nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và sử dụng kit chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi

Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và sử dụng KIT chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi Đề tài KC04.16 nhằm nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học tiên tiến

Bộ KH CN Viện Thú y

Bộ khoa học - công nghệ

Viện Thú Y

86, Đường Trường Chinh - Đống Đa – Hà Nội

Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.16:

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất

và sử dụng KIT chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Trương Văn Dung

6101

19/9/2006

Hà Nội – 2005

Bản quyền 2005 thuộc Viện Thú y

Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trưởng Viện Thú y trừ trường hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu

Bộ KHCN Viện Thú y

TT Mã số Tên đề tài nhánh Cơ quan của chủ

TS Trương Nam Hải

Viện Công nghệ sinh học

ViÖn C«ng nghÖ sinh häc

17 Ph¹m B¶o Ngäc TS ViÖn Thó y

35 Lª TrÇn Phan BSTY ViÖn Thó y

42 NguyÔn ThÞ Thanh Nhµn Th.S Chi côc TT L¹ng S¬n

9 Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

11 Chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh

12 Trung tâm nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản nước lợ Hải Phòng

Trang

1

5

Tãm t¾t b¸o c¸o

Danh môc c¸c tõ viÕt t¾t

1.3.1 Giíi thiÖu chung vÒ Salmonella

1.3.2 C¸c kh¸ng nguyªn cÊu tróc bÒ mÆt tÕ bµo

1.4.1 T×nh h×nh nghiªn cøu bÖnh Tô huyÕt trïng

1.4.2 BÖnh Tô huyÕt trïng t¹i ViÖt Nam

A Nguyªn liÖu 62

2.1 §èi t−îng nghiªn cøu bÖnh §èm tr¾ng ë t«m 62

2.3 Kit chÈn ®o¸n miÔn dÞch bÖnh Salmonella ë gµ 64

2.5 Kit chÈn ®o¸n bÖnh Tô huyÕt trïng tr©u bß 65

2.1.5 Ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p AND plasmid vµo tÕ bµo E.coli

2.1.6 Ph−¬ng ph¸p t¸ch AND plasmid tõ vi khuÈn

2.1.7 Ph−¬ng ph¸p ®iÖn di AND trªn gel

2.2.2 Ph−¬ng ph¸p ch¹y ®iÖn di n»m ngang

2.2.3 Ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp

2.4.2 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào VK E coli 86

2.4.3 Biến nạp DNA plasmid vào E.coli bằng PP TB khả biến 87

2.4.4 Điện di DNA trên gel agarose

2.4.5 Điện di thu gen trong túi thẩm tích

2.4.6 Xử lý DNA plasmid bằng enzym hạn chế

2.5 Kit chẩn đoán Tụ huyết trùng trâu bò 92

2.5.1 Qui trình chiết tách IgG của thỏ

2.5.2 Xác định nồng độ protein

2.5.3 Qui trình gây miễn dịch cho dê

2.5.4 Phản ứng ELISA để kiểm tra HGKT của dê

2.5.5 Chế tạo Peroxidase conjugation

2.5.6 Xác định đặc tính VSV, SH và độc lực của VK

2.5.7 Qui trình chế kháng nguyên và chất gây MD

2.5.8 Lịch trình gây tối miễn dịch trên thỏ

2.5.9 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của thỏ

3.1.3 Kết quả thực nghiệm

3.1.3.1 Kết quả tách AND tổng số từ tôm bệnh

3.1.3.2 Kết quả tách dòng và trình từ AND gây WSSV

3.1.3.3 Kết quả tách dòng và trình từ ADN gây MBV

3.4 Kit ELISA chẩn đoán bệnh Salmonella ở gà 146

3.4.1 Kết quả tách chiết DNA genome từ tế bào VK

3.4.2 Kết quả phân lập các gen từ DNA genome bằng PCR

3.4.3 Kết quả tách dòng các gen mã hoá KN roi của

Salmonella bằng hệ vector tách dòng pCR2.1

3.4.4 Biểu hiện các gen mã hoá KN roi

3.4.5 Tìm các điều kiện tối thích để biểu hiện các gen

3.4.6 Tinh sách các protein tái tổ hợp

3.4.7 Nghiên cứu khả năng liên kết miễn dịch của các

3.5 Kit chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 165

3.5.1 Kết quả nghiên cứu sản xuất tinh chiết kháng thể

dê kháng IgG

3.5.2 Kết quả nghiên cứu sản xuất tinh chiết kháng thể

165

169

3.5.2.2 Kết quả kiểm tra ĐƯMD qua thỏ

3.5.2.3 Kết quả chiết tách IgG

3.5.2.4 Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể và vi thể

3.5.2.5 Kết quả xác định độ pha loãng IgG trong kỹ

Đề tài:

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và

sử dụng KIT chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi

Đề tài KC04.16 nhằm nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học tiên tiến của các nước trên thế giới để tạo ra các chế phẩm sinh học dùng trong chẩn

đoán một số bệnh truyền nhiễm quan trọng ở vật nuôi đang là đòi hỏi của thực tế sản xuất ở nước ta như: Bệnh Đốm trắng ở tôm, bệnh Dịch tả lợn, bệnh do Salmonella gây ra và bệnh Tụ huyết trung trâu bò

Trên cơ sở đề cương và hợp đồng ký kết với Bộ khoa học công nghệ, đề tài

được tách ra làm 5 nhánh tương ứng với 5 nội dung nghiên cứu độc lập nhau

Đề tài được thực hiện từ tháng 11-2001 và kết thúc vào tháng 12-2004 Sau 3 năm thực hiện tất cả nội dung nghiên cứu đều đạt được kết quả tốt như dự định ban

đầu khi xây dựng đề cương (một số nhánh vượt hơn so với nội dung đặt ra) Kết quả

đã đạt được theo từng nội dung như sau:

1 ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học để phát hiện nhanh virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

- Đã tách dòng và xác định trình tự của đoạn AND đặc hiệu của virus gây bệnh

đốm trắng ở tôm

- Hoàn thiện qui trình chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm

- Hoàn thiện qui trình chẩn đoán đồng thời bệnh đốm trắng và bệnh MBV bằng phương pháp Multiplex PCR

- Chế tạo thành công Kit chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm đơn giản dễ vận chuyển, dễ bảo quản

- Chế tạo thành công Kit chẩn đoán bệnh MBV

- Chế tạo thành công Kit chẩn đoán đồng thời bệnh MBV và WSSV

- Đã hướng dẫn và đào tạo 7 sinh viên, 1 cao học

- Đã chuyển giao được 50 bộ Kit chẩn đoán bệnh đốm trắng

- Đã có 2 bài báo đăng trên tạp chí thú y và báo cáo tại hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003 Dự kiến đăng 1 bài báo tiếp theo

2) Nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn

- Đã sản xuất được conjugate huỳnh quang cho phương pháp kháng thể huỳnh quang miễn dịch

- Đã xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất kháng huyết thanh tối miễn dịch với kháng nguyên virus dịch tả lợn

- Đã xây dựng được qui trình chẩn đoán virus dịch tả lợn bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang

- Đã xây dựng được qui trình phân lập virus dịch tả lợn trên tế bào thận lợn PK15

- Đã thiết lập được phản ứng NPLA

- Đã thiết lập được kỹ thuật RT-PCR và ELISA trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn

- Đã chuyển giao Kit và qui trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn cho trung tâm thú

y vùng: Vinh, Đà nẵng và Cần Thơ để chẩn đoán với số lượng 1000 mẫu ( Kit chẩn

đoán miễn dịch huỳnh quang)

- Đã đào tạo 2 sinh viên

3) Kit chẩn đoán bệnh do Salmonella ở gà bằng công nghệ vi sinh

- Từ 339 mẫu phân gà Lương phượng đã phân lập được 20 mẫu dương tính với Salmonella enteritidis Từ 407 mẫu phân gà ri đã phân lập được 9 mẫu dương tính với S enteritidis

- Đã chế tạo thành công kháng huyết thanh tối miễn dịch qua thỏ để định typ vi khuẩn S enteritidis và S typhymurium

- Đã thiết lập được qui trình chế huyết thanh đơn giá và đa giá O vi khuẩn S êntritidis và S typhymurium

- Đã đăng được một bài báo trên tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn

4) Kit ELISA chẩn đoán Salmonella gây bệnh ở gà công nghiệp bằng công nghệ sản xuắt kháng nguyên bằng vi khuẩn biến nạp

- Tách dòng thành công các vùng gen mã hoá cho Epitop kháng nguyên roi của các vi khuẩn S typhymurium và S enteritidis trong vi khuẩn E.coli

- Thiết lập thành công các vector biểu hiện mang gen fliB1, fliB2, gm1, gm2 từ

vector bỉểu hiện pET22b+- Tạo được 4 chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp mang các gen fljB1, fljB2, gm1 và gm2

- Biểu hiện và tinh chế được 4 protein tái tổ hợp FljB1, FljB2, Gm1 và Gm2

- 4 protein tái tổ hợp FljB1, FljB2, Gm1 và Gm2 được thử khả năng liên kết đặc hiệu với kháng thể tự nhiên bằng phương pháp lai western blot Trong đó, FljB1 và

FljB2 có khả năng phát hiện đặc hiệu được S typhimurium; Gm1 và Gm2 có khả năng phát hiện đặc hiệu được S enteritidis Các protein này được sử dụng để làm nguyên liệu tạo kit ELISA phát hiện đặc hiệu Salmonella gây nhiễm ở gà

- Xây dựng được quy trình để tạo thành công hai bộ sinh phẩm (kit ELISA)

phát hiện đặc hiệu S typhimurium và S enteritidis gây nhiễm ở gà

- Đã xuất bản được 2 bài báo và dự kiến xuất bản 2 bài báo trong thời gian tới

- Đã đào tạo được 3 sinh viên, 1 thạc sỹ, 1 tiến sỹ

5) Nghiên cứu kit chẩn đoán miễn dịch - bệnh lý ( Hoá miễn dịch) đối với bệnh tụ huyết trùng trâu bò

- Đã thiết lập được qui trình chiết tách IgG của thỏ

- Đã thiết lập đ−ợc qui trình gây miễn dịch cho dê bằng IgG của thỏ

- Đã thiết lập đ−ợc qui trình kiểm tra hiệu giá kháng thể của dê kháng IgG của thỏ bằng kỹ thuật ELISA

- Đã chế tạo thành công conjugate gắn với men peroxydasa

- Đã sản xuất 1000 ml kháng huyết thanh dê khángIgG của thỏ

- Đã xây dựng đ−ợc qui trình chế kháng nguyên Pasteurella multocida

- Đã xây dựng đ−ợc qui trình chế kháng kháng huyết thanh tối miễn dịch kháng Pasteurella multocida

- Đã thiết lập đ−ợc qui trình chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng trâu bò bằng kỹ thuật miễn dịch bệnh lý ( Hoá miễn dịch)

- Đã thực hiện chuyển giao công nghệ chẩn đoán miễn dịch bệnh lý cho trung tâm Chẩn đoán thú y TW

- Đã xuất bản đ−ợc 2 bài báo và dự kiến xuất bản một bài báo trong thời gian tới

- Đã đào tạo đ−ợc 2 sinh viên và 2 thạc sỹ thú y

Danh môc c¸c tõ viÕt t¾t

BVDV Bovine diarrhea disease virus CSFV Classical swine fever virus ELISA Enzim-linked immunosorbent assay FAT Fluorescent antibody test

HRPO Horse radish peroxidase RT_PCR Revert Transcript polymerase reaction

EDTA Ethylen diamin tetra acetic acid

LB Luria-betani medium

S typhimurium Salmonella typhimurium

cña vi khuÈn S typhimurium

H:1,2 cña vi khuÈn S typhimurium

cña vi khuÈn S typhimurium

H:i cña vi khuÈn S typhimurium

cña vi khuÈn S enteritidis

gm2 Gen m· ho¸ vïng epitop cña kh¸ng nguyªn

H: g,m cña vi khuÈn S enteritidis

H: g,m cña vi khuÈn S enteritidis

FljB1 Protein t¸i tæ hîp ®−îc t¹o ra ë E coli do gen

AGPT: Agar Gel Precipitation Test

CFU: Colony forming unit CSMD: ChØ sè miÔn dÞch ELISA: Enzym Liking Immuno Sorbent Assay G-HCC: Hçn dÞch hång cÇu cõu glutaraldehyt

HGKT: HiÖu gi¸ kh¸ng thÓ

IHA: Indirect Haemagglutination

LPS: Lipopolysaccharide MDCS: MiÔn dÞch c¬ së

OMPS: Outer membrane Proteins PBS: Phosphat Buffer Salin PCR: Polymerase Chain Reaction

Chương I Tổng quan tài liệu

1.1 Bệnh đốm trắng ở tôm:

1.1.1 Tình hình dịch bệnh:

Thuỷ sản đã và đang trở thành một ngành kinh tế quan trọng của đất nước với sản lượng hiện nay khoảng 2,2 triệu tấn, trong đó nuôi trồng đạt gần 40% Theo kế hoạch, đến năm 2010 sản lượng nuôi trồng sẽ đạt 60-65% trong tổng sản lượng thuỷ sản của cả nước Để đạt sản lượng khai thác thuỷ sản khoảng 3,5 triệu tấn, cần phải tăng cường phát triển nuôi trồng thuỷ sản Việc phát triển nhanh chóng nghề nuôi trồng thuỷ sản đã dẫn đến một thực tế là sự mất cân bằng sinh thái trong các vùng nuôi trồng thuỷ sản rộng lớn Hiện tượng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh xảy ra liên tiếp ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới Năm 1987-1989, dịch bệnh tôm ở Đài Loan đã làm sản lượng nuôi tôm của quốc gia này giảm xuống từ 100.000 tấn (1987) xuống còn 30.000 tấn (1988) và 20.000 tấn (1989), gây thiệt hại ước tính 420 triệu USD Đến năm 1990-1991 nghề nuôi tôm ở hàng loạt các quốc gia khác của châu á, châu Phi và châu Mỹ đã bị ảnh hưởng nặng nề do dịch bệnh trong đó có một số quốc gia điển hình như: Thái Lan, Philippin, Trung Quốc, Indonesia, Băngladesh, Singapore, Nhật Bản, Hawaii, ấn Độ

Dịch bệnh đã ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống người dân, gây lúng túng cho các nhà quản lý Dịch bệnh xảy ra và những thiệt hại to lớn của nó là động lực thúc

đẩy các nhà khoa học nghiên cứu tìm hiểu về những loại bệnh ở tôm Cho đến năm

1996 có trên 30 loại bệnh khác nhau trên tôm he đã được tập trung nghiên cứu Dựa vào các tác nhân gây bệnh, các nhà khoa học chia ra thành một số bệnh chủ yếu:

• Bệnh do virút

• Bệnh do vi khuẩn

• Bệnh do nấm

• Bệnh do kí sinh trùng và một số bệnh do các yếu tố vô sinh gây ra Bắt đầu từ năm 1988, khi miền Trung Việt Nam cho đẻ thành công tôm sú, nghề nuôi tôm ở Việt Nam đã có những bước phát triển rất nhanh Hàng trăm trại sản xuất tôm giống đã xây dựng dọc bờ biển miền Trung, nhiều hecta mặt nước ven biển được đưa vào nuôi tôm thịt ở đồng bằng sông Cửu Long và một số vùng ở miền Bắc

Những địa phương có lịch sử nuôi tôm trong những năm gần đây đã đối mặt với thảm họa dịch bệnh tôm Bệnh tôm đã gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho những người nuôi tôm Tốc độ lây lan của virut đến các vùng khác nhau là hồi chuông cảnh báo đối với bất cứ ai nuôi tôm chuyên theo hình thức công nghiệp Bằng nhiều hình thức (thuốc, các biện pháp xử lý môi trường vi sinh vật) trong đó

có việc chọn tôm giống sạch bệnh trước khi thả trên diện rộng, đồng thời kiểm tra phát hiện bệnh sớm để có biện pháp xử lý thích hợp tránh sự lây lan dịch bệnh, nhằm đạt được năng suất nuôi tôm cao

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Từ năm 1993 bệnh tôm đã được các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan thông báo Năm 1995 các nước Đài Loan, ấn Độ, Inđônexia cũng cho biết có 4 loại virut gây chết tôm, trong đó thường gặp nhất là Baculovirus mà

đặc biệt là virut gây bệnh đốm trắng ở tôm Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán nhanh bệnh virut ở tôm như PCR, RFLP, lai Southern, lai dot blol đã được sử dụng rộng rãi ở các nước như Nhật Bản, Hồng Kông, Singapore, Philipin, Thái Lan, Mỹ, Australia

Các nhà khoa học đã tìm, mô tả hình thái, cấu trúc di truyền và định loại

được trên 20 loại virut gây bệnh chủ yếu cho tôm như: WSSV, TSV, YHV, HPV, IHHNV, MBV, BMV

Một số virut gây bệnh nguy hiểm cho tôm:

- MBV (Monodon Baculovirus)

- Hội chứng virut đốm trắng (WSSV – White spot syndrome virus)

- Virut đầu vàng (Yellow head virus)

- Virrut gây nhiễm trùng virut dưới da và hoại tử (IHHNV – Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus)

- Virut gây hoại tử gan tuỵ (Hepatopancreatic Parvovirus – HPV)

- Hội chứng Taura (Taura syndrom virus – TSV)

- Virut gây hoại tử tuyến ruột giữa (Baculovirus Migut gland Necrcosis – BMN)

Trong đó tỷ lệ gây chết tôm do bị virut đốm trắng là 90%, bệnh MBV tuy có

tỷ lệ chết thấp hơn nhưng đây là nhân tố mở đường cho các nhân tố gây bệnh khác

đồng thời lại làm cho năng suất nuôi tôm giảm mạnh do tôm không phát triển

được

1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

ở Việt Nam, các phương pháp chẩn đoán bệnh tôm do virut trước đây chủ yếu vẫn là phương pháp tế bào học và hoá tế bào do đó việc phát hiện bệnh thường

bị quá chậm, ảnh hưởng tới năng suất và chất lượng tôm gây thiệt hại lớn cho người nuôi tôm Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại đặc biệt là kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán bệnh tôm do virut vẫn chưa được cơ sở nào tiến hành

* Thực trạng của việc phát hiện, chẩn đoán bệnh virut của tôm

Trước tình hình phát triển mạnh của dịch bệnh, hầu hết các nước có ngành nuôi tôm đều hết sức chú trọng tới việc phát hiện, chẩn đoán sớm bệnh virut của tôm đồng thời đưa ra các phương pháp điều trị bệnh nhằm giảm thiệt hại tới mức thấp nhất cho người nuôi tôm

a Phương pháp chẩn đoán bệnh virut của tôm được coi là phương pháp truyền thống là:

- Dựa vào kinh nghiệm nuôi như mầu sắc, mùi vị của nước trong ao nuôi Khi tôm trong ao bị nhiễm bệnh nước nuôi thường đục, có mùi hôi thối, độ chua của nước tăng

- Dựa vào các triệu chứng lâm sàng của tôm khi bị nhiễm bệnh Ví dụ tôm

bị nhiễm virut đốm trắng (WSSV), đầu vàng (YHV) có các triệu chứng kém ăn, bơi

lờ đờ gần mặt nước Đối với tôm bị nhiễm virut đốm trắng thân xuất hiện các đốm màu trắng

Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm:

- Không chính xác, và thường xác định được bệnh khi tôm đã bị nhiễm bệnh nặng

- Dễ bị nhầm lẫn các bệnh với nhau nên dẫn đến các sai lầm trong phòng trị

b Phương pháp chẩn đoán bệnh virut dựa vào các đặc điểm mô học: Các mẫu tôm nghi bị nhiễm bệnh được xác định bằng cách nhuộm tiêu bản hiển vi để xác định hình dạng, cấu trúc bên ngoài và dựa vào các đặc điểm đó

để phân loại các nhân tố gây bệnh

Nhược điểm của phương pháp là: Thời gian chẩn đoán bệnh lâu, mức độ chính xác không cao do có rất nhiều loài vi khuẩn, virut tuy có nhiều điểm giống nhau về hình thái nhưng hệ genom của chúng lại khác xa nhau

c Phương pháp chẩn đoán bệnh virut hiện đại nhanh, nhạy, tính chính xác cao đang được các nước áp dụng là dựa vào sinh học phân tử Kỹ thuật PCR, RT-PCR được ứng dụng hữu hiệu và ngày càng có uy tín với người nuôi tôm

ở Việt Nam phương pháp này kể từ trước 2000 chưa được áp dụng một cách rộng rãi do nhiều nguyên nhân trong đó phải kể tới việc đầu tư khoa học kỹ thuật còn bị bỏ ngỏ Mấy năm gần đây việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đã

được áp dụng tại nhiều cơ sở tuy nhiên vẫn còn hạn chế do giá thành, vận chuyển,

sử dụng phức tạp

Bệnh DTL hiện nay lan tràn khắp thế giới và được coi là bệnh gây nhiều thiệt hại nhất cho ngành chăn nuôi lợn Do tầm quan trọng của bệnh, nhiều nước

đã xây dựng chương trình thanh toán bệnh ở Mỹ chương trình thanh toán bệnh dịch tả lợn bắt đầu năm 1962 và kết thúc vào năm 1976 tiêu tốn 140 triệu đôla EC (European Community) cũng tài trợ cho các nước thành viên một chương trình thanh toán dịch tả lợn Tuy nhiên, dịch tả lợn vẫn còn xảy ra và gây thiệt hại lớn về kinh tế Việc thanh toán bệnh vẫn là một vấn đề cần phải bàn Năm 1997, dịch xảy

ra ở năm nước trong khối EU là Đức, Hà Lan, ý, Tây Ba Nha và Bỉ gây tổn thất to lớn đối với nền kinh tế của các nước này

Theo thống kê của tổ chức dịch tễ thế giới (OIE), năm 1984 ở Mehico có

179 ổ dịch, Malaixia có 5 ổ dịch và Hàn Quốc có 45 ổ dịch (OIE-1984)

Những nước sau đây là những nước được coi là không có bệnh DTL: úc, Canada, Ireland, Newzealand, các nước thuộc bán đảo Scadinavi (gồm Thụy Điển, NaUy, Phần Lan ) và Thụy Sĩ (Theo Oirschot- 1984)

1.2.2 Tình hình bệnh dịch tả lợn ở Việt Nam:

ở Việt Nam DTL được Houdemer phát hiện lần đầu tiên vào năm

1923-1924 và gây nhiều đợt dịch, theo Đào Trọng Đạt và cộng sự (1989) cho đến nay bệnh vẫn thường xảy ra

Năm 1968 là năm có số ổ dịch xảy ra nhiều nhất ở miền Bắc, theo thống kê

có đến 481 ổ dịch nổ ra(Lê Độ, 1981) Từ năm 1975-1978, ở miền Nam do biến

động kinh tế - xã hội sau ngày giải phóng nên bệnh phát triển mạnh Năm 1973, dịch xảy ra ở 11 trại lợn xung quanh Sài gòn Năm 1974, xảy ra ở 17 tỉnh phía Bắc thiệt hại hơn 4 vạn con lợn Năm 1981, 15 tỉnh thuộc Nam Bộ có dịch gây chết 145.078 con lợn Năm 1990, tại lò mổ Huỳnh Thúc Kháng (Thừa Thiên Huế) bệnh DTL xảy ra do mua lợn tập trung về ăn tết sau đó lan ra thành phố Huế (Cục Thú

y, 1990)

Theo điều tra dịch tễ học từ năm 1995-1997, tại các tỉnh Ninh Thuận, Khánh Hoà, Phú Yên, Bình Định, Quãng Ngãi, Quảng Nam đều có lợn bị bệnh dịch tả Bệnh lẻ tẻ nhưng thường xuyên, số lợn bị bệnh không nhiều nhưng có ở khắp nơi trong tỉnh (Nguyễn Thị Phương Duyên-1996)

Công bố của Cục thú y về kết quả điều tra về dịch bệnh ở các tỉnh phía Bắc cho biết: Bệnh DTL có tỷ lệ chết cao nhất trong các bệnh của lợn là 2,45% (Lê Minh Chí và cs, 1999) Theo kết quả điều tra cả 3 miền trong các năm từ 1997-

1999 thì tỷ lệ nhiễm bệnh DTL cao nhất là miền Trung 3,35%, miền Bắc 3,01% và thấp nhất là miền Nam 2,91% (Hồ Đình Chúc, 2000)

Từ những năm 1980, được sự quan tâm của Nhà nước, Bộ Nông Nghiệp & PTNT đưa vào kế hoạch xây dựng chương trình phòng chống với việc tiêm phòng vacxin đã khống chế được các ổ dịch Cho đến nay bệnh vẫn tồn tại và không gây thành những ổ dịch lớn nhưng bệnh diễn biến ngày càng phức tạp và là mối đe dọa lớn đối với ngành chăn nuôi

1.2.3 Dịch tễ học bệnh Dịch tả lợn

1.2.3.1 Nguồn bệnh và các phương thức lây lan:

Bệnh DTL là một bệnh truyền nhiễm của loài lợn, lây lan rất mạnh, gây ra chỉ ở loài lợn bao gồm cả lợn rừng và lợn nhà

Theo các tác giả Đào Trọng Đạt, Trần Thị Tố Liên(1989) virus DTL tồn tại

ở bất cứ đâu có chăn nuôi lợn Chúng ta có thể khẳng định rằng virus DTL có ở

khắp nơi trên thế giới (Nguyễn Tiến Dũng,1996) Về nguồn gốc của virus DTL ở lợn rừng và lợn nhà có rất nhiều ý kiến khác nhau Aubert.M; Pcard.M, (1996) cho rằng bệnh DTL ở lợn rừng cũng giống như ở lợn nhà Những triệu chứng của bệnh giống nhau giữa hai loài: sốt cao, bỏ ăn, táo bón xen lẫn ỉa chảy và không thấy có

sự khác nhau về độ mẫn cảm với bệnh giữa lợn rừng và lợn nhà Khi gây nhiễm cho lợn nhà bằng chủng virus phân lập từ lợn rừng thì thấy những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích giống như ở lợn rừng Như vậy không thể phủ nhận một điều là lợn rừng cũng đóng vai trò trong việc phát tán mầm bệnh (Bùi Quang Anh, 2001)

Lợn bị bệnh DTL thải virus liên tục cho đến khi chết hoặc cho đến khi miễn dịch phát sinh ở những con còn sống sót (Resang, 1973) Các chủng virus có độc lực thấp hoặc trung bình gây ra bệnh thể mạn tính và thải virus liên tục ra ngoài môi trường hoặc cách quãng cho đến khi chết (Mengeling và Packer, 1969) Khi lợn nái có chửa bị nhiễm các chủng virus dịch tả lợn như trên thì có biểu hiện lâm sàng không rõ ràng, nhưng virus thường xuyên qua nhau thai truyền sang bào thai

Về mặt dịch tễ học những con lợn con sinh ra trong các trường hợp này có vẻ khoẻ mạnh nhưng đã nhiễm virus Những con lợn này có thể gieo rắc một lượng lớn virus ra ngoài môi trường mà không hề có dấu hiệu bệnh (Van Oirschot và Tepstra,1977) Không phải tất cả các chủng virus truyền lây nhanh như nhau Các chủng virus độc lực cao thường truyền lây nhanh hơn các chủng virus độc lực thấp

do phát triển nhanh trong cơ thể và thải tiết một lượng lớn ra ngoài Sự nhiễm virus

độc lực thấp thường không nhận ra ngay mà chỉ dựa vào các kết quả xét nghiệm huyết thanh học mới xác định được

Thực tế ở nước ta đã cho thấy bệnh dịch tả lợn nổ ra ở một nơi nào đó thường bắt đầu từ những con lợn con mới mua về và từ đó lây sang những lợn khác

ở địa phương nếu chúng chưa được tiêm phòng đầy đủ Nhiều tài liệu nước ngoài cũng đã đề cập vấn đề này

Brich(Anh, 1917) đã thấy DTL điển hình ở 2 lợn 5 tuần tuổi của hai lợn mẹ tối miễn dịch Michalka (Đức, 1931) thấy hiện sảy thai, thai chết ở lợn nái sau khi

dùng đồng thời 2 loại vacxin (Simultanous vaccination, serovaccination) được 12 tháng, lợn con của chúng đã mắc bệnh DTL lúc 4 tuần tuổi Davd và Rhoner (Đức, 1932) thấy những trại lợn sau khi đã bị bệnh DTL cấp tính thì bệnh DTL mạn tính kéo dài hàng năm ở lợn con và lợn choai trong trại Goodwin (Anh, 1965) thấy bệnh dịch tả lợn phát ra trong một trại bắt đầu ở những lợn con lấy từ trong thai của những con mẹ trước đó 18 tháng đã mắc bệnh dịch tả lợn thể nhẹ rồi khỏi Miller (1963), bằng kinh nghiệm thực tế của mình thấy rằng bệnh dịch tả lợn thường phát sinh từ những lợn con khoẻ mạnh từ những trại mà lợn mẹ thường hay

có hiện tượng sảy thai rồi truyền sang các trại lợn khác Những tư liệu trên cho thấy có sự truyền virus gây bệnh từ lợn mẹ sang lợn con qua bào thai còn gọi là

“nái mang trùng- carrier sow” và đó là một trong những nguyên nhân làm cho bệnh dịch tả lợn tồn tại kéo dài

Tiếp xúc trực tiếp là phương thức truyền lây chủ yếu Đường tiêu hoá là

đường xâm nhập chính Virus xâm nhập vào cơ thể theo thức ăn, nước uống Ngoài

ra virus có thể vào cơ thể qua đường hô hấp, qua đường nhau thai và qua đường tiêm chích

Bệnh DTL có tính chất lưu hành mạnh, lây lan nhanh và giết hại nhiều lợn ở nhiều lứa tuổi khác nhau, nhất là lợn con Không có vùng dịch rõ rệt về mặt địa lí 1.2.3.2 Loài vật mắc bệnh

Trong thiên nhiên chỉ có loài lợn mắc bệnh, cả lợn nhà cũng như lợn rừng Lợn ở các lứa tuổi khác nhau đều mắc nhưng nhiều nhất là lợn con, lợn cai sữa Các loài vật khác và người không bị mắc bệnh DTL (Nguyễn Lương,1997) Nhiều tác giả đã thí nghiệm truyền bệnh cho chuột lang, chuột nhắt, gà, ngựa, trâu nhưng không thành công Năm 1959, Fonanelli và cộng sự đã thử tiêm cho phôi gà nhưng không có kết quả

1.2.3.3 Lứa tuổi mắc bệnh:

Bệnh thường xảy ra đối với lợn mọi lứa tuổi song chủ yếu tập trung ở lợn con theo mẹ và lợn mới cai sữa Trong những năm gần đây việc tiêm phòng đã

được chú ý do vậy tuổi mắc bệnh phụ thuộc nhiều vào sức đề kháng và tình trạng miễn dịch của đàn lợn

Theo Bùi Quang Anh (2001) lợn từ 2-6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh DTL cao nhất trong tổng số lợn mắc bệnh, lợn theo mẹ 19,24%, lợn trên 6 tháng tuổi 12,08% Còn lợn nái và lợn đực tỷ lệ mắc bệnh DTL thấp nhất (0,21- 2,46%) nhưng lại là nguồn lây lan dịch bệnh nguy hiểm nhất

1.2.3.4 Mùa vụ mắc bệnh:

Bệnh DTL phát ra quanh năm, tuy nhiên do sự thay đổi thời tiết và cơ cấu

đàn lợn nên bệnh xảy ra không theo một quy luật nhất định nào cả và cũng không

có vùng dịch rõ rệt Theo thống kê thì 80% các ổ dịch xảy ra vào tháng 12 năm trước cho tới tháng 1, 2, 3 của năm sau

Cục Thú y đã thống kê thì những năm gần đây dịch xảy ra hầu hết các tháng trong năm nhưng sự chênh lệch giữa các tháng đông - xuân và hè - thu vẫn còn

đáng kể

1.2.4 Chất chứa mầm bệnh và độc lực của virus :

Virus có trong máu lợn 24h sau khi nhiễm bệnh ở trong máu virus thường bám vào hồng cầu vì vậy virus có thể theo máu khu trú ở khắp cơ thể Thịt, phủ tạng, các chất tiết (nước dãi, nước mắt, dử mắt, nước mũi, phân, nước tiểu) đều có virus

1.2.5 Sinh bệnh học :

Các trường hợp lây nhiễm bệnh tự nhiên với các chủng độc lực cao được

đặc trưng bởi các giai đoạn: nhiễm virus ở hạch nhân lên lần thứ nhất vào máu, đi vào hệ võng mạc nội mô và nhiễm virus ở phủ tạng Virus sinh sản nhiều nhất trong tế bào nội mô của mạch quản Một số lượng lớn virus được tạo ra ở mô bào

đích thứ hai như lá lách, hạch lâm ba nội tạng, tuỷ xương, đường tiêu hoá dẫn đến nồng độ virus cao trong máu và xâm nhập vào các cơ quan chức năng khác (đường hô hấp, hệ thần kinh trung ương) Tại các cơ quan bị nhiễm virus có hiện tượng thực bào do các đại thực bào tiến hành và virus phát triển thông qua nội bì mao

mạch Sự nhân lên của virus trong bạch cầu và các tế bào hệ thống lưới nội bì dẫn

đến giảm bạch cầu do đó lợn dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát

Do những bệnh tích ở mạch quản, các phủ tạng bị thấm tương dịch, xuất huyết, nhồi huyết, hoại tử cục bộ Virus làm hình thành mụn loét ở ruột già sau khi gây hoại tử ở những nang lâm ba riêng biệt và làm đông sợi huyết tạo thành những nốt loét hình cúc áo ở ruột già đây là một trong những bệnh tích đặc trưng của bệnh DTL

Các chủng virus có độc lực cao lan tỏa trong cơ thể trong vòng 5-6 ngày (Trần Đình Từ, 1990) Cách lây nhiễm đối với các chủng độc lực trung bình chủ yếu hạn chế ở các biến đổi hệ bạch huyết và cơ quan tuần hoàn cục bộ Sự tập trung virus trong máu và các cơ quan trong cơ thể có xu hướng thấp hơn

Lợn nái mang thai, virus DTL có thể truyền qua nhau thai ở tất cả các giai

đoạn Virus theo máu và phát triển ở một số nơi dọc theo nhau thai và cuối cùng lan truyền từ bào thai này đến bào thai khác (Van oirschot, 1979)

1.2.6 Một số đặc điểm chủ yếu của virus dịch tả lợn

1.2.61 Đặc tính sinh học :

Virus DTL là một loại virus qua lọc gọi là Tortor suis thuộc họ Togaviridae, nhóm Pestisvirus cùng với virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (Border viral Diarrhea virus-BVDV) và virus gây bệnh Border ở cừu (Border disease virus-BDV) Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây về cấu trúc phân tử của Pestisvirus cho thấy bộ gen của chúng (genome) tương ứng với các virus thuộc họ Flavi-viridae hơn là họ Togaviridae (Collett et al 1989 và Horzinek, 1990)

1.2.6.2 Hình thái - cấu trúc:

Virus DTL có dạng hình cầu với cấu trúc nucleocapsid đối xứng khối

Đường kính các virion khoảng 40-50 nm Bộ gen của virus là một chuỗi đơn ARN,

có độ dài khoảng 12kb (Meyers et al 1989 và Moormann et al.1990)

1.2.6.3 Phân loại:

Trước đây người ta cho rằng kháng nguyên virus dịch tả lợn đồng nhất, nhưng áp dụng kĩ thuật kháng thể đơn dòng (Mcab) có thể phân biệt virus dịch tả lợn thành một số nhóm kháng nguyên (Edwards và Sands-1990) Độc lực của chủng gây bệnh thay đổi rất lớn Các chủng độc lực cao gây bệnh cấp tính có tỷ lệ chết cao, trong khi đó các chủng có độc lực trung bình thường gây nhiễm trùng á cấp tính và mạn tính Các chủng virus dịch tả lợn độc lực yếu chỉ gây bệnh nhẹ, tuy nhiên có thể gây chết thai lợn và lợn con mới sinh

Tuỳ thuộc vào độc lực của chủng virus gây bệnh mà tỷ lệ chết có thể từ 0-100% Szent, (1985) đã phân chia các chủng virus DTL thành 2 nhóm:

• Nhóm I: gồm các chủng virus cường độc Alfort, chủng C

• Nhóm II: gồm các chủng 331 và các chủng khác phân lập được từ lợn bị

bệnh mãn tính

Ngày nay người ta đã sử dụng các phương pháp làm giảm độc lực của virus

và thu được một số chủng nhược độc có thể sử dụng làm vacxin như virus DTL chủng C, chủng GPE(-), chủng IFFA, chủng Thiveral

1.2.6.4 Đặc tính nuôi cấy, phân lập:

Có thể nuôi cấy virus trên môi trường tế bào thận lợn như CPK, PK15, SK6 hoặc FS-L3 Virus không gây bệnh tích tế bào (CPE) do virus nhân lên có giới hạn trong nguyên sinh chất của tế bào Thế hệ đầu tiên của virus giải phóng ra khỏi tế bào khoảng 5-6h sau khi gây nhiễm Hiện nay mới chỉ có chủng GPE(-) gây bệnh tích tế bào

Trong môi trường tế bào, virus lây lan sang tế bào bên cạnh và từ tế bào mẹ sang tế bào con thông qua cầu nối nguyên sinh chất Do virus trưởng thành trong nguyên sinh chất của tế bào nên không thể phát hiện được kháng nguyên của virus DTL trên bề mặt tế bào bị nhiễm (Edwards và Sands-1990)

1.3 Bệnh Salmonella ở gà

Cùng với các nhân tố vi khuẩn gây bệnh rất đa dạng mà chúng ta được biết có liên quan đến ngộ độc thực phẩm, nổi trội nhất là các thành viên thuộc họ

Salmonella Các vi khuẩn này thường kí sinh trong gia súc gia cầm, mà gà thường

là vật chủ trung gian chính Tuy nhiên, để nhận biết các thức ăn bị nhiễm

Salmonella là rất khó khăn vì các gà bị nhiễm bệnh điển hình vẫn không biểu hiện

một dấu hiệu hay triệu trứng gì Khi các gà bị nhiễm không có các đặc trưng để nhận biết, chúng có thể được sử dụng làm gà mẹ để đẻ trứng hoặc làm gà thịt để cung cấp thực phẩm Nếu quy trình chuẩn bị các đồ ăn từ trứng và thịt gia cầm không đúng cách hoặc nấu không chín sẽ là nguy cơ cao gây nên bệnh ngộ độc

thực phẩm do Salmonella (hay Salmonellois) Bệnh salmonellosis, một hội chứng

nhiễm độc vi khuẩn liên quan đến các bệnh dạ dày đường ruột, sốt thương hàn và sốt giả thương hàn Mặc dù hầu như mọi người đều sống sót khi bị nhiễm

Salmonella, nó có thể đe dọa cuộc sống đối với những trẻ nhỏ, người già và những

bệnh nhân bị suy giảm hệ thống miễn dịch

Cho đến nay vẫn không có thuốc đặc trị đối với các bệnh do Salmonella gây ra,

đặc biệt chúng còn kháng lại nhiều loại kháng sinh khác nhau nên việc điều trị cho bệnh nhân gặp nhiều khó khăn Vì vậy, một phương pháp phát hiện nhanh, chính

xác các Salmonella gây bệnh là hết sức cần thiết để ngăn ngừa bùng phát các đợt

dịch bệnh để bảo vẹ sức khỏe cộng đồng

Nhiều phương pháp dùng để phát hiện Salmonella đã được đưa ra như phương

pháp nuôi cấy, phương pháp ngưng kết huyết thanh, PCR và các phương pháp dựa trên nguyên tắc miễn dịch học Trong số đó, ELISA là một trong những phương pháp hiệu quả và có phạm vi ứng dụng rộng Tuy nhiên, các tác giả trước đây

thường dùng tế bào Salmonella hoặc các kháng nguyên toàn bộ được tách chiết

trực tiếp từ tế bào để làm ELISA nên hiệu quả chưa cao Để nâng cao độ nhạy và tính đặc hiệu, có thể sử dụng các kháng nguyên thành phần để thực hiện thí nghiệm Ngày nay, lĩnh vực công nghệ DNA tái tổ hợp phát triển mạnh mẽ tạo