chiết tách và tinh chế ubiquinone q.10 từ vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh rhodopseudomonas spp

PHÂN LOẠI VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA Vi khuẩn tía là một trong ba nhóm chủ yếu của nhóm vi khuẩn quang dưỡng VKQD không sinh oxy do chúng có khả năng dùng các chất có thế khử thấp hơn nướ

CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ UBIQUINONE Q10 TỪ VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH

sản xuất CoQ10 của các chủng vi khuẩn R Palustris PN16, PN21 và PN31 được

phân lập tại Việt Nam Đã khảo sát 4 phương pháp chiết tách CoQ10, trong đó phương pháp 3 và 4 cho hàm lượng CoQ10 cao và tạp chất ít hơn 2 phương pháp còn lại

SUMMARY

EXTRACTING AND REFINING UBIQUINONE Q10 FROM

RHODOPSEUDOMONAS SPP IS A PRUPLE NON-SULFUR

PHOTOTROPHIC BACTERIA

Coenzym Q10 (CoQ10) funtion in the mitochondrial respiratory chain and serves as

a lipophic antioxidant There is an increasing interest in the use of CoQ10 as a nutritional supplement and cosmetic ingredient It is known that CoQ10 is produced

in a wide variety of organisms, from microorganisms such as bacteria and yeast, to

higher animals and plant In this study, bacteria strain R Palustris PN16, PN21 and

PN31 isolated in VietNam produced CoQ10 Optimimization of cultural conditions such as light source, carbon source, vitamins, carrot juice and tomato juice in order

to improved the production of CoQ10 Of 4 methods selected for CoQ10 extraction, the method 3 and 4 demonstrated highly effective protocol for extracting

TÓM TẮT ĐỀ TÀI Error! Bookmark not defined MỤC LỤC Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC HÌNH iiv

DANH MỤC BẢNG vi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1.ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH –

HỌ RHODOSPIRILLACEAE 1

1.1.1 Phân loại vi khuẩn quang dưỡng tía 1

1.1.2 Khái quát về vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu hùynh 1

1.1.3 Sản phâm từ vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh và ứng dụng 3

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS 4

1.2.1 Đặc điểm chung của chi Rhodopseudomonas 4

1.2.2 Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris 4

1.3 TỔNG QUAN VỀ UBIQUINON Q-10 12

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 12

1.3.2 Tính chất vật lý 13

1.3.3 Tính chất hoá học 13

1.3.4 Chức năng sinh lý của Q-10 trong cơ thể sinh vật 15

1.3.5 Sinh tổng hợp ubiquinon Q-10 16

1.3.6 Những ứng dụng của Q-10 trong thực tiễn 20

1.3.7 Các phương pháp sản xuất ubiquinon Q-10 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Dụng cụ - thiết bị 25

2.2.2 Hoá chất – Dung môi 26

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn quang dưỡng 26

2.3.2 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh Rhodopseudomonas palustris 27

2.3.3 Thu nhận sinh khối vi khuẩn 31

2.3.4 Chiết xuất Q-10 từ vi khuẩn 31

2.3.5 Phân tích sản phẩm thu được 35

2.3.6 Tinh chế và kết tinh Q-10 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY PHÙ HỢP CHO VI KHUẨN

QUANG DƯỠNG TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS

PALUSTRIS 40

3.1.1 Nuôi cấy vi khuẩn R palustris trên môi trường SA 40

3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự tăng trưởng của vi khuẩn R palustri ……… 41

3.1.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên tăng trưởng của các chủng R palustris 43

3.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ chất dinh dưỡng lên sự tăng trưởng của các chủng vi khuẨn R palustris 45

3.1.5 Ảnh hưởng của một số vitamin lên sự tăng trưởng của vi khuẩn 45

3.2 CHIẾT XUẤT, CÔ LẬP VÀ PHÂN TÍCH HỢP CHẤT Q-10 48

3.2.1 Kết quả cô lập và định tính Q-10 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 48

3.2.2 Kết quả định tính Q-10 bằng phương pháp quang phổ 51

3.2.3 Kết quả định lượng Q-10 trong các chủng vi khuẩn R palustris PN16 , PN21 và PN31 bằng phương pháp quang phổ 53

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI VITAMIN LÊN SỰ TỔNG HỢP Q-10 58

3.4 KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT Q-10 62

3.4.1 Kết quả tinh chế hợp chất Q-10 bằng phương pháp sắc ký cột 64

3.4.2 Đánh giá tính chất của hợp chất Q-10 67

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris 4

Hình 1.2.Màng quang hợp của Rhodopseudomonas palustris 5

Hình 1.3.Các phương thức biến dưỡng ở loài R palustris 6

Hình 1.4. Những con đường tạo năng lượng và chuyển hóa carbon và nitơ ở

R palustris ……… 6

Hình 1.5.Vị trí các gen liên quan đến quang tự dưỡng ở R palustris 7

Hình 1.6.Các gen liên quan đến cố định N2 ở R palustris 7

Hình 1.7.Con đường phân giải hợp chất vòng ở R palustris 8

Hình 1.8.Dòng điện tử trong quang hợp ở R palustris 10

Hình 1.9.Con đường truyền điện tử trong phức hợp I 11

Hình 1.10.Con đường truyền điện tử trong phức hợp II 11

Hình 1.11.Công thức phân tử coenzym Q-10 14

Hình 1.12.Quá trình sinh tổng hợp para-hydrobenzoat từ tyrosin và 16

phenylalanin 16

Hình 1.13 Con đường axít mevalonic 18

Hình 1.14 Phản ứng hai bước được xúc tác bởi FPP synthase 19

Hình 1.15 Con đường tổng hợp Ubiquinon từ para-hydroxybenzoat 19

Hình 1.16.Q-10 được bán tổng hợp từ Solanesol 24

Hình 2.1.Phương pháp chiết xuất Q-10 của Collins 32

Hình 2.2.Phương pháp chiết xuất Q-10 của Paterson & Buddie 33

Hình 2.3.Phương pháp chiết xuất Q-10 của Yoshida 34

Hình 2.4.Phương pháp chiết xuất Q-10 của W Zhong 34

Hình 2.5.Tóm tắt quá trình tinh sạch Q-10 từ phương pháp sắc ký cột 38

Hình 3.1.Hình dạng của vi khuẩn R palustris dưới kính hiển vi 40

Hình 3.2.Sinh khối của các loài R palustris 40

Hình 3.3.Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phương pháp (I) dưới ánh sáng thường chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 48

Hình 3.4. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phương pháp (I) dưới UV 254 của chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 49

Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phương pháp (II) dưới UV 254 của chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 49

Hình 3.6. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phương pháp (III) dưới UV 254 của chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 49

Hình 3.7. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phương pháp (IV) dưới UV 254 của chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 50

Hình 3.8.Phổ hấp thu tử ngoại của dung dịch Q-10 chuẩn 51

Hình 3.10.Đường chuẩn của nồng độ dung dịch Q-10 theo OD275 54

Hình 3.11.Đồ thị hàm lượng Q-10 trong các chủng vi khuẩn R palustris được chiết

xuất từ các phương pháp khác nhau 56

Hình 3.12.Đồ thị ảnh hưởng của các loại vitamin lên sự tăng trưởng và tổng hợp

Hình 3.15.Phân đoạn dịch chiết có chứa Q-10 từ sắc ký cột II (C, chuẩn; các chấm

có đánh số tương ứng với các phân đoạn thu nhận trên sắc ký cột II) 65

Hình 3.16.Bột kết tinh Q-10, (a) chiết xuất theo phương pháp III; (b) chiết xuất theo

phương pháp IV 65

Hình 3.17.Hình dạng tinh thể Q-10 dưới kính hiển vi 66

Hình 3.18Phổ IR của hợp chất Q-10 chiết từ vi khuẩn R palustris 67

Hình 3.19. Sắc ký đồ của dung dịch Q-10 tinh sạch định lượng (C, chuẩn; 2, Q-10 chiết xuất từ PN21 theo phương pháp III; 3, Q-10 chiết xuất từ PN21 theo phương pháp IV) ……….69

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1.Ảnh hưởng của nguồn cung cấp carbon lên sự tăng trưởng của các chủng

vi khuẩn PN16, PN21 và PN31 42

Bảng 3.2.Ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên sự tăng trưởng của các chủng PN16 , PN21 và PN31 44

Bảng 3.3.Ảnh hưởng của nồng độ chất tăng trưởng lên sự tăng trưởng của các chủng PN16 , PN21 và PN31 45

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của vitamin lên sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn R palustris PN16 , PN21 và PN31 46

Bảng 3.5 Quang phổ hấp thu cực đại mẫu Q-10 chuẩn 52

Bảng 3.6 Quang phổ hấp thu cực đại của các mẫu Q-10 sau khi cô lập 52

Bảng 3.7 Nồng độ Q-10 chuẩn với giá trị OD275 tương ứng 54

Bảng 3.8.Hàm lượng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R palustris PN16 được chiết xuất từ các phương pháp khác nhau 55

Bảng 3.9 Hàm lượng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R palustris PN21 được chiết xuất từ các phương pháp khác nhau 55

Bảng 3.10. Hàm lượng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R palustris PN31 được chiết xuất từ các phương pháp khác nhau 59

Bảng 3.11.Ảnh hưởng của vitamin lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi khuẩn R palustris PN16 , PN21 và PN31 60

Bảng 3.12.Ảnh hưởng của nồng độ vitamin E lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi khuẩn R palustris PN16 , PN21 và PN31 61

Bảng 3.13.Ảnh hưởng của tiền tố tự nhiên lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi khuẩn R palustris PN16 , PN21 và PN31 61

Bảng 3.14.Thông số sắc ký cột để tinh chế dịch chiết Q-10 từ phương pháp (III) và phương pháp (IV) 64

Bảng 3.15.Một số biện giải về cấu trúc hóa học của Q-10 được kiểm định bằng phổ IR ……….68

Bảng 3.16.Hàm lượng Q-10 chiết xuất từ phương pháp (III) 68

Bảng 3.17.Hàm lượng Q-10 chiết xuất từ phương pháp (IV) 69

BẢNG VIẾT TẮT

ATP: adenosine triphosphate

Bchl (bacteriochlorophull): diệp lục khuẩn

Bph: bacteriopheophytin

Cyt: cytochrome

LH (light harvesting): Phức hợp hấp thu ánh sáng

NAD: nicotinamide adenine dinucleotide

NADP: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

PHB: poly- -hydroxybutyric acid

RC (reaction center): trung tâm phản ứng

SA: môi trường succinate - acetate

SK: sinh khối

TLC (thin layer chromatography): phương pháp sắc ký lớp mỏng

UQ, Q-10: hợp chất ubiquinone Q-10

VKQD: vi khuẩn quang dưỡng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA

KHÔNG LƯU HUỲNH – HỌ RHODOSPIRILLACEAE

1.1.1 PHÂN LOẠI VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA

Vi khuẩn tía là một trong ba nhóm chủ yếu của nhóm vi khuẩn quang dưỡng (VKQD) không sinh oxy do chúng có khả năng dùng các chất có thế khử thấp hơn nước như các hợp chất khử lưu huỳnh, hydro phân tử hoặc các hợp chất hữu cơ đơn giản làm chất cho điện tử để tạo NADPH + H+ Chúng có một hệ quang với sắc tố quang hợp là diệp lục khuẩn và rất nhiều loại carotenoid Các carotenoid là nhóm sắc tố quyết định màu sắc của vi khuẩn tía Chúng thường có màu nâu, màu hồng,

đỏ cam hoặc tím tía Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng chất hữu cơ, đôi khi sử dụng hợp chất lưu huỳnh dạng khử hoặc H2 Có khả năng di động với tiêm mao mọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ G+C là 61-72% [1]

Molish (1970) là người đầu tiên đã sử dụng sắc tố để phân loại vi khuẩn tía thành bộ

Rhodobacteria với hai họ Thiorhodaceae Pfennig và Truper (1971) thay đổi tên bộ

thành Rhodospirillales và tên họ thành Chromatiaceae và Rhodospirillaceae

Imhoff (1984) chia nhóm VKQD tía lưu huỳnh thành hai họ là Chromatiaceae,

Ectithiorhodospiraceae và vi khuẩn tía không lưu hùynh thành họ Rhodospirillaceae [1]

1.1.2 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA KHÔNG

LƯU HÙYNH

Họ Rhodospirillaceae rất đa dạng về hình thái, cấu trúc tế bào và đặc tính sinh lý

nên chúng là nhóm vi khuẩn phân bố rộng và đa dạng nhất trong VKQD tía nói chung Có thể tìm thấy các loài VKQD tía không lưu huỳnh ở nhiều thủy vực khác nhau như môi trường nước ngọt, nước biển, suối nước nóng, khu vực gần bờ, khu vực trầm tích, hồ ao nước thải và đất ẩm có nhiều ánh sáng [1], [13]

Hình dạng tế bào ở các loài VKQD tía không lưu huỳnh có tính đặc trưng loài:

Rhodobacter, Rhodopeudomonas có hình dạng thay đổi từ hình cầu, hình oval, đến

hình que ngắn; tế bào Rhodospirillum có dạng xoắn; tế bào Rhodocyclus purpureus

có hình vòng hay bán vòng đặc trưng [1]

VKQD tía không lưu huỳnh có hình thức biến dưỡng linh động Vi khuẩn có thể phát triển từ một trong bốn phương cách biến dưỡng như quang dị dưỡng, quang tự dưỡng, hóa dị dưỡng và hóa tự dưỡng phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng trong môi trường, đặc biệt là nguồn carbon và điều kiện ánh sáng Hầu hết các loài VKQD tía không lưu huỳnh phát triển được trong điều kiện vi yếm khi đến hiếu khí

và chịu được áp lực của oxy Một vài chủng rất nhạy cảm với oxy [13]

VKQD tía không lưu huỳnh sử dụng được rất nhiều loại carbon hữu cơ khác nhau như acid hữu cơ, rượu, đường, acid béo bão hòa mạch thẳng từ 5-8 carbon, hợp chất hữu cơ có vòng … làm chất cho điện tử và nguồn carbon Glucose, fructose, acetate, pyruvate và succinate được sử dụng phổ biến ở nhiều loài và thường được đồng hóa qua chu trình acid tricarboxylic Nguồn đạm của hầu hết các vi khuẩn tía không lưu huỳnh là ammonia, nitơ phân tử và nhiều hợp chất nitơ hữu cơ Nitrat chỉ được đồng hóa bởi vài loài và sự tăng trưởng trên nguồn đạm này thường thấp hơn các nguồn đạm khác Đồng hóa nitrat là một quá trình được cảm ứng bởi nitrat nhưng bị

ức chế khi có mặt ammonia và glutamate Hầu hết các VKQD tía đều có khả năng

cố định nitơ [12]

Biotin, thiamin, niacin và p-aminobenzoic là nhân tố tăng trưởng chính ở nhóm VKQD tía không lưu huỳnh Hầu hết VKQD tía không lưu huỳnh tăng trưởng mạnh trong môi trường có bổ sung lượng nhỏ cao nấm men hay nguồn dinh dưỡng phức tạp [1], [13]

1.1.3 SẢN PHẨM TỪ VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA KHÔNG

LƯU HUỲNH VÀ ỨNG DỤNG

1.1.3.1 Sinh khối

VKQD tía là nguồn protein có giá trị vì giàu vitamin, carotenoid VKQD tía có thể dùng làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho gia súc, phiêu sinh vật, tôm cá và dùng trong phân bón nông nghiệp [1]

1.1.3.2 Hydro phân tử

Trong điều kiện thiếu nitơ phân tử, hầu hết VKQD tía có khả năng sản xuất hydro phân tử nhờ enzym nitrogenase Hydro phân tử được xem là một trong những nguồn năng lượng có khả năng tái sinh đầy hức hẹn trong tương lai [13]

1.1.3.3 Các sản phẩm sinh hóa khác

Ubiquinon Q-10 (coenzym Q-10) là thành phần quan trọng của chuỗi truyền điện tử trong các hệ quang ở VKQD, là tác nhân chống oxy hóa, tăng cường sức khoẻ và có thể dùng để điều trị bệnh tim mạch Hợp chất này đã được chiết tách và thương mại

hóa từ Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus và Rhodospirillum

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA

KHÔNG LƯU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS

1.2.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CHI RHODOPSEUDOMONAS

Rhodopseudomonas là một chi vi khuẩn thộc họ Rhodospirillaceae Là vi khuẩn

Gram (-) Chỉ có những loài có tiêm mao mới có khả năng di động Khuẩn lạc thường có màu đỏ, nâu vàng Màng quang hợp nằm bên trong, có dạng túi, dạng ống hoặc dạng phiến Sinh sản chủ yếu bằng cách nẩy chồi Nhiều loài có khả năng khử sulfid tạo thành sulfat, sulfur và thiosulfat Vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ 25-35 oC, pH 6,5 – 7,0 Chúng là vi khuẩn quang dưỡng kỵ khí [1], [32]

1.2.2 VI KHUẨN RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS

1.2.2.1 Đặc điểm tế bào

Hình 1.1 Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris [41]

Rhodopseudomonas palustris là trực khuẩn Gram (-), màu tía kích thước 0,5 –

0,9 m x 0,6 - 5 m Có màng quang hợp phía trong, dạng phiến xếp song song với màng tế bào Sắc tố quang hợp chính là diệp lục khuẩn a (chlorophyll a)

Chu trình sống của Rhodopseudomonas palustris có hai giai đoạn phát triển chính

Giai đoạn đầu phân chia tế bào bằng cách nẩy chồi theo kiểu không đối xứng, hình thành hai tế bào khác nhau; một tế bào di động và một tế bào khác có cuống không

di động Tiếp đến là giai đoạn biệt hoá tế bào của một hệ thống phức tạp gồm các

túi trên màng tế bào chất phía bên trong để giúp vi khuẩn có khả năng quang dưỡng hoàn chỉnh [42]

Hình 1.2 Màng quang hợp của Rhodopseudomonas palustris [41]

1.2.2.2 Đặc điểm biến dưỡng [4] [41]

Kiểu biến dưỡng của R palustris rất đa dạng, có khả năng thực hiện nhiều kiểu biến

dưỡng trong cùng một tế bào Chúng có thể cố định CO2, N2 và chuyển hoá H2, sulfur, acid nhân thơm, đường, hợp chất dị vòng như benzoat… trong điều kiện kỵ khí Vi khuẩn có thể phát triển bằng một trong bốn phương thức biến dưỡng: quang

tự dưỡng, quang dị dưỡng, hoá tự dưỡng hoặc hoá dị dưỡng tùy theo điều kiện môi

trường Ở phương thức phát triển quang tự dưỡng, R palustris cố định CO2 theo

chu trình Calvin nhờ xúc tác enzym ribulose biophosphat carboxylase R palustris

có thể sử dụng H2S ở nồng độ thấp để làm chất cho điện tử cho sự khử CO2 nhưng nếu ở nồng độ cao H2S có tác dụng gây độc với loài vi khuẩn này Sự phát triển hoá

dưỡng của R palustris được tiến hành thông qua quá trình hô hấp hoặc lên men

[40],[41]

Hình 1.3 Các phương thức biến dưỡng ở loài R palustris [41]

Hình 1.4 Những con đường tạo năng lượng và chuyển hóa carbon và nitơ ở

R palustris [44]

HÓA TỰ DƯỠNG QUANG TỰ DƯỠNG

HÓA DỊ DƯỠNG QUANG DỊ DƯỠNG

Trình tự bộ gen của loài R palustris đã đƣợc giải mã bởi Viện JGI (Joint Genome

Institute) cho thấy sự hiện diện của các gen có vai trò trong quang hợp, hô hấp hiếu khí, cố định N2 và phân giải các hợp chất hữu cơ

Hình 1.5 Vị trí các gen liên quan đến quang tự dƣỡng ở R palustris [43]

Hình 1.6 Các gen liên quan đến cố định N2 ở R palustris [41]

Bộ gen Rhodopseudomonas palustris

Rubisco dạng II

Gen Hydrogenase Rubisco dạng I

Cụm gen Nif (Mo nitrogenase)

Bộ gen Rhodopseudomonas palustris

Cụm gen Anf (Fe nitrogenase)



Hình 1.7 Con đường phân giải hợp chất vòng ở R palustris [41]

Nhiều yếu tố điều hòa được khám phá (phytochromes, nhân tố sigma ngoài

màng…) Bộ gen của R palustris có một cơ chế chống chọi với stress như có nhiều

bơm kháng thuốc, phản ứng stress oxy hóa tốt, các gen kháng thuốc …

1.2.2.3 Chuỗi truyền điện tử

Chuỗi truyền điện tử trong quang hợp

Quang dưỡng là phương thức phát triển ưu thế ở loài vi khuẩn R palustris Các vi

khuẩn quang dưỡng chỉ có một hệ quang hợp Hệ quang hợp ở vi khuẩn quang dưỡng có hai phần chủ yếu:

- Trung tâm phản ứng – RC (reaction center)

Đây là phức hợp protein – sắc tố gắn kết trong màng thực hiện chủ yếu quá trình quang hợp RC có ít nhất ba tiểu đơn vị protein là nhẹ (Light), trung bình (Medium)

và nặng (Heavy) cùng nhiều cofactor: 4 Bchl, 2 BPh, 2 quinon và một ion Fe phi heme và một carotenoid đóng vai trò là nhóm ngoại Các nhóm ngoại nằm trong vùng xuyên màng liên kết với phức hợp L và M, hình thành hai nhánh và B Mỗi nhánh gồm có một phân tử Bchl của cặp Bchl dimer, một phân tử BPh và một quinon (QA hoặc QB) Nhánh A chủ yếu liên kết với tiểu đơn vị L được sử dụng có chọn lọc làm con đường truyền điện tử Một electron được tách ra từ cặp Bchl dimer

Bộ gen Rhodopseudomonas palustris

Gen phân giải Homoprotocatechuate Gen phân giải Phenyllacetate

Gen phân giải Protocatechuate Gen phân giải Homogentisate

bị kích thích bởi ánh sáng và đƣợc chuyển qua BPhA và QA QB là chất nhận điện tử cuối cùng của giai đoạn này [7], [10], [37]

- Phức hợp hấp thu ánh sáng LH1 và LH2

Hệ thống LH1 và LH2 có chức năng thu gom năng lƣợng bức xạ từ ánh sáng và chuyển năng lƣợng bức xạ này đến RC LH1 hình thành một phức hợp không đối xứng với RC, gọi là phức hợp lõi RC-LH1 Cả hai phức hợp đều có chung một nguyên lý cấu tạo: Bchl và các carotenoid liên kết không đồng hóa trị với hai chuỗi polypeptid là và [10], [18]

- Quá trình truyền điện tử trong màng quang hợp

Đầu tiên, sắc tố trong RC thu nhận năng lƣợng ánh sáng từ các phức hợp LH và cho điện tử Điện tử đƣợc truyền đến quinon để khử phân tử này thành quinol Phân tử quinol sau đó rời khỏi RC, đi qua bể quinon trong màng và di chuyển đến phức hợp Cyt bc1 Phức hợp này oxy hoá quinol thành quinon, các điện tử giải phóng đƣợc mang bởi các chất vận chuyển điện tử ở dạng hoà tan đến RC và RC trở về trạng thái ban đầu

Trong quá trình khử và oxy hóa quinon, một gradient proton xuyên màng đƣợc hình thành và đƣợc sử dụng vào quá trình tổng hợp ATP bởi ATP-synthase [12], [13], [32]

Hình 1.8 Dòng điện tử trong quang hợp ở R palustris [10]

Chuỗi vận chuyển điện trong hô hấp

Chuỗi truyền điện tử trong hô hấp gồm có 4 phức hợp protein gắn vào màng

Phức hợp I : NADH dehydrogenase

Phức hợp enzym này xúc tác phản ứng:

NADH + H+ + Q NAD+ + QH2Enzym này thực hiện đồng thời sự truyền điện tử và bơm proton qua màng Hai proton xuất phát từ NADH đƣợc giải phóng vào khoảng gian bào Phức hợp này sử dụng một chuỗi các cofactor nội tại để truyền điện tử từ NADH tới Q đồng thời bơm, proton qua màng

Hình 1.9 Con đường truyền điện tử trong phức hợp I [43]

Phức hợp II : Succinate dehydrogenase

Phức hợp enzym này xúc tác phản ứng

Succinat + Q Fumarat + QH2Enzym này không bơm proton Nó chỉ sử dụng một chuỗi các cofactor nội tại để truyền điện tử từ succinat tới Q

Hình 1.10 Con đường truyền điện tử trong phức hợp II [43]

Phức hợp III : Cytochrom bc1

Phức hợp này xúc tác phản ứng:

QH2 + 2 cyt c (Fe3+) Q + 2 H+ + 2 cyt c (Fe2+) Các proton cũng được bơm qua màng nhờ phức hợp cyt bc1 Hai proton tách ra từ

QH2 được giải phóng vào khoảng gian bào Vì Q thu nhận các proton này ở tế bào chất nên sự hoạt động liên kết của phức hợp III với phức hợp I hoặc với phức hợp II đều dẫn đến sự bơm proton Mô hình hoạt động phổ biến của quá trình bơm proton này được gọi là chu trình Q (với Q là quinin)

Phức hợp IV : Cytochrome oxydase

Phức hợp này xúc tác phản ứng:

4 cyt c (Fe2+) + 4 H+ + O2 4 cyt c (Fe3+) + 2 H2O

Và thực hiện đồng thời sự chuyển điện tử và bơm proton

1.3 TỔNG QUAN VỀ UBIQUINON Q-10

1.3.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU

Năm 1957, Frederick Crane cô lập ubiquinon từ tim bò Cũng trong năm đó, Morton xác định được cấu trúc Q-10 từ gan chuột bị bệnh thiếu vitamin A và đặt tên là ubiquinon [27]

Năm 1958, Karl Folkers cùng cộng sự đã xác định chính xác cấu trúc hóa học của Q-10 là 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl benzoquinon và lần đầu tiên sản xuất Q-10 bằng quá trình lên men

Năm 1961, Q-10 được quan tâm đến như là một chất chống ung thư đầy tiềm năng Yamamura (1964) là người đầu tiên trên thế giới sử dụng Q-7 (một hợp chất thuốc nhóm ubiquinon) điều trị chứng tim bị xung huyết ở người Mellors và Tappel (1966) chứng minh hợp chất Q-6 ở dạng khử là một chất chống oxy hóa vô cùng hiệu quả [22]

Năm 1972, Littarru và Karl Folkers chứng minh những người mắc bệnh tim thường

bị thiếu hụt Q-10 Giữa thập niên 1970, người Nhật hoàn thiện công nghệ sản xuất Q-10 với lượng lớn đủ cung cấp cho các thử nghiệm lâm sàng Năm 1978, Peter Mitchell đã nhận được giải Nobel nhờ thuyết hoá thẩm thấu với vai trò vận chuyển

proton của Q-10 Lars Ernster (1977) mô tả đầy đủ, chi tiết về tầm quan trọng của Q-10 như là chất chống oxy hoá và là nhân tố tiêu huỷ các gốc tự do [15]

Vào đầu những năm 1980, các nghiên cứu lâm sàng trên Q-10 gia tăng đáng kể về

số lượng cũng như về quy mô sản xuất Q-10 tinh sạch Hiện nay, Nhật Bản đứng đầu trong việc sản xuất Q-10 phục vụ cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cũng như dược phẩm

1.3.2 TÍNH CHẤT VẬT LÝ

Q-10 là chất bột tinh thể màu vàng đến màu cam, không mùi, không vị, dễ tan trong cloroform và carbontetrachloride, tan tự do trong dioxane, ether và hexane, tan một phần trong acetone Hầu như không tan trong nước, methanol và ethanol Hợp chất này bền vững ở nhiệt độ thường khi được bảo quản trong vật chứa đậy kín và chắn sáng nhưng bị phân huỷ từ từ và trở nên sẫm màu khi tiếp xúc với ánh sáng, đặc biệt khi ở dạng dung dịch Nhiệt độ nóng chảy của Q-10 là 480

C – 520C, bị nhiệt phân (pyrolysis) từ từ khi bị đun lên ở nhiệt độ 120 0C hoặc cao hơn [17]

1.3.3 TÍNH CHẤT HOÁ HỌC

Theo IUPAC (The International Union of Pure and Applied Chemistry), ubiquinon

là tên của nhóm hợp chất thuốc họ quinon có đặc điểm cấu tạo chung gồm vòng nhân 2,3-dimethoxy-5-methyl benzoquinon và chuỗi bên multiprenyl Ký hiệu viết tắt của nhóm hợp chất này là Q-n với n là số lượng đơn vị isoprene [22] Q-10 còn

có tên gọi là ubiquinon-50, coenzym Q 10 (Q-10), ubidecarenone, coenzym Q 50, mitoquinon, vitamin Q 10 hoặc Q-10 Tên gọi hoá học là 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1,4-benzoquinon Công thức hoá học của Q-10 là C59H90O4 với phân

tử lượng là 863,36 g/mol Công thức cấu tạo của Q-10 được biểu diễn như sau:

Hình 1.11 Công thức phân tử coenzym Q-10

Về cấu trúc, phân tử Q-10 có một vòng benzoquinon với một chuỗi isoprenoid gồm

10 đơn vị prenyl Hai nhóm quinon trong vòng benzoquinon quyết định khả năng khử và oxy hoá thuận nghịch của phân tử này giữa dạng quinon (dạng khử) và dạng quinol (dạng oxy hóa) Khả năng oxy hóa khử thuận nghịch này giúp Q-10 tham gia vào các quá trình vận chuyển điện tử và H+ trong tế bào sinh vật Đuôi isoprenoid làm cho Q-10 không phân cực mạnh, có khả năng hoà tan nhanh chóng trong các pha không phân cực Phần kỵ nước có nhiệm vụ neo giữ, định vị Q-10 ở màng tế bào và định hướng Q-10 từ chất cho điện tử đến chất nhận điện tử

Q-10 là một hợp chất khử mạnh nên phản ứng mạnh với các tác nhân oxy hoá Khi tiếp xúc với các hợp chất có tính kiềm, Q-10 chuyển thành dạng ubichromenol, một dạng sản phẩm phân hủy Chính vì thế trong quá trình chiết xuất Q-10 từ tế bào sinh vật không thể sử dụng tác nhân kiềm mạnh để phá vỡ màng tế bào

Coenzyme Q-10

Ubiquinone (CoQ)

1.3.4 CHỨC NĂNG SINH LÝ CỦA Q-10 TRONG CƠ THỂ SINH VẬT

Tính tan trong lipid cùng với khả năng nhận điện tử ở đầu benzoquinon quyết định một số chức năng sinh lý của Q-10 trong cơ thể sinh vật:

Vai trò coenzym trong chuỗi vận chuyển điện tử và proton dẫn đến quá trình sinh năng lượng ATP cho tế bào

Tất cả các chuỗi truyền điện tử nằm trên màng tế bào đều chứa các quinin Một bộ phận nhỏ ubiquinon liên kết chặt với các protein trong chuỗi và phần còn lại ở dạng

tự do để khuyếch tán quanh màng nên được gọi là bể quinin (Q pool) Đầu benzoquinon của coenzym Q-10 có khả năng tiếp nhận và cho điện tử từ các chất nhận điện tử trung gian trong các quá trình hô hấp hiếu khí, trao đổi chất hiếu khí, trao đổi chất oxy hoá, hô hấp tế bào…Thông qua các quá trình này, năng lượng của

tế bào là ATP được tạo ra để cung cấp cho sự xây dựng, phát triển và duy trì sự sống tế bào [16]

Giữ hoạt lực oxy hoá khử của màng

Vòng quinin của Q-10 có thể tồn tại ở dạng oxy hóa (quinin) hoặc dạng khử (quinol) Trong hầu hết các màng sinh học, các enzym đã xác định đều có khả năng khử quinin và oxy hoá quinol Tỷ lệ phần trăm của dạng quinol trong các màng khác nhau và trong huyết tương biến đổi trong khoảng 30 – 90% phụ thuộc vào trạng thái trao đổi chất của tế bào [33] Sự thay đổi vị trí với quá trình oxy hoá/khử của Q-10 có thể làm thay đổi tính chất về mặt cấu trúc và hoạt tính enzym trong màng [10]

Vai trò chất chống oxy hoá nội sinh của tế bào

Ở dạng bị khử QH2, Q-10 là một chất chống oxy hoá hiệu quả QH2 có thể ức chế sự peroxid hoá lipid khi màng tế bào và các lipoprotein có trọng lượng thấp (LDL) được đặt dưới điều kiện có ôxy

Tham gia duy trì trạng thái bền vững và linh động của màng

Dạng Q-10 ở dạng tự do trong màng tương tác vật lý với các chuỗi acid béo của lipid Chuỗi polyisoprene của Q-10 có thể cuộn gấp thành một cấu trúc ngắn hơn và

dày hơn thông qua đó tham gia vào việc duy trì trạng thái bền vững và linh động của màng tế bào [13]

1.3.5 SINH TỔNG HỢP UBIQUINON Q-10

Q-10 được tổng hợp ở tế bào qua ba bước quan trọng: (1) tổng hợp hydroxybenzoat; (2) tổng hợp nhánh bên isopren từ acetyl Co A và (3) hình thành Q-10 Enzym hydroxymethyiglutaryl (HMG)-CoA redutase đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hoà tổng hợp [11], [16], [21], [25]

1.3.5.2 Sự tổng hợp nhánh bên polyprenyl

Nhánh bên polyprenyl (isoprenoid) của ubiquinon được tổng hợp từ acetyl-CoA thông qua một trình tự phản ứng được gọi là con đường acid mevalonic (Hình 1.12), dẫn tới sự hình thành farnesyl diphosphat (EPP)

Acetyl CoA

HMG CoA

Mevalonate HMG CoA reductase

GPP

FPP

FPP synthase All-trans-GGPP synthase

Nonaprenyl-4-hydroxy-Ubiquinone

cis-prenyltranferase

Polyprenyl-PP

Dolichol Squalene synthase

Squalene

Cholesterol

Hình 1.13 Con đường axít mevalonic [11]

Trong con đường axit mevalonic, isopentenyl (IPP) được chuyển thành dimethylallyl diphosphat (DMAPP) nhờ xúc tác của enzym IPP isomerase IPP cũng có thể được trùng hợp với DMAPP và với genaryl diphosphat (GPP) để hình thành (E, E)-fanesyl diphosphat (FPP) nhờ sự xúc tác từ đầu đến cuối của enzym prenyltransferase (Hình 1.13)

Hình 1.14 Phản ứng hai bước được xúc tác bởi FPP synthase [11]

Nhánh bên có 6 đơn vị isopren được tổng hợp nhờ enzym hexaprenyl diphosphast (HexPP) synthase Enzym này xúc tác tổng hợp chuỗi HexPP bằng cách thêm 3 phân tử IPP vào FPP nhưng không thể xúc tác bước tổng hợp GPP hoặc FPP từ DMAPP và IPP FPP được cung cấp bởi FPP synthase [15], [16]

Nhánh bên có 7 đơn vị isoprene được tổng hợp nhờ enzym heptaprenyl diphosphat (HepPP) synthase Enzym này xúc tác tổng hợp chuỗi OctPP bằng cách thêm 4 phân tử IPP vào FPP giống với enzym HexPP synthase là nó không tổng hợp các chất từ C5 C10 C15 [21]

Nhánh bên có 8 đơn vị isopren được tổng hợp nhờ enzym octaprenyl diphosphat (OctPP) synthase Enzym này xúc tác tổng hợp chuỗi OctPP bằng cách thêm 5 phân

tử IPP vào FPP Các enzym nonaprenul và decaprenyl diphosphat synthase xúc tác

sự kéo dài của chuỗi bên từ GPP đến C45-P [25]

1.3.5.4 Sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp Q-10

Có nhiều nhân tố của tế bào ảnh hưởng đến quá trình điều hòa sinh tổng hợp ubiquinon Hàm lượng ubiquinon được điều chỉnh thông qua con đường mevalonate

và chịu sự tác động qua lại lẫn nhau giữa ba sản phẩm chủ yếu của con đường mevalonat là: ubiquinon, dolichol và sterol [11]

Các vitamin có ảnh hưởng khác nhau lên sự sinh tổng hợp ubiquinon Khi thiếu vitamin A, ubiqunone trong gan chuột tăng lên do vitamin A ức chế quá trình sinh tổng hợp phần benzoquinon hoặc gây rối lọan quá trình tạo mạch bên isoprene Tác dụng ức chế của vitamin A lên sự tổng hợp benzoquinon thông qua sự kiểm sóat quá trình dị hóa các acid amin thơm Đối với sự tổng hợp mạch bên isopren của ubiquinon, sự thiếu vitamin A gây ức chế quá trình sinh tổng hợp cholesterin dẫn đến việc làm tích lũy squalen, kéo theo làm tăng mức facnezin-pirophosphate tăng cường sinh tổng hợp ubiquinon [8] Ngược lại, vitamin C và vitamin E có tác dụng kích thích sự sinh tổng hợp ubiquinon

1.3.6 NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA Q-10 TRONG THỰC TIỄN

1.3.6.1 Vai trò của Co Q10

Đây là một dẫn chất benzoquinon, phân bố ở nhiều nơi trong cơ thể người và trong

tự nhiên, có đặc tính tương tự vitamin, nghĩa là cơ thể con người cần chúng với số lượng rất nhỏ

Sự thiếu hụt chất này sẽ gây ra các rắc rối về chuyển hóa và sinh bệnh tật Như chúng ta đã biết, hầu hết các chuyển hóa trong cơ thể, trong tế bào của người đều cần sự xúc tác của các loại enzym khác nhau Để tạo điều kiện cho các enzym này hoạt động có hiệu quả thì cần có các chất hỗ trợ (coenzyme) Co Q10 là một trong nhiều loại coenzyme có trong cơ thể người [29], [34] Đã chứng minh Co Q10 là yếu tố kết hợp (cofactor) của ít nhất 3 enzyme tại ty thể của mỗi tế bào để tạo ra ATP (adenosin triphosphat) cho năng lượng Tế bào hoạt động càng mạnh càng đòi hỏi nhiều ATP, có nghĩa cần nhiều Co Q10 Đến 95% năng lượng hằng ngày của cơ

thể được hoạt hóa bởi Co Q10 vì vậy thiếu nó sẽ ảnh hưởng nhiều đến hoạt động của cơ thể nhất là tim Đây là bộ phận quan trọng, hoạt động liên tục không nghỉ suốt cuộc sống của một đời người, nên tim tiêu thụ một năng lượng rất lớn nên có nhu cầu cao và mối liên hệ mật thiết với Co Q10

Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu nhận thấy “Mạng lưới 5 chất cơ bản nhất chống ôxy hóa, trong đó có Co Q10 Do tính chất trung hòa có gốc tự do được coi là nguyên nhân của hiện tượng lão hóa, nguồn gốc của một số bệnh như ung thư, suy giảm trí nhớ nên Co Q10 còn có ích trong các bệnh của tuổi già, trong thẩm mỹ [44]

1.3.6.2 Nhu cầu Co Q10 hằng ngày

Người bình thường hằng ngày cần từ 5-10mg Co Q10, chủ yếu do nguồn thực phẩm Co Q10 có trong rau, đậu, thịt, cá, trứng, sữa, gan, tim với hàm lượng nhỏ Cần chú ý công tác chế biến, để khỏi làm hao hụt tỷ lệ Co Q10 có trong đó, nên kết hợp cá, tim, gan với dầu thực vật vì Co Q10 tan trong dầu mỡ Cơ thể có tỷ lệ tổng hợp được Co Q10 từ tyrosin nhưng quá trình sinh tổng hợp này cần thêm một số chất khác như: taurin, methionin, các sinh tố B5, B6, B12, C, acid folic, selen Nếu thiếu một trong bất kỳ chất nào trên cũng làm quá trình sinh tổng hợp bị ngưng trệ Cần biết mức Co Q10 thay đổi theo tuổi, 20 tuổi mức cao nhất, sau đó giảm dần Người suy tim, người suy nhược cơ thể, nghiện rượu hoặc thuốc lá, bị stress, luyện tập thể thao cường độ cao, làm việc trong môi trường ô nhiễm thì nhu cầu khoảng 30-60mg/ngày Với liều lượng này thì khó thực hiện được bởi chỉ có ăn, vì để có 60mg cần 1kg cá mòi hoặc 2kg thịt bò hoặc lạc Do đó cần dùng thêm viên có chứa

Co Q10 [44]

1.3.6.3 Ứng dụng trong Y Dược

Do lượng Q-10 giảm dần theo độ tuổi và ở một số bệnh mãn tính như bệnh tim, bệnh loạn dưỡng cơ, các bệnh thoái hóa thần kinh, ung thư, tiểu đường,

Q-10 còn được dùng để điều trị cho các bệnh nhân bị viêm nướu răng nhờ khả năng tăng cường hệ thống miễn dịch, cải thiện những quá trình làm lành và hàn gắn các

mô phụ thuộc năng lượng của Q-10 [9]

Q-10 có thể được dùng để điều trị các bệnh về tim mạch như: đau tim do xung huyết, tim ngừng đập kinh niên, bệnh lệch van tim giữa, chứng cao huyết áp, chứng loạn nhịp tim, bệnh nhân giải phẫu tim Công dụng trị liệu của Q-10 trong các bệnh

về tim mạch đã được chứng minh rõ ràng bằng nhiều tư liệu nghiên cứu lâm sàng trên cả động vật và người Sự thiếu hụt Q-10 thường phổ biến ở các bệnh nhân mắc bệnh tim Điều chỉnh sự thiếu hụt Q-10 tạo ra những kết quả lâm sàng đáng kể cho bệnh nhân bị bất cứ dạng bệnh tim mạch nào Q-10 cải thiện chức năng tim bằng cách cải thiện quá trình sản sinh năng lượng trong cơ tim và bằng hoạt động của một chất chống oxy hóa Đối với các bệnh liên quan đến tim mạch, Q-10 có những tác dụng là cải thiện hiệu quả sử dụng oxy trên cơ tim bị thiếu máu cục bộ, kích hoạt tổng hợp ATP trong ty thể của tế bào cơ tim, cải thiện sự suy giảm chức năng tim, ức chế sự giảm thiểu lực co bóp cơ tim do thiếu máu cục bộ và tái tưới máu; bảo vệ cơ tim nhờ tác dụng chống oxy hóa và làm bền vững màng tế bào, hạn chế tổn thương tim và tác dụng kháng aldosterone bằng cách ức chế sự tiết aldosterone

và đối kháng với sự lưu giữ Na+ do aldosterone gây ra, dẫn đến sự bài tiết Na+ qua đường tiểu [20]

Người ta thấy máu của những người bị ung thư thường thiếu Q-10 Lượng Q-10 trong máu ở các bệnh nhân bị bệnh myeloma, lymphoma và bị bệnh ung thư ngực, ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tuỵ, ung thư ruột già, ung thư cổ , ung thư thận, ung thư đầu, … thường rất thấp Các mô và tế bào liên quan đến hoạt động miễn dịch phụ thuộc nhiều và năng lượng nên do đó cần một sự cung cấp Q-10 đầy

đủ cho hoạt động tối ưu Một số nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả tăng cường tính miễn nhiễm của Q-10 và tác động có lợi đối với bệnh nhân bị ung thư đang uống các thuốc hoá trị liệu có khả năng gây ngộ độc tim (ví dụ: adriamycin, athralines… ) [19]

Bệnh tiểu đường làm tăng các stress oxy hóa và làm sai hỏng quá trình trao đổi năng lượng Nồng độ Q-10 dạng khử trong huyết tương ở bệnh nhân tiểu đường thấp hơn ở người khoẻ mạnh nên Q-10 có thể sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường Bệnh Parkinson là một rố loạn suy thoái thần kinh, đặc trưng bởi các đặc điểm như run, cứng cơ, di chuyển chậm Một trong những nguyên nhân chính của bệnh này là

do sự suy giảm hoạt động phức hợp của chuỗi chuyền điện tử ti thể và sự tăng stress oxy hóa một phần não Sự bổ sung Q-10 có tác dụng làm chậm diễn tiến xấu của bệnh so với đối chứng

Tại Việt Nam, một số công ty dược đã sản xuất thuốc từ Q10 như: CoQ10 để điều trị tim mạch, Fonat Q10 dùng trong hổ trợ bệnh tim mạch

1.3.6.4 Ứng dụng trong mỹ phẩm

Các ứng dụng của Q-10 trong mỹ phẩm được dựa trên tính năng chống oxy hóa của Q-10, có tác dụng giúp các mô cơ thể, đặc biệt mô da chống lại hiện tượng lão hoá theo thời gian Trong mỹ phẩm, Q-10 có tác dụng như ngăn ngừa và chống nhăn

da, hạn chế hoạt động của enzym collagenase, hạn chế những ảnh hưởng có hại của các gốc tự do đối với da, do đó làm chậm lại quá trình tổn thương mô da và làm mờ các đốm da bị đồi mồi, nám, các quầng thăm ở mắt …

Hiện nay, rất nhiều hãng mỹ phẩm có bổ sung chất Q-10 trong kem dưỡng thể, son môi, sữa rửa mặt … như Nevia, Ponds, Rhoto

1.3.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT UBIQUINON Q-10

Chiết tách từ các nguồn thực phẩm tự nhiên

Vì Q-10 hiện diện trong các nguồn thực phẩm tự nhiên với hàm lượng rất thấp và khó tinh sạch, do vậy việc sản xuất Q-10 trên qui mô công nghiệp từ các nguồn thực phẩm tự nhiên không có giá trị thực tiễn

Tổng hợp hoá học

Việc tổng hợp hoá học Q-10 được thực hiện từ nguyên liệu là solanesol, được chiết tách từ cây họ Cà Solanesol được chuyển hoá thành một hợp chất 9-isoprenoid và phản ứng với hydroquinon để tạo thành Q-10

Hình 1.16 Q-10 được bán tổng hợp từ Solanesol [30]

Phương pháp vi sinh

Các vi sinh vật dùng trong sản xuất Q-10 được kích thích để tăng cường khả năng tổng hợp Q-10 của chúng Các vi sinh vật thường được dùng để sản xuất Q-10 là vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter , Agrobacterium

rhizogenes, Agrobacterium, Paracoccus denitrificans, Rhodobacter sphaeroidesa

[19], [31], [35], [37]

Solanesol

Coenzym Q10

Tổng hợp

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh Rhodopseudomonas palustris PN16,

PN21 và PN31 được phân lập tại Việt Nam từ Trung tâm Sinh học – Đại học Khoa học Tự Nhiên

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 DỤNG CỤ - THIẾT BỊ

Dụng cụ

Micropipet 20, 100, 1000, 10000 l của hãng Laboppet

Các dụng cụ thủy tinh: becher, erlen, đũa khuấy, phễu lọc, …

Cân kỹ thuật Sartorius (Thụy Sỹ)

Kính hiển vi hai mắt Olympus CH-2 (Nhật Bản)

Bình sắc ký Camag 10 x 10 cm

Tủ sấy Memmert (Đức)

Máy cô quay Bruchi R-200 (Thụy Sỹ)

Tủ sấy chân không Shellab (Mỹ)

Đèn tử ngoại Vilber Lourmat ở bước sóng 254 nm (Pháp)

Máy ly tâm

Máy vortex Labnet (USA)

Máy đo quang phổ UV-Vis Hitachi U-2010 (Nhật Bản)

Máy đo quang phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201 PC (Nhật Bản)

2.2.2 HOÁ CHẤT – DUNG MÔI

Các dung môi dùng trong chiết xuất là các dung môi kỹ thuật Các dung môi dùng cho sắc ký, phân lập, tinh chế là các dung môi tinh khiết, đạt tiêu chuẩn cho phân

tích: Cloroform, n-hexan, Ethylether, Aceton, Methanol, Isopropanol, Acetonitril,

chất chuẩn Q-10 (Nishin – Nhật Bản)

Các loại vitamin dùng trong thử nghiệm: Vitamin B1, Viatmin B6, Vitamin B12, Vitamin B8, Viatmin E, Vitamin C, Vitamin A là các vitamin nguyên liệu dùng trong sản xuất thuốc

Silicagel 60 cỡ hạt 0,015-0,04 mm – Merck (Đức)

Silicagel F254-Merck (Đức), loại bản nhôm mỏng tráng sẵn dày 0,25 mm

Các loại hóa chất dùng trong môi trường nuôi cấy đều đạt tiêu chuẩn sử dụng trong thí nghiệm

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 NUÔI CẤY VI KHUẨN QUANG DƯỠNG

2.3.1.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy và tăng sinh các chủng VKQD tía không lưu huỳnh là môi trường SA (natri acetate) do Imhoff và Truper thiết kế (1971) và được cải tiến bởi Kawasaki (1993) [1]

2.3.1.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào [3]

Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc

có thể quan sát bằng mắt thường được Đây là cơ sở của việc xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Dịch nuôi cấy được pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng để tạo thành dãy các nồng độ pha loãng khác nhau 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 Mức độ pha loãng tuỳ vào lượng vi khuẩn dự kiến có trong mẫu

Ở mỗi độ pha loãng, lấy 200 µl dịch huyền phù cho vào đĩa petri (sử dụng 3 đĩa cho mỗi độ pha loãng) có chứa môi trường thạch SA, dùng que trải bằng thủy tinh vô trùng trải đều vi khuẩn, đem ủ ở 37oC, 72 giờ, chiếu sáng bằng đèn neon trong điều kiện kỵ khí

Đếm số khuẩn lạc trên các hộp có 30-300 khuẩn lạc Tổng số tế bào vi khuẩn có trong 1ml dịch nuôi cấy được tính bằng trung bình số tế bào ở một độ pha loãng nhất định nhân với độ pha loãng

Số vi khuẩn /ml = Số khóm 10số thứ tự hộp +1

2.3.2 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY PHÙ HỢP CHO VI

KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH

72 giờ nuôi cấy, thu nhận mẫu ở mỗi lô và xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm sống để đánh giá được sự ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự tăng trưởng của vi khuẩn

Thực hiện các lô thí nghiệm sau:

Lô 1: Chứng

Lô 2: Glucose

Lô 3: Xylose

Lô 4: Mannitol

Lô 5: Natri citrat

Lô 6: Natri benzoat

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự tăng

Lô 6: Bổ sung Pepton nồng độ 0,5 g/lít

2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng

lên sự tăng trưởng của VKQD

Thực hiện tương tự mục 2.2.1, sử dụng môi trường SA lỏng có các nguồn chất kích thích tăng trưởng thay đổi như sau:

Lô 1: Chứng

Lô 2: Bổ sung Yeast etract nồng độ 0,25g/lít

Lô 3: Bổ sung Yeast etract nồng độ 0, 5g/lít

Lô 4: Bổ sung Yeast etract nồng độ 0,75g/lít

Lô 6: Bổ sung Yeast etract nồng độ 1g/lít

2.3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn viatmin lên sự tăng

trưởng của vi khuẩn

Thực hiện tương tự mục 2.2.1, sử dụng môi trường SA lỏng chứa 0,005% vitamin thay đổi như sau:

Lô 1: chứng

Lô 2: Bổ sung Vitamin A (5mg/100ml)

Lô 3: Bổ sung Vitamin C (5mg/100ml)

Lô 4: Bổ sung Vitamin E (5mg/100ml)

2.3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn viatmin và các tiền tố tự

nhiên lên sự sinh tổng hợp Q-10

Sau khi chọn được vitamin cho hàm lượng Q10 cao nhất rồi thì tiến hành chọn nồng

Lô 2: bổ sung cà chua 25%

Lô 3: bổ sung cà chua 50%

Lô 4: bổ sung cà chua 75%

Lô 5: bổ sung cà rốt 25%

Lô 6: bổ sung cà rốt 50%

Lô 7: bổ sung cà rốt 75%

2.3.3 THU NHẬN SINH KHỐI VI KHUẨN

Sau 72 giờ nuôi cấy trên môi trường SA lỏng, canh trường có màu đỏ tía hoặc nâu vàng thì ly tâm thu tế bào (10000 vòng/phút trong 10 phút) Sinh khối này được rửa

2 lần với nước cất và được dùng để chiết tách ubiquinon Q-10 [8], [28]

2.3.4 CHIẾT XUẤT Q-10 TỪ VI KHUẨN

Q-10 là một cấu phần trong chuỗi truyền điện tử nên chúng nằm phía bên trong màng tế bào chất vi khuẩn Q-10 chỉ tan trong các dung môi không phân cực Vì vậy, sau khi thu tế bào, phải tiến hành phá vỡ màng tế bào vi khuẩn để hiệu suất chiết đạt hiệu quả cao nhất Thường sử dụng hệ dung môi có khả năng phá tế bào và hoà tan tối đa Q-10

Quinon là lipid tự do nên có thể chiết tách từ tế bào vi khuẩn bằng các dung môi

kém phân cực như aceton, cloroform và n-hexan Do các quinon dễ bị phân hủy

trong điều kiện acid hay kiềm mạnh nên phản ứng xà phòng hoá không thích hợp cho quy trình chiết Q-10

Q-10 có thể được chiết tách theo phương pháp sau:

Hỗn hợp cô đặc này dùng một lượng nhỏ hoà tan trong n-hexan đem định tính

Hình 2.1 Phương pháp chiết xuất Q-10 của Collins

2.3.4.2 Phương pháp Paterson & Buddie (1991) [25]

Lấy 200mg cắn tế bào vi khuẩn cho vào 3ml hỗn hợp dung môi methanol - n-hexan (3:2), trộn đều bằng máy vortex trong 15 phút Thêm n-hexan, trộn đều bằng máy

vortex trong 2 phút Loại xác tế bào bằng cách ly tâm dịch huyền phù này ở tốc độ thấp (8000 vòng/phút)/15 phút hoặc cho qua bình lắng gạn để thu nhận dịch chiết có

chứa Q-10 là lớp n-hexan ở trên cùng Chiết tách hai lần nữa với n-hexan để lấy tối

đa lượng Q-10 có trong mẫu, cẩn thận không nên lấy lẫn lớp methanol Thu gộp dịch chiết Q-10, cô quay với tốc độ 100 vòng/phút ở nhiệt độ 40oC Hỗn hợp cô đặc

này dùng một lượng nhỏ hoà tan trong n-hexan đem định tính

Sinh khối tươi của VK

cloroform-methanol (2:1) + bi thủy tinh

Lọc thu dịch chiết chứa Q-10