trường Vỏ thân cây non thường nhẵn, màu xanh nhạt pha đồng, có độ dày khoảng 1,25-2,5 cm

Lá neem thuộc loại lá kép lông chim một lần, dạng mác, bìa lá có khía hình răng cưa, cuống lá ngắn Cây ra lá non vào tháng 3 – 4 và bộ lá thường xanh tốt quanh năm, không có thời kỳ rụng lá

Hoa mọc thành chùm ở nách lá, màu trắng, hương thơm, cuống ngắn và có 5 cánh Hoa lưỡng tính và hoa đực có thể xuất hiện trên cùng một cây, cánh hoa rời, xếp lớp, phủ đầy lông mịn Ống nhụy hình trụ, cao khoảng 3 – 5mm, miệng hơi loe Ở Sri Lanka, Ấn Độ

và Việt Nam, cây thường ra hoa từ tháng 3 đến tháng 4 Tuy nhiên ở vài vùng của Ấn Độ, cây có thể ra hoa quanh năm

Trái neem có hình bầu dục, trơn láng và dài khoảng 2cm Trái hình thành, phát triển

và chín trong vòng 1 – 2 tháng Thời điểm thu hoạch trái tốt nhất là lúc trái vừa chuyển sang màu xanh vàng và nên hái trái khi còn trên cây không để trái rụng xuống đất chất lượng bị giảm Cây trưởng thành mỗi năm có thể cho 30 – 50kg trái Thông thường, trái chín từ tháng

6 đến tháng 8 Mỗi hecta có thể trồng từ 100 – 200 cây, sản lượng trái hàng năm khoảng 5 –

Tại một số vùng ở Ấn Độ, nông dân thường cho gia súc ăn lá neem sau khi sinh con

để gia tăng sự tiết sữa Ngoài ra, lá neem còn có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho gia súc, kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh cho người, gia súc và cây trồng do lá có chứa nhiều hợp chất như nimbin, nimbinene, nimbandiol, nimbolide, quercetin… Nhiều nơi lá neem non còn được dùng làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột ( Srivastav và ctv, 1998)

* Trái: Trái neem khi chín có vị ngọt, có thể ăn được hoặc sử dụng trong công nghệ

lên men Trái neem được làm thuốc tẩy giun, thuốc giảm đau và thuốc trị bệnh đường tiết

niệu, bệnh trĩ Quả khô ngâm nước có thể trị một số bệnh ngoài da Nước thịt quả khi phun lên cây có thể xua đuổi nhiều côn trùng, đặc biệt rất hữu hiệu đối với châu chấu

* Nhân: Nhân hạt neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như azadirachtin,

salanin, nimbin, meliantriol… Dầu chiết từ nhân hạt neem được dùng để sản xuất thuốc giảm đau, thuốc sát trùng và thuốc ngừa thai Ngoài ra, dầu hạt neem còn được sử dụng trong ngành mỹ phẩm, xà phòng và nhiều công nghiệp khác Tại Ấn Độ và Sri Lanka, khoảng 25% hạt neem được sử dụng cho ngành dược, số còn lại được dùng làm thuốc trừ sâu

* Bánh dầu neem: Bánh dầu neem chứa khoảng 1,00 – 1,40% hợp chất sulfur,

khoảng 1,5 – 2,5% N, khoảng 0,7 – 1,2% P2O5 và 1,2 – 1,5% K2O Bánh dầu neem là nguồn phân hữu cơ rất tốt, vừa cung cấp chất dinh dưỡng cho cây, vừa diệt được các loại tuyến trùng, kiến mối trong đất và có khả năng ức chế quá trình nitrat hóa trong đất làm tăng hiệu quả sử dụng đạm của đất trồng Theo Rao (1993), khi bón phân ure trộn với dầu neem, mức

hấp thụ đạm, lân và kali ở cây cỏ hương (Cymbopogon winterianus Jowitt.) tăng theo thứ tự

17, 15 và 25% so với khi chỉ bón phân ure Lượng đạm mất do bay hơi NH3 cũng giảm 31%

* Vỏ cây: Dịch chiết từ vỏ cây neem được dùng làm thuốc chữa đau răng, trị bệnh sốt

rét, bệnh vàng da hoặc dùng để nhuộm lụa Vỏ cây có chứa nimbin, nimbidin, nimbinin nên cũng được dùng để điều chế thuốc bảo vệ thực vật và một số thuốc trị bệnh ngoài da

Từ năm 1960, cây neem đã nổi tiếng trên khắp thế giới do từ cành, lá và hạt neem các nhà hóa học đã trích được một số hoạt chất limonoid có tác dụng gây ngán ăn và xua đuổi côn trùng rất có hiệu quả Các loại thuốc bảo vệ thực vật như Neemgold, Margocide CK… điều chế từ cây neem rất được ưa chuộng ở Ấn Độ Nhiều nước trên thế giới đã mang cây neem về trồng trên đất nước họ để sử dụng Hai sản phẩm Neem Azal và Neem Azal F sản xuất từ cây neem tại Đức được bán khắp châu Âu Năm 1975, Bộ Nông nghiệp Mỹ đã xây dựng kế hoạch trồng cây neem trên khắp nước Mỹ Đến năm 1985, Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ đã cho phép bán ra trên khắp nước Mỹ hai loại thuốc bảo vệ thực vật trích ly từ

lá và hạt cây neem với tên thương mại Margosan-O và Izatin Từ năm 1985, Bộ Nông nghiệp Nhật, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc cũng đã đưa cây neem về trồng và đến nay họ cũng đã sản xuất ra nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật và thuốc trị bệnh cho người, gia súc, gia cầm Hai chế phẩm Yu Teng và Ku Seng chiết xuất từ hạt neem để xua đuổi côn trùng rất được nông dân Trung Quốc ưa chuộng

Từ năm 1980 đến nay đã có 8 hội nghị khoa học quốc tế về cây neem tổ chức tại CHLB Đức (lần 2, 1983), Pakistan (1986), Kenya (lần 3, 1987), Mỹ (1992), Ấn Độ (1993), Philippin (IRRI,1994), Úc (1996), Anh(1999) Họ đã khẳng định giá trị của cây neem trong lĩnh vực thuốc bảo vệ thực vật, diệt trừ sâu mọt, nấm mốc và trị bệnh cho người Đến nay

người ta đã xác định được trên 150 limonoid trong cây neem, trong đó có khoảng 30 chất có cấu trúc và tác dụng tương tự như azadirachtin Các limonoid chỉ gồm các nguyên tố C, H,

O, N không có Cl, P và các nhóm có độc tính khác nên không hại đối với người và gia súc gia cầm, không làm ô nhiễm môi trường và không có dư lượng độc trong rau quả như các loại thuốc trừ sâu tổng hợp

Cây neem ở nước ta được GS Lâm Công Định mang hạt giống từ Senegal về trồng từ năm 1993 trên các vùng đất khô cằn Tuy Phong tỉnh Bình Thuận Đến nay tỉnh Ninh Thuận

đã trồng được khoảng 4.700 ha cây neem làm rừng phòng hộ và có kế hoạch đến năm 2015 trồng được 7.000 ha Cây neem ở 2 tỉnh Bình Thuận và Ninh Thuận phát triển tốt, hàng năm

có thể cho trên 10.000 tấn trái và hơn 15.000 tấn cành lá để đưa ra sản xuất

1.2.2 Hoạt chất limonoid trong cây neem [32,33,34]

Hoạt chất đầu tiên có tác dụng gây ngán ăn cho loại châu chấu Schistocerca gregaria

được 2 nhà hóa học Morgan và Butterworth ly trích từ năm 1968 và đặt tên là azadirachtin (AZ) Kết quả thử nghiệm sau đó cho thấy azadirachtin ở nồng độ 50ppm gây ngán ăn cho

loài Earias fabia (Phytoparasiteca 9/1, 27, 1981), ở nồng độ 5 – 10 ppm ngăn chặn sự phát triển của loài Spodoptera litura (Indian J Exp Biol, 23(3), 16,1985) và ở nồng độ 10 – 100 ppm ngăn chặn sự phát triển và sự sinh sản của loài Epilachna verivestis (Z Angew

Entomol, 93, 12, 1982) LD50 của azadirachtin đối với S.litura là 1,1 γ/g (J Entomol Res

11/2, 166, 1987) Tác dụng lưu dẫn của azadirachtin từ rễ đến lá cũng được Saxena và ctv chứng minh (J Econ Entomol 77/2, 502, 1984)

Từ đó đến nay có gần 100 tetranortriterpenoid (limonoid) trong đó có khoảng 30 dẫn xuất của azadirachtin được cô lập từ các dịch trích của cây neem được gọi tên chung là ARL (Azadirachtin related limonoid)

azadirachtin A, B, D, E, F, G, H, I, K, L nồng độ 1 – 10 ppm có tác dụng ngăn chặn sự phát

triển đối với Epilachna verisestis (Insectisides of Plant Origin ACS Symposium series, 387,

150, 1989), azadirachtin do Morgan và Butterworth trích ra trước đây nay được gọi là azadirachtin A 3-Tigloylazadirachtol nồng độ 1 ppm có tác dụng gây ngán ăn 97% nhiều

loại côn trùng (Tetrahedron 45, 5175, 1989) Các hợp chất khác đều có ít nhiều tác dụng

gây ngán ăn, diệt sâu bọ hay xua đuổi hoặc ngăn chặn sự phát triển và sự sinh sản của côn trùng (Proceeding, 3rd International Neem Conference, 1997)

Ngoài ra, các chế phẩm neem chứa limonoid còn có tác dụng diệt được vi khuẩn và nấm bệnh hại cây trồng Nhiều thí nghiệm chứng tỏ dầu neem có tác dụng bảo vệ các loại

đậu chống các loại nấm bệnh như Rhizocionia solani, Sclerotium solfsii, Sclerrotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum Bánh dầu neem trộn trong đất diệt được nấm R solani

Dịch trích hạt neem có tác dụng trị được các bệnh nấm lá Dịch trích dầu neem trị được các

loại mốc sương trên cây (tốt hơn thuốc diệt nấm Benlat) và trị được 90% bệnh rỉ sét và bệnh cháy lá

Dịch trích lá neem có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium equiseti, F semitectum, Aspergillus flavus, A.niger và nấm bệnh gây bệnh cháy lá lúa Pyricularia oryzae (Rajeswari and Mariappan, 1993)

Loại vi nấm rất dễ lây lan do nhiều loại côn trùng nhiễm vi nấm mang từ nơi này sang nơi khác Đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị Các chế phẩm neem cho kết quả khá tốt

Một số thí nghiệm ở Philippines cho thấy khi phun dung dịch dầu neem trên cánh đồng lúa bị nhiễm vi nấm hoại sinh, sau 3 ngày các cây lúa dần dần hồi phục

Một số thí nghiệm ở Ấn Độ cho thấy dịch trích lá neem có thể ngăn chặn sự lây lan của vi nấm gây bệnh đốm lá trên vườn rau quả

Chế phẩm neem chứa ARL diệt được nhiều loại tuyến trùng trong đất Điều này rất có

ý nghĩa vì tuyến trùng rất khó trị, một số thuốc tổng hợp trị tuyến trùng đều rất độc nên bị cấm sử dụng ở nhiều nơi

Theo Siddiqui và Alam (1985) dịch trích từ lá, trái và nhân hạt neem trị được nhiều

loại tuyến trùng như Helicotylenchus indicus, Tylenchus filiformis, Rotylenchus reniformis

Trong bánh dầu neem sau khi ép dầu và trích hoạt chất còn chứa một ít limonoid nên khi trộn với phân bón như phân ure có thể diệt được các tuyến trùng gây bệnh bướu rể, một loại bệnh lây lan nhanh và có tác hại rất lớn cho cây trồng

Việc nghiên cứu chiết xuất hoạt chất ARL trong cây neem ở nước ta còn rất hạn chế:

 Năm 2002, Dương Anh Tuấn và CTV thuộc Viện Hóa học Trung tâm KHTN – CNQG và Viện Bảo vệ thực vật Bộ NN – PTNT đã trích ly được hoạt chất azadirachtin từ nhân hạt cây neem lấy ở Thuận Hải và cũng đã thử nghiệm thấy nó có tác dụng gây ngán ăn

mạnh đối với sâu khoang Spodoptera litura [35]

 Năm 2004, Nguyen Thuong Dong và CTV thuộc Viện Dược liệu Bộ Y Tế nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học và tác dụng dược lý của lá neem, Tạp chí Dược liệu, tập 9 số 01/2004 [36]

 Năm 2011, Vũ Văn Độ Viện Sinh học Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh đã nghiên cứu thành công đề tài cấp Thành phố “Thử nghiệm tạo một số dạng chế phẩm diệt muỗi truyền

bệnh sốt rét và sốt xuất huyết từ dịch chiết lá và nhân hạt neem Azadirachta indica A Juss

trồng tại Việt Nam [37]

 Năm 2012, Nguyễn Thị Ý Nhi dưới sự hướng dẫn của Trần Lê Quan và Trần Kim Qui đã bảo vệ thành công luận án Tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần limonoid của lá cây neem

Azadirachta indica trồng ở Ninh Thuận”, trong luận án này tác giả đã chiết được 20

limonoid trong đó có 16 limonoid mới mà thế giới chưa công bố (kiểm tra theo phần nềm Scifinder) [38]

 Từ năm 2006 đến năm 2013 Trần Kim Qui cùng các cộng sự đã thực hiện thành công các đề tài và dự án sau đây:

 Đề tài NCKH: Ly trích hoạt chất từ cành, lá cây neem và cây cóc hành (còn gọi là cây neem địa phương) làm thuốc trị bệnh cho người và gia súc, gia cầm; đề tài cấp Tỉnh Ninh Thuận nghiệm thu tháng 10 năm 2007, được Hội đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại 1 [39]

 Đề tài NCKH: Hoàn thiện quy trình trích ly hoạt chất limonoid ARL trên quy mô pilot từ cây neem và điều chế các phụ gia thích hợp để làm nguyên liệu pha chế thuốc bảo vệ thực vật; Đề tài cấp Tp Hồ Chí Minh nghiệm thu tháng 9 năm 2006, được Hội đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại Khá [40]

 Dự án NCKH: Ly trích hoạt chất Azadirachtin≥ 3% trong hạt neem để làm thuốc bảo

vệ thực vật; Dự án cấp Thành phố Hồ Chí Minh nghiệm thu tháng 12 năm 2011, được Hội đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại Khá [41]

 Dự án CGCN: Xây dựng mô hình ứng dụng công nghệ chiết xuất hoạt chất

Azadirachtin limonoid ARL từ cây neem (Azadirachta indica) làm nguyên liệu để

sản xuất chế biến một số sản phẩm khác; Dự án cấp Nhà nước chuyển giao công nghệ cho Trung tâm Thông tin và ứng dụng tiến bộ KHCN Ninh Thuận, Sở Khoa học

đánh giá đạt loại khá [42]

1.3

Như đã trình bày trên đây khi bón phân đạm vào đất thì chỉ trong vòng 15 ngày khoảng 45-50% phân đạm bị thất thoát do cặp vi sinh vật nitrit hóa tác dụng sinh ra chất nitrat làm ô nhiễm môi trường đất, nước và nguồn thực phẩm Để giải quyết vấn đề trên,nhất thiết phải khử cặp vi khuẩn nitrit hóa này

Việc nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất một số limonoid trong hạt cây neem trồng ở Ninh Thuận để phối chế ra một chế phẩm mới đặt tên là Limo NI từ những nguyên liệu trong nước có khả năng khử được cặp vi khuẩn nitrit hóa phân đạm trong đất là một đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn Nếu đề tài được thành công thì chẳng những nó góp phần đáng kể vào việc bảo vệ nguồn nước ngầm và rau củ quả không bị nhiễm độc nitrat mà còn giúp nông dân sử dụng một lượng đạm ít hơn mà năng suất cây trồng vẫn tăng cao; như thế người nông dân được tăng thêm thu nhập và Nhà nước không phải chi nhiều ngoại tệ để nhập nhiều phân đạm như hiện nay

II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT NEEM VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ARL KHỬ MẠNH NHẤT VI SINH VẬT NITRIT HÓA PHÂN ĐẠM

2.1.1 Mô tả nội dung

2.1.1.1 Ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem

a Dùng 5 dung môi thông dụng có độ phân cực khác nhau như: hexane, ether dầu, ethyl acetate, ethanol, dichlorometane lần lượt trích ly các ARL trong bánh neem Chưng cất áp xuất thấp, tách dung môi, thu cao ARL của các dung môi khác nhau

b Chạy sắc ký điều chế bản mỏng với các dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau, chọn chất giải ly thích hợp để tách các ARL

c Pha thuốc thử Salkowski (dung dịch vanillin, H2SO4 trong methanol tạo ra màu xanh lục khi có sự hiện diện của limonoid) phun vào bản sắc ký đểphát hiện các chất ARL,hiện ra với màu xanh lục trên bản sắc ký

d Tách các chất ARL, tìm dung môi thích hợp hòa tan từng chất ARL

2.1.1.2 Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp trong

đất trồng rau (có bón phân đạm) và nhân giống 2 chủng vi khuẩn này

a Phân lập chủng Nitrosomonas sp trong môi trường Winogradsky P1 và phân lập

chủng Nitrobacter sp trong môi trường Winogradsky P2

b Nhân giống Nitrosomonas sp trong môi trường Watson và nhân giống Nitrobacter sp

trong môi trường Hall-Murphy

2.1.1.3 Thử tính sát khuẩn của các chất ARL đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và

Nitrobacter sp theo phương pháp kháng sinh đồ dựa vào vòng tròn vô khuẩncủa các

ARL trên bề mặt môi trường Nutrient agar nuôi cấy vi khuẩn

a Chọn 3 chất ARL có tác dụng khử mạnh nhất 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp (có vòng tròn vô khuẩn lớn nhất)

b Dùng phương pháp phổ nghiệm để định danh 3 chất ARL có tác dụng khử mạnh nhất

2 chủng vi khuẩn này

2.1.2 Phương pháp

2.1.2.1 Ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem

Hoạt chất ARL trong hạt neem được ly trích và tách ra theo hình sau đây: (Hình 2.1)

Hình2.1: Quy trình ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem

Chưng cất áp suất thấp thu 5 loại cao trích ly (TL)

0

Sắc ký bản mỏng tách các hoạt chất ARL trong cao TL

Dung môi thu hồi

Hạt neem khô

Dầu neem

Ly trích các ARL trong bánh neem

Bả hạt neem

Vỏ hạt neem

Dùng 5 dung môi có độ phân cực khác nhau

Phun thuốc thử Salkowski để hiện màu các ARL

Tách các ARL

Thu 6 ARL có hàm lượng cao nhất

2.1.2.2 Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp

a Phân lập và nhân giống chủng Nitrosomonas sp

i Phân lập:

Lấy 1g đất trồng rau có bón phân đạmở độ sâu khoảng 10cm;pha loãng đến nồng độ thích hợp;cấy trải trên môi trườngWinogradsky P1 Ủ ở 28 ± 2oC trong 4 ngày; quan sát đại thể, vi thể và nhuộm Gram để nhận biết giống vi sinh vật

Môi trường Winogradsky P1:

(NH4)2SO4 : 0,2g

K2HPO4 : 1,0g MgSO4,7H2O : 0,5g

ii Nhân giống

Nhân giống trong môi trườngWatson ở nhiệt độ 30oC Theo dõi quá trình lên men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu

Môi trường Watson:

(NH4)2SO4 : 3g

K2HPO4 : 0,5g MgSO4,7H2O : 0,05g

Phenol red : 0,05mg FeSO4,7H2O : 0,05g

Môi trường Winogradsky P2:

ii Nhân giống

Nhân giống trong môi trường Hall-Murphy ở nhiệt độ 30oC Theo dõi quá trình lên men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu

Môi trường Hall-Murphy:

3.1.2.3 Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 chất ARL có hàm lƣợng cao nhấttrích từ

hạt neem, đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp

a Vật liệu và môi trường

 Vi khuẩn thử nghiệm: Các chủng vi khuẩn Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp được giữ giống trong ống thạch nghiêng ở 4oC

 Môi trường kháng sinh đồ: Môi trường Nutrient agar

Cao thịt : 3g Pepton : 5g NaCl : 5g Agar : 20g Nước qsp : 1000ml

 Mẫu thử nghiệm: Các chất ARL1, ARL2, ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 (tên chung là ARLx) bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong chai có màu và đậy kín nắp

 Dụng cụ:

 Hộp petri thủy tinh có đường kính 110mm vô trùng (36 hộp)

 Que cấy trải tam giác vô trùng

 Các đĩa giấy có đường kính 5mm, được tiệt trùng qua nồi hấp autoclave ở

121oC, 1atm trong 30 phút và sấy khô hoàn toàn

b Làm kháng sinh đồ

 Phương pháp thử nghiệm: Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Agar dilution) đo đường kính vòng vô khuẩn tức là vòng không có vi khuẩn mọc xung quanh đĩa giấy có đẫm mẫu chất ARLx

 Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn chọn và tách ra 3 chất trong số các ARLx có tác

dụng ức chế mạnh nhất 2 chủng vi khuẩn Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp (có vòng vô

khuẩn lớn nhất)

 Dùng phương pháp phổ nghiệm để định danh 3 chất ARLx này

2.2 NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ CHẾ

PHẨM LIMO NI

2.2.1 Nội dung và phương pháp

2.2.1.1 Ly trích 3 hoạt chất ARLx trong nhân hạt neem có tác dụng ức chế mạnh

nhất 2 chủngNitrosomonas sp và Nitrobacter sp (Theo kết quả của nội dung 1)

a Dùng hệ dung môi có tính năng trích ly chọn lọc các limonoid để trích các ARLx trong hạt neem Chưng cất dưới áp suất thấp thu hồi dung môi và thu được cao trích

 Cột ODS pha đảo với dung môi giải ly phân cực mạnh

c Thu hồi dung môi giải ly và tinh chế 3 hoạt chất ARLx có tác dụng ức chế mạnh nhất

2.2.1.2 Điều chế chất tạo màngESOđể bảo vệ các hoạt chất ARLx trong chế phẩm Limo NI

Một trong những chất mà các nhà hóa học sử dụng để tạo màng che, ngăn chặn ánh sáng mặt trời tác dụng làm giảm cấp hoạt chất ARL là một loại dầu đậu nành epoxy ESO (Epoxidised Soybean Oil) tên thương mại là dầu vernolat

Dầu ESO được điều chế qua các giai đoạn:

 Epoxid các nối đôi trong dầu đậu nành bằng hỗn hợp H2O2 - formic acid

 Trung hòa hỗn hợp phản ứng với Na2CO3 đến pH=7

2.2.1.3 Điều chế chất hoạt diện Sucroester nhằm giúp chế phẩm Limo NI thấm đều

và tác dụng tốt trong đất

Sucroester được điều chế qua 2 giai đoạn:

 Điều chế ethyl laurat từ ethanol và dầu dừa

 Xuyên ester hóa giữa sucrose và ethyl laurat với xúc tác lipase trong thời gian 20 giờ

ở to 40oC và áp suất thường

2.2.1.4 Lập công thức pha chế Limo NI bền nhũ và bền nhiệt

Công thức pha chế Limo NI dựa vào tính chất các thành phần và công dụng của sản phẩm

2.2.2 Thử độ bền nhiệt và bền nhũ của Limo NI

2.2.2.1 Thử độ bền nhiệt của Limo NI theo tiêu chuẩn CIPAC, vol F, MT 46

2.2.2.2 Thử độ bền nhũ của Limo NI theo tiêu chuẩn CIPAC vol F, MT20

2.3 NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT

2.3.1 Mô hình thử nghiệm

Thử nghiệm được thực hiện trong thùng bằng thép không rỉ hình trụ đường kính 1,2m

x cao 2m đáy hình nón có máy khuấy trộn,giữa đáy có van xả nước, chứa đầy đất trồng cây, pH=7 Cho 1kg urê đã bao Limo NI vào thùng thử nghiệm và trộn với lớp đất mặt Sau 20 ngày tưới đều với 15l nước sạch trên bề mặt đất trong thùng, xả van đáy thùng lấy nước ra

để định lượng nitrat

Thử nghiệm đối chứng được thực hiện giống như trên nhưng cho 1kg urê không bao Limo NI vào thùng thử nghiệm

2.3.2 Chỉ tiêu theo dõi

Hàm lượng nitrat trong nước xả

2.3.3 Phương pháp

Xác định hàm lượng nitrat trong nước xả theo phương pháp đo phổ TCVN 1:2004 Phản ứng của nitrat với 2,6-dimethylphenol xúc tác H2SO4/H3PO4 (1:1 w/w) cho ra 4-nitro-2,6-dimethylphenol có màu Đo độ hấp thu của sản phẩm sinh ra bằng quang phổ kế

7323-ở bước sóng 324nm và xác định nồng độ nitrat trong mẫu thử dựa theo đường chuẩn

2.4 NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ

ĐO LƢỢNG NITRAT BỊ THẤT THOÁT

2.4.1 Thay đổi tỷ lệ trộn Limo NI và urê

Phối trộn Limo NI và urê theo các tỷ lệ khác nhau (%): 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 (6 nghiệm thức) Thực hiện thử nghiệm theo mô hình trong nội dung 3 với 6 nghiệm thức này

2.4.2 Đo hàm lƣợng nitrat đối với mỗi nghiệm thức

Thực hiện cách đo hàm lượng nitrat dựa theo đường chuẩn trong nội dung 3

Xác định tỷ lệ Limo NI/urê làm giảm thấp nhất lượng nitrat thất thoát

2.5 NỘI DUNG 5: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM ĐO LƢỢNG NITRAT ĐƢỢC CÂY TRỒNG HẤP THU – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO

NI VỚI URÊ VÀ ĐO LƢỢNG NITRAT ĐƢỢC CÂY TRỒNG HẤP THU

2.5.1 Mô hình thử nghiệm

Chế phẩm Limo NI có tác dụng khử các vi sinh vật nitrit hóa phân đạm trong đất sinh

ra nitrat NO3–, một phần ngấm dần theo nước vào đất làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần được cây trồng hấp thu làm ô nhiễm nguồn thực phẩm

Dùng chế phẩm Limo NI bao phân đạm urê theo các tỷ lệ khác nhau và bón phân urê

có bao Limo NI cho cây cải ngọt và cây dưa chuột Đo hàm lượng nitrat do các cây này hấp thu để đánh giá tác dụng khử các vi sinh vật nitrit hóa của chế phẩm Limo NI

 Thử nghiệm được thực hiện trên 2 luống rau, mỗi luống có diện tích 70m2 và đươc chia làm 7 ô, mỗi ô có diện tích 10m2 đánh số từ số 1 đến số 7

 Thay đổi tỷ lệ bao Limo NI/urê (%) : 0 (đối chứng), 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 (7 nghiệm thức) để bón cho 7 ô trồng cải ngọt và dưa chuột

b Cây dưa chuột

 Bón lót: Bón 100% lượng phân hữu cơ + 30% urê bao Limo NI + 100% superphosphat + 20% sulfat kali

 Bón thúc đợt 1: Khi cây có 2-3 lá thật, bón 50% urê bao Limo NI + 30% sulfat kali

 Bón thúc đợt 2: Sau khi cây có hoa đến khi bắt đầu thu quả, bón 20% urê bao Limo

NI + 50% sulfat kali

2.5.2.2 Chăm sóc và thu hoạch

Trong thời gian khảo nghiệm, các khâu chăm sóc như phòng trừ sâu bệnh, bón phân, tưới nước…, được thực hiện như nhau ở tất cả các nghiệm thức

và bị nitrit hóa thành nitrit NO2 và nitrat NO3–

Dùng chế phẩm Limo NI bao phân đạm urê theo các tỷ lệ khác nhau và bón phân urê

có bao Limo NI cho cây cải ngọt và cây dưa chuột Đo năng suất cây cải ngọt và dưa chuột

để đánh giá tác dụng của Limo NI đến năng suất cây trồng

 Thử nghiệm được thực hiện trên 2 luống rau, mỗi luống có diện tích 70m2, luống 1 trồng cải ngọt, luống 2 trồng dưa chuột; mỗi luống chia làm 7 ô, mỗi ô có diện tích 10m2 đánh số từ số 1 đến số 7

 Thay đổi tỷ lệ bao Limo NI/urê (%) : 0 (đối chứng), 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 (7 nghiệm thức) để bón cho 7 ô trồng cải ngọt và dưa chuột

 Bón thúc đợt 2: Sau khi trồng 15 ngày, dùng hết lượng urê bao và sulfat kali còn lại

b Cây dưa chuột

 Bón lót: Bón 100% lượng phân hữu cơ ĐCX + 30% urê bao Limo NI + 100% superphosphat + 20% sulfat kali

 Bón thúc đợt 1: Khi cây có 2-3 lá thật, bón 50% urê bao Limo NI + 30% sulfat kali

 Bón thúc đợt 2: Sau khi cây có hoa đến khi bắt đầu thu quả, bón 20% urê bao Limo

NI + 50% sulfat kali

2.6.2.2 Chăm sóc và thu hoạch

Trong thời gian khảo nghiệm, các khâu chăm sóc như phòng trừ sâu bệnh, bón phân, tưới nước…, được thực hiện như nhau ở tất cả các nghiệm thức

Thu hoạch:

 Khi thu hoạch cây cải ngọt, cắt toàn bộ cây, làm sạch, tỉa bỏ lá vàng úa, rũ sạch bụi bẩn, sau đó cân trọng lượng để xác định năng suất sản phẩm của 7 ô trồng khảo nghiệm cây cải ngọt

 Thu hoạch dưa chuột khi các u ở quả còn nổi rõ tức là sau khi hoa cái tàn, vỏ trái có màu xanh mượt còn lớp phấn trắng Sau đó cân trọng lượng dưa chuột thu hoạch trên mỗi ô

để xác định năng suất sản phẩm của 7 ô trồng dưa chuột

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT

NEEM AZADIRACHTA INDICA

3.1.1 Ly trích hoạt chất ARL trong hạt neem

Hoạt chất ARL trong hạt neem được ly trích theo sơ đồ 2.1, sau đây là một số kết quả thu nhận được

3.1.1.1 Tách vỏ hạt neem và nghiền nhỏ nhận hạt

Hạt neem có lớp vỏ cứng bên ngoài chiếm khoảng 50 – 55% trọng lượng hạt, nhân hạt chiếm khoảng 44 – 45% Trước khi ép hạt neem người ta thường tách vỏ hạt vì nếu ép nguyên vỏ, dầu neem thu được có màu sẫm và chứa nhiều mảnh vỏ hạt Ngoài ra vỏ hạt neem có chứa khoảng 0,2% hoạt chất limonoid nên cần được tận dụng để điều chế phân bón hoặc các chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật

Dùng máy tách vỏ hạt neem (Hình 3.1) để tách vỏ 20kg hạt neem thu được 8,8 kg nhân hạt, sau đó nghiền nhỏ nhân hạt đến cỡ hạt 0,5-1mm để chuyển qua máy ép thủy lực để

 Chức năng hoạt động của máy ép:

 Máy có thể ép piston xuống sát mặt đáy có lỗ thoát

 Chất lỏng được thoát ra ngoài qua hệ thống lỗ “tàn ong” với 1 tấm lưới 40 và một tấm lưới 80

 Sau khi ép xong, piston được nâng lên cách mặt trên của xi lanh một khoảng 300

mm

 Bên dưới “tàn ong” có hệ thống đẩy nguyên liệu lên miệng xi lanh để tách lấy bánh neem ra

 Sau đó “tàn ong” được hạ xuống trở về vị trí ban đầu

Quá trình hoạt động được lặp lại

Tất cả các bộ phận của máy có tiếp xúc với nguyên liệu đều làm bằng thép không rỉ

 Công suất máy ép: 20kg hạt neem/giờ (Hình 3.2)

Dầu neem được đưa qua máy lọc ép để tách các tạp chất cơ học, sau đó cho vào dầu khoảng 1-2% chất hút ẩm Na2SO4 khan để hút nước có trong dầu

Phần bánh neem còn lại khoảng 7,3 kg (83% trọng lượng nhân hạt) được dùng để trích ly ARL Bánh neem phải được đập cho nát nhỏ ra và sử dụng ngay không để quá 24giờ

3.1.1.3 Chiết suất ARL trong bánh neem

Chiết xuất hoạt chất ARL trong bánh dầu neem trong 24 giờ, lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau như hexane, ether dầu, ethyl acetate, ethanol, dichloromethane(5 dung môi) trong bình Soxhlet (Hình 3.3)

Lọc ly tâm thu nước cái và loại bỏ bã để chuyển sang xử lý làm phân bón

3.1.1.4 Thu các loại cao ARL

Chưng cất dưới áp suất thấp trong máy cô quay để tách dung môi và thu các cao trích

ly (TL) với các dung môi có độ phân cực khác nhau: Cao TL C6H14, cao TL ether dầu, cao

TL EtOAC, cao TL EtOH, cao CH2Cl2 (Hình 3.4)

3.1.1.5 Tách các ARL khác nhau trong mỗi loại cao TL

Chạy sắc ký bản mỏng mỗi loại cao TL với các dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần Sử dụng các bản sắc ký điều chế silica gel tráng sẵn loại silica gel preparative Merck Kielselgel 60, F254, 500μm để tách các ARL trong mỗi loại cao

Dùng các thuốc thử biệt tính có tác dụng hiện màu các nhóm chức khác nhau trong hạt neem trên sắc ký đồ để từ đó phát hiện các ARL có trong 5 loại cao TL

Bảng 3.1: Thuốc thử biệt tính để xác định các nhóm chứa hóa học

1 Sterol Liebermann-Burchard Màu đỏ - hồng

4 Alcaloid,

Hợp chất amin

Bouchardat Mayer

Dd FeCl3 1% trong nước

Màu vàng nhạt để lâu hóa nâu

Dd chuyển màu xanh

7 Chất béo Thấm vào giấy lọc Vết dầu loang trên giấy lọc

Kết quả được ghi trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của 5 loại cao TL

TT Thuốc thử/Hoạt chất Cao TL

hexane

Cao TL ether dầu

Cao TL EtOAc

Cao TL EtOH

Dấu – : không hiện màu

Dấu + : có hiện màu của nhóm chức hóa học tương ứng

Thuốc thử Salkowski làm cho các limonoid hiện ra có màu xanh lục Kết quả cho thấy có 6 limonoid:

 1 limonoid ARL1 trong cao TL hexane

 1 limonoid ARL2 trong cao TL ethyl acetate

 2 limonoid ARL3, ARL4 trong cao TL ethanol

 2 limonoid ARL5, ARL6 trong cao TL dichloromethan

Gọi tên chung 6 limonoid này là ARLx

Hình 3.1: Máy tách vỏ hạt neem

Hình 3.2 : Máy ép dầu neem

Hình 3.3 : Trích hoạt chất ARL trong bánh neem trong hình Soxhlet

Hình 3.4 : Tách dung môi trong máy cô quay dưới áp suất thấp

3.1.1.6 Tách các limonoid ARLx

Hòa tan 6 limonoid hiện ra trên sắc ký đồ ARL1, ARL2, ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 trong các dung môi tương ứng, lọc bỏ tạp chất, chưng cất dưới áp suất thấp thu hồi dung môi; 6 limonoid đã được tách riêng ra ARL1, ARL2, ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 có dạng đậm đặc Hòa tan các limonoid ARLx trong nước cất thành 6 dung dịch ARLx 1% Thử

nghiệm tính sát khuẩn của 6 ARLx này đối với 2 chủngNitrosomonas sp và Nitrobacter sp

3.1.2 Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp

3.1.2.1 Phân lập và nhân giống chủng Nitrosomonas sp

a Phân lập và chọn giống

Lấy 1g đất trồng rau sâu khoảng 5-10cm, hòa vào 9ml nước cất, ly tâm loại cặn, pha loãng đến nồng độ thích hợp Dùng pipetman hút 0,1ml dung dịch cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Winogradsky P1; dùng que cấy, cấy trải dàn đều trên dung dịch mặt thạch Ủ ở

28 ± 2oC trong 4 ngày, chọn và tách những khuẩn lạc tương đối rời

Dùng que cấy vòng lấy một ít giống vi khuẩn hòa tan trong nước cất, cấy ria lên dĩa Petri chứa môi trường Winogradsky P1 Ủ 4-5 ngày ở nhiệt độ 30oC Quan sát hình dáng của tế bào và sự sắp xếp của màng tế bào chất theo các tiêu chí phân loại vi khuẩn (Hình 3.5)

Bảng 3.3 : Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrosomonas sp

1 Hình dạng Có dạng cầu, một số có dạng bầu dục

2 Kích thước (μm) 0,7 – 1,5 x 1,0 – 2,4

3 Kiểu tiên mao Mọc ở cực

4 Cấu trúc màng Màng bao tế bào chất có các lỗ nằm rãi rác đôi khi các màng

này gấp cuộn vào bên trong tế bào chất

5 Nhuộm Gram Thuộc loại Gram âm không di động

b Nhân giống

Nuôi cấy chủng vi khuẩn Nitrosomonas sp trong bình lên men có chứa 1 lít dung dịch

môi trường Watson ở nhiệt độ 30oC

Theo dõi quá trình lên men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng

buồng đếm hồng cầu (Bảng 3.4) Sau 4 ngày nuôi cấy mật độ chủng Nitrosomonas sp trong

dung dịch là: CFU/ml = 1,4 x 108

Bảng 3.4: Mật độ chủng Nitrosomonas sp thay đổi theo thời gian nuôi cấy ở pH = 7 và

Đưa chủng Nitrosomonas sp vào môi trường giữ giống Winogradsky P1 trong ống

nghiệm thạch nghiêng bảo quản ở 4oC

3.1.2.2 Phân lập và nhân giống chủng Nitrobacter sp

a Phân lập và chọn giống

Lấy 1g đất trồng rau sâu khoảng 5-10cm hòa vào 9ml nước cất, ly tâm loại cặn, pha

loãng đến nồng độ thích hợp Dùng pipetman hút 0,1ml dung dịch cho vào đĩa Petri có chứa

môi trường Winogradsky P2; dùng que cấy, cấy trải dàn đều trên dung dịch mặt thạch Ủ ở

28 ± 2oC trong 4 ngày, chọn và tách những khuẩn lạc tương đối rời

Dùng que cấy vòng lấy một ít giống vi khuẩn hòa tan trong nước cất, cấy ria lên dĩa

Petri chứa môi trường Winogradsky P2 mới pha Ủ 4-5 ngày ở nhiệt độ 30oC Quan sát hình

dáng của tế bào và sự sắp xếp của màng tế bào chất theo các tiêu chí phân loại vi khuẩn

(Hình 3.6)

Bảng 3.5: Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrobacter sp

1 Hình dạng Có dạng cầu, đôi khi có hình quả lê hay que ngắn

2 Kích thước (μm) 0,6 – 0,8 x 1,0 – 2,0

3 Kiểu tiên mao Mọc ở gần cực, đuôi và bên hông

4 Cấu trúc màng Carboxysome hiện diện ở tế bào chất ở dạng thể vùi trong

nguyên sinh chất Vách tế bào có thêm một lớp vỏ bọc bên

ngoài được cấu trúc bởi các tiểu đơn vị protein ghép với nhau theo một trật tự nhất định

5 Nhuộm Gram Thuộc loại Gram âm di động nhờ tiên mao ở đuôi và bên hông

b Nhân giống

Nuôi cấy chủng vi khuẩn Nitrobacter sptrong bình lên men có chứa 1 lít dung dịch

môi trường Hall-Murphy ở nhệt độ 30oC

Theo dõi quá trình lên men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng

buồng đếm hồng cầu (Bảng 3.6) Sau 5 ngày nuôi cấy mật độ chủng Nitrobacter sptrong

dung dịch là: CFU/ml = 1,15 x 108

Bảng 3.6: Mật độ chủng Nitrobacter spsau 5 ngày nuôi cấy ở pH = 7 và t o = 30 o C

TT Thời gian (giờ) pH t o (C) Mật độ tế bào (CFU/ml)

Đưa chủng Nitrobacter sp vào môi trường giữ giống Winogradsky P2 trong ống

nghiệm thạch nghiêng bảo quản ở 4oC

(a) (a)

(b)

Hình 3.5: Hình dạng khuẩn lạc Nitrosomonas sp

a) Sau 4 ngày b) Sau 9 ngày

(a)

(b)

Hình 3.6: Hình dạng khuẩn lạc Nitrobacter sp

a) Sau 4 ngày b) Sau 9 ngày

3.1.3 Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với 2

chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp theo phương pháp kháng sinh đồ

3.1.3.1 Vật liệu và môi trường

a Vi khuẩn thử nghiệm

1 Nitrosomonas sp (–) Nitrosomonas sp là một loại vi khuẩn hóa tự dưỡng

hình cầu, Gram (–), hoạt động háo khí, oxid hóa NH4+

và NH3 trong phân đạm thành NO2– trong điều kiện to: 20-34oC và pH=6,0-9,0

2 Nitrobacter sp (–) Nitrobacter sp là một loại vi khuẩn hóa tự dưỡng hình

cầu, Gram(–), hoạt động háo khí, cộng sinh với

Nitrosomonas sp, oxid hóa NO2– thành NO3– ở nồng độ oxy ≥ 0,5ppm, to: 30-40oC và pH=6,5-8,5

Các chủng vi khuẩn này được phân lập trong đất trồng rau có bón phân đạm, nuôi cấy, nhân giống và giữ giống trong môi trường Winogradsky P1 và P2 trong ống nghiệm thạch nghiêng, bảo quản ở 4oC và được cấy chuyền mỗi tháng 1 lần

b Mẫu thử nghiệm

Các hoạt chất ARL1,ARL2,ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 (ARLx) được tách ra bằng phương pháp sắc ký bản mỏng điều chế từ các loại cao trích ly (TL) của nhân hạt neem Các hoạt chất ARLx này được bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong chai có màu nâu sậm và đậy kín nắp

c Môi trường kháng sinh đồ

Môi trường Nutrient agar

Cao thịt : 3g Pepton : 5g NaCl : 5g Agar : 20g Nước qsp : 1000ml

3.1.3.2 Thử nghiệm

a Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

Từ các ống nghiệm thạch nghiêng giữ giống, vi khuẩn được cấy chuyền lên mặt thạch chứa môi trường giữ giống Winogradsky P1 và P2 tương ứng

Ủ các hộp thạch có vi khuẩn ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 3-4 ngày Sau khi các khuẩn lạc (vi khuẩn sinh sản mọc thành nhóm) xuất hiện, chọn 3-5 khuẩn lạc riêng lẻ giống nhau để làm một huyền phù dung dịch vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 0,5% Tween 80 trong 5ml nước muối sinh lý sao cho mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm khoảng 108

CFU/ml

b Chuẩn bị các hộp thạch thử nghiệm

Đun cách thủy hỗn hợp Nutrient agar đến tan hoàn toàn Khử trùng bằng nồi hấp ở

121oC trong 30phút Sau khi để nguội đến 50o

C bắt đầu phân phối ra các đĩa Petri vô trùng Trong mỗi đĩa Petri có 38ml thạch tương đương với độ dày 4mm Các hộp thạch này được ủ qua đêm để kiểm tra sự vô trùng Loại bỏ các hộp thạch bị nhiễm

Dùng que cấy tam giác vô trùng nhúng vào huyền phù dung dịch vi khuẩn đã chuẩn

bị ở trên rồi trải đều chủng vi khuẩn thử nghiệm trên mặt thạch của môi trường Nutrient agar

c Làm kháng sinh đồ

Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch (Dilution agar)

Dùng kẹp vô trùng kẹp đĩa giấy đường kính 5mm đã tẩm mẫu dung dịch 1% trong nước của 6 hoạt chất ARLx đặt lên mặt thạch thử nghiệm Làm tương tự với mẫu trắng (đĩa giấy tẩm nước cất) Lật ngược hộp thạch và ủ ở 30oC Sau 24giờ đọc kết quả đường kính vòng vô khuẩn tức là vòng không có vi khuẩn mọc xung quanh đĩa giấy tẩm mẫu dung dịchhoạt chất ARLx thử nghiệm

3.1.3.3 Kết quả

Kết quả sát khuẩn của các hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với 2 chủng

Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp được trình bày trong bảng sau đây (Bảng 3.7)

Bảng 3.7: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các hoạt chất ARLx đối với 2 chủng

Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp

TT Hoạt chất ARLx Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Đối chứng Nitrosomonas sp Nitrobacter sp