khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo cpg thuộc vùng promoter của các gene brca1, p16ink4a, rassfia, cyclin d2 và gstp1 trên các bệnh nhân bị ung thư vú

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Breast cancer is the common cause of death among women in most countriesworldwide, with rapidly increases in the developing countries, including Vietnam.The b

BÁO CÁO NGHI M THU

RASSF1A, CYCLIN D2 VÀ GSTP1 TRÊN CÁC B NH NHÂN B

UNG TH VÚ

Ch nhi m tài: PGS.TS Lê Huy n Ái Thúy

TS.BS oàn Th Ph ng Th o

THÀNH PH H CHÍ MINH THÁNG 1/2014

3.4 N i dung 4- Kh o sát in silico các o CpG thu c vùng promoter c a các gen

BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1

58 3.5 N i dung 5 - Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c vùng

promoter c a các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng

Methylation-specific-PCR

71

3.6 N i dung 6 - Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c vùng

promoter c a các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng gi i

trình t s n ph m Methylation-specific-PCR

82

TÓM T T N I DUNG NGHIÊN C U

Ung th vú là m t c n b nh ph bi n và là nguyên nhân gây ch t hàng u ph

m c b nh này trên th gi i B nh v n ang có xu h ng gia t ng trên th gi i, c

bi t là các n c ang phát tri n trong ó có Vi t Nam Nghiên c u s d ng k thu tMethylation-specific PCR (MSP) kh o sát m c methyl hóa trên 200 m u mô

nh c sinh thi t t các b nh nhân ung th vú và 20 m u mô vú lành tính thu th p

b nh vi n i h c Y D c thành ph H Chí Minh Các gen BRCA1 (gen s a ch a DNA), p16 INK4a và Cyclin D2 (nhóm gen u hòa chu trình t bào), GSTP1 (gen gi i c), và RASSF1A (gen è nén u) c ch n ki m tra t n s methyl hóa

t qu cho th y t l methyl hóa c a các gen BRCA1 là cao nh t chi m 85%.

Ti p theo là các gen Cyclin D2, p16 INK4a , GSTP1 và RASSF1A có t l methyl hóa l n

t 57.5, 48.5, 46.5 và 40% Tính ch t methyl hóa trên n m gen kh o sát u là c

m c tr ng c a b nh ung th vú, và c ánh giá là làm t ng nguy c d n n

nh Kh n ng phát hi n s methyl hóa trong m u b nh ng i Vi t Nam là r t caokhi sàng l c cùng m t lúc n m gen b i bao ph t 100% trên s m u kh o sát

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Breast cancer is the common cause of death among women in most countriesworldwide, with rapidly increases in the developing countries, including Vietnam.The best opportunity for improving the survival is thought to be had an early detectionthrough the promising biomarker: DNA hypermethylation In present study, with theaim towards using the hypermethylation at CpG islands of promoter of candidategenes as the biomarker for Vietnamese population, sensitive methyl specific PCR(MSP) was carried out to analyze the hypermethylation status of the panel of five

genes including BRCA1, p16 INK4 , GSTP1, RASSF1A and Cyclin D2 in 220 samples

including 200 breast cancer specimens and 20 normal breast tissues from anotherdisease (not breast cancer) which were obtained Ho Chi Minh City Medical Hospital,Vietnam The results indicated that the hypermethylation of one or more genesoccurred in all total of 200 tumor specimens (100% diagnostic coverage), considered

to be a specific characteristic of Vietnamese breast cancer patients, with thefrequencies for methylation of each genes were 85, 57.5, 48.5, 46.5 and 40% for

BRCA1, p16 INK4 , GSTP1, RASSF1A and CyclinD2 gene, respectively.

DANH SÁCH CÁC CH VI T T T

5’UTR 5‘ Untranslated Region

3’UTR 3‘ Untranslated Region

BRCA1 Breast cancer susceptibility 1

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

GSTP1 Glutathione S-transferase Pi-1

IDT Integrated DNA Technology (công ty IDT)

mRNA messenger Ribonucleic acid

NCBI National Center for Biotechnology Information

RASSF1A Ras association domain family 1 isoform A

DANH SÁCH B NG

Trang

ng 1.1 Danh sách ch n l c các biomarker ti m n ng cho ung th 13

B ng 1.2 Khái quát các nghiên c u v n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và

p16 INK4a

25

ng 3.9 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen BRCA1 v i

các y u t c n lâm sàng và c m gi i ph u b nh trên b nh nhân ung th vú

84

ng 3.10 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen Cyclin D2

i các y u t c n lâm sàng và c m gi i ph u b nh trên b nh nhân ung th vú

85

ng 3.11 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen GSTP1 i

các y u t c n lâm sàng và c m gi i ph u b nh trên b nh nhân ung th vú

86

ng 3.12 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen p16 INK4 v i

các y u t c n lâm sàng và c m gi i ph u b nh trên b nh nhân ung th vú

87

ng 3.13 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen RASSF1A

i các y u t c n lâm sàng và c m gi i ph u b nh trên b nh nhân ung th vú

88

ng 3.14 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen BRCA1 v i

tình tr ng bi u hi n Her2/neu và p53 trên b nh nhân ung th vú và lành tính

90

ng 3.15 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen Cyclin D2

i tình tr ng bi u hi n Her2/neu và p53 trên b nh nhân ung th vú và lành tính

91

B ng 3.16 M i t ng quan gi a l methyl hóa t i vùng promoter c a gen p16 INK4 v i

tình tr ng bi u hi n Her2/neu và p53 trên b nh nhân ung th vú và lành tính

92

ng 3.17 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen GSTP1 i

tình tr ng bi u hi n Her2/neu và p53 trên b nh nhân ung th vú và lành tính

93

ng 3.18 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen RASSF1A

i tình tr ng bi u hi n Her2/neu và p53 trên b nh nhân ung th vú và lành tính

ng 3.22 M c liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen p16 INK4a

Hình 1.5 T n s methyl hóa c a n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và

p16 INK4atrong ung th vú.

26

Hình 1.6: T n s methyl hóa c a n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và

p16 INK4atrong t bào bình th ng

27

Hình 1.7: T n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a các gen RASSF1A, GSTP1,

BRCA1, cyclin D2 và p16 INK4a trong ung th vú nói chung và phân chia theo các giai

Hình 3.6 Trình t gen RASSF1A và s phân b c a m t s nhân t phiên mã 60

Hình 3.9 Trình t gen BRCA1 và s phân b c a m t s nhân t phiên mã 61

Hình 3.12 Trình t gen Cyclin D2 và s phân b c a m t s nhân t phiên mã 63

Hình 3.15 Trình t gen GSTP1 và s phân b c a m t s nhân t phiên mã 64

Hình 3.18 Trình t gen p16 INK4a và s phân b c a m t s nhân t phiên mã 66

Hình 3.19: t qu ki m tra c hi u m i methyl/BRCA1 (WT3) b ng Methblast 68

Hình 3.20a. th bi u di n k t qu kh o sát m i methyl WT7, c tr ng cho gen

Hình 3.23 K t qu n di s n ph m MSP v i các c p m i methyl c hi u cho các gen

BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 trên 27 m u b nh ph m ung th vú

78

NG QUY T TOÁN tài: Kh o sát m c methyl hóa t i các o CpG thu c vùng promoter c a các gen

BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và p16 INK4atrên các b nh nhân b ung th vú

Ch nhi m: TS Lê Huy n Ái Thúy & ThS BS oàn Th Ph ng Th o

I Kinh phí c p trong n m th II: 190.000 190.000

II Kinh phí quy t toán trong n m II 190.000 190.000

PH N M U

1 Tên tài: Kh o sát m c methyl hóa t i các o cpg thu c vùng promoter c a

các gen BRCA1, p16 INK4 , RASSF1A, CYCLIN D2 và GSTP1 trên các b nh nhân b

gen BRCA1, p16 INK4A , RASSF1A, cyclin D 2 và GSTP1 trên các b nh nhân b ung th

vú ng i Vi t Nam nh m ánh giá tiên li u, xác nh ph ng pháp u tr

- L y m u nghiên c u, thu th p d li u v các c m: tu i, gi i tính

- Kh o sát các c m mô b nh h c: kích th c, v trí u, mô vú xâm l n và mô vúung th t i ch , hóa mô mi n d ch

- Kh o sát in silico các o CpG thu c vùng promoter c a các gen BRCA1, p16 INK4a,

RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1, nh n di n các o có th xem là “hot-spot”, nh n

di n vùng trình t thi t k m i

- Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c vùng promoter c a các gen

BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng PCR bao g m:

+ Thi t l p quy trình tách chi t DNA thích h p t sinh thi t mô

+ Thi t l p quy trình x lý DNA b ng sodium bisulfite

+ Thi t l p quy trình tinh s ch DNA sau x lý sodium bisulfite

+ Thi t l p quy trình methylation-specific PCR (MSP) nh m phát hi n smethyl hóa t i vùng promoter trên các gen này

+ Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c vùng promoter c a các

gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng MSP

- Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c vùng promoter c a các gen

BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng gi i trình t s n ph mmethylation-specific PCR

i dung 3: Th c hi n k thu t hoá mô mi n d ch

ánh giá v bi u hi n c a p53 và HER2

trên 200 m u carcinôm ng tuy n vú xâm

n và 18 m u mô vú lành tính

ã ánh giá bi u hi n c a p53 và HER2 trên 200 m u carcinôm ng tuy n vú xâm l n và và 20 m u mô vú lành tính

i dung 4: Kh o sát in silico các o CpG thu c vùng promoter c a các gen

BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1

- Trình t các vùng promoter và/ho c exon

1 c a các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A,

cyclin D2 và GSTP1

- o CpG thu c vùng promoter và/ho c

exon 1 c a các gen BRCA1, p16 INK4a,

RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1

- Các b m i cho

Methylation-specific ã thu nh n trình t các vùng promoter và/ho c exon 1 c a các gen

BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin

D2 và GSTP1

- ã thu nh n o CpG thu c vùng promoter và/ho c exon 1 c a các gen

BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin

D2 và GSTP1

- ã thi t k và ánh giá các b m i

PCR và gi i trình t tho mãn các yêu c u

thành ph n GC, nhi t lai, kh n ng

o hairpin loop, primer-dimer

cho Methylation-specific-PCR và gi i trình t tho mãn các yêu c u v thành ph n GC, nhi t lai, kh n ng

o hairpin loop, primer-dimer

i dung 5: Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c vùng promoter

a các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 b ng specific-PCR (MSP)

Methylation Quy trình tách chi t DNA thích h p t

sinh thi t mô

- Quy trình x lý DNA b ng sodium

bisulfite

- Quy trình tinh s ch DNA sau x lý

sodium bisulfite

- Quy trình MSP nh m phát hi n s methyl

hóa t i o CpG vùng promoter trên các

gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2

và GSTP1

- D li u methyl hóa t i vùng promoter trên

các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin

- ã xây d ng thành công quy trình

lý DNA b ng sodium bisulfite

- ã xây d ng thành công quy trình tinh s ch DNA sau x lý sodium bisulfite

- ã xây d ng thành công quy trình MSP nh m phát hi n s methyl hóa

i o CpG vùng promoter trên các gen BRCA1, p16 INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1

- ã có d li u methyl hóa t i vùng promoter trên các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và

tuy n vú xâm l n và 200 m u mô vú lành tính

i dung 6: Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c vùng promoter

a các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 b ng gi i trình t

n ph m Methylation-specific-PCR

- D li u methyl hóa t i vùng promoter trên

các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin

carcinôm ng tuy n vú xâm l n và mô vú

- ã có d li u methyl hóa t i vùng promoter trên các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và

lành tính carcinôm ng tuy n vú xâm l n và mô

vú lành tính

i dung 7: X lý s li u

Xác nh t l , m i t ng quan gi a tình

tr ng methyl hoá t i các o CpG thu c

vùng promoter c a các gen BRCA1,

p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1

i dung 8: Vi t báo cáo nghi m thu

i dung 9: Nghi m thu tài c p c s

Báo cáo khoa h c c H i ng nghi m

thu c p c s thông qua

- ã hoàn t t

i dung 10: Nghi m thu tài c p thành ph

Báo cáo khoa h c c H i ng nghi m

thu c p thành ph thông qua

n t ra, áp ng m c tiêu tài

promoter c a các gen BRCA1,

p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2

và GSTP1

20 m i(m i gen

có 4 m i)

×(25 m i)

3 Quy trình k

thu t MSP

Các b c c th trong quy trìnhMSP:

- Quy trình tách chi t DNA tsinh thi t mô

- Quy trình x lý DNA b ngsodium bisulfite

- Quy trình tinh s ch DNA sau

lý sodium bisulfite

- Quy trình MSP nh m phát

hi n s methyl hóa t i các oCpG vùng promoter trên cácgen BRCA1, p16 INK4a,

RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1

4 quytrình

×(4 quytrình)

1 b d

li u

×(1 b d

(1 báocáo)

tr ng methyl

hóa và các c

m gi i ph u

nh

promoter c a các gen BRCA1,

p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2

và GSTP1 và các c m gi i

ph u b nh c a 200 m ucarcinôm ng tuy n vú xâm l n

6 Bài báo khoa

c

ng trên các t p chí chuyênngành ho c k y u h i nghkhoa h c chuyên ngành

(4 bài báo

ng t pchí; 5 báocáo h i

tr ng t i

4 HNKH

Qu c t và

1 HN.CNSHtoàn qu c,2011)

7 ào t o 05 khóa lu n t t nghi p c nhân

Công ngh Sinh h c, 01 th c schuyên ngành Di truy n

(08 ng i:

05 cnhân, 02

th c s và

01 nghiên

u sinh)

PH N BÁO CÁO

T V N

Ung th vú là lo i ung th th ng g p nh t và gây t vong hàng u ph nnhi u n c công nghi p ây là m t b nh h t s c ph c t p mà trong nhi u n m qua ã

có nhi u nghiên c u v nguyên nhân, b nh sinh và u tr

Nh ng n m g n ây, hi n t ng epigenetic (s thay i quá trình bi u hi n c agen, m c dù b n ch t gen không thay i) ang c nhi u nhà nghiên c u trên th

gi i quan tâm theo khuynh h ng s d ng chúng nh d u ch ng sinh h c(biomarker), và th c t cho th y có m t s liên quan h t s c ch t ch gi a hi n t ngepigenetic v i nhi u lo i ung th M t trong nh ng ki u epigenetic c ch ng minh

có ti m n ng tr thành d u ch ng sinh h c cao, ó là s b t ho t c a các gen è nén u(tumour suppressor gene) b ng c ch methyl hoá quá m c các nucleotide cytosine

hi n di n trong o CpG, và s methyl hoá quá m c này th ng c ghi nh n t ivùng promoter hay kéo dài qua n exon th nh t c a các gen nói trên

Vi c tìm hi u v tính m n c m c a con ng i i v i b nh, m c bi n i

t ch t di truy n c a t bào hay m c epigenetic trên c ng ng dân c Vi t nam,

là nh ng d li u ban u h t s c c n thi t nh m ti n t i nghiên c u tìm ra m t lo i

u ch ng sinh h c cho ung th nói chung và ung th vú nói riêng

Nghiên c u này vì v y c th c hi n nh m tìm hi u s methyl hóa t i các o

CpG thu c vùng promoter c a các gen BRCA1, p16 INK4A , RASSF1A, CYCLIN D 2 và

GSTP1 trên các b nh nhân b ung th vú ng i Vi t Nam ánh giá, tiên li u,

nh m xác nh ph ng pháp u tr b nh

PH N I – T NG QUAN

1.1 T ng quan v epigenetics:

Epigenetics c nh ngh a là s thay i trong s bi u hi n c a gen nh ngkhông liên quan n bi n i trình t DNA và c di truy n m t cách n nh t th này sang th h khác [1] Epigenetics bao g m các hi n t ng sau: s methyl hóaDNA, acetyl hóa histone, và microRNAs [2].

Methyl hóa DNA là m t hi n t ng bình th ng x y ra trong quá trình phát tri n

a t bào Nó óng vai trò then ch t trong vi c ki m soát chu trình t bào, s pháttri n c a phôi, quá trình phiên mã, s b t ho t nhi m s c th X … [2] ng i, smethyl hóa DNA c tìm th y xuyên su t c b gen, nhóm –CH3 c b sung t i vtrí C5 c a cytosine ng tr c guanine trong c p dinucleotide CpG [3, 4] Trong các bào c a ng i có kho ng 70-80% dinucleotide CpG b methyl hóa Các c pnucleotide CpG phân b không ng u trong b gen, chúng tr i dài trên trình t gen

và xen k v i các vùng không b methyl hóa Vùng DNA giàu dinucleotide CpG cókích th c kho ng 0,5-4 kb g i là o CpG [2] Các o CpG th ng kéo dài t u5’ n exon u tiên c a gen, các t bào bình th ng ph n l n các o này không bmethyl hóa, ch nh ng phân nhóm riêng bi t t vùng promoter n vùng exon u tiên

a gen b methyl hóa [2, 5]

Hi n t ng methyl hóa DNA x y ra sau quá trình t ng h p DNA, quá trình này

c th c hi n b i các enzyme chuy n nhóm methyl t ch t cung c p methyl

S-adenosylmethionine (SAM) n v trí C5 c a cytosine (Hình 1.1) [4] ây là m t henzyme chuyên bi t có tên DNA methyltransferase (DNMTs) trong ó 3 enzymeDNA methyltransferase 1, 3A, 3B (DNMT1, 3A, 3B) tr c ti p tham gia quá trìnhmethyl hóa: DNMT1 ho t ng chính ng v t h u nh , nh m duy trì tính n nh methyl hóa c a các t bào sinh d ng khác nhau trong su t quá trình sao chépDNA Trong khi ó, DNMT3A và DNMT3B ho t ng nh m t o các v trí methyl

hóa m i (de novo methylation) [4, 5].

Hình 1.1 S b sung nhóm –CH 3 vào v trí 5’ c a cytosine nh DNMTs

Hi n t ng epigenetics trong ung th ng i ã và ang tr thành m t l nh v cnghiên c u m i, nh m m t trong nh ng m c tiêu là nh n d ng (s m) các d u ch ng

epigenetic và phát tri n nhanh các k thu t phát hi n (s m) ung th [6] Trong nhi ubài t ng quan, các tác gi u có chung nh n nh r ng, trong t ng lai các d u ch ng

a trên thông tin DNA b methyl hóa c s d ng trong tiên oán s m ung th b i methyl hóa quá m c các o CpG này c tìm th y ph bi n v i s l ng “v a

” trong các m u sinh thi t mô t các b nh nhân ung th giai n u, trên DNA t

do trong máu, n c ti u [1, 6] Dõi theo các công b g n ây h n, các báo cáo ãcho th y hi n t ng methyl hóa b t th ng có th tìm th y t các t bào trong giai

n ti n ung th thông qua s b t ho t do methyl hóa quá m c các gen è nén u,các gen u khi n chu trình t bào; c ng nh vi c kích ho t các gen gây ung th b ng

ch gi m m nh methyl hóa (hypomethylation) trong vùng promoter c a gen [2, 3,

5, 6] Ngoài ra, thông tin DNA methyl hóa c ng có vai trò trong d oán tr li u Hi nnay, khuynh h ng s d ng thu c epigenetic - ch t c ch methyl hóa, dùng riêng

ho c k t h p v i ph ng pháp hóa tr li u nh m tái ho t ng các gen ( è nén u) b

im l ng trong ung th , ph c h i ch c n ng các gen này chính là h ng i m i trong

u tr ung th và ã c a vào các th nghi m lâm sàng Ch t c ch DNAmethyltransferase (DNMTs), 5-azacytidine (5-AzaCR) và 5-aza2’- deoxycytidine (5-AzadC), là nh ng thu c epigenetic c công b u tiên Nh ng thu c này tác ng

ng cách g n vào DNA t i các v trí Cytosine trong quá trình tái b n DNA, t ó

ng n c n ho t ng c a DNMTs [7] Nh ng thu c này ã c FDA (Food and DrugAdministration) cho phép th nghi m lâm sàng trên các h i ch ng myelodysplasticsyndrome (MDS), u trung m c ác (malignant mesothelioma), b nh ti n ung th máu(preleukemic disease), ung th vú, ung th m i h ng (nasopharyngeal carcinoma -NPC) và m t vài b nh khác [8-11] G n ây, Zebularine, m t ch t c ch DNMT m i

i c tính th p h n nh ng nh y c m trong ch n l c t bào ung th c ng c công, c bi t các báo cáo ã ch ra ph n ng c a thu c ch trên m t s gen è nén uquan tr ng ã b c ch ho t ng trong các dòng t bào ung th vú cho dù n ng

th p [12] H n n a, m t h ng ch ng methyl hóa m i ang c nghiên c u, c chDNMT thông qua siRNA, ribozymes, và antisense oligonucleotides, c ng ã c ngh tuy ch m i là nh ng th nghi m b c u M t vài thu c ã ch ng minh c

hi u qu tác ng trên h th ng nuôi c y t bào, mô hình ng v t và k c thnghi m lâm sàng [13] Có th k tên các “thu c” tiêu bi u: MG98, m t antisense

oligonucleotide tác ng tr c ti p lên DNMT1 [14, 15], và RG108 [16, 17], m t phân

nh , m i, g n lên trung tâm ho t ng c a DNMT Vi c k t h p ch t c chacetyl hóa histone (histone deacetylases inhibitors - HDACIs), ví d nh TSA vàphenylbutyrate [18], v i ch t c ch DNMT c bi t h a h n tính hi u qu trong u

tr ung th H n n a, vi c m t bi u hi n c a estrogen receptor (ER) b ng methyl hóa

t th ng và bi n i histone ã d n n h qu là kháng antiestrogen – m t li upháp trong ch a tr ung th vú M t vài nghiên c u ã ch ra r ng vi c k t h p dùng5-azacytidine v i TSA có th c m ng tái bi u hi n ch c n ng c a ER, chính vì v ylàm t ng nh y c a nh ng dòng t bào ung th vú tr c ó th hi n âm tính v i ERtrong li u pháp tamoxifen [19, 20] K t h p HDACIs, trastuzumab (Herceptin), m tkháng th n dòng t ng i kháng l i HER2 a n hi u qu tác ng trong àn áp phát tri n và c m ng apoptosis các dòng t bào ung th vú [21, 22] H n n a,

vi c k t h p các thu c epigenetic v i các ch t hóa tr li u hay các ch t n kiêng tnhiên (natural dietary ingredients) c ng làm t ng hi u qu u tr M t nghiên c u

ti n lâm sàng ã ch ra r ng 5-AzadC k t h p v i docetaxel (m t ch t kháng phânbào, dùng trong hóa tr li u) có th t ng hi u qu ch ng t bào ung th , th nghi m

ti n hành trên các dòng t bào ung th vú [23] 5-AzadC k t h p v i m t ch t khác,amsacrine hay idarubicin c ng cho th y hi u qu u tr Polyphenol trà xanh, (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), có th là nguyên nhân d n n tái mô hình hóa

u trúc s i chromatin c a vùng promoter ER b ng vi c thay i tình tr ng acetylhóa histone và methyl hóa, và chính vì v y, h qu là tái ho t hóa ER K t h p TSA,EGCG d n n tái ho t ng c a r t nhi u gen è nén u b ng s c ch tr c ti p haygián ti p ho t ng DNMTs [24] Dietary sulforaphane (SFN) [25], m t ch t c ch acetyl hóa histone, c ch r t hi u qu tính s ng và t ng sinh c a các t bào ung

hi u l c t t, d a trên thông tin methyl hóa b t th ng c a DNA trong nhi u lo i ung

th nh sau:

ng 1.1 Danh sách ch n l c các biomarker ti m n ng cho ung th

SEPT9 Ki m soát chu k

bào

Ch n oán s m(early detection)

Tiên l ng b nh(prognosis)

Ph i không tbào nh

Mô, sinh thi t

u b ch huy ttrung th t(mediastinallymph nodebiospy)

nh y v i thu c(predicting drugsensitivity)

U th n kinh m(glioma), ru t,

ph i, ung th h

ch huy t(lymphoma)

ng quan m c a hai tác gi Fukushige và Horii (thu c i h c Tohoku,

Nh t b n, B môn B nh h c Phân t ) trong công b v a nêu trên [28], là các tác gikhác nh Baylin và John (2011) [29], Heyn và Esteller (2012) [30], Thông tin vtính ch t methyl hóa b t th ng trên các gen c ch n làm d u ch ng c ng nh hi u

bi t v ch c n ng c a chúng trong ung th ang gia t ng nhanh chóng c ng nh vàocác thành qu nghiên c u trên t ng th b gen (genome-wide), s phát tri n c a

nh ng k thu t phát hi n r t nh y – bao g m c công ngh nano, tính ti n l i trongphát hi n tính ch t methyl hóa t nhi u lo i b nh ph m khác nhau, trong ó các tác

gi u c bi t nh n m nh v kh n ng s d ng các lo i m u nh máu và các d ch c

th khác ( c thu nh n ch b ng nh ng th thu t xâm l n t i thi u – minimallyinvasive procedures) ây chính là m l i th c a m t biomarker ti m n ng khi s

ng tính ch t methyl hóa b t th ng trong tiên l ng và ch n oán s m b nh ung

RASSF1A (Ras association domain family 1 isoform A) hay còn c bi t n

i các tên khác nh 123F2, NORE2A, RAD32, REH3P21 là m t gen è nén u n m

trong vùng 3p21.3 trên nhi m s c th s 3 c a b gen ng i [31] RASSF1 dài kho ng

18000 bp, bao g m 8 exon và 7 intron, t o thành 8 vùng phiên mã khác nhau t

RASSF1A t i RASSF1H [31] Trong ó, RASSF1A bao g m các exon 1 , 2 , 3, 4, 5,

6 mã hóa cho m t chu i polypeptide ng n v i 340 amino acid có tr ng l ng phân t

là 38,8 kD [32, 33]

Trong t bào bình th ng, RASSF1A là gen è nén u tham gia vào con ng

u hòa s phát tri n và ch t theo chu trình c a t bào [32] RASSF1A cùng nh v(co-localizes) v i các s i thoi kì trung gian, v i các s i t vô s c và trung th trong

su t quá trình nguyên phân, m b o tính n nh các s i thoi và b o v t bào ch ng

i các tác nhân phân h y polymer thành các monomer Khi RASSF1A liên k t v icác s i thoi thì các bi n i c a nó b thi u h t d n t i c ch t ng h p DNA và c

ch s phát tri n c a t bào [32, 34]

Bên c nh ó, RASSF1A có th gây kìm hãm chu trình t bào thông qua protein

Rb (Retinoblastoma protein) ki m soát chu trình t bào Nó c ch quá trình tích

y c a cyclin D1 - gen u khi n hi n t ng phosphoryl hóa Rb và ki m soát

ch ng trình ch t c a t bào t pha G1 T ó, RASSF1A có th c ch s ti p di n

a chu trình t bào t i giai n chuy n i G1/S ng th i, s kìm hãm phát tri n bào c a RASSF1A c ng có th m t i do s bi u hi n sai c a các cyclin [33, 35]

t khác, chu trình t bào có th b ki m soát gián ti p khi RASSF1A liên k t v iCdc20 - m t nhân t u hòa chu trình t bào ch y u c n thi t cho vi c hoàn t t quátrình nguyên phân, nó ho t ng nh tác nhân kích ho t c a ph c h p kích thích kì

sau APC (anaphase-promoting complex) Sau khi liên k t v i RASSF1A, Cdc20 skhông kích ho t APC và chu trình t bào s b ch n l i t i th i m tr c kì gi anguyên phân [31, 32, 34] Nh v y, RASSF1A ho t ng trong giai n tr c kì

gi a c a nguyên phân s trì hoãn quá trình này di n ra, t ó ng n ch n hi n t ng

t gãy c a các cyclin và n nh chúng [36] Tuy nhiên, theo nghiên c u c a Liu và

ng s , s t ng tác gi a RASSF1A và ph c h p Cdc20-APC ã không c xác

nh n [37] Vì v y, vai trò c a Cdc20-APC trong vi c RASSF1A ki m soát gián ti pchu trình t bào c n c nghiên c u sâu h n [31, 32]

Vai trò c a RASSF1A còn c ch ng minh nh m t nhân t kích ho t con

ng ch t theo ch ng trình c a Ras-protein ho t ng liên quan n t ng c ng sphát tri n, chuy n hóa và t n t i c a t bào [31, 32] C ng nh NORE1A (novel Ras

effector 1 isoform A)-nhân t kích ho t Ras, RASSF1A có th t h p v i cácenzyme u hòa quá trình “ti n apoptosis” (pro-apoptosis), serine/threonine kinaseMST1, MST2 (mammalian sterile twenty) u khi n Ras theo con ng ch ttheo ch ng trình [32-34] Th t v y, khi RASSF1A và NORE1A t ng tác v i MST1

o ph c h p NORE1A/RASSF1A-MST1 s kích ho t cho con ng ch t theo chutrình t bào Ph c h p này i di n cho con ng ch t theo chu trình b t th ng

c u khi n b i Ras trong t bào [38], t ó d n t i kìm hãm s phát tri n c a

kh i u Có th tóm t t vai trò sinh h c c a RASSF1A b ng s sau:

Hình 1.2 Tóm t t vai trò sinh h c c a RASSF1A

1.2.1.2 S methyl hóa c a RASSF1A trong ung th :

Các ho t ng methyl hóa b t th ng t i các o CpG thu c vùng promoteróng vai trò ch y u trong vi c làm m t i ch c n ng sinh h c c nh c a các gen ènén u và hi n t ng này i v i gen RASSF1A ã c ch ng minh khá rõ Hi n

ng m t bi u hi n c a gen RASSF1A do s methyl hóa quá m c vùng promoter ã

c phát hi n trong nhi u lo i ung th nh : ung th vú, ung th c t cung, ung th

ph i, ung th u và c , ung th d dày, ung th bu ng tr ng, … [39, 32, 40, 41] và

tính ch t methyl hóa này c a RASSF1A hi m khi c tìm th y trong các mô bình

th ng và ch c tìm th y trong vài m u mô không ung th g n k v i các kh i u[32] Chính vì v y, có th xem hi n t ng methyl hóa quá m c c a RASSF1A là m t

ki n x y ra s m trong quá trình phát sinh ung th ; h n n a ho t ng c a gen nàytuân theo mô hình Knudson trong s tích l y t bi n hình thành ung th : smethyl hóa t i các o CpG thu c vùng promoter d n n s b t ho t c xem là

di n ra tr c (“first hit”), và ti p theo là s m t n vùng 3p (“second hit”) [40,42]

1.2.2 Gen BRCA1:

1.2.2.1 C u trúc và ch c n ng:

BRCA1 (Breast cancer gene 1) hay còn c bi t n v i nhi u tên g i khác nh

IRIS; PSCP; BRCAI; BRCC1; PNCA4; RNF53; BROVCA1 là m t gen è nén u n m

vùng 17q21 n m trên nhi m s c th s 17 c a b gen ng i BRCA1 dài kho ng

80000 bp bao g m 24 exon trong ó có 22 exon mã hóa cho protein mRNA do

BRCA1 phiên mã có kích th c 7,8 kb và mã hóa cho m t phân t protein g m 1863amino acid v i tr ng l ng phân t là 220 kDa [43] Trình t protein c a BRCA1không t ng ng v i các trình t protein khác ã c bi t, nh ng các trình t b o

n c nh n th y trên gen ã cho th y m t vài manh m i suy lu n v ch c n ng

a nó BRCA1 có m t vùng “RING” u N, là n i có th gián ti p t o các t ngtác protein - DNA ho c protein-protein [43, 44] (Hình 1.3) Thông qua vùng RINGnày, BRCA1 s t ng tác v i BARD1 (BRCA1 associated RING domain 1) t othành ph c h p BRCA1-BARD1 tham gia vào quá trình ubiquitin hóa [45] Bên c nh

ó, trên BRCA1 có ch a các trình t nh v nhân NLS (Nuclear localizationsequence) và các vùng gia t ng t l bi u hi n gen [46] BRCA1 còn có vùng trình t

o t n l p l i S l p l i c a BRCT u C (BRCA1 C-terminal) là c a các motif

th ng c tìm th y trong các protein liên quan n quá trình s a ch a và chuy nhóa DNA [47] uôi C c a BRCA1 ch a hai ph n g m 95 amino acid còn l i c avùng BRCT, trình t này c ng c tìm th y trong các protein khác liên quan n quátrình u hòa chu trình t bào và s a ch a DNA (Hình 1.3).

Hình 1.3 Các vùng ch c n ng c a BRCA1

Trong t bào bình th ng, BRCA1 là gen mã hóa cho m t phosphoprotein h t

nhân óng vai trò trong vi c duy trì s n nh di truy n, ng th i nó c ng ho t ng

nh m t gen è nén u BRCA1 b phosphoryl hóa m t cách nhanh chóng trên DNAsai h ng và khuôn sao chép c a các t bào ang phân chia b i các kinase ATM (ataxiatelangiectasia mutated), ATR và CHK2 (cell cycle checkpoint kinase 2) [48, 49] Quátrình phosphoryl hóa khác nhau c a BRCA1 trong các áp ng khác nhau v i các tácnhân làm sai h ng DNA ã cho th y BRCA1 có th cung c p m t s k t n i gi a

nh y c a quá trình sai h ng DNA và các c ch áp ng [50] Th t v y, BRCA1 cóliên quan n vi c ki m soát quá trình ánh d u m pha S và G2 c a chu trình tbào, c ng nh ki m soát quá trình sao chép c a trung th [51]

BRCA1 c ng c xác nh n là có vai trò trong u khi n s bi u hi n c a con

ng p53 và GADD45-m t gen áp ng sai h ng c a DNA Xa h n, BRCA1 còn có

vai trò trong vi c phát tín hi u và nh y liên quan n quá trình sai h ng DNA [52]

Bi u hi n c a GADD45 c ch m t cách bình th ng b i s k t h p BRCA1 i

t nhân t phiên mã m i ZBRK1 [53] Sau quá trình b c x ion hóa, hi n t ngphosphoryl hóa c a BRCA1 b i ATM c ng làm gi m s bi u hi n c a GADD45 [49].Ngoài ra, BRCA1 cùng nh v v i m t vài protein áp ng sai h ng DNA khác nh

MSH2, MSH6, MLH1, ATM, … trong m t ph c h p có tên là BAGSC associated genome surveillance complex) Ph c h p này có vai trò trong vi c ng n

(BRCA1-ch n sao (BRCA1-chép b t th ng c a DNA, thay th các nucleotide h h ng và tùy theo m c thi t h i nó duy trì ho c y m nh quá trình apoptosis [54] Vai trò c a BRCA1còn c th hi n trong quá trình s a ch a hi n t ng gãy DNA s i ôi (DBS - DNA

double-strand break) Các v trí DSB c ánh d u b i hi n t ng phosphoryl hóa

a các histone c nh (H2A-X) và BRCA1 s di chuy n n v trí b phosphoryl hóa

a H2A-X [55], v i s t ng tác c a nó cùng ph c h p MRE11/RAD50/Nbs1 cótrong ng v t h u nh liên quan n vi c s a ch a hi n t ng gãy DNA s i ôi

n n a, v trí kh ho t tính c a BRCA1 t i v trí DBS c phát hi n b i s t ngtác c a nó v i các protein bi n i nhi m s c th hay c u trúc DNA T ó, nó thúc

y các thành ph n c a b máy s a ch a DNA n ti p c n v trí DSB [50] BRCA1còn t ng tác tr c ti p v i ph c h p s a i nhi m s c th SWI/SNF, v i các nhân t

u hòa quá trình acetyl hóa ho c deacetyl hóa histone, c ng nh v i các DNAhelicase bao g m BLM và BACH1 [54, 56, 57]

Bên c nh vai trò s a ch a DBS, BRCA1 tham gia vào quá trình phiên mã và

chuy n hóa RNA thông qua vi c liên k t v i holoenzyme RNA polymerase II, ER- ,

AR, p53, c-MYC, v i các nhân t ng kích ho t phiên mã p300/CBP và nhân t

ng kìm hãm CtIP [54, 58-60] S t ng tác c a BRCA1 v i các protein s a ch aphân t không cân x ng MSH2 và MSH6 liên quan n quá trình phiên mã k t h p

a ch a DNA sai h ng, u này c gi i thích b ng s gia t ng nh y c acisplatin c mô t trong các t bào thi u BRCA1 [61].

Ph c h p BRCA1/BARD1 gi ng nh ng vùng protein RING khác có ch c n ng

nh m t enzyme ubiquitin ligase [62] Nó t ng tác v i nhân t polyadenyl hóa

CstF-50 và enzyme unbiquitin hóa BAP1, tham gia vào quá trình polyadenyl hóa RNA

ng nh ubiquitin hóa ph thu c vào s thoái hóa protein [63, 64] Do ó, thông qua

vi c u hòa s thoái hóa và s ho t ng c a mRNA ho c protein ích, ph c h pBRCA1/ BARD1 có th chi m gi các ch c n ng quan tr ng trong ánh giá s è nén

kh i u [50] G n ây, BRCA1 còn c ch ng minh cho th y cùng nh v v i XISTmRNA th hi n vai trò c a nó trong b t ho t nhi m s c th X n [65]

1.2.2.2 S methyl hóa c a BRCA1 trong ung th :

t bi n gen BRCA1 là m t hi n t ng xu t hi n trong kho ng 20-30% c a các

tr ng h p ung th vú (có tính gia ình) và 10-20% c a các tr ng h p ung th

bu ng tr ng [66] S methyl hóa BRCA1 trong ung th vú r i rác c cho là có liênquan n t bi n gen BRCA1 trong ung th vú, c hai hi n t ng này u có tính ditruy n [66] Trong các kh i u c a ung th vú có s methyl hóa không ng nh t thông

qua hi n t ng methyl hóa không hoàn toàn c a m t ho c c hai alen. m t alen

hoang d i c a BRCA1 do s xóa b toàn b nhi m s c th s 17 là m t s ki n di

truy n x y ra s m trong các dòng t bào m m mang t bi n, theo sau ó là s gia

ng các t bi n t ng ng còn l i Hi n t ng methyl hóa quá m c o CpG hi m

khi xu t hi n, n u ch m t alen c a BRCA1 t bi n trong kh i u Tuy nhiên n u haialen có m t và m t trong s chúng có t bi n dòng m m, thì s kh ho t tính haialen c a gen có th c hoàn thành b i s methyl hóa promoter c a alen hoang d i

còn l i [67] Nh v y, s methyl hóa trên các o CpG c a BRCA1 c ng là hi n t ng

y ra tr c (theo mô hình Knudson), r i các t bi n trên gen này m i x y ra sau[66] ng th i, s methyl hóa quá m c vùng promoter c a BRCA1 là s ki n x y ra

m trong ung th vú và th ng ch xu t hi n trong các t bào ung th [68]

1.2.3 Gen cyclin D2:

1.2.3.1 C u trúc và ch c n ng:

Cyclin D2 thu c nhóm cyclin lo i D tham gia vào chu trình t bào, gen cyclin D2

m trong vùng 12p13 trên nhi m s c th s 12 c a b gen ng i [69] Cyclin D2 còn

c g i v i nhi u tên khác nh KIAK0002, MGC102758 Cyclin D2 dài kho ng

31000 bp bao g m vùng promoter dài kho ng 1600 bp, vùng 5’, 3’ không d ch mã, 5

exon và 4 intron Phân t mRNA do cyclin D2 phiên mã có kích th c 6.5 kb và nó

ch mã cho m t phân t protein dài 289 amino acid [70]

Chu trình t bào tr i qua 4 giai n G1, S, G2,M; chuy n t giai n G1sang S t bào ph i tr i qua m gi i h n G0 g n cu i pha G1, t i m t i h n này

di n ra s ki m tra quan tr ng nh t trong chu trình t bào [71] Nhóm cyclin lo i D

m 3 gen cyclin D1, D2, D3 tham gia vào vi c u hòa chu trình t bào Trong chu

trình t bào, cyclin D là lo i cyclin u tiên c t o ra khi t bào c kích thíchchuy n t giai n G0 sang pha S Cyclin D không dao ng trong su t chu trình t

bào nh các lo i cyclin khác, m c bi u hi n c a chúng b ki m soát b i các nhân

t ng tr ng Cyclin D b t u tích t nhi u d n gi a giai n G1, trong khi

cyclin E xu t hi n sau ó ngay tr c khi quá trình chuy n i t giai n G1 sanggiai n S [72]

Cyclin D liên k t v i enzyme kinase ph thu c protein cyclin (CDKs - cyclindependent kinases) t o thành ph c h p cyclin D/CDKs, ph c h p này óng m t vai

trò quan tr ng trong u hòa chu trình t bào, quá trình bi t hóa [73] Không có sphân bi t rõ ràng vai trò c a các cyclin D1, D2, D3 trong ph c h p này [74] Ph c

p cyclin D/CDKs u hòa chu trình t bào b ng cách gây phosphoryl hóa Cyclin

D k t h p v i CDK4 (cyclin dependent kinase 4) ho c CDK6 (cyclin dependentkinase 6) t o thành ph c h p cyclin D/CDK4, cyclin D/CDK6 Các ph c h p này stác ng vào protein Rb (retinoblastoma protein) và các protein liên quan v i p107,p130 gây phosphoryl hóa [74] Khi b phosphoryl hóa, protein Rb b b t ho t khôngliên k t v i nhân t phiên mã E2F, khi ó E2F c gi i phóng t do E2F t do s

u hòa kích ho t các gen mã hóa cho các protein tham gia vào ti n trình t bào, ho t

ng trao i ch t và t ng h p DNA Nhân t phiên mã E2F còn có ho t tính kích

ho t s phiên mã c a gen t o ra E2F và cyclin E Cyclin E c t o thành liên k t v iCDK2 t o ph c h p cyclin E/CDK2, ph c h p này s t ng c ng s phosphoryl hóa

Rb [75] (Hình 1.4)

Ph c h p cyclin D/CDKs c hình thành n m t l ng nh t nh thì t bào

t giai n G0 và chuy n sang pha S Trong u ki n t bào ch a chu n b s nsàng cho m t chu trình m i, ch ng h n do môi tr ng thi u dinh d ng hay DNA bsai h ng ch a c s a ch a thì m t s protein c ch c ho t hóa phá h y

ph c h cyclin D/CDKs n th i m này, chu trình t bào di n ra không còn phthu c vào ho t tính c a ph c h p cyclin D/CDK4 ho c cyclin D/CDK6, b i vì cùng

i ti n trình các nhân t t ng tr ng không t ng thêm thì m c bi u hi n c acyclin D c ng gi m i và khi ó t bào v t m gi i h n G0 i vào pha S [76, 77]

Hình 1.4 S phosphoyl hóa Rb gi i phóng E2F

1.2.3.2 S methyl hóa c a cyclin D2 trong ung th :

m t bi u hi n c a gen cyclin D2 do methyl hóa quá m c vùng promoter

ch c tìm th y trong t bào kh i u c a b nh nhân ung th vú [78] Theo nghiên

u c a Fackler và c ng s vào n m 2003, t n s methyl hóa c a gen cyclin D2 i

i ung th bi u mô xâm l n (ILC-invasive lobular carcinoma) là 32% và ung th ng

n s a xâm l n (IDC- invasive ductal carcinoma) là 52% T n s methyl hóa c a

cyclin D2 i v i lo i ung th vú t i ch là 23% trong tr ng h p ung th bi u mô t i

ch (LCIS- lobular carcinomas in situ); 29% cho giai n m t, 25% cho giai nhai và 39% cho giai n ba c a tr ng h p ung th ng d n s a t i ch (DCIS-

ductal carcinomas in situ) [79] Theo các th ng kê c a nghiên c u này thì t n s methyl hóa c a cyclin D2 trong ung th vú tuy không cao nh ng ch xu t hi n r t c

tr ng cho ung th vú

1.2.4 Gen GSTP1:

1.2.4.1 C u trúc và ch c n ng:

GSTP1 (Glutathione S-transferase Pi-1) n m trên vùng 11q13 c a nhi m s c th

11 GSTP1 có kích th c 3059 bp thu c chu i ng n trên vùng nhi m s c th này

GSTP1 có 7 exon và 6 intron, phiên mã t o phân t mRNA có kích th c 986 bp và

ch mã cho phân t protein có 210 amino acid [80]

GSTP1 là gen mã hóa cho enzyme Glutathione S-transferase P ng i Enzyme

này thu c nhóm Glutathione S-transferases (GSTs), là m t h g m các enzyme óng

vai trò quan tr ng trong quá trình xúc tác cho các ph n ng oxy hóa kh x y ra trong bào b ng cách chuy n tác nhân glutathione (GSH) t i các ph c h p ái n t , bao

m các tác nhân gây ung th (carcinogens) và m t s thu c ngo i sinh (exogenousdrugs) khác ào th i chúng i [81, 82] D a trên các tính ch t sinh lý, sinh hóa,

mi n d ch c ng nh c u trúc c a các GSTs, có th phân chia nhóm enzyme này thành

4 nhóm: theta, pi, mu và alpha Trong s các d ng này, vai trò c a gen glutathione

S-transferase pi (GSTP1) i v i b nh ung th ã c nghiên c u trong th i gian g n

ây [83] S bi u hi n c a GSTP1 có liên quan n vi c u hòa quá trình t ng sinh bào và quá trình apoptosis, thông qua vi c liên k t tr c ti p c a nó v i enzyme c-

Jun N-terminal kinase (JNK) t o ph c h p GSTP1/JNK Trong ph c h p này, GSTP1

có th c ch JNK d n n k t qu trong quá trình kh c, GSTP1 xu t hi n nh m t

ch t áp ng liên quan n vi c t o áp l c t bào (áp l c oxy hóa bên trong và/ho cbên ngoài t bào), ng th i ki m soát chu trình t bào [84, 85]

Vai trò c a GSTP1 trong vi c u hòa hi n t ng apoptosis ã c mô t trongnhi u nghiên c u D i các u ki n không b áp l c, GSTP1 c ch các n phânJNK thông qua vi c thành l p c a m t ph c h p protein [86] S ti p xúc v i các áp

c oxy hóa gây ra quá trình phân ly c a GSTP1 t JNK và hình thành chu i trình tcon c a các h p ch t c ng hóa tr nh trùng h p D i các u ki n này, ho t ng

y c a JNK c gi b i chính JNK d n n ho t ng c a c-jun thông qua hi n

ng phosphoryl hóa t i v trí Ser-63 ho c Ser-73 và t ng c ng ho t ng phiên mã

a các gen áp ng AP-1 Các k t qu này có vai trò trong vi c kích ho t các con

ng phát tín hi u cho áp ng áp l c, t ng sinh và apoptosis [86, 87, 88] Thêm vào

ó, nó còn tái ho t ng hình thái c a phân t oxy-các tác nhân kích ho t phiên mã

a GSTP1 thông qua các c ch t kích ho t phiên mã JNK, bao g m c-Jun, quá trình

ng h p m i c a GSTP1 x y ra, quá trình này ti p t c kìm hãm JNK Th t v y, s c

ch c a GSTP1 d n n t ng c ng các ho t ng c a JNK Vì v y, GSTP1 nh

ng n các con ng phát tín hi u cho apoptosis b ng vi c u ch nh các ho t

ng c a enzyme kinase JNK [83]

1.2.4.2 S methyl hóa c a GSTP1 trong ung th :

methyl hóa c a GSTP1 th ng ít xu t hi n trong các t bào bình th ng, mà

ch xu t hi n trong các t bào b ung th [78] M t s bi n i trên GSTP1 nh s

methyl hóa quá m c các o CpG thu c vùng promoter có th làm ng n ch n s liên

t v i các y u t phiên mã, làm cho enzyme RNA polymerase II không còn kh n ng

ng tác v i vùng promoter d n n c ch quá trình phiên mã u này làm gián

n ho c d ng c ch s a ch a DNA, khi ó nh ng t n th ng DNA c tích l y

i d n d n hình thành ung th Do ó n u quá trình phiên mã b c ch , t bào s ti p

c i vào quá trình sao chép DNA và phân bào b t k mang theo các t bi n và sai

ng DNA Các t bi n và sai h ng DNA s ti p t c c tích l y qua m i chu trình bào và n m t lúc nào ó t bào không còn ki m soát c ho t ng phân bào

a và chuy n sang tr ng thái ung th [89] ng th i, khi b methyl hóa, GSTP1

t kh n ng c ch JNK, làm gián n quá trình kh c và t ng nguy c d n t iung th (ví d kh các ch t thu c nhóm xenobiotic và các ch t hóa tr li u…) Hi nnay, trên th gi i có nhi u công trình nghiên c u v các lo i thu c gi i methyl hóa

GSTP1 k t h p v i hóa tr li u nh m u tr ung th V i nh ng lý do ó, GSTP1

a h n là m t d u ch ng sinh h c ti m n ng trong ch n oán, nh h ng khuynh

ng tr li u c ng nh ánh giá hi u qu u tr trong ung th nói chung và ung th

vú nói riêng [5, 83, 84, 89, 90]

1.2.5 Gen p16 INK4a :

1.2.5.1 C u trúc và ch c n ng:

Gen CDKN2A (Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A) n m trên vùng 9p12 c a

nhi m s c th s 9 thu c b gen ng i, mã hóa cho hai protein p16 (p16INK4a) có tr ng

ng phân t 16 kDa, và p14 (p14ARF) [91] Trong ó, gen p16 INK4acó ba exon 1 , 2

và 3, óng vai trò chính trong các con ng u hòa chu trình t bào v i ch c n ng

u hòa âm tính chu trình t bào thông qua s c ch các CDK (cyclin dependentkinase) t ng tác v i cyclin D1 [91] S bi u hi n c a gen p16 INK4aliên quan t i quátrình lão hóa c a t bào, khi càng l n tu i thì n ng c a p16 INK4a càng cao p16 INK4a

có kh n ng chi ph i quá trình lão hóa b ng gi i h n s t làm m i c a các t bào có

kh n ng nhân ôi

CDK và cyclin là hai nhóm protein có vai trò quan tr ng t i các m ki m soátchu trình t bào [92] Khi không có m t p16INK4a, CDK cùng cyclin t o ph c h pcyclin/CDK th c hi n quá trình phosphoryl hóa pRb (protein Retinoblastoma) Bình

th ng, pRb không b phosphoryl hóa s liên k t v i nhân t phiên mã E2F [93] Khi phosphoryl hóa, pRb s m t liên k t v i E2F, E2F c t do s kích ho t các gensao chép DNA thúc y chu trình t bào i qua m ki m soát G1/S Tuy nhiên, khiqua m ki m soát này n u phát hi n DNA h h ng, chu trình t bào s t m d ng

a ch a DNA Quá trình t m ng ng này c th c ki n nh s t ng tác c ap16INK4a v i các thành ph n CDK4/CDK6 c n tr s t o thành ph c h p cyclin/CDK,

n t i c ch quá trình phosphoryl hóa c a pRb và không tách r i E2F, quá trình saochép DNA không di n ra, chu trình t bào ng ng l i t i m ki m soát G1/S, lúc nàycác gen ch u trách nhi m s a ch a DNA h h ng s làm vi c [94, 95] Nh v y, khi

p16 INK4a b b t ho t s làm cho chu trình t bào b xáo tr n, các t bào sao chép không

ki m soát n m t lúc nào ó s d n n ung th

1.2.5.2 S methyl hóa c a p16 INK4a trong ung th :

Có th th y r ng s xáo tr n chu trình t bào c bi t do thi u h t ch c n ng c agen u hòa trong con ng thi t y u là pRb (pRb/p16 INK4a /cyclin D1) là ích

th ng xuyên c a các quá trình b nh hóa ung th , k c ung th vú Trong nhi u lo i

ung th p16 INK4a c tìm th y tr ng thái b b t ho t do hai nguyên nhân t bi ntrên gen và bi n i epigenetics [95] S m t bi u hi n c a p16 INK4a th ng do smethyl vùng o CpG trong vùng 5’ không d ch mã t i vùng exon 1 c a gen [96, 97]

Trong nghiên c u c a Krassenstein và c ng s , t n s methyl c a p16 INK4a trong ung

th vú là 17% [98] Theo m t vài nghiên c u, s methyl hóa c a gen p16 INK4alà m t

ki n x y ra s m trong ung th vú [99] Do ó, s methyl hóa b t th ng trên gen

p16 INK4a a h n là m t d u ch ng sinh h c trong tiên oán, ch n oán và theo dõi

ti n tri n kh i u ti m n ng trong ung th vú

Tóm l i, trên th gi i ã và ang có nhi u công trình nghiên c u v s methylhóa b t th ng c a các gen nh m h ng t i vi c s d ng chúng nh m t d u ch ngsinh h c c tr ng cho t ng b nh ung th k c ung th vú c xu t b n Có côngtrình thì ánh giá chung cho nhi u gen, có công trình ch kh o sát trên m t ho c vàigen có m t cái nhìn t ng th h n v tính ch t methyl hóa trên c n m gen t ng

p t t t c các công trình nghiên c u tr c, trong quá trình th c hi n tài, chúngtôi ã ti n hành t ng h p và phân tích s li u t thông tin methyl hóa trên n m gen

BRCA1, RASSF1A, Cyclin D2, p16 INK4a và GSTP1 t r t nhi u công b trên th gi i

Toàn b k t qu này ã c chúng tôi xu t b n vào n m 2011 [100] Ph n ti p theo,chúng tôi s trình bày m t cách tóm l c k t qu phân tích – t ng h p này

Sau khi ti n hành khai thác d li u trên Pubmeth và Pubmed (NCBI) b ng v icác t khóa “breast cancer”, “epigenetics” và “DNA methylation”, chúng tôi thu c

44 công trình th c nghi m kh o sát m c methyl hóa trên vùng promoter c a n m

gen RASSF1A, GSTP1, cyclin D2, p16 INK4a và BRCA1 (tính t i th i m tháng

12/2011) M t s nh n nh ban u c rút ra là: (1) M c methyl hóa c a gen

c phát hi n b ng nhi u k thu t trên nhi u lo i m u khác nhau và (2) T n smethyl hóa khá là khác nhau gi a các nghiên c u Do v y, chúng tôi ti n hành tính

n s methyl hóa trung bình có tr ng s ( lo i b s khác bi t v m c methylhóa gi a các nghiên c u)

Trong các nghiên c u này, MSP là ph ng pháp ch y u c s d ng phântích tình tr ng methyl hóa c a các gen, chi m 89% (39/44); 3 nghiên c u khác s

ng ph ng pháp bisulfite sequencing và 2 nghiên c u còn l i s d ng th nghi m

kh methyl hóa (B ng 1.2) Có th th y r ng tuy có nhi u k thu t c i biên t MSP,

nh ng MSP v n c s d ng nhi u b i s n gi n, nh y cao nh t là kh n ngphân bi t alen (methyl hóa ho c không) trong h n h p DNA tách t m u là t p h pcác t bào ung th hay không ung th ây th c s là m t l i th c a MSP so v i kthu t gi i trình t d a trên PCR (v n c xem là chu n vàng c a các k thu t Sinh

c Phân t )

Trong n m gen kh o sát, s methyl hóa b t th ng c a BRCA1 c phân tích

trong 12 nghiên c u v i t ng s m u là 850; ti p theo là gen p16 INK4a v i 10 nghiên

u trên 811 m u 11 nghiên c u ã ti n hành v i gen RASSF1A và s l ng m u

ng ng là 593 Cu i cùng, tình tr ng methyl hóa c a hai gen cyclin D2, GSTP1 n

t c ti n hành trên 7 nghiên c u v i 397 m u và 4 nghiên c u v i 527 m u

ng 1.2: Khái quát các nghiên c u v n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin

D2, GSTP1 và p16 INK4a

Gen

ng nghiên u

ng

u

MSPs/s nghiên c u

n s methyl hóa (%, có

tr ng s ) Trong ung

n c vào ph n tr m có ý ngh a theo kích c m u phân tích, chúng tôi ghi nh n

n s methyl hóa c a gen RASSF1A là cao nh t chi m 72.2%, ti p n là gen cyclin

D2 v i 47.2% T n s methyl hóa c a hai gen BRCA1 và GSTP1 là th p nh t, d i

20%, c th BRCA1 (8.8%), GSTP1 (9.8%) T n s methyl hóa c a gen p16 INK4a ngkhá th p ch chi m 23.9% trong các m u ung th vú (Hình 1.5)

Trong các m u mô bình th ng, chúng tôi ch ghi nh n t n s methyl hóa c a ba

gen BRCA1, RASSF1A và cyclin D2 C ba gen u có t n s methyl hóa có ý ngh a

i 20%, c th là 0% i v i BRCA1, 19.8% i v i RASSF1A và 2.4% i v i

cyclin D2 (Hình 1.5, 1.6).

Chú thích: Tâm các vòng tròn th hi n t n s methyl hóa ã c báo cáo trong các nghiên

u liên quan Kích th c vòng tròn th hi n s l ng m u trong nghiên c u ng th ng

m ngang hi n th t n s methyl hóa trung bình có tr ng s d a trên t t c các nghiên c u.

Hình 1.5 T n s methyl hóa c a n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1

và p16 INK4atrong ung th vú.

Chú thích: Tâm các vòng tròn th hi n t n s methyl hóa ã c báo cáo trong các nghiên

u liên quan Kích th c vòng tròn th hi n s l ng m u trong nghiên c u ng th ng

m ngang hi n th t n s methyl hóa trung bình có tr ng s d a trên t t c các nghiên c u.

Khi phân tích lo i m u s d ng trong 44 ki u kh o sát, chúng tôi nh n th y m u

mô úc praffin và m u mô t i c s d ng v i t l khá cao, l n l t là 33% và31% M u d ch hút mô và các lo i m u khác c ng c s d ng các phân tích này.Thông th ng, các nghiên c u u b t u b ng vi c s d ng m u mô úc paraffinhay mô t i b i chính c m c a lo i m u này: l y chính xác ngay t i kh i mô ung

th (có s l ng t bào ung th r t cao so v i t bào bình th ng) xác nh chínhxác tình tr ng methyl hóa c a t bào ung th Bên c nh ó, v i m c tiêu h ng t i

kh ng nh tính h u d ng c a biomarker trong tiên oán, theo dõi s ti n tri n kh i u,vvv, các nghiên c u ã s d ng các lo i m u khác c l y t b nh nhân ch a ho c

a m i có các d u hi u c a b nh, ó là: ch c hút b ng kim nh thu nh n d ch núm vú, ng d n s a

Bên c nh ó, c n c vào các giai n c a ung th vú c phân lo i trong cácnghiên c u kh o sát, chúng tôi t ng h p và phân tích s li u methyl hóa theo t ng giai

n b nh c a n m gen RASSF1A, GSTP1, Cyclin D2, p16 INK4a và BRCA1 (Hình 1.7).

Các thu t ng phân chia giai n b nh trong các nghiên c u c s d ng bao

m “t bào bình th ng”, “mô c n k kh i u” (nh m ám ch tính ch t “bình th ng”

ho c ch a r t ít t bào ung th ), “ti n ung th ” (primary breast tumor, m u thu c

mô t là ung th ng d n s a t i ch (DCIS- ductal carcinomas in situ) ho c ung th

bi u mô thùy t i ch (LCIS- lobular carcinomas in situ), x p vào giai n 0 – theophân lo i ung th vú Tumor-lympho Nodes-Metastasis (TNM), “ung th và di c n”(các giai n 1, 2, 3 và 4 – theo phân lo i TNM) i v i các nghiên c u không phân

rõ giai n b nh, chúng tôi t ng h p thành t n s methyl hóa và g i chung là “ung

th vú”.

Hình 1.6: T n s methyl hóa c a n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2,

GSTP1 và p16 INK4atrong t bào bình th ng.

1-69 70-119

120-160

Hình 1.7: T n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a các gen RASSF1A,

GSTP1, BRCA1, cyclin D2 và p16 INK4atrong ung th vú nói chung và phân chia

Chú thích: Ung th vú (UTV), t bào bình th ng (TBT), mô c n k kh i u (MCK), ti n ung

th (TUT), ung th và di c n (DC) Tâm các vòng tròn th hi n t n s methyl hóa ã c báo cáo trong các nghiên c u liên quan Kích th c vòng tròn th hi n s l ng m u trong nghiên c u ng th ng n m ngang hi n th t n s methyl hóa trung bình có tr ng s d a trên t t c các nghiên c u.

Nh v y, có th th y r ng t n s methyl hóa c a n m gen t ng d n theo các m c

ti n tri n c a b nh: (1) i v i gen BRCA1: t n s methyl hóa t ng t 0 (t bào

bình th ng) lên 20, 30 và 50% l n l t i v i t bào t “mô k c n kh i u”, “ti nung th ” và “ung th và di c n”; (2) i v i gen GSTP1: t n s methyl hóa t ng t 0

(“mô k c n kh i u”) lên 20 và ~40% l n l t i v i t bào “ti n ung th ” và “ung

th và di c n”; (3) i v i gen Cyclin D2: t n s methyl hóa t ng t 0 (t bào bình

th ng) lên 10, 30 và 50% l n l t i v i t bào t “mô k c n kh i u”, “ti n ung

th ” và “ung th và di c n”; (4) i v i gen p16 INK4a: t n s methyl hóa t ng t 20(mô k c n kh i u) lên 30 và 50% l n l t i v i “ti n ung th ” và “ung th và din” và (5) i v i gen RASSF1A: t n s methyl hóa t ng t 20 (mô k c n kh i u)

lên 60 và 76% l n l t i v i “ti n ung th ” và “ung th và di c n” Trong ó, i

i gen này, t bào bình th ng, t n s methyl hóa có tr ng s c a gen RASSF1A là

khá cao (37%) Tuy nhiên s li u này ch xu t hi n duy nh t trong m t nghiên c u[101]

Qua t ng h p s li u và phân tích trên, có th th y r ng tính ch t methyl hóa

t th ng c a c n m gen c c p u là các c tính c a t bào ung th vú, gia

ng theo m c ti n tri n c a b nh: chuy n t th p (ho c r t th p, ho c b ng 0) tbào bình th ng, sang t ng d n các t bào n m k c n kh i u, t ng h n n a các tbào thu c giai n ti n ung th và t ng cao nh ng t bào ung th ho c/và ã i vào

di c n

n ây, v i s phát tri n c a k thu t Sinh h c Phân t , c bi t là các k thu t

gi i trình t , nhi u công trình ã công b các t l methyl hóa c kh o sát b ng các

ph ng pháp m i nh illuminase sequencing, pyrosequencing, phân tích m t cách

ng th (meta-analysis) trên c b gen (t o thành nh ng thu t ng chuyên ngành m i

nh “methylome” thu c “epigenome” ) Chúng tôi ghi nh n m t vài s li u nhình t các công b sau n m 2011 nh sau:

i v i gen RASSF1A: Nh ng nghiên c u g n ây (sau n m 2012) cho th y tính

ch t methyl hóa b t th ng gen này có t ng quan v i m t s tính ch t lâm sàng c a

nh Nghiên c u th c hi n trên 193 b nh nhân ung th vú t i M , ghi nh n tính ch tmethyl hóa b t th ng c a RASSF1A (23.1%) t ng quan v i bi u hi n c a estrogenreceptor (+) (p<0.001, và progesterone receptor (+) (p=0.019), v i tính tái phát(p=0.045) và v i tính s ng còn th p (p=0.016) c m methyl hóa c a gen

RASSF1A vì th c ngh s d ng nh m t biomarker ti m n ng nh m tiên l ng

nh ung th vú [102]

t s nghiên c u khác: th c hi n n m 2013 c ng ghi nh n tính ch t methyl hóalàm t ng nguy c d n n ung th t bào bi u mô th c qu n (esophageal squamus cellcarcinoma) (OR=5.90, 95% CI=2.78–12.52) và ung th tuy n tâm v d dày (gastriccardia adenocarcinoma) (OR=7.50, 95% CI= 2.78–20.23), t ng quan v i m t s tính

ch t nh tu i b nh nhân (tính ch t methyl hóa cao nh t chi m 77% tu i 50–60(p=0.03, OR=3.1, 95%CI= 1.10–8.73), bi t hóa mô m c trung bình (tính ch tmethyl hóa m c th p chi m 39% bi t hóa mô trung bình (p=0.006, OR=0.28,95%CI= 0.12–0.69) [103]

c m methyl hóa (14%) c a gen RASSF1A các b nh nhân ung th ru t

ng c cho là t ng quan v i tiên l ng x u c a b nh (p=0.021), phân mô h c

và tính bi t hóa t bào (p=0.037) Nghiên c u này s d ng k thu t pyrosequencing xác nh tính ch t methyl hóa [104]

Tính t ng quan gi a methyl hóa cao c a RASSF1A (47%) v i phân mô h c

và tính di c n c a t bào ung th c ng ã c xác nh trong ung th i tr c tràng(p=0.034 và 0.044) T ó, tính ch t methyl hóa gen RASSF1A ng c ngh là

u ch ng sinh h c ng d ng trong ch n oán và tiên l ng b nh [105]

Gi a tính ch t methyl hóa c a gen RASSF1A và t bi n trên gen BRAF ccho là có m i t ng quan ng c (p=0.035/0.005, OR=0.74/0.53, 95%CI=0.56-0.97/0.34-0.82 ng v i hai tr ng h p: t bi n n/gen BRAF và a t bi n/gen

BRAF) c ghi nh n trên ung th tuy n giáp [106]

i vi c s d ng k thu t MSP k t h p phân tích ng cong nóng ch y phân gi i cao s n ph m MSP (Methylation-specific high resolution melting – MS-

HRM), tính ch t methyl hóa c a hai gen RASSF1A và RASSF2A ã c ngh s

ng nh m t biomarker nh m ánh giá tình tr ng tái phát c a b nh ung th bàngquang, c ng nh xác nh mô có nguy c di n ti n thành ung th v i nh y t 72%

và c hi u t 94% Nghiên c u này c ng ngh s d ng n c ti u thay th môvùi n n n u áp d ng k thu t MS-HRM t m soát tính ch t methyl hóa [107]

i v i gen BRCA1: bên c nh các thông tin v tính ch t methyl hóa r i rác t

các nhóm nghiên c u khác nhau, theo chúng tôi, m t ki u thông tin c bi t c l u

ý, ó là i v i dòng thu c u tr ung th c g i là ch t c ch PARP ribose polymerase) trên c s khóa ch t con ng s a ch a th ng t n DNA duy

(Poly-ADP-nh t c a các t bào ung th , bên c (Poly-ADP-nh vi c s d ng t bi n trên gen BRCA1, các

nghiên c u hi n nay ang t p trung theo khuynh h ng s d ng tính ch t methyl hóa

t th ng c a gen này trên i t ng ung th vú, tuy n ti n li t, ung th bu ng tr ng

và kh i u tuy n t y, c bi t khi mà tính t bi n trên gen BRCA1 và c BRCA2

th ng xu t hi n hi m và các t bi n r t khó khu trú vùng th ng xuyên xu t hi n.[108-113]

i v i gen Cyclin D2: và k c gen RASSF1A là hai gen th hi n tính methyl

hóa có tính phân bi t nh ng tr ng h p ung th vú m i b t u b ng nh ng t n

th ng t bào ng (columnar cell lesions) so v i các tr ng h p ung th t i ch thu c

ng d n s a và/ho c ung th xâm l n (t l methyl hóa t ng) [114] Ngoài ra, trong các gen c th nghi m nh m ki m tra tính t ng quan gi a vi c hút thu c làm

m ng tính ch t methyl hóa cao b t th ng có th x y ra giai n s m hay tr

a vi c hình thành b nh ung th ph i, nghiên c u th c hi n phân tích trên 316

tr ng h p mô ph i (121 ã t ng hút thu c và 30 ch a bao gi hút) Trong s 19 gen

c ki m tra, ch có gen cyclin D2 i tính ch t methyl hóa v t m c (21%) là ph nánh s khác bi t gi a nhóm t ng hút thu c (methyl hóa chi m 26%) so v i nhóm

ch a bao gi hút thu c (methyl hóa chi m 3%) và vì v y tính ch t methyl hóa b t

th ng gen Cyclin D2 c cho là có kh n ng c m ng hình thành ung th ph i

[115] Bên c nh nh ng s li u methyl hóa, tính ch t methyl hóa gen Cyclin D2 ng

ã c s d ng trong các nghiên c u th nghi m thu c u tr