nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây bắt ruồi drosera indica l.. nhằm thu nhận plumbagin

burmanii thông qua mô sẹo và trực tiếp từ lớp mỏng tế bào và ứng dụng 1 số kỹ thuật tăng sinh plumbagin trên dịch huyền phù tế bào: điều kiện nuôi cấy thích hợp ủ tối, tốc độ lắc 125 vò

i

TÓM TẮT TIẾNG VIỆT

Loài cây bắt ruồi Drosera đã được chứng minh là có giá trị dược tính trong điều trị

các căn bệnh như: lao, ung thư, HIV, tim mạch, ho gà, hen suyễn…kể cả những căn

bệnh do đột biến [Samaj J., 1999] Thế nhưng, trong tự nhiên Drosera tương đối

hiếm, là loài có nguy cơ tuyệt chủng, nhiều quốc gia đã phải ban hành luật để bảo

vệ chúng [Blehova A, 1995], [Bonnet M, 1984].Ở Việt Nam, có 3 loài Drosera

[Phạm Hoàng Hộ, 1995]; chưa loài nào được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như dược tính [Đỗ Tất Lợi] Do vậy, đề tài đã ra đời với nhu cầu thiết yếu của

nó nhằm bảo tồn nguồn cây Drosera vốn khan hiếm; khai thác tiềm năng dược tính

của 1 loài cây hoang dại ở Việt Nam; đáp ứng nhu cầu thực vật cũng như về dược

chất 1 cách chủ động Với đại diện là cây bắt ruồi D burmanii Vahl được thu hái ở

Việt Nam, chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình vi nhân giống; sàng lọc, thu nhận và chứng minh cấu trúc của plumbagin, vốn là hoạt chất có giá trị dược tính

cao từ nguồn nguyên liệu in vitro của loài Drosera này Trong đề tài này, chúng tôi tập trung nghiên cứu tạo hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D burmanii

(thông qua mô sẹo và trực tiếp từ lớp mỏng tế bào) và ứng dụng 1 số kỹ thuật tăng sinh plumbagin trên dịch huyền phù tế bào: điều kiện nuôi cấy thích hợp (ủ tối, tốc

độ lắc 125 vòng/phút, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 2,6×104 tế bào/ml), bổ sung tiền chất (phenylalanine 0,3mM hay tyrosine 0,3mM); chất cảm ứng (acid salicylic 1,5mg/l trong 4 ngày khi dịch huyền phù tế bào được 8 ngày tuổi); và loại bỏ 2,4-D trong thành phần môi trường nuôi cấy đều là những kỹ thuật giúp gia tăng tích lũy

plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D burmanii Trong đó, việc loại bỏ 2,4-D

(từ ngày thứ 8 trở đi) có ảnh hưởng rõ nhất đến khả năng tích lũy plumbagin trong

dịch huyền phù tế bào D burmanii, giúp tăng hàm lượng plumbagin lên gấp 2,58

lần

ii

TÓM TẮT TIẾNG ANH

Species of Drosera have been proved to have important phamacognostical

evaluation in treatment of ailments like: tuberculosis, cancer, HIV, cardiovascular, asthma, whooping cough, without exception of mutation related diseases [Samaj J.,

1999] Beingrelatively rare in nature, Droseraare such endangered species that

many countries have enacted legislation to protect them [Blehova A, 1995], [Bonnet

M, 1984] However, among three known species of Drosera in Vietnam

[Pham Hoang Ho, 1995], it is the fact that there has been no publication studying these species on the chemistry, pharmacology [Do Tat Loi] There is an urgent need

to adopt conservation measure regionally, which may preserve these valuable species from being vanished Moreover, studying in specific potential medicinal properties of these wild plants may suggest a source of fresh biomass and their

extracted substances for interesting industrial employment Focusing on D burmani

Vahl collected inVietnam, the micro propagation has been successfully established

From these in vitro materials, the screening, isolating and elucidating (both

structural and bioactive properties) of quercertine and plumbagin have also been carried out.Especially in this thesis is successful application of cell suspension

cultures strategies for D burmani(via callus and directly via thin cell layers of

tissue) to improve plumbagin yields:choosing appropriate culture conditions (dark incubation, shaking speed 125 round/minute, cell concentration 2,6×104 cells/ml), precursor addition (phenylalanine 0,3mM or tyrosine 0,3mM); elicitation (salicylic acid 1,5mg/l in 4 days) on 8 day old cell suspension;2,4-D elimination from media

of 8 day old cell suspesion.Among these, the last strategy is reported to increasing plumbagin yield to the highest level (2.58 times than control)

iii

MỤC LỤC

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH x

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đặc điểm giống thực vậtDrosera 4

1.1.1 Đặc điểm phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm phân bố 6

1.1.3 Đặc điểm hình thái 7

1.1.4 Đặc tính sinh học 12

1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112] 14

1.1.6 Thành phần hóa học 15

1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng 18

1.1.8 Tình hình nghiên cứu 21

1.2 Nuôi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) 23

1.2.1 Sự phát sinh cơ quan 23

1.2.2 Sự phát sinh phôi thể hệ 24

2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Nuôi cấy in vitrođể tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 26

2.1.1 Vật liệu 26

iv

2.1.2 Phương pháp 26

2.2 Sàng lọc và thu nhận plumabgin từ nguồn nguyên liệu in vitrocủa D.burmani: tìm hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB)28 2.2.1 Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro của D burmani 30

2.2.2 Xác định cấu trúc và hàm lượng hợp chất 31

2.3 Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bàoD burmani nhằm thu nhận plumbagin33 Vật liệu 33

Phương pháp 33

2.3.1 Tạo mô sẹo 33

2.3.2 Tạo dịch huyền phù tế bào 34

2.3.3 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận plumbagin lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 36

2.4 Xử lý thống kê 39

3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 40

3.1 Nuôi cấy in vitrođể tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 40

3.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 40

3.1.2 Nhân giống bằng chồi bên 40

3.1.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào 43

3.1.4 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh 45

3.2 Sàng lọc và thu nhận plumbagin từ nguồn nguyên liệu in vitro 46

3.2.1 Xử lý mẫu và điều chế các loại cao chiết 46

3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bàoin vitrotheo phương pháp Sulforhodamine B (SRB) 47

v

3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ

thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 52

3.3.1 Tạo mô sẹo 52

3.3.2 Tạo dịch huyền phù tế bào 59

3.3.3 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 63

4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 77

4.1 Kết luận 77

4.2 Đề nghị 77

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC a

BSA : Bovine Serum Albumine

COSY : COrelation SpectroscopY

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DLD-1 : dòng tế bào ung thư ruột kết ở người

DMSO : Dimethyl sulphoxide

DTT : 1, 4-DiThioTreitol

DW : Dry weight (trọng lượng khô)

FBS : Fetal Bovine Serum

FW : Fresh weight (trọng lượng tươi)

HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

HMQC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

I : tỷ lệ ức chế sự tăng sinh tế bào (%)

IAA : indoleacetic acid

IBA : 3-indolebutyric acid

LB : Luria – Bertani

MS : Murashige & Skoog, 1962

NAA : Naphthalene Acetic Acid

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

vii

OD : Optical Density

PAL : Phenylamine ammonia lysase

PBS : Phosphate Buffer Saline

PVP : Poly Vinyl Pyrrolidone

SRB : SulfoRhodamine B

TAL : Tyrosine ammonia lyase

TBS : Tris Buffered Saline

TCA : Trichloroacetic acid

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [99] 16

Bảng 1.2 Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin và 7-methyljuglone [99] 16

Bảng 1.3 Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera [99] 16

Bảng 1.4 Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera [99] 19

Bảng 1.5 Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây nhất của D burmani [73] 20

Bảng 1.6 Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera 21

Bảng 1.7 Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera 22

Bảng 2.1 Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D 38

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự nhân chồi bên 41

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự tạo chồi bất định từ phát hoa 43

Bảng 3.3 Phần trăm nước của hai loại nguyên liệu tươi Drosera in vitro (%) 46

Bảng 3.4 Thu suất các loại cao từ bột cây D.burmani 46

Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các cao chiết (100µg/ml) 47

Bảng 3.6 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D burmani 48

Bảng 3.7 Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn (100µg/ml) 49

Bảng 3.8 Kết quả sắc ký cột phân đoạn 3 của bảng 3.14 50

Bảng 3.9 Phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và HMBC của hợp chất B 51

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nền khoáng, nồng độ đường lên khả năng sống của lớp mỏng tế bào 53

ix

Bảng 3.11 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá và rễ D burmani 54

Bảng 3.12 Tỷ lệ % mẫu tạo mô sẹo từ lá dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA 56

Bảng 3.13 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA 57

Bảng 3.14 Hàm lượng plumbagin tích lũy trong các loại mô khác nhau 63

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đến thời gian tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào rễ Drosera 64

Bảng 3.16 Ảnh hưởng ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng trưởng và tích lũy plumbagin 66

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 68

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D burmani 71

Bảng 3.19.Ảnh hưởng của acid salicylic lên lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 74

Bảng 3.20 Kết quả định lượng plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D burmani đã được ứng dụng kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng HPLC 75

x

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên trình tự

DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome [122] 5

Hình 1.2 Sự phân bố Drosera trên thế giới (vùng có màu xanh lá) [121] 6

Hình 1.3 Các dạng cấu trúc thân của Drosera 7

Hình 1.4 Các hình dạng khác nhau của lá và lông tuyến Drosera [127] 8

Hình 1.5 Màu sắc đa dạng của hoa Drosera [130] 10

Hình 1.6 Mặt cắt ngang của hoa Drosera 10

Hình 1.7 Các dạng nang chứa hạt của Drosera [125] 11

Hình 1.8 Hình thái hạt Drosera [56] 11

Hình 1.9 Phương tiện và cơ chế bắt côn trùng của D indica L 13

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tách chiết từ các loài Drosera [22] 17

Hình 1.11 Một số flavonoid và flavonoid glucoside có trong Drosera 17

Hình 1.12 Một số hình thái lạ mắt của Drosera [131] 20

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bên [7] 27

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bất định [64] 28

Hình 2.3 Buồng đếm tế bào và quy tắc đếm trong 1 ô lớn có thể tích 0,1mm 3 37

Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của D burmani 41

Hình 3.2.Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D burmani sau 5 tuần 42

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của D burmani 44

Hình 3.4 Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D burmani 44

Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào DLD-1sau khi cảm

ứng 48 giờ của các phân đoạn 49

Hình 3.8 Cô lập và thu nhận hoạt chất B 50 Hình 3.9 Biều đồ thể hiện ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả năng

sống của lớp mỏng tế bào 53

Hình 3.10 Hình thái mô sẹo được tạo thành từ lá D.burmani 55 Hình 3.11 Hình thái mô sẹo được tạo thành từ rễ D.burmani 55 Hình 3.12 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo dưới ảnh hưởng của 2,4-D, NAA, KN 57 Hình 3.13 Hình thái mô sẹo dưới tác động kết hợp của 3 loại hormone 58 Hình 3.14 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo 60 Hình 3.15 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào 61 Hình 3.16 Tế bào D burmani bắt màu hồng khi nhuộm TTC – A: tế bào trong dịch

huyền phù từ mô sẹo; B: tế bào trong dịch huyền phù từ lớp mỏng tế bào 62

Hình 3.17 Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D burmani có mật

độ tế bào ban đầu khác nhau 64

Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng trưởng và

sự tích lũy plumbagin 66

Hình 3.19 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và tích lũy

plumbagin 69

Hình 3.20 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng trưởng

và tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D burmani 72

xii

Hình 3.21 Con đường tổng hợp plumbagin từ tiền chất tyrosine thông qua các đơn vị

acetate [39] 73

Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự tích

lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 74

Hình 3.23 Sinh tổng hợp plumbagin ở Drosera và một số yếu tố tác động lên quá trình

sinh tổng hợp 76

1

PHẦN MỞ ĐẦU

Tên đề tài/dự án: NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ SẸO VÀ DỊCH HUYỀN PHÙ

CÂY BẮT RUỒI DROSERA BURMANI VAHL NHẰM THU NHẬN

PLUMBAGIN

Chủ nhiệm đề tài/dự án: QUÁCH NGÔ DIỄM PHƯƠNG

Cơ quan chủ trì: Trung tâm phát triển khoa học và công nghệ trẻ

Thời gian thực hiện: 12 tháng

Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng

Kinh phí đã cấp: 70 triệu đồng theo TB số: TB-SKHCN ngày /

Mục tiêu:

Do vậy, đề tài đã ra đời với nhu cầu thiết yếu của nó nhằm mục tiêu:

Bảo tồn nguồn cây Drosera vốn khan hiếm;

Khai thác tiềm năng dược tính của 1 loài cây hoang dại ở Việt Nam;

Đáp ứng nhu cầu thực vật cũng như về dược chất 1 cách chủ động

Nội dung thực hiện:

Với đại diện là cây bắt ruồi D burmani Vahl được thu hái ở Việt Nam, chúng tôi đã

thành công:

Thiết lập thành công quy trình vi nhân giống;

Sàng lọc, thu nhận và chứng minh cấu trúc của plumbagin, vốn là hoạt chất

có giá trị dược tính cao từ nguồn nguyên liệu in vitro của loài Drosera này

Áp dụng được 1 quy trình định lượng plumbagin thích hợp bằng phương pháp HPLC

Tạo hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D burmani (thông qua mô sẹo

và trực tiếp từ lớp mỏng tế bào)

Tối ưu hóa được điều kiện nuôi cấy dịch huyền phù D burmani để thu được

dịch huyền phù có hàm lượng plumbagin cao nhất:

Loại bỏ 2,4-D trong thành phần môi trường nuôi cấy đều là những kỹ thuật

giúp gia tăng tích lũy plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D burmani

Trong đó, việc loại bỏ 2,4-D (từ ngày thứ 8 trở đi) có ảnh hưởng rõ nhất đến

khả năng tích lũy plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D burmani, giúp

tăng hàm lượng plumbagin lên gấp 2,58 lần

Sản phẩm:

Quy trình tạo dịch huyền phù D burmani làm nguồn nguyên liệu thu nhận

plumbagin:

1 Sinh khối tế bào D burmani trong dịch huyền phù đạt 64.3g/lít

2 Hoàn toàn không bị tạp nhiễm

3 Thời gian nuôi cấy từ cây con in vitro cho đến khi thu được dịch

huyền phù ổn định là 3 tháng

4 Hàm lượng plumbagin được xác định khoảng 0.05% FW (so với trọng lượng tươi sinh khối)

Bài báo: 3 bài

1 Nhân giống in vitro Cây Bắt ruồi Drosera burmani Vahl để thu nhận

một hợp chất quinone có hoạt tính sinh học Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ, ĐH Quốc gia TP HCM.Tập 10, tháng 4/2007, trang 59-66

2 Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây Bèo đất Drosera

burmani Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone Tạp chí Phát triển Khoa

học & Công nghệ, ĐH Quốc gia TP HCM Tập 13, tháng 2/2010,

trang 53-61

4

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm giống thực vậtDrosera

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, Droserathuộc: [9]

Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Magnoliophyta (Ngọc Lan) Lớp: Magnoliopsida (Ngọc Lan)Phân lớp: Rosidae (Hoa Hồng) Bộ: Caryophyllales Họ: Droseraceae

Giống: Drosera

Tên tiếng Anh: Sundew, Sondou, Doublom

Droseralà giống thực vật chiếm số lƣợng loài nhiều nhất trong nhóm thực vật ăn

thịt, với hơn 188 loài [77] Năm 1994, Seine và Barthlott đã chia các loài thuộc

giống Droseravào 11 nhóm (section) thuộc 3 phân giống (subgenus) (hình 1.1) Phân giống Drosera: là phân giống lớn nhất, các loài thuộc phân giống này đƣợc chia thành 7 section gồm Drosera, Ptycnostigma, Thelocalyx,

Phycopsis, Bryastrum, Lasiocephala, Coelophylla

Phân giống Ergaleium: các loài thuộc phân giống này đƣợc chia thành 3 section gồm Stoloniferae, Erythrorhizae, Ergaleium

Phân giống Regiae: chỉ gồm 1 loài duy nhất là D regiae thuộc section

Regiae

5

Hình1.1 Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên trình

tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome [122]

1.1.2.2 Trong nước

Theo sách Phạm Hoàng Hộ, người ta đã từng tìm thấy 3 loài Droseraở Việt Nam là

D indica L, D peltata, D burmaniVahl [4] Tuy nhiên, cho đến nay, người dân chỉ

tìm thấy và sử dụng 2 trong số 3 loài này (D indica, D burmani) như những vị thuốc dân gian [5] Hai loài Droseranày xuất hiện nhiều ở các tỉnh miền Bắc, Bắc

Trung Bộ (Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh), khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phước Bửu thuộc tỉnh Bà Rịa Vũng Tàuvà khu du lịch sinh thái Bắc Bình, Bình Thuận

7

1.1.3 Đặc điểm hình thái

1.1.3.1 Thân

Hầu hết các loài Droserađều là thân thảo, mềm, mảnh, hình dạng nhỏ Tuy nhiên,

hình thái của chúngrất đa dạng tùy vào kết cấu của thân:

Thân trên mặt đất, phân nhánh hay không phân nhánh, thân có thể ngắn hay dài (chiều cao có thể từ 1cm đến 2-3m tùy loài), thẳng hay ở dạng xoắn (hình 1.3a) Thân tiêu biến, chỉ có lá kết cụm từ một điểm tạo thành dạng hoa hồng úp xuống hay ngược lên trên mặt đất (hình 1.3b)

Thân rễ hay thân củ ở dưới đất, lá và cuống lá tủa ra từ thân tạo thành các phiến mỏng xòe rộng ra từ một điểm (hình 1.3c)

Hình 1.3 Các dạng cấu trúc thân của Drosera

8

1.1.3.2 Lá

Lá có chiều dài lá từ 0,5cm (D pygmaea) đến 60cm (D binata) Lá có nhiều hình dạng khác nhau tùy từng loài (hình 1.4), chủ yếu ở 2 dạng: hình ovale (D

erythrorhiza) hay hình kim (D binata) Lá mọc cụm về một điểm nhƣ dạng hoa

hồng hay mọc luân phiên đối với loài có thân trên không Lá kèm có thể phát triển

hay kém phát triển, đôi khi tiêu biến tùy từng loài Đặc trƣng của lá Drosera là có

nhiều lông tơ có tuyến bao phủ khắp bề mặt phiến lá của chúng.Lông tơ mang nhiều tuyến tiết này đƣợc tạo bởi một cuống dài, nhỏ, có cấu trúc đa bào và đầu mút tua cuốn đƣợc tạo bởi 2 lớ ến Chất keo dính đƣợc tiết ra từ các tế bào tuyến xuyên qua lớp biểu bì tạo thành những giọt keo (dạng dịch nhầy) ở đầu mút tua cuốn giúp cây bắt dính và tiêu hóa con mồi

Hình 1.4 Các hình dạng khác nhau của lá và lông tuyến Drosera [127]

9

1.1.3.3 Rễ

Hệ thống rễ của hầu hết các loài Droseratương đối đơn giản: rễ chùm nhưng chỉ có

một vài nhánh Ở một số loài, rễ của chúng được gọi là rễ giả vì chủ yếu chỉ giữ chức năng như 1 cơ quan hút nước, cung cấp nước cho cây và giúp cho cây bám được vào đất, hoàn toàn không có vai trò trong hấp thu dinh dưỡng cho cây

Drosera ở Nam Phi sử dụng rễ của chúng chỉ để trữ nước và chất dinh dưỡng do

cây chuyển hóa Một số loài có hệ thống rễ thô và rắn chắc có thể sống sót qua mùa

đông lạnh cho dù thân cây của chúng đã chết.Một số loài khác như D adelae và D

hamiltonii sử dụng rễ của chúng cho mục tiêu nhân giống vô tính thông qua sự nẩy

chồi bất định dọc trên rễ.Còn Drosera ở Úc có thể tạo thành những dạng thân hành dưới đất giúp cây sống sót qua mùa hè khô hạn Rễ của loài Drosera có sắc tố

thường phát triển dài hơn nhiều so với chiều cao thân cây, một cây cao 1cm có thể

có rễ dài đến 15cm bám sâu dưới lòng đất D lasiantha và D scorpioides cũng có khả năng hình thành rễ bất định.D intermedia và D rotundifolia từng được công bố

có thể hình thành dạng cộng sinh với nấm Arbuscular mycorrhizas (AMs), giúp cây

dễ dàng hấp thu dinh dưỡng từ đất [77]

1.1.3.4 Hoa(hình 1.6)

Lưỡng tính, nhỏ, có dạng tỏa tia, mỗi phát hoa có 3-20 hoa [127].Cũng như hoa của

các loài thực vật ăn thịt khác, hoa Droserathường được giữ ở vị trí cao hơn nhiều so

với lá của chúng nhờ cuống hoa hay thân Sự sắp đặt tự nhiên này ban đầu được cho

là sự thích nghi của cây để tránh bắt nhầm những tác nhân gây thụ phấn tiềm năng

Nhưng gần đây, nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng Droseracuốn hút côn trùng làm

tác nhân thụ phấn và bẫy con mồi làm thức ăn với hai kiểu khác nhau [82] Do đó,

có thể nói rằng sự sắp đặt tự nhiên của vị trí hoa Drosera(cuống hoa dài) nhằm giúp

nâng hoa lên một vị trí mà ở đó có thể nhận diện được tác nhân thụ phấn cho chúng một cách an toàn Hoa nở chỉ khi chúng đáp ứng với sự nhạy cảm ánh sáng trực tiếp

và toàn bộ hoa tự cũng có tính hướng quang, thường di chuyển đến vị trí có ánh sáng mặt trời [27]

Cánh hoa: 5 cánh rời, hình nêm hay hình trứng, kích thước 5-10 x 3-4mm.Nói

chung, hoa thường có màu trắng, hồng hay hoa cà, có vân Các loài Droseraở Úc có dãy màu hoa rộng hơn, bao gồm cam (D callistos), đỏ (D adelae), vàng (D

zigzagia), tím (D microphylla) (hình 1.5) Hầu hết đều có cánh nhỏ (< 1.5cm),

ngoại trừ 1 số loài đặc biệt như D regia và D cistiflora có cánh rộng (>4cm) [27]

Đài hoa: 5 cánh, màu xanh ngả vàng, mọc từ đế, hình ngọn giáo ở đỉnh rồi thuôn

hẹp dần, kích thước 3-5x 1-2mm, mép liền, có tuyến tiết [127]

Bộ phận sinh dục đực: 5 chỉ nhị hình sợi, dài 3-5mm [127] Hạt phấn thường kết

lại với nhau thành từng đơn vị bộ bốn nhờ sự kết dính giữa các vách, đây là một cấu trúc duy nhất có ở thực vật hạt kín Bộ bốn hạt phấn này hoạt động như một đơn vị riêng biệt và một lượng nhiều hơn số hạt phấn này được xem như để tăng cường

khả năng tự thụ phấn, vì mỗi hoa trong cụm hoa Drosera nở ra chỉ trong vài giờ vào

buổi sáng.Hầu hết hoa tự thụ phấn nhờ côn trùng Nếu sự thụ phấn không diễn ra, hạt phấn và nhụy sẽ tự thụ phấn khi hoa khép cánh [99]

Bộ phận sinh dục cái: bầu nhụy dạng ống, trứng hay dạng cầu méo, có 3 thai tòa, 3

vòi nhụy dính nhau ở đế, thường uốn cong, hướng vào trong, đầu nhụy đơn giản [127] Bầu noãn thượng và chia ngăn, đính noãn ở vách.Noãn được xác định nhờ sự kéo dài của phôi tâm và những tế bào biểu bì mở rộng [99]

11

1.1.3.5 Quả nang và hạt

Quả nang: đường kính 2-6mm (hình 1.7), chứa nhiều hạt [127]

Hạt: hình ellip, hẹp như một đường thẳng hay hình cánh quạt.Droseracó vỏ hạt ít

phức tạp hơn so với Drosophyllum hay Dionaea Hạt có vẩy hình mắc lưới, cấu tạo

gồm 3 phần: 1 lớp vỏ hạt có nhiều lignin, 1 lớp nội nhũ có nhiều tinh bột, và 1 phôi nhỏ [99], [128] (hình 1.8).Hạt thu được sau một tuần từ khi hoa nở

Hình 1.7 Các dạng nang chứa hạt của Drosera [125]

Hạt non và chín

Hình 1.8 Hình thái hạt Drosera [56]

Hình thái hạt D indica (mắc lưới 6 canh thẳng) và D

burmani (mắc lưới 4 cạnh không thẳng)

12

1.1.4 Đặc tính sinh học

1.1.4.1 Điều kiện sống

Khí hậu: Drosera thích nghi với các vùng khí hậu khác nhau.Chủ yếu là những nơi

ẩm ướt như những vùng đất thấp lầy, bờ ao, bờ sông hay những vùng đất cao, thoáng đãng nhưng có độ ẩm cao; thậm chí có thể chịu được úng ngập nhưng không thể chịu được khô hạn do hệ thống rễ của chúng cạn, khó ăn sâu vào trong đất tìm mạch nước ngầm [99], [123]

Đất đai:sống được ở hầu hết các điều kiện đất đầm lầy, sỏi, cát, đất acid Đất trồng

Drosera là một hỗn hợp gồm 3/4 đất mùn + 1/4 cát, cát sạch, cát trộn bột than gỗ

pH: cây chịu được môi trường acid (pH3) đến môi trường trung tính (pH7), nhờ đó

cây có thể sống được trên những vùng đất than bùn, có tốc độ phân giải của các hợp chất hữu cơ thấp [99]

Độ ẩm: 50 - 80%, độ ẩm thấp hơn sẽ làm mất giọt keo dính đầu lông tiết

Nhiệt độ: chịu được nhiệt độ cao (>300

C) vào mùa hè, và thấp ( 50C) vào mùa đông [99]

Ánh sáng:cây thích hợp với ánh sáng trực tiếp, tối thiểu từ 6 - 8 giờ chiếu sáng một

ngày Khi cây sống ở nơi có cường độ ánh sáng cao thì toàn bộ cây sẽ chuyển sang màu đỏ Nếu cây không nhận đủ ánh sáng thì tua cuốn sẽ có màu xanh

Nhu cầu dinh dưỡng: trong những điều kiện tự nhiên, Drosera mọc hầu hết trên

các cơ chất acid, thường thiếu nitrogen và phosphor.Mặt khác, nồng độ muối cao sẽ ngăn cản sự tăng trưởng của cây, ảnh hưởng này biểu hiện rõ hơn sự thiếu hụt côn trùng trong môi trường [105] Côn trùng là một nguồn bổ sung nitrogen có giá trị Cây sẽ tăng trưởng tối đa khi được cung cấp côn trùng; trong khi đó nếu bổ sung nitrogen vô cơ, cây sẽ tăng trưởng chậm hơn và sự trổ hoa thường sẽ bị ức chế Nhiều nghiên cứu cho thấy nitrogen là một nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho

Drosera [60]

13

1.1.4.2 Cơ chế bắt côn trùng

Phương tiện bẫy mồi:cáibẫy mồi của những loài cây này bao gồm rất nhiều những

lông tơ mang tuyến tiết trên bề mặt lá và thân cây (hình 1.9A), những tuyến tiết này tiết ra nhiều giọt giống như keo (dew-drop) (hình 1.9B) thu hút côn trùng Giọt keo này không bị khô và mất đi dưới ánh nắng mặt trời, chính vì lý do này mà loài cây này được đặt tên “sundew” [32] Tế bào tiết của những tuyến tiết sản sinh ra nhiều enzyme thủy phân protein, chẳng hạn như protease, acid phosphatase.Khi tuyến tiết được kích hoạt, các enzyme này sẽ được hoạt hóa và được tiết ra ngoại bào cùng với một dịch nhầy.Dịch nhầy được tiết ra bởi tuyến lông (không có những tuyến riêng biệt để tiết enzyme và chất nhầy), chính chất nhầy này sẽ giữ vai trò bẫy mồi cũng như tiêu hóa chúng [99]

Hình 1.9 Phương tiện và cơ chế bắt côn trùng của D indica L

A: Lông tơ trên bề mặt lá và thân cây [129], B: Giọt keo dew-drop [129], C: Con mồi bị thu hút và đến gần lá cây [120], D: Giọt keo bắt dính con mồi [120], E: Lông tiết cúi gập, giữ chặt con mồi [120]

E

14

Cơ chế bẫy mồi: con mồi bị thu hút, đến gần lá cây, lập tức sẽ bị những giọt keo bắt

dính ở đó (hình 1.9C,D).Chất keo dính này không độc, không gây chết con mồi, chúng chỉ có vai trò bắt dính con mồi và tạo áp lực kéo các lông tiết cuộn gập xuống Lông tiết phần do áp lực của các giọt keo, phần do nhạy cảm với protein sẽ cúi gập, giữ chặt con mồi (hình 1.9E) Tuyến tiết khi đó ngừng tiết dịch keo dính và tiết nhiều enzyme thủy phân tiêu hóa con mồi Sản phẩm tiêu hóa mau chóng được

lá hấp thụ, cung cấp chất dinh dưỡng từ con mồi cho cây [32]

Hình thức sinh sản:chủ yếu là loài cây một năm [127], với 2 hình thức sinh sản:

Hữu tính (bằng hạt) [59]: cây có thể tự thụ phấn hay thụ phấn nhờ gió và côn

trùng Hạt được phóng thích khi trái chín rục Bên trong hạt thường có không khí

nên chúng có thể trôi nổi trong nước nhiều ngày, giúp giống Droserađược phát tán

đến nhiều nơi theo dòng nước

Vô tính (bằng mầm) [99]: một số loài sundew ở Úc (như D dichrosepala và D

pygmaea)lại phát sinh mầm Mầm đại diện cho những cơ quan đặc biệt trong sinh

sản vô tính, có chức năng và thậm chí có cấu trúc tương tự như hạt.Mầm tượng trưng cho những đầu chồi mầm bị rụng mà chính những đầu chồi mầm này sẽ hoạt động sinh sản giống như hạt, chỉ khác là không có quá trình thụ tinh xảy ra.Kiểu sinh sản vô tính này trước đây đã được mô tả ngắn gọn bởi Slack (1980) [104] và Lowrie (1989) [72], họ cho rằng mầm bao gồm mô sinh dưỡng và những cấu trúc lá

và rễ phát sinh phôi.Nhiều dữ liệu cho thấy ở Droserakiểu sinh sản vô tính có hiệu

quả hơn hữu tính: mất ít thời gian hơn (70-90 ngày), trong khi hạt phải mất 120-150 ngày, nẩy chồi có hiệu quả (80-100%) chỉ trong vòng 7-14 ngày [99]

1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112]

Mỹ: tất cả đều đã được liệt trong danh sách thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở các

tiểu bang [USDA,2006] May mắn là một số ít quần thể Droseravẫn được duy trì

bảo vệ tốt trong những khu sinh thái thiên nhiên được bảo tồn như Vườn Quốc gia, Khu bảo tồn sinh vật hoang dã

15

Châu Âu: nhiều loài Droserađã được bảo vệ bằng luật pháp (Đức, Áo, Thụy Điển,

Cộng hòa Séc, Phần Lan, Hungary, Pháp, Bulgaria)

Ở Nam Phi và Úc: hai trong số ba trung tâm phát triển về sự đa dạng và sinh thái tự

nhiên của giống cây này đã và đang phải chịu một áp lực lớn từ những hoạt động sống của con người Hạn hán từng xảy ra ở nước Úc hơn 10 năm qua và cũng đã

nâng cao đáng kể mối đe dọa tuyệt chủng cho một số loài Droseraở đó

Madagascar: một số loài Droseralà loài đặc hữu của nước này, nhưng hiện đang

trên đà có nguy cơ tuyệt chủng do không được bảo vệ và liên tục bị thu hái phục vụ cho sản xuất dược liệu Hằng năm, 100-200 triệu cây được thu hái làm dược liệu

1.1.6 Thành phần hóa học

1.1.6.1 Naphthoquinone

Droserathiên nhiên (bảng 1.1) cũng như in vitro(bảng 1.2) có thể sản sinh 2 loại

naphthoquinone chính là: plumbagin và 7-methyljuglone [64].Sự hiện diện và hàm lượng của chúng đã được sử dụng như những đặc trưng (marker) hóa học để phân

loại thực vật ở các loài Drosera [26] Crouch và cộng sự (1990) [25] đã công bố hàm lượng plumbagin trong D natalensis và D capensis thiên nhiên chiếm khoảng

0,0025%, và 0,0048%FW Mặt khác, Repcák và Galambosi (1994) [95] cũng đã

chứng minh trong D rotundifolia và D anglica ở Phần Lan sự hiện diện của

7-methyljuglone, hàm lượng hợp chất này trong cây thay đổi tùy thuộc vào sự phát triển và sinh lý của lá Họ khảo sát thấy hàm lượng 7-methyljuglone cao nhất trong

lá non (2,7%DW ở D rotundifolia và 2,1%DW ở D anglica) và hàm lượng này giảm trong lá trưởng thành (0,8-1,2%DW ở D rotundifolia và 0,6-1,6%DW ở D

anglica).Hơn nữa, ở những lá có nhiều sắc tố đỏ, hàm lượng các naphthoquinone

này thấp (0,04-0,1%DW ở cả hai loài) Ngoài ra, Droseracòn tổng hợp được một số

naphthoquinone vi lượng khác như droserone, hydroxydroserone và nhiều naphthoquinone glucoside (bảng 1.3) mà không tìm được ở các loài khác [99]

Bảng 1.3.Các naphthoquinonevi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera [99]

a: Sản phẩm chuyển hóa sinh học thu được từ dịch chiết với dung môi hữu cơ

17

Hình 1.11 Một số flavonoid và flavonoid glucoside có trong Drosera

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside

tách chiết từ các loài Drosera [22]

1.1.6.2 Flavonoid

Drosera còn chứa phổ rộng các flavonoid, flavonoidglucoside nhƣ quercetin,

isoquercitin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin,…(hình 1.12) [99] D

rotundifolia và D anglica thiên nhiên ở Phần Lan đƣợc đem phân tích hàm lƣợng

flavonoid aglycone bằng HPLC, trong đó thành phần quercetin chiếm 3,6-6,4%DW

ở cả 2 loài, trong khi thành phần kaempferol chỉ chiếm 0,07-0,45%DW Cả 2 flavonoid đều có ở lá, thân, và hoa nhƣng chủ yếu ở hoa [82], [105] Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside đã đƣợc công bố tách chiết từ

Drosera đƣợc trình bày trong hình 1.11

Kaempferol

O

OH HO

O OH

OH

O

OH HO

O O

OH

OH

O OH

OH OH OH

Hyperin

O

OH HO

O OH

OH OH O

HO HO

CH2OH O OH

Gossypin Myricetin

O

OH HO

O OH

OH OH

18

1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng

1.1.7.1 Trong lãnh vực sinh thái, môi trường

D burmani Vahl thường mọc ở vùng đất chua, bạc màu nên trở thành loài chỉ thị

cho vùng có đặc tính này [99]

1.1.7.2 Trong nghiên cứu khoa học

Họ Droseraceae là một đối tượng điển hình cho các nghiên cứu về tiến hóa ở thực

vật.Bên cạnh đó, giống Drosera bao gồm rất nhiều loài thích nghi với từng điều

kiện môi trường khác nhau nên thích hợp cho những nghiên cứu về sự thích nghi cấu trúc và chức năng (dinh dưỡng từ côn trùng, sản sinh mầm) Ngoài ra, hạt phấn

của Drosera được tổ chức cố định thành bộ bốn, là trạng thái chuyển tiếp từ giao

phấn sang tự thụ phấn trong quá trình tiến hóa của hệ thống thụ phấn thực vật [99]

1.1.7.3 Trong y dược

Dịch chiết từ Drosera được chứng minh là có nhiều dược tính và những hoạt tính có giá trị ứng dụng khác (bảng 1.4) Cho đến nay, Drosera vẫn còn đang là đối tượng

thu hút các nhà khoa học về giá trị trị liệu của chúng Tháng 5/2009, V.Madhavan

và các cộng sự [73] vừa chứng minh được cả dịch chiết alcohol và dịch chiết nước

của D burmaniđều có khả năng chống thụ thai trên chuột (bảng 1.5) Tháng 10/2009, Hema B và cộng sự [49] đã khẳng định có thể sử dụng D burmaniđể điều

chế thuốc điều trị chứng co giật, động kinh với giá thành rẻ mà hạn chế tác dụng

phụ hơn so với thuốc tổng hợp

Ở những nước Châu Âu: Drosera được bán trên thị trường với dạng dược thảo

khô “Herba Droserae”, song cây trong tự nhiên không đủ cung cấp nhu cầu, họ

thường phải nhập khẩu các loài cây này từ các nước khác [30], chủ yếu từ Ấn Độ hay một số nước Châu Á tạo nên nguồn thu nhập có giá trị cho các nước này

Ở Ấn Độ: các loài như D indica, D burmani, D peltata được sử dụng như những

thành phần chính trong một số vị thuốc phachế mà dân địa phương thường gọi là

“Golden ash” [55]

19

Ở Trung Quốc: D burmani (tên thông thường là Cẩm Địa La) được người dân Vân

Nam dùng để chữa bệnh viêm ruột, lị, sưng, đau họng, ho do phổi nóng, khạc ra

máu, đổ máu mũi và trẻ em bị cam tích Ở Quảng Tây, toàn cây D burmanidùng để

trị đòn ngã, tổn thương và bệnh mề đay [6]

Ở Campuchia: D burmaniđược dùng để chế một loại thuốc trị bệnh nấm [1]

Riêng ở Việt Nam: theo Phạm Hoàng Hộ [5], chưa loài nào trong 3 loài Droseracó

ở Việt Nam được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như dược tính, song trong dân gian đã không ít người dùng chúng để chữa bệnh:

Năm 1958-1959, bệnh viện Vinh từng dùng D burmani dưới nhiều dạng khác

nhau (rượu thuốc, xirô, thuốc hãm, thuốc cao) chữa bệnh ho gà [6]

D burmaniđược công nhận có giá trị trong việc chữa những căn bệnh như: kiết

lị, lao hạch, cam tích (suy dinh dưỡng nhưng bụng chướng to ở trẻ em) [1], [5]

Ở Thanh Hóa, người dân thường ngâm D indica(Cỏ Mồ côi, cỏ Trói gà) trong

rượu để chữa chai chân, chúng làm mềm và làm bong các vết chai sần [6]

Bảng 1.4 Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera [99]

Chống lão hóa và xơ cứng động mạch Grieve (1959)

20

Hình 1.12.Một số hình thái lạ mắt của Drosera [131]

Bảng 1.5 Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây nhất của D burmani [73]

1.1.7.4 Trong công nghiệp

Ở một số nơi trên thế giới, dịch chiết Drosera được dùng làm đông tụ sữa do giàu hàm lượng acid hữu cơ và enzyme [99] Ngoài ra sắc tố của một số loài Drosera

còn được dùng để nhuộm vải [32]

Thân hành của những loài Drosera ở Úc được xem như một món ăn cao lương mỹ

vị có nhiều giá trị bổ dưỡng [120]

1.1.7.5 Trong đời sống tinh thần

Sự đa dạng về giống loài, sự lạ mắt về hình thái khiến Drosera đem lại giá trị kinh

tế khá cao trong thị trường hoa cảnh thế giới (hình 1.11)

địa phương, chưa được phổ biến rộng rãi Do vậy, nhu cầu nhân giống in vitrohay

thu nhận dược chất từ loài cây này ở Việt Nam chưa được biết đến, tình hình nghiên cứu về chúng chưa được đào sâu và còn khá mới mẻ

1.1.8.2 Ngoài nước

Bảng 1.6 Những nghiên cứu về nhân giống in vitrogiống Drosera

tham khảo

D rotundifolia

MS (Murashige and Skoog 1962); RM (Reinert and Mohr 1967)

22

Bảng 1.7 Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong

thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera

tham khảo

1994

Nuôi cấy in vitro D commnis St Hil trên môi trường

lỏng McC cho hàm lượng naphthoquinone = 0,17% DW Nuôi cấy trong bioreator 25l, sau 3 tháng thu được 1,2 kg

D communis tương ứng với 200mg plumbagin

[102]

1998

Cảm ứng tổng hợp và tiết plumbagin vào môi trường trên

dung dịch huyền phù tế bàoDrosophyllum lustitanicum

bằng chitin, chitosan, glucan

[83]

2001

Xác định hàm lượng naphthoquinone trên cây: Dionaea

muscipula (plumbagin: 5,3%), D rotundifolia

(7-methyljuglone: 0,6%), D binata (plumbagin: 1,4%) và D

capensis (7-methyljuglone: 0,5%),

[50]

Huyền phù tế bào D.muscipula trên môi trường (McC) có

bổ sung 2,4-D, NAA và tạo ra plumbagin (2,59%) sau 30 ngày nuôi cấy

Huyền phù tế bào D rotundifolia trên môi trường MS

không có naphthoquinone

2002

Tạo mô sẹo và nuôi cấy thành công dịch huyền phù tế bào

để thu nhậnplumbagin từ cây Drosophyllum lusitanicum

trên môi trường MS bổ sung 1mg/l IBAvà 0,5mg/l NAA

[57]

2007

Tăng tích lũy quercetin (1,6-2 lần) bằng chiến lược bổ

sung L-phenylanine vào môi trường nuôi D capensis,

Dionaea muscipula

[68]

2008

Tăng tích lũy naphthoquinone và flavonoid trên cây

Dionaea muscipula, D capensis nuôi cấy in vitro bằng

cách sử dụng những chất cảm ứng: khi bổ sung acid

jasmonic, A rhizogenes lysate, phenylalanine, giảm lượng

nitrogen, thì hàm lượng plumbagin, ramentaceone, quercetin tăng từ 1,9 đến 4 lần

[68]

2008 Cảm ứng 7-methyljuglone trên cây D capensis in vitro, in

2010

Sử dụng elicitor (cao nấm men, methyl jamonate) trong

nuôi cấy D burmani làm tăng tích lũy plumbagin lên 3,5

lần

[91]

McC (McCowns Woody Plant); DW: sinh khối khô, MS (Murashige and Skoog 1962)

Theo kết quả từ bộ sưu tập các loài thực vật, Drosera trên thế giới được tìm thấy

trong thiên nhiên tương đối hiếm [58].Ở nhiều quốc gia, loài cây này được bảo vệ bằng luật pháp vì nguồn cây ngoài thiên nhiên đang có mối đe doạ tuyệt chủng

23

[21].Vì vậy, những phương pháp công nghệ sinh học dựa trên việc nuôi cấy tế bào

in vitrođược xem là cách nhân giống bảo đảm được số lượng cần thiết, cung cấp

nguồn dược liệu quan trọng.Đồng thời việc sản xuất naphthoquinone từ cây in

vitrocũng được đánh giá là mang lại kinh tế cao Hầu hết những nghiên cứu trước

đây về nuôi cấy mô Drosera đều chú trọng đến nhu cầu dinh dưỡng và kỹ thuật vi

nhân giống Với nhiều nỗ lực, người ta cũng đã thu được nhiều kết quả tốt trên một

số loài Drosera (bảng 1.6), mục đích vẫn là tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy [19], [59], để sản sinh hàm lượng naphthoquinone in vitro cao hơn (bảng 1.7) [20]

1.2 Nuôi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures)

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của

tế bào thực vật khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện in vitro một cách có định hướng

thành những cấu trúc biệt hóa hay chưa biệt hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật [34]

Sự phát sinh hình thái in vitro trong nuôi cấy tế bào thực vật có thể được chia thành

hai con đường chính: phát sinh cơ quan (chồi hay rễ) và phát sinh phôi

1.2.1 Sự phát sinh cơ quan

Sự phát sinh cơ quan có thể được thực hiện từ chồi hiện diện sẵn hay từ sự tạo mới Các chồi tận cùng và các chồi nách hiện diện sẳn, ở trạng thái hoạt động hay nghỉ,

có thể phát triển in vitro Một mô cấy chứa một chồi duy nhất có thể phát triển

thành một chồi hay cụm chồi, tùy thuộc vào loài, trạng thái sinh lý của mô cấy và môi trường nuôi cấy [10]

Nuôi cấy mô phân sinh ngọn là một phương pháp hiệu quả trong vi nhân giống, sản xuất cây sạch bệnh bảo tồn và lưu trữ nguồn gen Sự phát sinh cơ quan chịu ảnh hưởng bởi tuổi, trạng thái sinh lý của mô cấy của chính những cơ quan bên dẫn xuất

từ mô phân sinh ngọn và sự thay đổi của các điều kiện môi trường, đặc biệt là vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng [10]

24

Kích thích sự phát triển của chồi hiện diện sẵn là phương pháp vi nhân giống chậm, nhưng thông dụng, dễ áp dụng nhất trong hầu hết các loài thực vật, đặc biệt đối với cây gỗ Trước sự phân hóa để tạo tầng phát sinh của chồi được tạo mới, tiền mô phân sinh hay tế bào phân hóa đều phải qua sự tái hoạt động Sự tái hoạt động này

có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng sự đàn áp các hiệu ứng cản tương quan (thí dụ: cắt bỏ vùng ngọn để gỡ ưu tính ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường thích hợp Sự tái hoạt động gồm hai giai đoạn: khử phân hóa và tái phân hóa [10] Trong sự tạo mới chồi từ các tế bào lá đã phân hóa, người ta cho rằng có sự hiện diện của các nhóm tế bào đặc biệt, gọi là mô đích.Các tế bào này là nơi nhận các thông tin hóa học, đặc biệt là các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: nếu auxin có tác dụng tạo rễ đối với các mô quanh mạch (nguồn gốc nội sinh của rễ) thì cytokinin

có tác dụng tạo chồi đối với các mô ngoại vi (nguồn gốc ngoại sinh của chồi).Tỷ lệ auxin/cytokinin xác định một chương trình phát sinh hình thái (rễ hay chồi) [46] Trong phần lớn trường hợp, sự hiện diện của cytokinin giúp cho sự tạo chồi và cản

sự tạo rễ Do đó, môi trường cảm ứng tạo rễ phải là môi trường khác và đôi khi phải qua nhiều lần cấy chuyền trên môi trường không có cytokinin

1.2.2 Sự phát sinh phôi thể hệ

Sự phát sinh phôi thể hệ là con đường trung tâm của vi nhân giống ở thực vật và có vai trò đặc biệt quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh hình thái thực vật Thu nhận phôi thể hệ thường bao gồm hai giai đoạn: tạo các tế bào sinh phôi (mô sẹo, dịch huyền phù tế bào) và tiến hóa phôi từ các tế bào sinh phôi [11]

Sự tạo mô sẹo:

Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân

chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan Do

đó, các phần non của cơ thể thực vật dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in

vitro, dưới tác động của một auxin mạnh (như 2,4-D) được áp dụng riêng rẽ hay kết

hợp với auxin khác hay với cytokinin [46]

25

Nói chung, sự tạo mô sẹo in vitro thuộc một trong ba quá trình: sự phản phân hóa

của tế bào nhu mô, sự phân chia của tế bào tượng tầng hay sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi Để tạo mô sẹo, cần chú ý đến tuổi của mô cấy, sử dụng auxin riêng lẻ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ auxin [10]

Sự tạo dịch huyền phù tế bào:

Dịch huyền phù tế bào là dịch chứa các tế bào cô lập và các nhóm nhỏ tế bào phân tán, di chuyển trong một môi trường lỏng di động.Dịch huyền phù tế bào thường được khởi phát bằng cách đặt mô sẹo (được tạo trên môi trường đặc) vào môi trường lỏng được lắc.Giống như đối với mô sẹo, môi trường tạo dịch huyền phù tế bào thường có một hay vài loại auxin, kết hợp với cytokinin hay không [10]

Dịch huyền phù tế bào lý tưởng có sự phân chia tế bào tích cực, sự cân bằng tốt giữa hai quá trình tạo nhóm và tách rời tế bào, có tính đồng nhất cao về hình thái và sinh hóa Dịch huyền phù tế bào lý tưởng là một dịch mịn, hầu như chỉ bao gồm các

tế bào có khả năng sinh phôi, cô lập hay hợp lại thành từng nhóm nhỏ chứa từ vài đến vài chục tế bào.Tế bào có khả năng sinh phôi là các tế bào nhỏ, hình cầu với tế bào chất đậm đặc, nhân to, lượng protein dự trữ lớn và một vài hạt tinh bột [46]

Sự thu nhận phôi thể hệ:

Phôi thể hệ là phôi được tạo từ tế bào thể hệ (tế bào sinh dưỡng, 2n), theo con đường sinh phôi thể hệ Trong sinh phôi thể hệ, tế bào thể hệ đóng vai trò sinh phôi như hợp tử và sự phát triển phôi cũng qua các giai đoạn như trong sinh phôi hợp tử

Sự hiện diện của phôi thể hệ là điểm kết thúc của một chuỗi các bước tăng trưởng bao gồm thu nhận các tế bào có khả năng phát sinh phôi và biệt hóa tế bào [107]

26

2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nuôi cấy in vitrođể tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu

2.1.1 Vật liệu

Nguyên liệu nuôi cấy: trái chứa hạt của D burmaniđược thu thập từ khu bảo tồn

thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu (tỉnh Bà Rịa–Vũng Tàu).Việc định danh mẫu thu hái được tiến hành bởi BM Thực vật học (nay là BM Sinh thái và Sinh học tiến hóa) của Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP HCM (phụ lục 2.1)

Hoá chất khử trùng: Javel + Tween-20 (0,01%v/v)

Chất điều hòa tăng trưởng thực vật: BA

Môi trường nuôi cấy: MS (phụ lục 1.1), bổ sung: đường sucrose (30g/l), than hoạt

tính (1g/l), casein hydrosylate (100 mg/l), agar khi sử dụng môi trường rắn (7g/l),

pH = 5,8 ± 0,1 (được chỉnh bằng NaOH 1N hay HCl 1N).Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm, 1210

C, trong 30 phút

Điều kiện nuôi cấy: chiếu sáng trong 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là

2800±200 lux, nhiệt độ phòng nuôi cấy khoảng 22-250C và ẩm độ trung bình là 70%

2.1.2 Phương pháp

2.1.2.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy

D burmani thu hái ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phước Bửu có bề mặt thân

và lá phủ đầy lông tơ mang tuyến tiết với giọt “dew drop” có chất dính ở đầu và mang vô số vi sinh vật khác nhau Do vậy, để có mẫu cấy vô trùng, chúng tôi phải

nuôi cấy cây trưởng thành trong điều kiện in vitro từ bộ phận khác dễ khử trùng hơn

là trái chứa hạt, rồi mới sử dụng các mẫu cấy từ cây trưởng thành in vitrođó Để có

sự đồng nhất về di truyền, các mẫu cấy sử dụng trong cùng một thí nghiệm sau đó đều có nguồn gốc từ một cây trưởng thành ban đầu này

27

Hình2.1 Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bên [7]

Trái chứa hạt D burmaniđược khử trùng theo các bước: đốt nhanh trái qua đèn cồn

cho cháy hết lông tơ bên ngoài, sau đó rửa bằng nước cất vô trùng 2-3 lần, rồi lắc trong ethanol 70% trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3-5 lần trước khi lắc trong dung dịch khử trùng gồm Tween-20 (0,01%v/v) và Javel (10% v/v), sau 10 phút rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-7 lần, cuối cùng tách

bỏ vỏ của trái đã khử trùng để lấy hạt chứa bên trong, đem hạt ngâm trong dung dịch giberelin 1% trong 24 giờ trước khi gieo hạt trên môi trường MS rắncó bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1

2.1.2.2 Nhân giống bằng chồi bên (hình 2.1)

Cây con nẩy mầm từ hạt sau khoảng 4 tuần nuôi cấy được cô lập chồi ngọn và chồi bên trong môi trường MS rắncó bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1, cùng với các nồng độ BA khác nhau (0; 0,1;0,5;1; 2; 3mg/l)

Sau 5 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ mẫu tạo chồi bên, số chồi bên được tạo thành trên một mẫu, chiều cao trung bình chồi Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức với nồng độ BA khác nhau như đã đề cập; mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một bình, mỗi bình chứa 100ml môi trường và 10đốt thân

2.1.2.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào (hình 2.2)

Các bộ phận lá, cuống lá, cuống hoa, của cây con D burmani nẩy mầm từ hạt sau

khoảng 4 tuần nuôi cấy được cô lập, cắt thành những lớp mỏng (3-4mm) và được

28

Hình2.2.Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bất định [64]

cấy vào môi trường MS rắn có bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1, cùng với nồng độ BA khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5mg/l)

Sau 5 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ mẫu tạo chồi bên, số chồi bên được tạo thành trên một mẫu, chiều cao trung bình chồi Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức với nồng độ BAkhác nhau như đã đề cập; mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một bình, mỗi bình chứa 100ml môi trường và 5 mẫu cấy lớp mỏng ban đầu

2.1.2.4 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh

Chồi con tách ra từ cụm chồi mẹ được tạo thành ở D burmani sau 4-6 tuần nuôi cấy

có thể phát triển thành cây con hoàn chỉnh với đầy đủ các bộ phận trên môi trường

MS lỏng bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1, kể cả rễ mà không cần đến việc bổ sung auxin

2.2 Sàng lọc và thu nhận plumabgin từ nguồn nguyên liệu in vitrocủa D.burmani: tìm hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào bằng

phương pháp Sulforhodamine B (SRB)

Vật liệu: mẫu cần sàng lọc được pha loãng bằng dung môi DMSO 0,25%, dòng tế

bào ung thư ruột kết ở người DLD-1 được cung cấp bởi American Type Culture Collections, McCoy’s 5A media w GlutaMaxTM (10% FBS), D-PBS, Gemtamicin

và Trypsin của hãng Gibco, SRP 0,2%, TCA 50%, acid acetic 1%, Tris-base 10mM

và hoạt chất resveratrol của hãng Sigma (60µM) pha trong DMSO 0,25% làm chứng dương [14], [17], [67]