nghiên cứu trình tự gen 5’ – utr và ứng dụng trong chẩn đoán sớm csfv (classical swine fever virus) gây bệnh dịch tả heo

Để phát hiện CSFV gây bệnh dịch tả heo có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như dựa trên bệnh tích, tiêm truyền qua heo… Các phương pháp này có nhược điểm là chỉ phát hiện được bện

THÀNH ĐOÀN TP.HCM SỞ KH & CN TP.HCM

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

Báo cáo nghiệm thu đề tài :

(Bản đã chỉnh sửa theo ý kiến Hội đồng nghiệm thu)

DỊCH TẢ HEO

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi xin chân thành cám ơn Sở Khoa Học và Công Nghệ và Trung Tâm Phát Triển Khoa Học và Công Nghệ Trẻ TĐ, Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ Sinh học Trường ĐHKHTN, Tp.HCM đã giúp đỡ về kinh phí và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi thực hiện đề tài này

Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Trần Linh Thước đã cho chúng em nhiều lời khuyên quí báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin cảm ơn anh Đinh Minh Hiệp, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên chúng tôi hoàn tất đề tài

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nông nghiệp phát triển, nông dân có truyền thống chăn nuôi Gần đây, cùng với nhu cầu phát triển của xã hội, ngành chăn nuôi ngày càng phát triển, đặc biệt là nuôi heo Do đó, việc kiểm soát bệnh trong chăn nuôi là một nhu cầu bức thiết Việt Nam có đầu heo khoảng 16 triệu con, chủ yếu dùng để tiêu thụ trong nước, chưa xuất khẩu được do chúng ta chưa kiểm soát được bệnh dịch tả heo và một số bệnh khác Vì vậy, vấn đề kiểm soát bệnh thú y nói chung, và bệnh dịch tả heo nói riêng là một vấn đề cần được giải quyết nhằm thúc đẩy sự phát triển của ngành chăn nuôi ở nước ta

Bệnh dịch tả heo đã tồn tại trên 100 năm nay Hiện nay vẫn được coi là bệnh nguy hiểm cho ngành chăn nuôi heo Việc dùng kháng sinh để trị bệnh không có tác dụng, chỉ có thể phòng ngừa bằng vắc-xin và các biện pháp vệ sinh chuồng trại Bệnh gây chết hàng loạt, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi heo hằng năm, chiếm 50-60% thiệt hại trong chăn nuôi heo Một đặc điểm đáng lưu ý là bệnh xảy ra âm ỉ, lẻ tẻ, triệu chứng và bệnh tích không điển hình Diễn biến của bệnh ngày càng phức tạp Những biểu hiện lâm sàng và bệnh tích không rõ ràng tuy kết quả xét nghiệm bệnh là dương tính (Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, 1999)

Bệnh dịch tả heo do Classical swine fever virus (CSFV), thuộc chi Pestivirus,

gây ra Pestivirus được xếp vào họ Flaviviridae (Mulphy et al., 1995), gồm các loài

virus gây bệnh cho heo và động vật nhai lại, như CSFV gây bệnh dịch tả heo, Bovine

viral diarrhoea virus (BVDV) gây bệnh dịch tả bò và Border disease virus (BDV) gây

bệnh cho cừu Mặc dù hiện nay việc phân loại Pestivirus chủ yếu dựa vào loài vật chủ bị nhiễm bệnh, nhưng có nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng Pestivirus không có tính chuyên biệt vật chủ cao Cụ thể BVDV có thể gây nhiễm không chỉ cho trâu bò mà còn gây nhiễm cho cừu; BDV gây nhiễm cho cả heo; CSFV chủ yếu gây bệnh cho heo nhưng cũng thấy ở trâu bò và dê Cũng có trường hợp người ta phát hiện được Pestivirus ở trâu và hươu

Để phát hiện CSFV gây bệnh dịch tả heo có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như dựa trên bệnh tích, tiêm truyền qua heo… Các phương pháp này có nhược điểm là chỉ phát hiện được bệnh khi đã có xuất hiện các triệu chứng lâm sàng Khi đó bệnh đã có nguy cơ lây lan cao do đó không đáp ứng yêu cầu kiểm soát dịch bệnh Vì vậy nhu cầu có một phương pháp chẩn đoán, phát hiện bệnh gây ra bởi CSFV một cách nhanh chóng, chính xác, độ tin cậy cao là cấp bách và cần thiết Hiện nay, phương pháp RT-PCR là phương pháp chẩn đoán đang được tổ chức Thú y thế giới (OIE) khuyến khích sử dụng do có các ưu điểm như: độ nhạy cao, cho kết quả nhanh, độ chuyên biệt cao, có thể phát hiện bệnh sớm khi chưa có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích … Do vậy, phương pháp RT-PCR được xem là một phương pháp chẩn đoán có nhiều tiềm năng ứng dụng và việc thiết lập một quy trình phát hiện bệnh dịch tả heo bằng phương pháp RT-PCR tại Việt Nam là rất cần thiết

Đồng thời, trong các chẩn đoán phát hiện CSFV, việc phân biệt chính xác bệnh

do CSFV hay một loài khác trong chi Pestivirus gây ra thường gặp nhiều khó khăn Các phương pháp phát hiện CSFV dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể không cho phép phân biệt CSFV và BDV hay BVDV Thực tế, việc chẩn đoán, phát hiện chính xác CSFV có ý nghĩa quan trọng nhằm định hướng các biện pháp xử lý tránh lây nhiễm, tiêu diệt ổ bệnh và vắc-xin phòng chống Đáp ứng nhu cầu thực tiễn này, hiện nay kỹ thuật RT-PCR đã được ứng dụng nhằm phát hiện nhanh và chuyên biệt CSFV dựa trên trình tự 5’UTR

Trong RNA bộ gen của virus CSFV, vùng 5’UTR là vùng đặc trưng chuyên biệt cho CSFV Dựa vào trình tự 5’UTR người ta có thể phân biệt CSFV với những loài khác trong chi Pestivirus như BDV, BVDV Vì vậy, phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vùng 5'UTR của CSFV cho phép chẩn đoán chính xác bệnh dịch tả heo Ngoài ra, khảo sát xác định trình tự vùng 5’UTR của CSFV còn có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu phân loại CSFV Hiện nay, một số trình tự 5’UTR của một số chủng CSFV như chủng Alfort/187 (Switzerland), chủng C (Trung Quốc), … đã được xác định và công bố lưu trữ trong ngân hàng gen Tuy vậy, chưa có công bố nào về trình tự 5’UTR của CSFV phân lập tại Việt Nam Vì vậy, mục tiêu đề ra của chúng tôi là xác định trình tự 5’UTR của chủng CSFV phân lập tại Việt Nam nhằm phục vụ cho nghiên cứu phân loại và hỗ trợ cho phương pháp phát hiện CSFV bằng RT-PCR So sánh trình tự đoạn 5’UTR của một số chủng CSFV khác trong Ngân hàng gen

Để thực hiện các mục tiêu này, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Thu nhận đoạn gen 5'UTR từ virus CSFV

- Tạo dòng gen 5'UTR trong E coli

- Giải trình tự gen 5'UTR, so sánh với các trình tự đã công bố trên thế giới

- Thiết kế mồi để phát hiện CSFV bằng RT-PCR

- Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm, nhanh, nhạy CSFV bằng RT-PCR

MỤC LỤC

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các hình & bảng

Phần I: Tóm tắt các nội dung chính của đề tài - 1 -

1.1 Mở đầu - 1 -

1.2 Tóm tắt tình hình nghiên cứu ngoài nước có liên quan - 2 -

1.3 Tóm tắt tình hình nghiên cứu trong nước có liên quan - 2 -

1.4 Mục tiêu đề tài - 3 -

1.5 Nội dung nghiên cứu - 3 -

Phần II: Tổng quan tài liệu - 4 -

2.1 Tình hình bệnh dịch tả heo - 4 -

2.2 Sự lây nhiễm - 5 -

2.3 Triệu chứng lâm sàng - 6 -

2.4 Bệnh tích - 7 -

2.5 Đặc điểm của virus dịch tả heo, Classical Swine Fever Virus – CSFV - 8 -

2.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh dịch tả heo - 11 -

2.7 Phương pháp RT-PCR - 14 -

2.8 Kĩ thuật tạo dòng - 20 -

Phần III: Vật liệu – Phương pháp - 26 -

3.1 Hóa chất và Môi trường - 26 -

3.2 Vật liệu và Phương pháp - 28 -

Phần IV: Kết quả – Biện luận - 42 -

4.1 Tạo dòng đoạn gen mã hóa vùng 5'UTR của CSFV - 42 -

4.2 Giải trình tự đoạn gen 5’UTR - 45 -

4.3 Xây dựng quy trình phát hiện CSFV bằng RT-PCR - 49 -

4.4 Kiểm chứng quy trình phát hiện CSFV bằng phương pháp RT-PCR - 54 -

Phần V: Kết luận – Đề nghị - 60 -

5.1 Kết luận - 60 -

5.2 Đề nghị - 60 -

Phần VI: So sánh các nội dung đăng ký và kết quả đạt được - 61 -

Phần VII: Các thành viên tham gia thực hiện đề tài - 62 -

Phần VIII: Các công trình khoa học có liên quan đến đề tài - 63 -

Tài liệu tham khảo - 64 -

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp : Ampicillin

BDV : Border disease virus

bp : base pair, cặp base

BVDV : Bovine viral diarrhoea virus

cDNA : complementary DNA

CSFV : Classical Swine Fever Virus

EDTA : Ethylene diamin tetraacetic Acid

ELISA : Enzyme linked immuno sorbent assay

HCV : Hog cholera virus

IPTG : Isopropylthio- - D- Galactosidase

kDa : kilo Dalton

Mab : Monoclonal antibody

MCS : Multi cloning site

MMLV : Moloney Murine Leukemia Virus, enzyme phiên mã

ngược

OD : Opical density

pB : pBluescript II SK (+)

PCR : Polymerase Chain Reaction

RE : Restriction enzyme, enzyme cắt giới hạn

RNA : Ribonucleic Acid

RNase : Ribonuclease, enzyme thuỷ phân RNA

RNasine : RNase inhibitor

RT-buffer : Reverse transcript buffer

RT-PCR : Reverse transcription- polymerase chain reaction SDS : Sodium dodecyl sulfate

UTR : Untranslated region

X-gal : 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside

DANH MỤC CÁC HÌNH & BẢNG

Hình 1: Thận heo nhiễm bệnh dịch tả heo với các điểm xuất huyết trên

vỏ thận 8

Hình 2: Tụ huyết và xuất huyết màng não tủy ở heo bệnh 8

Hình 3: Cấu tạo bộ gen RNA của Pestivirus 10

Hình 4: Sơ đồ tổng quát một quy trình RT-PCR 15

Hình 5: Sơ đồ plasmid pBluescript II SK (+) 28

Hình 6: Sơ đồ dòng hoá gen 5’UTR 33

Hình 7: Sơ đồ và vị trí mồi để giải trình tự gen 5’UTR 36

Hình 8: Sơ đồ quy trình RT-PCR phát hiện virus CSFV 39

Hình 9: Kết quả phản ứng RT-PCR 42

Hình 10: Kết quả phản ứng mở vòng pBlue bằng EcoRV 43

Hình 11: Kiểm tra khuẩn lạc dự tuyển mang gen 5’UTR bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 44

Hình 12: Kiểm tra thể biến nạp bằng cặp mồi T3/T7 45

Hình 13: Kết quả so sánh trình tự 5’UTR của virus dịch tả heo chủng Việt Nam với một số chủng trong ngân hàng gen 46-48 Hình 14: RNA tổng số thu nhận bằng phương pháp 1 và phương pháp 2 49

Hình 15: Thiết lập phản ứng RT-PCR 50

Hình 16: Khảo sát nồng độ MMLV 50

Hình 17: Khảo sát nồng độ mồi CSR 51

Hình 18: Khảo sát nồng độ dNTP 51

Hình 19: Khảo sát nồng độ mẫu 52

Hình 20: Khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng PCR 52

Hình 21: Khảo sát nồng độ mồi 53

Hình 22: Khảo sát nồng độ Mg2+ 53

Hình 23: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 53

Hình 24: Khảo sát thời gian bắt cặp 54

Hình 25: Khảo sát thời gian kéo dài 54

Hình 26: Kiểm chứng quy trình phát hiện CSFV 55

Hình 27: Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR thực hiện trên các mẫu bệnh nhiễm Salmonella 57

Hình 28: Kết quả sản phẩm PCR trên các mẫu lấy từ thực địa 57

-/ -Bảng 1: Thành phần cơ bản của phản ứng RT 38

Bảng 2: Thành phần cơ bản của phản ứng PCR 28

Bảng 3: Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của plasmid sau tách chiết 42

Bảng 4: Phân tích độ tinh sạch của RNA bằng quang phổ hấp thu 49

Bảng 5: Kiểm chứng quy trình phát hiện CSFV bằng RT-PCR 55

Bảng 6: Kết quả phản ứng RT-PCR với cặp mồi chuyên biệt đối với CSFV thực hiện trên 21 mẫu bệnh phẩm nhiễm Salmonella 56

PHẦN I: TÓM TẮT CÁC NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI

1.1 MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nông nghiệp phát triển, nông dân có truyền thống chăn nuôi Gần đây, cùng với nhu cầu phát triển của xã hội, ngành chăn nuôi ngày càng phát triển, đặc biệt là nuôi heo Do đó, việc kiểm soát bệnh trong chăn nuôi là một nhu cầu bức thiết Việt Nam có đầu heo khoảng 16 triệu con, chủ yếu dùng để tiêu thụ trong nước, chưa xuất khẩu được do chúng ta chưa kiểm soát được bệnh dịch tả heo và một số bệnh khác

Vì vậy, vấn đề kiểm soát bệnh thú y nói chung, và bệnh dịch tả heo nói riêng là một vấn đề cần được giải quyết nhằm thúc đẩy sự phát triển của ngành chăn nuôi ở nước ta Bệnh dịch tả heo đã tồn tại trên 100 năm nay Hiện nay vẫn được coi là bệnh nguy hiểm cho ngành chăn nuôi heo Việc dùng kháng sinh để trị bệnh không có tác dụng, chỉ có thể phòng ngừa bằng vắc-xin và các biện pháp vệ sinh chuồng trại Bệnh gây chết hàng loạt, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi heo hằng năm, chiếm 50-60% thiệt hại trong chăn nuôi heo Một đặc điểm đáng lưu ý là bệnh xảy ra âm ỉ, lẻ tẻ, triệu chứng và bệnh tích không điển hình Diễn biến của bệnh ngày càng phức tạp Những biểu hiện lâm sàng và bệnh tích không rõ ràng tuy kết quả xét nghiệm bệnh là dương tính (Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, 1999)

Bệnh dịch tả heo do Classical swine fever virus (CSFV), thuộc chi Pestivirus, gây

ra Pestivirus được xếp vào họ Flaviviridae (Mulphy et al., 1995), gồm các loài virus gây

bệnh cho heo và động vật nhai lại, như CSFV gây bệnh dịch tả heo, Bovine viral

diarrhoea virus (BVDV) gây bệnh dịch tả bò và Border disease virus (BDV) gây bệnh

cho cừu Mặc dù hiện nay việc phân loại Pestivirus chủ yếu dựa vào loài vật chủ bị nhiễm bệnh, nhưng có nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng Pestivirus không có tính chuyên biệt vật chủ cao Cụ thể BVDV có thể gây nhiễm không chỉ cho trâu bò mà còn gây nhiễm cho cừu; BDV gây nhiễm cho cả heo; CSFV chủ yếu gây bệnh cho heo nhưng cũng thấy ở trâu bò và dê Cũng có trường hợp người ta phát hiện được Pestivirus ở trâu và hươu

Để phát hiện CSFV gây bệnh dịch tả heo có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như dựa trên bệnh tích, tiêm truyền qua heo… Các phương pháp này có nhược điểm là chỉ phát hiện được bệnh khi đã có xuất hiện các triệu chứng lâm sàng Khi đó bệnh đã có nguy cơ lây lan cao do đó không đáp ứng yêu cầu kiểm soát dịch bệnh Vì vậy nhu cầu có một phương pháp chẩn đoán, phát hiện bệnh gây ra bởi CSFV một cách nhanh chóng, chính xác, độ tin cậy cao là cấp bách và cần thiết Hiện nay, phương pháp RT-PCR là phương pháp chẩn đoán đang được tổ chức Thú y thế giới (OIE) khuyến khích sử dụng do có các ưu điểm như: độ nhạy cao, cho kết quả nhanh, độ chuyên biệt cao, có thể phát hiện bệnh sớm khi chưa có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích … Do vậy, phương pháp RT-PCR được xem là một phương pháp chẩn đoán có nhiều tiềm năng ứng dụng và việc thiết lập một quy trình phát hiện bệnh dịch tả heo bằng phương pháp RT-PCR tại Việt Nam là rất cần thiết

Đồng thời, trong các chẩn đoán phát hiện CSFV, việc phân biệt chính xác bệnh do CSFV hay một loài khác trong chi Pestivirus gây ra thường gặp nhiều khó khăn Các

phương pháp phát hiện CSFV dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể không cho phép phân biệt CSFV và BDV hay BVDV Thực tế, việc chẩn đoán, phát hiện chính xác CSFV có ý nghĩa quan trọng nhằm định hướng các biện pháp xử lý tránh lây nhiễm, tiêu diệt ổ bệnh và vắc-xin phòng chống Đáp ứng nhu cầu thực tiễn này, hiện nay kỹ thuật RT-PCR đã được ứng dụng nhằm phát hiện nhanh và chuyên biệt CSFV dựa trên trình tự 5’UTR

Trong RNA bộ gen của virus CSFV, vùng 5’UTR là vùng đặc trưng chuyên biệt cho CSFV Dựa vào trình tự 5’UTR người ta có thể phân biệt CSFV với những loài khác trong chi Pestivirus như BDV, BVDV Vì vậy, phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vùng 5'UTR của CSFV cho phép chẩn đoán chính xác bệnh dịch tả heo Ngoài ra, khảo sát xác định trình tự vùng 5’UTR của CSFV còn có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu phân loại CSFV Hiện nay, một số trình tự 5’UTR của một số chủng CSFV như chủng Alfort/187 (Switzerland), chủng C (Trung Quốc), … đã được xác định và công bố lưu trữ trong ngân hàng gen Tuy vậy, chưa có công bố nào về trình tự 5’UTR của CSFV phân lập tại Việt Nam Vì vậy, mục tiêu đề ra của chúng tôi là xác định trình tự 5’UTR của chủng CSFV phân lập tại Việt Nam nhằm phục vụ cho nghiên cứu phân loại và hỗ trợ cho phương pháp phát hiện CSFV bằng RT-PCR So sánh trình tự đoạn 5’UTR của một số chủng CSFV khác trong Ngân hàng gen

1.2 TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN

Theo Hanson (1957), bệnh dịch tả heo được ghi nhận từ năm 1810 tại Tennessce Sau đó ổ dịch được phát hiện tại Pháp năm 1822, tại Ohio vào đầu năm 1833, Đức năm

1835, Anh năm 1862 và sau đó lan rộng khắp Châu Âu, Nam Mỹ và Nam Phi

Năm 1885, Xanmon và Smit cho rằng bệnh do một loài vi khuẩn gây ra Hai ông đặt

tên vi khuẩn này là Bacillus cholera suis (hay còn gọi là Samonella cholera suis) Đến

năm 1903, Schweinitz và Dorset đã chứng minh bệnh gây ra bởi virus, còn vi khuẩn

Bacillus cholera suis chỉ đóng vai trò phụ Năm 1907, Dorset, McBryde và W.B Niles đã

sử dụng huyết thanh miễn dịch để phòng trị bệnh dịch tả heo Năm 1935, Dorset, McBryde, và C.G Cole tạo ra vaccine vô hoạt bằng tím kết tinh (crystal violet) Năm

1951, J.A Baker phát triển một loại vaccine virus sống biến đổi (modified live vaccine) để phòng ngừa bệnh dịch tả heo thu được hiệu quả bảo vệ cao

Đầu thập niên 60, phương pháp tiêm truyền qua heo hoặc thỏ được sử dụng để chẩn đoán bệnh dịch tả heo Năm 1963, Mengeling, E.C Pirtle, và J.P Torrey phát triển phương pháp miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán bệnh nhanh Từ đó đến nay, các kỹ thuật chẩn đoán được liên tục cải tiến giúp phát hiện bệnh nhanh chóng Đặc biệt, với sự

ra đời của phương pháp PCR, các nhà nghiên cứu đã có thêm một công cụ mạnh để chẩn đoán, phát hiện bệnh nhanh chóng, cũng như trong việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền, trong phân loại, … Từ năm 1997-1999, vùng 5’-UTR của CSFV từ 27 chủng phân lập tại Lào được phân tích và so sánh với các chủng của châu Âu và châu Á, hỗ trợ cho nghiên cứu dịch tễ học bệnh dịch tả heo

1.3 TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC CÓ LIÊN QUAN

Việt Nam là nước nông nghiệp phát triển, được xem là một trong 10 nước sản xuất thịt heo nhiều nhất thế giới Vì vậy, việc bảo vệ và kiểm soát dịch bệnh trong chăn nuôi có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sản xuất và xuất khẩu các sản phẩm từ thịt

Trong thời gian qua, bệnh dịch tả heo được chẩn đoán dựa trên triệu chứng và bệnh tích, nhưng phương pháp này không đáng tin cậy và triệu chứng của bệnh thường xuyên biến đổi rất đa dạng và phức tạp Một số phương pháp chẩn đoán truyền thống được sử dụng như tiêm truyền qua heo, trung hòa trên thỏ, phương pháp phân lập vi rút dịch tả heo trên nuôi cấy tế bào PK-15 cho kết quả chậm, tốn kém, chỉ phát hiện được bệnh khi đã có xuất hiện các triệu chứng lâm sàng Khi đó bệnh đã có nguy cơ lây lan cao do đó không đáp ứng yêu cầu kiểm soát dịch bệnh Vì vậy nhu cầu có một phương pháp chẩn đoán, phát hiện bệnh gây ra bởi CSFV một cách nhanh chóng, chính xác, độ tin cậy cao là cấp bách và cần thiết Áp dụng thành tựu của di truyền học phân tử và các kỹ thuật miễn dịch mới đã cho ra đời nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác hơn Trong đó, phương pháp ELISA được sử dụng phổ biến Tuy nhiên, thông thường phương pháp này cũng phải kết hợp với chẩn đoán lâm sàng Một kỹ thuật có nhiều ưu điểm hơn là sử dụng phản ứng tổng hợp dây chuyền polymerase (PCR) nhằm phát hiện gen đặc trưng, chuyên biệt đối với vi rút CSFV Phương pháp này dễ thực hiện, độ nhạy cao, và đặc biệt khác phục được nhược điểm của phương pháp phân lập virút, được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán, là nguồn mẫu không cần phải sạch Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có công trình nghiên cứu phát hiện CSFV bằng RT-PCR được công bố tại Việt Nam Vì vậy, mục tiêu đề ra của chúng tôi là xác định trình tự 5’UTR của chủng CSFV phân lập tại Việt Nam nhằm phục vụ cho nghiên cứu phân loại và hỗ trợ cho phương

pháp phát hiện CSFV bằng RT-PCR

1.4 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Mục tiêu đề ra của chúng tôi là dòng hóa và giải trình tự đoạn 5’UTR của CSFV phân lập tại các tỉnh thành phía Nam Việt Nam và xây dựng quy trình phát hiện sớm CSFV bằng kỹ thuật RT-PCR, tạo một công cụ chẩn đoán chuyên biệt cho CSFV tại Việt Nam, góp phần bảo vệ và kiểm soát bệnh dịch tả heo trong ngành chăn nuôi heo, đồng

thời phục vụ cho các nghiên cứu phân loại, dịch tễ học của bệnh này

1.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để thực hiện các mục tiêu này, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Thu nhận đoạn gen 5'UTR từ virus CSFV

- Tạo dòng gen 5'UTR trong E coli

- Giải trình tự gen 5'UTR, so sánh với các trình tự đã công bố trên thế giới

- Thiết kế mồi để phát hiện CSFV bằng RT-PCR

- Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm, nhanh, nhạy CSFV bằng RT-PCR

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH BỆNH DỊCH TẢ HEO

Bệnh dịch tả heo, Classical swine fever - CSF hay Hog cholera là một bệnh dịch do

một loại virus có tên Classical swine fever virus (CSFV) hay Hog cholera virus (HCV)

gây ra trên heo Đây là một bệnh truyền nhiễm có khả năng lây lan lớn, tỉ lệ gây tử vong cao (từ 60% - 90%)

2.1.1 Tình hình bệnh Dịch tả heo trên thế giới [2, 7, 8, 17, 20, 26, 27, 28]

Bệnh dịch tả heo được phát hiện đầu tiên vào năm 1810 ở Mỹ và đến 1855 bệnh lan tràn khắp nước Mỹ, toàn châu ÂÂu đến khắp các châu lục Hiện nay bệnh đã được thanh toán ở Canada, Mỹ, Úc, Niudilan và Nam Phi Ở Pháp, sau 15 năm thực hiện chặt chẽ chương trình thanh toán bệnh, năm 1983 bắt đầu ngừng tiêm phòng, thực hiện các biện pháp vệ sinh phòng dịch nghiêm ngặt, đến nay đàn heo nuôi nước Pháp không bị một tổn thất nào do dịch tả heo gây ra, được coi là không có bệnh dịch tả heo trừ một vài

ổ dịch ở heo rừng phía Bắc của Vosges là nguy cơ gây nhiễm cho heo nuôi ở vùng lân cận như ổ dịch tháng 9 năm 1993

Ở Đức, 1993 có 103 ổ dịch, 1994: 117, 1995: 54 ổ dịch, năm 1996 chỉ có 4 ổ dịch nhưng đầu năm 1997 xuất hiện 2 ổ dịch do dùng thức ăn thừa của nhà bếp trại lính Mỹ Dịch đã tiếp tục từ đó lưu hành trong vùng tiếp giới Đức, Hà Lan Kết quả phân tích sinh học phân tử về các chủng virus dịch tả heo ở Đức và Hà Lan cho thấy mối liên quan chặt chẽ với nhau

Năm 1997-1998, dịch bệnh dịch tả heo nổ ra mạnh mẽ ở 6 nước: Đức, Ý, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ và Úc, tiêu diệt hơn 12,4 triệu con, thiệt hại khoảng 2,3 tỉ USD Ở Hà Lan, năm 1997, tổng số đã có tới 424 ổ dịch nổ ra, tính bình quân 15 ổ dịch mỗi tuần Tháng 2/1997, hai ổ dịch ở Ýù được xác nhận là có liên quan tới heo mua từ Hà Lan về, và cũng như vậy, tháng 4/1997 nổ ra ổ dịch đầu tiên và cả năm có tới 78 ổ dịch Việc nhập heo từ Hà Lan về cũng được xác minh là nguyên nhân của ổ dịch này Tháng 6 năm 1997, ổ dịch đầu tiên ở Bỉ cũng được công bố có liên quan tới một trại heo ở Hà Lan (A.Mesplede và cộng sự, 1997) Các vụ dịch ở Đức, Pháp còn được ghi nhận lây lan từ đàn heo rừng

Hiện nay bệnh dịch tả heo được ghi nhận khắp thế giới: Châu Âu, Trung Phi, Mexico, các nước Trung Mỹ, hầu hết các nước Nam Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Á và Đông Nam Á (Hàn Quốc, Indonesia, Philippine, Thái Lan, Việt Nam)

Năm 2000, dịch bệnh xảy ra ở Anh Năm 2001, dịch bệnh nổ ra ở Đức, Slovakia, Tây Ban Nha Vào cuối năm 2003 dịch bệnh tả heo xuất hiện tại Nhật, Albania và Slovakia

Nhiều quốc gia đã xây dựng chương trình thanh toán bệnh Ở Mỹ, chương trình tiêu diệt bệnh dịch tả heo được triển khai năm 1962 nhưng đến năm 1976 mới thành công, tiêu tốn hết 140 tỉ USD Hiện nay bệnh đã được thanh toán ở Canada, Mỹ, Úc, New Zealand, Nhật và Nam Phi

Hiện nay, bệnh dịch tả heo có ở hầu hết các nước có chăn nuôi heo Bệnh này vẫn còn lây lan nhiều ở các nước như Pháp, Hà Lan, các nước Châu Phi và cả các nước ở Châu Á như Nhật Bản, Việt Nam…

2.1.2 Tình hình bệnh Dịch tả heo ở Việt Nam [7, 14, 18]

Bệnh dịch tả heo ở Việt Nam được Houdemer phát hiện đầu tiên vào năm

1923-1924 Từ đóù đến nay bệnh đã lan truyền và được phát hiện ở nhiều nơi

Năm 1949-1950, một vụ dịch lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang các tỉnh Phú Thọ, Yên Bái, Thái Nguyên, Hà Nội và Hải Phòng Năm 1960-1961, dịch lan từ Hoà Bình sang Yên Bái, Phú Thọ, Lào Cai Năm 1961, dịch xảy ra ở Nghệ An, lan sang Sơn Tây, Hà Đông và Hà Nội Năm 1968-1969, dịch phát ra ở hơn 20 tỉnh miền Bắc Năm 1974, dịch đã nổ ra ở 17 tỉnh phía Bắc, đặc biệt là từ Thanh Hóa dọc theo quốc lộ 1 đến Quảng Trị, gây thiệt hại trên 400.000 con Theo báo cáo của Cục thú y (1986), ở các tỉnh Nam Bộ, bệnh dịch tả heo thường bị hội nhiễm với bệnh phó thương hàn (An Giang, Long An năm 1984, Tiền Giang và Hậu Giang năm 1985) Bệnh dịch tả heo hội nhiễm với bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở Đồng Nai và TP Hồ Chí Minh năm 1985 (Trần Thanh Phong, 1996)

Trong những năm gần đây, các ổ dịch lớn không còn xảy ra, song các ổ dịch địa phương vẫn tồn tại và liên tục có các ổ dịch mới xuất hiện Theo báo cáo của Cục Thú y năm 1998, trong năm 1995 cả nước có 13 tỉnh xảy ra dịch bệnh tả heo, và số tỉnh có dịch tăng lên là 23 tỉnh trong năm 1996, 32 tỉnh trong năm 1997 và 50 tỉnh trong năm 1998 Theo thống kê của tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y tập VII, số 1–2000, tỉ lệ heo nhiễm virus dịch tả heo mãn tính tại các tỉnh duyên hải miền Trung là 46,87%

Bệnh dịch tả heo mãn tính và bẩm sinh xuất hiện vào thập niên 90 của thế kỷ 20 (Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự, 2002) Hiện nay dịch tả heo phát muộn đã được ghi nhận trong tất cả các khu vực trong cả nước Các dạng bệnh không điển hình này gây nhiều trở ngại cho việc chẩn đoán

Trong năm 2000, theo thống kê của OIE, cả nước có 63 trận dịch xảy ra ở các tỉnh Ninh Bình, Lai Châu, Cao Bằng, Yên Bái, Thanh Hóa, Bình Thuận, Phú Yên, Quảng Trị, Huế… Năm 2001 và 2002, nhiều trận dịch xảy ra ở các tỉnh trên và liên tục có các trận dịch địa phương mới xuất hiện như ở Bình Định, Vĩnh Phúc, Kiên Giang… Năm 2003, tổng cộng có 58 trận dịch bệnh tả heo xảy ra ở nhiều tỉnh trong cả nước

2.2 SỰ LÂY NHIỄM [8, 27]

Bệnh dễ lây lan do tiếp xúc trực tiếp giữa heo bệnh và heo mẫn cảm Heo nhiễm virus bài thải một lượng lớn virus trong dịch mũi, nước bọt, nước tiểu và phân ngay cả trước khi biểu hiện triệu chứng bệnh và có thể bài thải virus đến khi chết Trong một số trường hợp khi khỏi bệnh, heo vẫn tiếp tục bài virus trong một thời gian dài sau đó Heo bệnh nhiễm virus có độc lực thấp liên tục bài thải virus hàng tháng mà không biểu hiện triệu chứng (Van Oirschot và Terpstra, 1977)

Dịch bệnh có thể truyền lây theo các cách:

- Tiếp xúc trực tiếp giữa các động vật bị nhiễm virus (heo bệnh từ nơi khác về, heo rừng tiếp xúc với heo nhà)

- Cho heo ăn bằng thức ăn thừa, đặc biệt là thức ăn thừa có chứa thịt heo bệnh

- Truyền qua nhau từ heo nái có thai sang phôi

- Sự thụ tinh heo nhân tạo với tinh trùng đã bị nhiễm bệnh

- Các yếu tố khác như người, xe cộ, đồ dùng trong chăn nuôi có dính virus đều có thể lây lan và phát tán virus khắp nơi

- Ởû một số nước châu Á, heo được thả rong, dầm mình trong ao hồ, do đó bệnh có thể lây qua ao hồ, kênh tưới tiêu, sông suối và các tuyến đường thủy nhiễm bẩn

Các ổ dịch bệnh dịch tả heo nổ ra trong điều kiện tự nhiên không phụ thuộc vào mùa vụ và điều kiện khí hậu Tất cả các giống heo ở các lứa tuổi đều mắc bệnh, nhưng đặc biệt mẫn cảm là các giống heo cao sản và heo con

Điều kiện thức ăn và chăm sóc có thể ảnh hưởng đến đặc điểm lây lan của bệnh Việc sử dụng thức ăn kém phẩm chất, thiếu vitamin và các nguyên tố vi lượng gây nên sự rối loạn trao đổi chất là điều kiện cho bệnh dịch tả heo phát ra dữ dội, thường ở dạng cấp tính

2.3 TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG [2, 3]

Tuỳ theo độc lực của virus, số lượng virus và phản ứng của cơ thể, bệnh dịch tả heo được chia thành các thể lâm sàng: quá cấp tính, cấp tính, bán cấp tính, mãn tính và thể tiềm ẩn Thời gian ủ bệnh từ 2-14 ngày

Thể quá cấp tính

Dạng bệnh này hiếm thấy Quá trình diễn biến bệnh rất nhanh, thân nhiệt tăng cao (41-42oC), heo mệt mỏi, bỏ ăn và nôn Hoạt động của hệ tim mạch rối loạn rất nặng Phần da mỏng ửng đỏ chưa kịp xuất huyết trên da nên còn gọi là “dịch tả trắng” Heo chết nhanh sau 1-3 ngày Tỉ lệ chết có thể lên đến 100%

Thể cấp tính

Heo có biểu hiện lờ đờ, kém ăn, nhiệt độ trực tràng 40-41oC hoặc cao hơn Viêm kết mạc, sưng mắt là dấu hiệu lâm sàng sớm nhận thấy trên heo Da heo có màu hơi đỏ Giai đoạn đầu của bệnh thường có các dấu hiệu thần kinh như quay vòng, không phối hợp và mất điều hoà vận động Heo bệnh lạnh và run do đó chúng thường nằm túm tụm trên nền chuồng hay nằm chồng lên nhau Lượng bạch cầu hạ thấp, chỉ còn khoảng 3000 tế bào trong 1 mm3 máu (ở heo bình thường thì tỉ lệ bạch cầu là 9000/ mm3 máu)

Một số heo chết trong vòng 24-48 giờ sau khi biểu hiện bệnh nhưng trong hầu hết các ca bệnh, giai đoạn lâm sàng từ lúc bỏ ăn đến khi chết là 10-20 ngày

Trong trường hợp cấp tính, heo nái có thể sảy thai nếu không được tiêm phòng hay đẻ ra heo con yếu ớt, run rẩy Tuy nhiên, nếu heo nái được tiêm vaccine ít nhất một lần thì không xảy ra bệnh nghiêm trọng

Thể bán cấp tính

Bệnh dịch tả heo bán cấp tính có dấu hiệu lâm sàng ít nghiêm trọng hơn và thời kỳ bệnh kéo dài đến khoảng 30 ngày Những đặc điểm thường thấy ở heo bị nhiễm bệnh thể bán cấp tính là chán ăn, buồn bã, gầy rạc dần, dáng đi yếu và lảo đảo, trong một số trường hợp da trở nên tím bầm trước khi chết

Heo nhiễm bệnh ở thể bán cấp tính thường có hiện tượng hội nhiễm của vi khuẩn

như Salmonella và Pasteurella

Thể mãn tính

Thể mãn tính của bệnh dịch tả heo đặc trưng bằng diễn biến bệnh kéo dài vài tuần hoặc thậm chí vài tháng Ban đầu heo bệnh yếu, chán ăn và buồn bã, sau đó biểu hiện dấu hiệu lạnh và nằm túm tụm với nhau Sau vài tuần, heo hồi phục rõ rệt và thèm ăn trở lại Trong giai đoạn thứ 3, heo lại có biểu hiện chán ăn và buồn bã Tỉ lệ tăng trưởng

bị ảnh hưởng nghiêm trọng

Phần lớn heo bị hội nhiễm vi khuẩn (Salmonella, Pasteurella…) nên phát ra các triệu

chứng toàn thân như rối loạn hô hấp, rối loạn tiêu hoá, tỉ lệ chết cũng khá cao Con vật gầy mòn và chết trong vòng 30-95 ngày sau khi bắt đầu bệnh Những con không chết sẽ còi cọc chậm phát triển và bài virus khoảng 3 tháng

Thể tiềm ẩn

Bệnh dịch tả heo có thể có dạng tiềm ẩn do nhiễm virus bẩm sinh Ở thể bệnh này thời kỳ không xuất hiện triệu chứng lâm sàng khá dài Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau một vài tháng nhiễm bệnh Các triệu chứng thường thấy là heo bỏ ăn, ủ rũ, viêm kết mạc, tiêu chảy và bị liệt Những cảm nhiễm dai dẳng như vậy rất khó phát hiện, chỉ có xét nghiệm máu mới chẩn đoán được thể bệnh này Dấu hiệu có ý nghĩa chẩn đoán tốt nhất là hiện tượng giảm bạch cầu, thấy ngay sau 48 giờ nhiễm bệnh và vào ngày thứ 5-8 lượng bạch cầu giảm rõ rệt

Cảm nhiễm virus dịch tả heo bẩm sinh có thể gây ra rối loạn sinh sản như sẩy thai, thai gỗ, thai dị dạng và đẻ ra heo con yếu ớt

2.4 BỆNH TÍCH [2, 3]

Các tổn thương bệnh lý của bệnh dịch tả heo chủ yếu do virus phá huỷ tế bào mô, mạch quản và do suy tủy làm giảm bạch cầu và tiểu cầu Quá trình bệnh lý này liên quan chặt chẽ với hiện tượng xuất huyết và xung huyết tràn lan khắp cơ thể

Các biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan của heo bị bệnh như sau:

Da

Trong bệnh dịch tả heo cấp tính, xuất huyết mảng và xuất huyết điểm với nhiều kích thước khác nhau thường hiện diện trên khắp cơ thể heo, đặc biệt ở tai, mũi, chân và vùng bụng

Hạch bạch huyết

Trong bệnh dịch tả heo thể cấp tính, các hạch bạch huyết thường sưng lớn và bị xuất huyết Lát cắt ngang của hạch bạch huyết thường cho thấy dạng có vân giống đá hoa vân do hạch bị xuất huyết ở vùng ngoại vi

Hạch hạnh nhân

Ở heo bình thường, màu của hạch hạnh nhân gần như cùng màu với mô xung quanh Trên heo bị bệnh dịch tả cấp tính, các hạch hạnh nhân thường có màu đậm cho đến đỏ đậm, đôi khi có thể thấy các vết xuất huyết

Thận

Xuất huyết điểm và xuất huyết mảng vùng vỏ thận là đặc trưng của bệnh dịch tả heo cấp tính (hình 1) Đây là một bệnh tích tương đối ổn định Hiện tượng xuất huyết còn thấy ở phần tuỷ thận

Hình 1: Thận heo nhiễm bệnh dịch tả heo với các điểm xuất huyết trên vỏ thận

Lách

Hiện tượng nhồi huyết ở lách xảy ra trong khoảng 25% đến 65% các trường hợp heo nhiễm bệnh Hiện tượng này được coi là một bệnh tích chỉ định cho bệnh dịch tả heo (Van Oirschot, 1982) Thông thường bệnh tích nhồi huyết xảy ra dưới dạng những nốt với nhiều kích cỡ, hơi nhô lên bề mặt và thường tập trung lại thành một đường viền chạy liên tục dọc theo bìa của lách

Não

Trên heo bệnh, màng của não thường bị tụ huyết và xuất huyết trầm trọng (hình 2)

Ở thể bán cấp tính, tụ huyết trong các mạch máu màng não tũy thường xuất hiện rất rõ

Hình 2: Tụ huyết và xuất huyết màng não tủy ở heo bệnh

Ngoài ra, những bệnh tích đại thể khác có thể bao gồm xuất huyết mảng hay xuất huyết điểm ở nhiều cơ quan như bàng quang, túi mật, niêm mạc của dạ dày và ruột Các nốt loét hình cúc áo của ruột, đặc biệt của kết tràng và đôi khi manh tràng là do tổn thương mạch quản và viêm hoại tử

2.5 ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS DỊCH TẢ HEO, CLASSICAL SWINE FEVER

VIRUS – CSFV

2.5.1 Đặc điểm phân loại [23]

Virus dịch tả heo, Classical swine fever virus – CSFV, trước đây được xếp vào họ Togaviridae thuộc chi Pestivirus Theo Collett (1989) và Hozinek (1990), những nghiên cứu gần đây cho thấy cấu trúc bộ gen của chi Pestivirus tương ứng với các virus thuộc họ Flaviviridae hơn là Togaviridae Chính vì vậy, hiện nay CSFV được xếp vào họ Flaviviridae

Pestivirus là tác nhân gây bệnh nổi trội ở động vật nhai lại Trong nhóm này, ngoài

CSFV còn có 2 thành viên khác là: virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (Bovine viraldiarrhoea

virus, BVDV) và Border Discase virus (BDV) Cấu trúc kháng nguyên và cấu trúc bộ

gen của CSFV rất giống với BVDV và BDV, do vậy cần phải phân biệt các virus này với nhau khi chẩn đoán bệnh

Không có sự khác nhau cơ bản nào về tính kháng nguyên để sắp xếp các chủng virus gây bệnh dịch tả heo vào nhiều type virus khác nhau (Gieger, 1939) Trần Đình Từ (1990) lại cho rằng hiện tượng biến chủng của virus CSFV làm độc lực của virus biến chủng thường thấp hơn độc lực của virus ban đầu Những nghiên cứu định lượng bằng phản ứng trung hòa huyết thanh cho phép phân biệt 2 nhóm phụ về huyết thanh:

- Nhóm phụ A: gồm những chủng cường độc (như chủng Alfort), chủng độc lực thấp, chủng biến đổi (chủng Chinois, chủng Thiverval …)

- Nhóm phụ B: chủng độc lực thấp gây xáo trộn sinh sản (như chủng 331)

Những chủng thuộc nhóm B có khả năng gây bệnh yếu, khả năng kích thích tạo ra kháng thể trên heo nhiễm virus thấp Ngược lại, thú cảm nhiễm bởi những chủng thuộc nhóm A cho nhiều kháng thể hơn và kháng thể này phản ứng với cả hai nhóm A và B Như vậy, khi theo dõi những thể cận lâm sàng (sub – clinique) cần phải nghiên cứu kỹ huyết thanh học

Bệnh dịch tả heo do những chủng có độc lực trung bình phần nào chịu ảnh hưởng bởi những yếu tố thuộc vật chủ như: giống, tuổi, sự cạnh tranh miễn dịch, điều kiện dinh dưỡng Trái lại, đối với những chủng có độc lực cao yếu tố trên giữ vai trò rất nhỏ

Như vậy, những chủng có độc lực cao thường gây bệnh cấp tính và tỉ lệ chết cao, trái lại những chủng có độc lực trung bình gây bệnh ở thể á cấp tính hay mãn tính Các chủng có độc lực thấp thường gây tỉ lệ chết trong bào thai và heo sơ sinh cao

Năm 1975, Dunne cho rằng tính độc của virus không bền, tính độc sẽ thay đổi sau một hay nhiều lần tiêm truyền qua heo Dựa vào đặc tính này mà người ta sản xuất vắc-xin phòng bệnh dịch tả heo – đó là phương pháp làm giảm độc lực của virus và thu được một số chủng nhược độc sử dụng làm vắc-xin như CSFV chủng C, chủng IFFA …

2.5.2 Bộ gen virus [13, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 25]

Classical swine fever virus (CSFV) có dạng hình cầu, cấu trúc nucleocapside là một khối đối xứng 20 mặt, được bao bọc bởi màng ngoài (envelope) Virion có đường kính 40 – 50 nm, nucleocapsid khoảng 29nm

CSFV có cấu tạo gồm 2 phần:

- Phần vỏ có chứa glycoprotein và nucleocapside

- Phần lõi là RNA, mạch dương (+) chứa đầy đủ những thông tin di truyền về cấu trúc và những đặc điểm cần thiết cho mọi hoạt động sống của virus như: xâm nhiễm, sinh sản và gây bệnh

RNA, vật liệu di truyền chính của CSFV cũng như của nhóm Pestivirus, mang đặc điểm RNA của họ Flaviviridae, tức là RNA virus được gắn mũ chụp (cap) ở đầu 5’methyl, RNA bộ gen thiếu chuỗi poly A ở đầu 3’ Bộ gen có kích thước khoảng 12,5 kb (Moormann và Hulst, 1988), chứa vùng 5’không mã hóa (5’unstranslated region,

5’UTR), điểm gắn vào ribosome tế bào chủ (internal ribosomal entry site, IRES), 1 khung đọc mở (open reading frame, ORF) mã hóa cho 1 polyprotein lớn chứa khoảng

4000 amino acid và vùng 3’ không mã hóa (3’unstranslated region, 3’UTR)

Khung đọc mở (ORF) của CSFV mã hoá cho 2 nhóm protein quan trọng là protein cấu trúc và protein không cấu trúc RNA bộ gen có chức năng như mRNA, được dịch mã sau khi virus nhiễm vào tế bào chủ để tạo ra polyprotein, sau đó các polyprotein này được scắt bỏ để tạo thành các protein trưởng thành

 Cấu trúc protein của CSFV: bao gồm protein C, E1, E2; trong đó protein C

tham gia tạo nucleocapside, còn protein E1 và E2 tham gia tạo vỏ Ba loại protein này mã hóa từ nucleotide 1100 đến 3600 E0 và E2 có vai trò quan trọng trong việc kích thích tạo đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ (heo) bị nhiễm bệnh

- E0-glycoprotein tạo homodimer bằng một nối di-sulfide có khối lượng phân tử 97kDa Các monomer tương tự có sự khác biệt nhỏ trong khối lượng phân tử (44 và 48kDa) có lẽ là do những biến đổi trong quá trình glycosyl hóa Mỗi monomer chứa khoảng 227 amino acid và tương ứng từ gốc 268-494 trên polyprotein của CSFV 50% khối lượng phân tử E0-glycoprotein trưởng thành được tạo ra từ carbohydrate

E0 nối với màng qua vòng xoắn xuyên màng và những phần quan trọng của protein được thải ra từ những tế bào bị nhiễm Cơ chế liên kết E0 với bề mặt virion chưa được làm rõ Gần đây, chức năng RNase của E0 mới được phát hiện Đồng thời E0-glycoprotein cũng là mục tiêu đầy hứa hẹn cho việc phát triển các loại thuốc chống virus và làm vắc-xin phòng bệnh CSF

- E2 là glycoprotein màng chính ở bề mặt ngoài của virion Nó cảm ứng tạo kháng thể trung hoà bảo vệ hệ miễn dịch ở heo rất mạnh

Thuộc tính kháng nguyên của E2 được làm rõ qua thí nghiệm dùng một số kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody, Mabs) Đoạn gen mã hóa cho E2 đã được tạo dòng để làm vắc-xin tái tổ hợp phòng bệnh dịch tả heo

 Protein không cấu trúc: nằm tiếp theo sau phần protein cấu trúc, gồm các protein sau: NS2, NS3, NS4, NS5 Trong đó mỗi protein có chức năng riêng

Kháng thể trong huyết thanh hình thành từ sự cảm ứng trong quá trình nhiễm virus sẽ kháng trực tiếp với protein tham gia tạo cấu trúc virion như E0, E2 và cả protein không cấu trúc NS3 Kháng thể đơn dòng kháng protein cấu trúc virion hầu hết cho phép phân biệt được CSFV và các Pestivirus khác, kháng thể đơn dòng kháng NS3 lại có tính nhận biết cao đối với các epitope bảo tồn trong nhóm Pestivirus

 Cấu trúc vùng 5’UTR

Hình 3: Cấu tạo bộ gen RNA của Pestivirus

Vùng gen ở đầu 5’(5’UTR) và 3’(3’UTR) là vùng không dịch mã nhưng đóng vai trò quan trọng Vùng 5’ có khả năng điều hòa dịch mã Mặt khác người ta còn sử dụng trình tự này để tạo mẫu dò (do vùng này có mức độ bảo tồn cao) và tổng hợp primer trong kĩ thuật PCR dùng trong chẩn đoán

Vùng 5’UTR của Pestivirus chứa nhiều mã AUG nằm ở vùng thượng nguồn của điểm bắt đầu cho sự tổng hợp polyprotein Trong vùng 5’UTR chứa những trình tự nucleotide có tính bảo tồn cao

Qua việc so sánh phân tích trình tự và mô hình nhiệt động học của vùng 5’UTR của nhiều chủng BVDV và CSFV, người ta đã xây dựng mô hình cấu trúc bậc hai của RNA bộ gen virus Bộ gen của picorna viruses cũng có cấu trúc RNA nhiều mã bộ ba AUG định vị tại đầu 5’UTR

2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ HEO

Trước đây, bệnh dịch tả heo được chuẩn đoán dựa trên triệu chứng và bệnh tích, nhưng phương pháp này không đáng tin cậy và triệu chứng của bệnh thường xuyên biến đổi rất đa dạng và phức tạp Ngày nay, áp dụng thành tựu của di truyền học phân tử và các kỹ thuật miễn dịch mới, các phương pháp chẩn đoán nhạy, chính xác hơn được ra đời nhằm phát hiện các tác nhân gây bệnh truỵền nhiễm

2.6.1 Chẩn đoán virus học

2.6.1.1 Phương pháp tiêm truyền qua heo [12]

Lấy bệnh phẩm máu, lách của heo trong trường hợp nghi ngờ, triệu chứng, bệnh tích không rõ ràng để tiêm cho heo con Heo con được dùng làm thí nghiệm khoảng 3-4 tháng tuổi, khoẻ mạnh, không ở ổ bệnh dịch tả heo Ba ngày sau heo sẽ biểu hiện các triệu chứng bệnh Sau một tuần con vật mệt lả và chết Các bệnh tích đặc trưng thường thấy trong lúc mổ khám là ở ngoài da, nhất là ở vùng đùi, bụng có nốt đỏ xuất huyết, dạ dày và ruột loét, thận xuất huyết từng chấm đỏ mặt ngoài, lá lách xuất huyết, tụ huyết quanh rìa Đây là phương pháp cần nhiều thời gian, tốn kém và phải hết sức cẩn thận tránh lây nhiễm nhưng có độ chính xác cao hơn phương pháp nuôi cấy tế bào 10 lần

2.6.1.2 Phương pháp trung hòa trên thỏ [12]

Phương pháp này đã được ứng dụng trong chẩn đoán một số ổ dịch nghi bệnh dịch tả heo ở miền Trung (Nguyễn Thị Phương Duyên, 1988) Phương pháp chẩn đoán qua thỏ được thực hiện như sau: lách heo bệnh nghiền nhuyễn pha thành huyễn dịch tiêm dưới da thỏ (có thể thay bằng máu heo bệnh) để gây miễn dịch Sau 5-10 ngày, tiêm tĩnh mạch tai thỏ vắc-xin dịch tả heo nhược độc đồng thời cũng tiêm vắc-xin vào tĩnh mạch một tai thỏ khác để làm đối chứng, khoảng 3 ngày sau nếu thỏ tiêm bệnh phẩm không sốt, trong khi thỏ đối chứng sốt rõ rệt, chứng tỏ bệnh phẩm chứa virus dịch tả heo (Theo dẫn liệu của Trần Thanh phong, 1996)

Phương pháp chẩn đoán trên này dựa trên nguyên tắc virus dịch tả heo cường độc và virus dịch tả heo thông qua thỏ (nhược độc) có sức gây bệnh khác nhau nhưng có tính kháng nguyên giống nhau, có thể sử dụng virus dịch tả heo cường độc để gây miễn dịch cho thỏ, dùng thỏ hay heo để chẩn đoán virus

* Phản ứng trung hòa trên thỏ, cũng như việc tiêm truyền lợn thí nghiệm là các phương pháp chẩn đoán truyền thống, tuy nhiên cho kết quả chậm, tốn kém Trước mắt một số nơi chưa có điều kiện vẫn phải sử dụng, về lâu dài có thể dùng như là phản ứng đối chứng

2.6.1.3 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp [26]

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp được thực hiện trên những mẫu mô đông lạnh nhằm phát hiện sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm Kháng thể dịch tả heo được đánh dấu huỳnh quang sẽ bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng, tức là virus, có trong bệnh phẩm tạo phức hợp kháng nguyên và kháng thể phát sáng khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang

Ưu điểm của phương pháp là giá thành rẻ, đơn giản (kể cả việc lấy bệnh phẩm), phát hiện nhanh (có thể hoàn thành trong 2 giờ) và khá tin cậy, vì vậy đã trở thành một trong những phương pháp chẩn đoán phổ biến trong nhiều chương trình diệt trừ virus dịch tả heo

Tuy nhiên, phương pháp này không cho phép phân biệt giữa kháng nguyên dịch tả heo và tiêu chảy ở bò vì virus dịch tả heo có cùng kháng nguyên với virus gây tiêu chảy

ở bò, do đó chẩn đoán có thể cho kết quả âm tính giả

2.6.1.4 Phương pháp phân lập virus dịch tả heo trên nuôi cấy tế bào PK-15 [12]

Phủ tạng heo nghi nhiễm virus dịch tả heo được nghiền nát, chất nghiền được trực tiếp nuôi cấy vào môi trường tế bào PK-15 Sau đó phát hiện virus trong các tế bào bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Phương pháp này còn được dùng để chẩn đoán lại những trường hợp mà xét nghiệm ELISA cho kết quả còn nghi ngờ Kết quả có được sau 3-5 ngày gây nhiễm virus trên tế bào PK-15 Phương pháp phân lập virus thì nhạy hơn phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên phẫu thức đông lạnh, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là tốn nhiều thời gian

2.6.1.5 Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch (IHC: Immunohistochemical staining) [26]

Để phát hiện kháng nguyên virus dịch tả heo trong những bệnh phẩm, phương pháp miễn dịch huỳnh quang đòi hỏi mẫu mô phải được đông lạnh, ngược lại trong phương pháp IHC có thể sử dụng mẫu mô cố định bằng formol 10% và đóng khối bằng parafin Sau đó phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp miễn dịch với sự hiện diện của Biotin và Avidin peroxidase (The Avidin-Biotin Complex Immunoperoxidase Method) Phương pháp này tiện lợi hơn phương pháp miễn dịch huỳnh quang là mẫu bệnh phẩm được cố định ngay tại thực địa (thuận lợi cho vận chuyển trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm) và phẫu thức nhuộm được quan sát bằng kính hiển vi bình thường

2.6.2 Chẩn đoán huyết thanh học

2.6.2.1 Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme ELISA (enzyme-linked

immuno sorbent assay) [5]

Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng được cố định trên các giếng với mục đích thu giữ kháng nguyên đặc hiệu mục tiêu Những kháng nguyên này lại được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp được gắn kết với enzyme có khả năng tạo màu khi bổ sung cơ chất chuyên biệt

Phương pháp ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng nhận biết được một biểu mô khác trên protein E2 của virus dịch tả heo, vì vậy cho phép phân biệt virus này và các Pestivirus khác Phương pháp này đơn giản, cho kết quả nhanh trong vòng 36 giờ và có thể thực hiện trên số lượng mẫu lớn, cho kết quả tin cậy đối với những mẫu bệnh phẩm từ heo có dấu hiệu lâm sàng như: sốt, tiêu chảy… Do đó sử dụng phương pháp ELISA phải kết hợp với chẩn đoán lâm sàng trên thú bệnh

Tuy nhiên, sử dụng trong chẩn đoán đại trà sẽ gặp khó khăn vì giá thành cao Phương pháp này được khuyến cáo sử dụng để đánh giá phát hiện virus dịch tả heo tại các trại giống, kiểm tra lại kết quả của các phản ứng khác Từ 1998-1999 một số tỉnh phía Nam đã áp dụng phương pháp này để phát hiện, xử lý heo nái ở thể mang trùng mang lại kết quả tốt cho chăn nuôi

2.6.2.2 Chẩn đoán bằng phản ứng trung hòa trên môi trường tế bào [5]

Phản ứng trung hòa hay thử nghiệm trung hòa dựa trên cơ sở của sự tác động của virus đối với kháng thể đặc hiệu nhờ đó có thể trung hòa hoạt tính của virus Thí nghiệm bao gồm trộn virus với kháng huyết thanh và đưa hỗn hợp này vào hệ thống sinh học động vật thí nghiệm, trứng có phôi hay nuôi cấy tế bào mẫn cảm đối với virus Nếu virus

bị trung hòa thì hệ thống chỉ định sẽ không biểu hiện bệnh tích

Thử nghiệm trung hòa được sử dụng để giám định virus, hiệu giá của virus, phát hiện được sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu và hàm lượng của kháng thể Phương pháp trung hòa virus được hội nghị khoa học thú y của cộng đồng trung Châu Âu nghiên cứu để phát hiện kháng thể trung hòa trong chẩn đoán bệnh dịch tả heo Đây là một trong những kỹ thuật được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm quốc gia Pháp (Y Leforban và cộng sự, 1987) Phản ứng trung hòa được xem là phản ứng có độ nhạy và độ chuyên biệt cao, được dùng để kiểm tra lại những mẫu mà phản ứng ELISA cho kết quả âm tính (Nguyễn Tiến Hà, 2001)

2.6.3 Chẩn đoán bệnh dịch tả heo bằng kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction ) [12, 17, 21]

Một kỹ thuật khác có nhiều ưu điểm hơn là sử dụng phản ứng tổng hợp dây chuyền polymerase (polymerase chain reaction - PCR) nhằm phát hiện gen đặc trưng Do vật liệu di truyền của virus dịch tả heo là RNA nên kĩ thuật phối hợp RT-PCR được sử dụng cho phát hiện virus dịch tả heo có trong mẫu Trước hết, RNA được chuyển thành cDNA

nhờ enzyme phiên mã ngược Sau đó, cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase Kĩ

thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phương pháp cổ điển như Northern blot Nhờ vậy việc phát hiện virus được nhanh chóng và có tính đặc hiệu cao

Một kỹ thuật mới phát triển-kĩ thuật in situ RT-PCR cho phép khuếch đại các RNA

ngay trên mô và tế bào Kĩ thuật này có nguyên tắc như trên, được tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame

2.6.4 Các phương pháp chẩn đoán khác

2.6.4.1 Kính hiển vi điện tử [10]

CSFV nằm ngoài giới hạn thấy được của kính hiển vi quang học Những số liệu về hình thái của virus này được biết đến qua kính hiển vi điện tử Muốn thấy được vật liệu

sinh học dưới tác động của chùm điện tử cần phải nhuộm bằng thuốc nhuộm chứa kim loại nặng Lát cắt cực mỏng của tế bào nhiễm virus có thể được nhuộm dương bản với chì hay muối uranium, huyền dịch của virion có thể được nhuộm âm bản với acid phosphotungstic

2.6.4.2 Dùng phương pháp tủy đồ [5]

Phương pháp tủy đồ được sử dụng để chẩn đoán bệnh dịch tả heo dựa trên đặc tính biến đổi của tủy xương tạo máu, trong đó chú ý dến các dạng tế bào gây bệnh như paralymphoblast tăng lên Người ta đã xác định là trong tủy xương của heo nhiễm virus dịch tả heo cường độc có xuất hiện những paralymphoblast khi heo bệnh thể cấp tính có triệu chứng lâm sàng Sự biến đổi này không thấy ở bệnh mãn tính Tuy nhiên phương pháp này không phổ biến trong đại trà bệnh dịch tả heo (J bull, 1985)

2.6.4.3 Chẩn đoán phân biệt [5]

Với biểu hiện “đỏ” trên da cần phân biệt với các bệnh do Salmonella, bệnh đóng

dấu son, bệnh do Parvovirus, bệnh tụ huyết trùng và bệnh dịch tả Châu Phi Tuy nhiên cần lưu ý các đặc điểm sau: bệnh dịch tả heo lây lan nhanh, mạnh từ một nơi có thể lan

ra vùng khác, gây chết heo hầu hết các lứa tuổi, heo 5-35kg thường chết ở thể cấp tính Giai đoạn đầu nhiễm bệnh heo thường sốt cao kéo dài trong nhiều ngày, sau đó giảm sốt, kèm theo triệu chứng tiêu chảy dữ dội Xuất huyết đốm ở nhiều cơ quan Nhồi huyết

ở rìa lách Ruột khoét hình cúc áo Số lượng bạch cầu giảm < 10000/mm3 Cần mổ nhiều heo bệnh, sự vắng mặt những bệnh tích chuyên biệt không cho phép loại thải giá trị chết

về bệnh (theo dẫn liệu của Trần Thanh Phong, 1996)

2.7 PHƯƠNG PHÁP RT-PCR [1, 19, 32]

Phản ứng dây chuyền polymerase (polymerase chain reaction - PCR) là một công cụ quan trọng trong sinh học phân tử được khám phá bởi Kary Mullis và cộng sự vào năm 1983 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA xác định từ một nguồn mẫu ban đầu phức tạp như DNA bộ gen

Đối với RNA, có thể khuếch đại một trình tự chuyên biệt từ mẫu RNA bằng kỹ thuật RT-PCR (reverse transcriptase PCR) Kỹ thuật RT-PCR không chỉ là một phương pháp giúp phân tích sự biểu hiện của gen mục tiêu một cách nhanh, nhạy mà còn có thể cung cấp một số thông tin bán định lượng về mức độ biểu hiện

2.7.1 NGUYÊN TẮC CHUNG

Trong phản ứng RT-PCR, trước hết RNA được chuyển thành DNA nhờ phản ứng phiên mã ngược giống như cách biến đổi RNA bộ gen của những virus RNA thành DNA trong tế bào chủ, sau đó thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA bổ sung (complementary DNA – cDNA) Phản ứng RT và phản ứng PCR có thể thực hiện trong 2 tube phản ứng khác nhau (RT-PCR hai bước) hay trong cùng một tube (RT-PCR một

bước) Sơ đồ mô hình một quy trình phản ứng RT-PCR được trình bày trong hình 4

Giai đoạn RT

Phản ứng phiên mã ngược có thể được thực hiện trên RNA tổng số hay mRNA Enzyme phiên mã ngược dùng trong phản ứng RT là một DNA polymerase phụ thuộc

RNA (RNA-dependent DNA polymerase) sử dụng mRNA làm mạch khuôn để tổng hợp

ra một mạch DNA bổ sung

Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi ngược của phản ứng PCR (mồi chuyên biệt gen), mồi oligo(dT) hay mồi trình tự 6 nuleotide bắt cặp ngẫu nhiên

Giai đoạn PCR

PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bước sau:

- Biến tính DNA thành DNA mạch đơn

- Phản ứng của mồi bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn

- Kéo dài đoạn DNA mới nhờ DNA polymerase chịu nhiệt

Những phản ứng này được thực hiện nhờ enzyme polymerase có tính ổn định rất cao đối với nhiệt độ, và sự thay đổi chu kỳ nhiệt độ một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho sự biến tính và bắt cặp Ba bước này được xảy ra theo chu kỳ rất nhanh và lặp lại nhiều lần để khuếch đại DNA Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, mỗi lần lặp lại sẽ gấp đôi lượng mẫu của lần trước Theo tính toán, sau khoảng 30 chu kỳ thì đoạn DNA mục tiêu sẽ được khuếch đại gấp 106 so với lượng mẫu ban đầu

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Khi cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được tổng hợp Điều này có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA, cần phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt Các mồi này gồm một mồi xuôi (tác động lên mạch 5’-3’, forward primer) và mồi ngược (tác động lên mạch 3’-5’, reverse primer) Ba giai đoạn của phản ứng PCR xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau, nên máy luân nhiệt phải có tính chất tự động hoá một cách chính xác với sự trợ

mRNA hay RNA tổng số

cDNA Mồi xuôi + Taq DNA polymerase

Mồi ngược + Reverse Transciptase

Chu kỳ PCR 1 Chu kỳ PCR 2

Hình 4 Sơ đồ tổng quát một quy trình RT-PCR

giúp của enzyme chịu nhiệt Taq DNA polymerase Đây là nguyên tắc cơ bản quyết định

sự thành công của PCR

2.7.2 TỐI ƯU HOÁ CÁC ĐIỀU KIỆN CHO PHẢN ỨNG RT-PCR

Có nhiều yếu tố cần được xem xét trong phản ứng RT-PCR như nhiệt độ tối ưu của enzyme phiên mã ngược, mức độ nhạy của phản ứng, ứng dụng của sản phẩm PCR và sự dễ dàng trong quá trình thực hiện Để đạt được hiệu quả tốt trong phản ứng RT-PCR, các yếu tố trong phản ứng cần được tối ưu

2.7.2.1 Phản ứng phiên mã ngược (Reverse Transriptase - RT)

a) Trình tự và nồng độ mồi

Việc lựa chọn mồi phù hợp cho phản ứng phiên mã ngược phụ thuộc vào kích thước và cấu trúc thứ cấp của mRNA mục tiêu Nồng độ tối ưu của mồi được xác định trong thực nghiệm đối với từng phản ứng cụ thể

Đối với mồi oligo(dT), phản ứng phiên mã ngược dựa vào đuôi polyA ở đầu 3’ mRNA của eukaryote để tổng hợp trực tiếp mạch cDNA Nồng độ mồi oligo(dT) được đề nghị là 0,5 g trong 20 l phản ứng

Mồi chuyên biệt trình tự gen có thể bắt cặp chuyên biệt với RNA mục tiêu tại vùng 3’ Đây cũng là mồi ngược của giai đoạn PCR Để có thể phân biệt đoạn cDNA được khuếch đại với các trình tự khuếch đại của DNA bộ gen, mồi được thiết kế gắn chuyên biệt với trình tự exon Khi đó, sản phẩm khuếch đại từ bộ gen sẽ được phân biệt do có kích thước lớn hơn sản phẩm được khuếch đại từ cDNA mục tiêu Trong quy trình RT-PCR một bước, mồi chuyên biệt gen được sử dụng giúp tránh sự canh tranh giữa mồi của phản ứng RT và PCR Nồng độ mồi chuyên biệt được đề nghị là 0,5 g trong 20 l phản ứng

Để khuếch đại những đoạn mRNA dài hay những phân tử có cấu trúc thứ cấp, mồi chuyên biệt trình tự và mồi oligo(dT) gặp phải trở ngại là enzyme phiên mã ngược phải kéo dài một trình tự quá dài hay đi qua một trình tự có cấu trúc thứ cấp Trong trường hợp này, mồi 6 nucleotide ngẫu nhiên được sử dụng Tuy nhiên mồi 6 nucleotide ngẫu nhiên lại có tính chuyên biệt thấp do sự bắt cặp là ngẫu nhiên trên RNA

b) Enzyme phiên mã ngược

Hai enzyme xúc tác phản ứng phiên mã ngược thường được sử dụng là enzyme phiên mã ngược từ virus: Monoley murine leukemia virus (MMLV-RTase) và Avian myeloblastosis virus (AMV-RTase) Enzyme AMV có hoạt tính 5’-3’ polymerase phụ thuộc mồi (5’-3’ primer-dependent polymerase) sử dụng khuôn mẫu là RNA hoặc DNA và có hoạt tính 3’-5’ RNAse H MMLV chỉ sử dụng khuôn mẫu là RNA

Để phiên mã RNA thành cDNA, các cấu trúc thứ cấp của RNA phải được biến tính

Do enzyme AMV và MMLV bị bất hoạt ở nhiệt độ cao nên các phản ứng tổng hợp mạch cDNA phải được thực hiện ở 37-48oC Nhiệt độ phản ứng tối đa của enzyme MMLV là

42oC, trong khi AMV có thể hoạt động tại 48oCở điều kiện dung dịch đệm phù hợp Vì vậy việc sử dụng enzyme AMV RT có thể giúp loại trừ những vấn đề liên quan đến cấu trúc thứ cấp của RNA

Một enzyme khác có thể sử dụng trong phản ứng RT là enzyme Tth DNA

polymerase có hoạt tính phiên mã ngược khi có mặt ion Mn2+ Enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ cao (60-70oC) nên có nhiều thuận lợi trong trường hợp cần loại trừ các cấu trúc thứ cấp của RNA Tuy nhiên, khi tổng hợp mạch cDNA bằng mồi 6 nucleotide ngẫu nhiên, việc giảm nhiệt độ sẽ gây trở ngại cho hoạt tính của enzyme chịu nhiệt Trong trường hợp này, enzyme AMV hay MMLV sẽ được sử dụng

Mặt khác, các nghiên cứu cho thấy enzyme phiên mã ngược từ virus nhạy hơn DNA polymerase chịu nhiệt Do đó trong các trường hợp yêu cầu sự chính xác cao như khuếch đại DNA để tạo dòng thì AMV và MMLV thường được sử dụng

c) Các thông số trong chu kỳ

Sự tổng hợp mạch cDNA sử dụng enzyme AMV có thể được thực hiện trong 20-60 phút tại 37-48 oC

Trước phản ứng phiên mã ngược, bước biến tính có thể được thực hiện độc lập hay phối hợp bằng cách ủ mồi và khuôn RNA ở 94oC trong 2 phút Sau đó, hỗn hợp khuôn RNA/mồi được làm lạnh đến nhiệt độ phù hợp cho phản ứng phiên mã ngược (37-48oC) và thêm các hỗn hợp phản ứng

Sau phản ứng phiên mã ngược, nhiệt độ lại được tăng lên 94oC nhằm biến tính sợi đôi RNA/cDNA và ức chế hoạt tính enzyme phiên mã ngược Các báo cáo từ kết quả thực nghiệm cho thấy việc ức chế hoạt tính enzyme phiên mã ngược giúp thu được hiệu quả khuếch đại DNA ở bước PCR tốt hơn

2.7.2.2 Phản ứng PCR

a) Thể tích phản ứng và tube phản ứng

Hầu hết các quy trình PCR được thực hiện với thể tích từ 25-100 l trong các tube 0,2ml hay 0,5ml Trong trường hợp tiến hành với thể tích lớn hơn 100 l thì thời gian ủ cần lâu hơn để có sự cân bằng nhiệt độ trong hỗn hợp phản ứng Thể tích được lựa chọn sao cho sự điều khiển nhiệt độ trong hỗn hợp phản ứng được chính xác

Các loại tube cần được thiết kế phù hợp với máy luân nhiệt và phù hợp với sự thay đổi nhiệt độ trong khoảng thời gian nhanh nhất

b) Trình tự và nồng độ mồi

Trình tự mồi

Trình tự của mồi quyết định tính chuyên biệt của phản ứng PCR Việc lựa chọn trình tự mồi chuyên biệt và nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng có vai trò quan trọng đối với hiệu quả của phản ứng Thông thường, độ dài của mồi sử dụng trong phản ứng PCR dao động trong khoảng 18-30 bp

Khi chọn lựa hai mồi cho phản ứng PCR, cần lưu ý rằng mồi không được chứa các trình tự tự bổ sung và không bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược

Thành phần G/C thông thường trong khoảng 15-55%, tỉ lệ G+C khoảng 40-60% giúp gia tăng độ bền của mồi và tránh các cấu trúc bậc hai

Mồi cho phản ứng PCR không nên thiết kế bắt cặp với vùng chứa cấu trúc bậc hai trên DNA mục tiêu

Việc lựa chọn trình tự và tính toán nhiệt độ bắt cặp có thể thực hiện bằng máy tính với các phần mềm chuyên dụng

Nồng độ mồi

Trong hầu hết các ứng dụng, mồi xuôi và mồi ngược đều phải có nồng độ bằng nhau Theo thực nghiệm, 95% các phân tử đầu tiên của mồi vẫn còn duy trì sau 30 chu kỳ PCR Vì vây, nồng độ mồi tối ưu sử dụng nên dao động trong khoảng 0,1 M đến 1

M trong 25 l dung dịch phản ứng Sử dụng nồng độ mồi cao hơn không những không cần thiết mà còn có thể dẫn đến sự hình thành dimer giữa các mồi và hiện tượng bắt cặp nhầm

c) Nồng độ Mg 2+

Một trong những yếu tố ảnh hưởng có tính chất quyết định là nồng độ Mg2+, kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR Nồng độ cao của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA mạch đôi ổn định hơn, ngăn cản sự biến tính tạo thành sợi đơn làm giảm sản phẩm PCR Lượng thừa Mg2+ còn gây ra sự bắt cặp không chính xác làm giảm sự chuyên biệt của phản ứng

Ngược lại, khi nồng độ Mg2+ thấp (< 0,5 M) sẽ ảnh hưởng đến quá trình kéo dài do

Mg2+ đóng vai trò co-factor của enzyme polymerase

Ion Mg2+ tự do có thể liên kết với dNTP, mồi và DNA bản mẫu nên lượng ion Mg2+

cần cho hoạt động của enzyme sẽ bị giảm Do đó, cần phải xác định nồng độ tối ưu của

Mg2+ để đảm bảo sự chuyên biệt của sản phẩm PCR và hiệu suất tổng hợp Nồng độ

Mg2+ tự do cần cao hơn nồng độ dNTP 0,5-2,5 mM

d) Dung dịch đệm (buffer)

pH của dung dịch đệm cần được xem xét trong phản ứng PCR Hầu hết các phản ứng được đệm trong môi trường 10-50 mM Tris-HCl ở pH 8,3 nhiệt độ 20oC Tuy nhiên

pH giảm khi nhiệt độ tăng, do đó theo chu kỳ nhiệt của PCR, pH sẽ thay đổi từ 7,8 đến 6,8 Với sự dao động như vậy, pH được xem như tạm chấp nhận

Môi trường đệm KCl thường được sử dụng Nồng độ KCl hay NaCl cao có thể ức

chế hoạt tính của enzyme Taq polymerase, tuy nhiên các thành phần này lại cần để thúc

đẩy sự bắt cặp giữa mồi và khuôn mẫu

Ammonium sulphate cũng được sử dụng làm dung dịch đệm để phát hiện các sản phẩm khuếch đại có trọng lượng phân tử thấp trên gel acrylamide

Gelatine hoặc Triton X-100 được dùng để bảo quản enzyme Nhằm bảo quản và ổn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của phản ứng PCR, dung dịch đệm trong phản ứng thường chứa gelatine ở nồng độ 0,01% và Triton X-100 ở nồng độ 0,1% (v/v)

e) Enzyme

Nhiều loại enzyme chịu nhiệt có thể được sử dụng trong phản ứng PCR như Taq polymerase, Tth polymerase… Nồng độ của enzyme polymerase là một nhân tố quan

trọng quyết định sự chính xác của phản ứng PCR Nếu nồng độ enzyme cao và dư thừa

sẽ làm giảm sự chuyên biệt và gia tăng giá thành không cần thiết Nồng độ Taq

polymerase nên sử dụng được khuyến cáo trong hầu hết các protocol là 0,5 U/ 25 l phản ứng và không nên sử dụng nồng độ cao hơn 1,25 U/ 25 l phản ứng

f) Các thông số trong chu kỳ

Nhiệt độ biến tính và thời gian biến tính

DNA tồn tại ở dạng mạch đôi ổn định, do đó để tạo mạch đơn cho phản ứng bắt cặp giữa DNA và mồi, DNA cần được biến tính bằng nhiệt Nhiệt độ được tăng cao hơn Tm

của mạch đôi sau đó được làm lạnh nhanh để sự tránh sự tái bắt cặp của hai mạch bổ sung Do DNA được biến tính trong môi trường đệm ion nên nhiệt độ biến tính khoảng 91-97oC

Taq polymerase có thời gian bán phân hủy là 30 phút ở 95oC Đây là lý do tại sao không nên thực hiện nhiều hơn 30 chu kỳ khuếch đại Tuy nhiên, sau khoảng 10 chu kỳ có thể giảm nhiệt độ biến tính thấp hơn 80oC đối với khuôn mẫu có 50%(G+C) do chiều dài đoạn DNA mục tiêu đã giảm Nhờ vậy có thể thực hiện khoảng 40 chu kỳ khuếch đại mà không ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả của enzyme

Thời gian biến tính cũng là lý do ảnh hưởng hoạt tính của enzyme Thông thường thời gian biến tính là 1 phút ở 94oC Đối với các trình tự khuôn mẫu ngắn, thời gian biến tính có thể được giảm xuống 30 giây hay ít hơn

Nhiệt độ bắt cặp

Nhiệt độ bắt cặp tối ưu nên được xác định bằng thực nghiệm Enzyme sử dụng trong phản ứng PCR hoạt động ở 25-72oC do đó sự bắt cặp và lai cần phải ổn định ở nhiệt độ này Nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng PCR được chọn lựa dựa vào độ dài và thành phần của mồi

Suggs và ctv (1981) đã đề nghị một công thức tính nhiệt độ tan chảy (Tm) mà tại nhiệt độ này, một nửa các mồi sẽ được phản ứng bắt cặp với DNA mục tiêu:

Tm (oC)= 4(G + G) + 2(A + T) Công thức này chỉ áp dụng cho những mồi ít hơn 20 nucleotide Đối với các mồi dài hơn thì được tính theo công thức tính sau:

Tm = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41 (% G+C) – 675/n Với [Na+] là nồng độ muối, n là số base trong mồi oligonucleotide

Giá trị Tm thu được từ tính toán cần phải được tối ưu trong thực nghiệm Thông thường, giá trị Tm thường trong khoảng 55-65oC, tuy nhiên nhiệt độ bắt cặp tối ưu lại thường cao hơn giá trị Tm tính toán Nhiệt độ cao giúp giảm tối thiểu sự bắt cặp không đặc hiệu, tăng lượng sản phẩm đặc hiệu và giảm sự hình thành dimer của mồi

Thời gian bắt cặp không nên kéo dài Hầu hết các mồi đều bắt cặp hiệu quả trong 30 giây hoặc ít hơn

Nhiệt độ kéo dài và thời gian kéo dài

Thông thường, nhiệt độ kéo dài trong phản ứng PCR dao động khoảng 70-72oC trong 0,5-3 phút Tại 70oC, hoạt tính của enzyme Taq polymerase đạt tối ưu và sự kéo

dài có thể đạt được 100 base/giây Thời gian kéo dài khoảng 1 phút thích hợp với sự khuếch đại đoạn DNA khoảng 2 kb Các sản phẩm dài hơn yêu cầu thời gian kéo dài lâu hơn Thời gian kéo dài lâu hơn cũng có nhiều ích lợi đối với những chu kỳ cuối, khi mà nồng độ sản phẩm vượt quá nồng độ của enzyme và nồng độ dNTP, mồi bị giới hạn

Số chu kỳ

Số chu kỳ khuếch đại trong phản ứng PCR cần để tạo ra một vạch nhìn thấy được trên gel phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ DNA mục tiêu ban đầu Innis và Gelfand (1990) đề nghị 40-45 chu kỳ để khuếch đại 50 phân tử DNA mục tiêu và 25-30 chu kỳ để khuếch đại 3 105 phân tử mục tiêu ban đầu Vào những chu kỳ cuối, sản phẩm khuếch đại có nồng độ cao kết hợp với sự phân hủy của enzyme, dNTP, sự cạn kiệt thành phần phản ứng (mồi, dNTP), sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, sự cạnh tranh các thành phần phản ứng bởi những sản phẩm không đặc hiệu, sự bắt cặp giữa các bản sao… làm giảm hiệu quả khuếch đại một cách rõ rệt Vì vậy, số chu kỳ khuếch đại thường không vượt quá 40 chu kỳ trong một phản ứng PCR

Trong trường hợp sản phẩm chưa được khuếch đại đủ sau 30 chu kỳ thì nên sử dụng một lượng nhỏ sản phẩm khuếch đại để tiến hành một phản ứng PCR mới (với khoảng 20-30 chu kỳ) hơn là gia tăng số lượng chu kỳ khuếch đại

g) Các yếu tố khác

Nồng độ khuôn DNA

Lượng khuôn mẫu DNA có khuynh hướng giảm nhờ sử dụng các polymerase có hiệu quả cao Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu ban đầu còn giúp hạn chế các khuếch đại ký sinh tạo những sản phẩm phụ không mong muốn

Lượng khuôn mẫu DNA ban đầu là nanogram (đối với các khuôn được dòng hóa) hay microgram (đối với DNA bộ gen), hay khoảng 20.000 bản sao ban đầu thường được lựa chọn để bắt đầu một phản ứng PCR

Trong phương pháp RT-PCR, đối với phương pháp RT-PCR một bước, toàn bộ mẫu cDNA được sử dụng cho phản ứng PCR tiếp theo Đối với phương pháp RT-PCR hai bước, lượng sản phẩm RT dùng cho phản ứng PCR được đề nghị là không quá 1/2 thể tích sản phẩm RT

2.8 KĨ THUẬT TẠO DÒNG

2.8.1 KHÁI NIỆM VỀ TẠO DÒNG

Tạo dòng là một trong những bước cơ bản của công nghệ gen Mục đích của việc tạo dòng là nhằm thu nhận một lượng lớn và tinh khiết các trình tự DNA xác định một cách dễ dàng hay nhằm thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu

2.8.2 CÁC PHƯƠNG TIỆN DÙNG TRONG TẠO DÒNG

DNA nguyên liệu cho tạo dòng

Các vector

Tế bào chủ

Enzyme: gồm enzyme giới hạn và các enzyme thông dụng khác

2.8.2.1 DNA nguyên liệu cho tạo dòng [4]

Nguồn DNA nguyên liệu dùng trong tạo dòng rất đa dạng Chúng có thể là DNA bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu, đoạn DNA tổng hợp từ khuôn RNA dưới tác động của enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase), DNA sản phẩm của phản ứng PCR dưới sự tổng hợp của DNA polymerase hay các DNA tổng hợp in vitro

2.8.2.2 Các vector dùng trong tạo dòng

a) Khái niệm vector [4]

Vector là một DNA, thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mượn bộ máy di truyền tế bào vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu

Các ứng dụng chủ yếu của vector là:

Tạo dòng để khuếch đại số lượng bản sao một trình tự DNA xác định

Chuyển các gen vào trong tế bào hay vào cơ thể (tạo các sinh vật chuyển gen - GMO, gene transformatic organism)

Sản xuất RNA với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng

Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng

b) Những đặc tính chung của vector [4, 16]

Vector phải có các trình tự khởi sự sao chép (ori) để có thể tự sao chép và tồn tại độc lập với sự sao chép bộ gen của tế bào chủ

Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng DNA tối đa Hơn nữa, kích thước vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và có hiệu quả

Vector phải có các gen chọn lọc để dễ dàng phát hiện ra chúng hoặc các gen lạ gắn vào Thông thường đó là đặc tính kháng với kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vector sống được trên môi trường có kháng sinh, hoặc khả năng sản sinh một enzyme ( -galactosidase của operon lactose) chuyển hoá một cơ chất tạo màu phát hiện được trên môi trường thạch

Vector phải có trình tự nhận biết (palindromic), nơi mà các restriction endonuclease nhận biết để cắt hở làm chỗ ráp đoạn gen lạ vào Các trình tự này thường nằm xa điểm xuất phát sao chép để tránh bị cắt nhầm

Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn nhất cho tế bào chủ

Ngoài ra chúng còn phải có những đặc tính bổ sung khác để cho việc tạo dòng dễ thực hiện:

Chứa các gen làm vô hiệu hóa đoạn DNA không mong muốn bị gắn vào

Có các trình tự nucleotide cần thiết cho sự biểu hiện của gen như promoter, trình tự gắn với ribosome để dịch mã (ribosome binding site)

Giá trị của các vector ở chỗ nó được cấu tạo như thế nào để thuận tiện cho mục đích sử dụng Một vector được xem là càng mạnh khi càng có nhiều các đặc tính trên

Một vector được coi là mạnh khi càng mang nhiều những đặc tính kể trên Có nhiều loại vector: plasmid, cosmid, phage, YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men), MAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú).…

c) Các vector plasmid [4]

Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5kb), dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn Mỗi vi khuẩn có thể chứa hàng trăm plasmid Vector này có thể nhận 8-9kb DNA cần dòng hóa

Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid đã không ngừng được cải tiến để ngày

càng thuận tiện hơn cho kỹ thuật tái tổ hợp DNA

2.8.2.3 Chọn tế bào chủ [16]

Một số tế bào chủ lý tưởng cho tạo dòng cần có những đặc tính sau :

- Tăng trưởng nhanh chóng

- Phát triển mạnh trên môi trường nuôi cấy không mắc tiền

- Không gây hại hoặc lây bệnh

- Có khả năng thu nhận DNA

- Ổn định trong môi trường nuôi cấy

Tế bào chủ phải mang những enzyme thích hợp cho sự sao chép của vector Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào chủ thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và tự sao chép độc lập với bộ gen của tế bào Tế bào chủ phải mang những enzyme thích hợp cho sự sao chép của vector Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào chủ thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và tự sao chép độc lập với bộ gen của tế bào Những tế bào chủ hữu dụng nhất cho tạo dòng là những vi sinh vật tăng trưởng nhanh, thông tin di truyền đầy đủ và thao tác gen dễ dàng, bao gồm

tế bào prokaryote như vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis và tế bào eucaryote như nấm men Saccharomyces cerevisiae, tế bào động vật

2.8.2.4 Các enzyme dùng trong tạo dòng [4, 16]

Enzyme dùng trong tạo dòng gồm hai nhóm lớn là enzyme giới hạn và các enzyme thông dụng khác

a) Các enzyme giới hạn (Restriction enzyme, RE)

Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định

Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trưng Các trình tự này thường bao gồm 4-8 nucleotide Các RE khác nhau có thể có cùng trình tự nhận biết và đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác

Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindrom, nghĩa là những đoạn DNA mạch đôi có trình tự nucleotide của hai mạch đơn giống nhau theo chiều 5’ 3’ Như vậy, vị trí cắt là giống nhau trên cả hai mạch

Các kiểu cắt của các RE loại II:

 Cắt tạo đầu bằng (blunt ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp trở lại Để nối chúng lại phải dùng enzyme nối T4 ligase

 Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại Đặc tính này được sử dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro, hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau nhưng cùng được cắt bởi một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính

b) Các enzyme thông dụng khác

 Các polymerase: gồm các DNA polymerase và RNA polymerase DNA

polymerase được quan tâm nhiều trong tạo dòng Các DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’ 3’ Phần lớn các DNA polymerase dùng mạch DNA làm khuôn cho sự tổng hợp Một số DNA polymerase thường dùng trong tạo dòng là DNA

polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase, Pfu DNA polymerase

 Các ligase

Đây là các enzyme xúc tác sự hình thành liên kết phosphodiester nối hai đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) Trong kĩ thuật tạo dòng (lĩnh vực sử dụng quan trọng nhất của các ligase), chúng thường được sử dụng kết hợp với hai enzyme khác là

T4 polynucleotide kinase và Alkaline phosphatase Ngoài ra còn có các loại như E coli

DNA ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase

 Các nuclease

Đây là nhóm các enzyme phân cắt DNA (DNase) và RNA (RNase) Các enzyme giới hạn đề cập ở trên cũng là những nuclease nhưng mang tính chuyên biệt trình tự cao hơn Các nuclease chính bao gồm các enzyme sau: DNase I, nuclease S1, exonucleaseIII, Rnase A, RNase H,…

2.8.3 CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG TẠO DÒNG [4, 16]

Tùy thuộc vào loại thư viện gen cần thiết lập, các nhân tố tham gia vào quá trình tạo dòng có thể thay đổi, nhưng tiến trình thực hiện đều bao gồm các bước sau:

Chọn và xử lý vector

Xử lý DNA cần tạo dòng

Tạo vector tái tổ hợp

Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ

Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gen

2.8.3.1 Chọn và xử lý vector

Việc chọn lọc vector phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước các đoạn DNA muốn tạo dòng, mục đích tạo dòng…

Việc xử lý vector sẽ tùy thuộc vào chiến lược tạo dòng Thông thường, vector sẽ được cắt mở vòng bằng RE ở một hoặc hai vị trí xác định Sau đó, hai đầu chỗ mối cắt được xử lí để chúng không thể nối trở lại; vector chỉ có thể trở lại dạng vòng ban đầu khi

hai đầu chỗ mối cắt được nối với một trình tự DNA lạ Điều này nhằm tránh sự hình thành các dòng vi khuẩn mang vector không tái tổ hợp

2.8.3.2 Xử lý DNA cần tạo dòng

DNA mục tiêu có thể được khuếch đại trực tiếp từ DNA bộ gen thông qua phương pháp PCR hay cắt trực tiếp từ một lượng lớn DNA bộ gen ban đầu

DNA mục tiêu được dùng để tạo dòng phải có kích thước tương ứng với loại vector đã chọn Hai đầu của DNA này cần phải xử lý cho phù hợp với hai chỗ mối cắt của vector Nếu ở giữa các đoạn DNA mục tiêu hay cDNA có các điểm nhận biết của RE, có thể dùng enzyme methylase hóa đoạn đó DNA sẽ tránh được sự cắt của các RE này

2.8.3.3 Tạo vector tái tổ hợp

Vector và DNA cần tạo dòng đã được xử lý sẽ được nối theo một tỷ lệ nhất định với sự hiện diện của ligase Ligase xúc tác phản ứng nối vector với DNA mục tiêu tạo thành vector tái tổ hợp (recombinant)

2.8.3.4 Chuyển gen tái tổ hợp vào tế bào chủ

Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao Kĩ thuật chuyển được sử dụng sẽ tùy thuộc vào loại tế bào chủ

2.8.3.5 Phát hiện và chọn lọc dòng cần tìm trong thư viện gen [14, 18]

Kết quả phản ứng nối một trình tự DNA và một vector đã được mở vòng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối như vector-vector, vector-DNA mục tiêu… Do đó, các thể biến nạp sau khi được nuôi trên môi trường dinh dưỡng có thể phát triển thành các dòng

vi khuẩn sau:

- Tế bào không nhận được plasmid

- Tế bào nhận được plasmid không có gen lạ vào

- Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tổ hợp

Để có thể phân lập dòng tế bào chủ tái tổ hợp chứa gen mục tiêu trong thư viện DNA hay thư viện cDNA, người ta sử dụng các phương pháp sàng lọc Phổ biến là các phương pháp sau:

- Phát hiện kiểu hình nhờ bổ sung ( -complementation)

- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp lai (lai khuẩn lạc)

- Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc, PCR với khuôn mẫu là plasmid tách chết từ thể biến nạp)

- Phương pháp miễn nhiễm

- Dựa vào các gen phát sáng như GFP…

a) Phát hiện kiểu hình nhờ bổ trợ

Nhiều vector được sử dụng (như họ pUC, pBluescript, pGem…) mang một đoạn

ngắn của trình tự điều hoà mã hoá (lacZ) cho 146 amino acid đầu tiên của enzyme

-galactosidase xúc tác phản ứng dị hoá đường lactose, -protein đầu N Việc chèn vào vùng mã hoá của gen này một đoạn MCS (multicloning site) chứa các vị trí cắt hạn chế

duy nhất (vẫn duy trì khuôn đọc) sẽ tạo thêm vài amino acid trong -protein mà không

ảnh hưởng đến chức năng của lacZ Các vector loại này sẽ được sử dụng với chủng chủ

biểu hiện phần đầu C của galactosidase, protêin đầu N Hai prorein bất hoạt của

-galactosidase E coli ( và -protein ) kết hợp với nhau hình thành một enzyme có chức

năng gọi là hiện tượng -complementation Điều này cũng có nghĩa là, nếu một hệ thống, có đột biến mất đoạn đầu của đoạn vận hành (operator segment) của lacZ trên plasmid, được bù đắp nhờ các thể đột biến âm của -galactosidase có operator nguyên vẹn ở tế bào chủ, sẽ có kiểu hình Lac+ Các vi khuẩn có kiểu hình Lac+ - khuẩn lạc có -complementation được phát hiện nhờ sự đổi màu của X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl D-galactoside) làm khuẩn lạc có màu xanh

Khi chèn đoạn DNA vào MCS của các vector (ví dụ, pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành -protêin đầu N Do đó, hiện tượng -complementation không xảy ra, phản ứng phân cắt X-gal không thực hiện đuợc Vì vậy, các tế bào vi khuẩn mang các

plasmid tái tổ hợp này sẽ cho khuẩn lạc màu trắng

b) Mất hoạt tính do xen đoạn [16]

Phương pháp này được sử dụng với các vector có mang hai hay nhiều hơn các gen kháng thuốc và trên các gen này có những điểm nhận biết của các enzyme restriction endonuclease Các đoạn DNA cần gắn vào plasmid được phân cắt với restriction enzyme mà điểm nhận biết của chúng nằm chỉ trên một gen kháng kháng sinh (ví dụ, gen kháng ampicillin Ampr, gen kháng tetracycline TerR) Nếu đoạn DNA lạ xen vào giữa gen TetR

sẽ làm mất hoạt tính kháng tetracycline do đó phương pháp này đươc gọi là mất hoạt tính

do xen đoạn (insertional inactivation)

Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào

chủ có khả năng sinh trưởng trên môi trường có kháng sinh Do đó, khi trải E coli biến

nạp lên môi trường chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trưởng Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trưởng được

c) Phương pháp PCR khuẩn lạc

Phương pháp PCR khuẩn lạc cũng dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp PCR Tuy nhiên, DNA bản mẫu không được đưa trực tiếp trong thành phần của phản ứng mà được đưa vào dưới dạng nằm trong tế bào Khi phản ứng PCR xảy ra, nhiệt độ cao sẽ phá vỡ màng tế bào và DNA thoát ra ngoài trở thành DNA bản mẫu

PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

3.1 HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG

- RNAse 1mg/ml

- Phenol pH 8 bão hòa trong TE

- Chloroform

- Isopropanol lạnh (giữ ở –20oC)

- Ethanol 70% lạnh (giữ ở –20oC)

- Dung dịch TE (vô trùng):

- CaCl2 100mM lạnh (giữ ở 4oC)

- Ampicillin 50 g/ml (pha trong nước cất vô trùng)

Hóa chất dùng cho bảo quản giống

Glycerol 80% vô trùng

Hóa chất tách chiết RNA tổng số

 Dung dịch ly giải I:

4M Guanidinium thiocyanate 25mM Sodium citrate pH 7

0,1M 2 - Mercaptol ethanol

 Dung dịch Trizol:

Phenol pH4 380ml/l

- DEPC-H2O (nước xử lý bằng Di Ethyl Pyro Carbonate)

Hóa chất RT-PCR: dNTP, RT buffer 5X, Rnasin, DTT, MMLV, PCR buffer

10X, MgCl2 25mM, Taq polymerase

Hóa chất điện di

- TAE 1X (Tris Acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH8)

- Agarose

- Ethidium bromide (10mg/ml)

- Loading dye (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyanol; 40% glycerol)

Bộ Kit NucleoSpin Extract dùng để tinh chế DNA (Amersham Pharmacia

Biotech Inc)

Bộ hóa chất dùng giải trình tự gen ALFexpress TM AutoCycle TM Sequencing Kit

(Amersham Pharmacia Biotech Inc)

Các enzyme sử dụng trong tạo dòng

- EcoRV (Fermentas)

- Pfu DNA polymerase (Fermentas)

- Taq DNA polymerase (Fermentas)

- T4 DNA ligase (Fermentas)

Hình 5 Sơ đồ plasmid pBluescript II SK (+)

Cao nấm men 5g

Nước cất 1000ml

- Môi trường LB-Amp dùng để chọn lọc thể biến nạp E coli: có thành phần

tương tự như môi trường LB và được bổ sung thêm ampicillin với nồng độ

50 g/ml ở 40-45oC sau khi hấp khử trùng

Trong trường hợp dùng để chọn lọc dòng dựa trên nguyên tắc bổ trợ , môi trường có bổ sung X-gal 40µg/ml

- Môi trường LB thạch có thành phần như môi trường lỏng, có bổ sung 2% agar Tất cả các môi trường trên đều được hấp khử trùng ở 121oC, 25 phút

3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.2.1 Vật liệu

3.2.1.1 Mẫu thí nghiệäm

- Mẫu huyết thanh heo do trung tâm thú y vùng cung cấp

- Mẫu máu, bệnh phẩm từ thực địa: tại các trại nuôi ở các tỉnh Đồng Nai, Biên Hòa,Vũng Tàu

3.2.1.2 Chủng vi sinh vật

Escherichia coli DH5 (F - endA1 hsdR17 (r k- /m k- ) supE44 thi – recA1 gyrA96 lacU169 ( 80 lacZ M15))

được chèn vào vùng mã hoá của gen này sẽ tạo thêm một vài acid amin trong -protein

mà không ảnh hưởng chức năng của lacZ

3.2.2 Phương pháp

3.2.2.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

a) Phương pháp lấy mẫu

Mẫu bệnh phẩm lấy từ thực địa, tại các trại heo (nghi ngờ bệnh)

Trên heo sống:

Lấy máu cho vào ống nghiệm sạch khô có chất chống đông EDTA Máu được lấy ở tĩnh mạch tai, tĩnh mạch ở vùng tim

Trên xác động vật:

Mổ lấy bệnh phẩm: lách, hạch amidal, hạch bạch huyết, thận

Mẫu lấy ghi rõ đặc điểm, triệu chứng lâm sàng và những biểu hiện bệnh tích

b) Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm được bảo quản trong glycerol 20%, giữ ở nhiệt độ - 20oC

3.2.2.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

a) Phương pháp 1

 Nguyên tắc

Mẫu bệnh phẩm được đồng nhất trong dung dịch ly giải Đồng thời, dưới tác động của Sarrkosyl và tác động cơ học (vortex), tế bào bị phá vỡ DNA, RNA được giải phóng Guanidinium thiocyanate và mercapto-ethanol là 2 tác nhân gây biến protein mạnh, do vậy, RNA tồn tại trong dung dịch bị biến tính Tiếp theo đó, DNA trong hỗn hợp bị biến tính dưới tác động của phenol pH 4 Toàn bộ protein và DNA biến tính được loại đi nhờ xử lý chloroform-isoamylacohol RNA tổng số được tủa bằng isopropanol trong điều kiện lạnh và được hòa tan trong nước cất hai lần đã xử lý với DEPC

 Các bước tiến hành

- Cho 100 l dung dịch ly giải I vào 200 l máu hoặc 50-100mg mẫu mô Vortex kĩ

- Thêm 40 l NaOAc pH 5,4

- Thêm 440 l phenol pH 4 Vortex

- Thêm 178 l Chloroform-isoamylalcohol (49:1) Ly tâm 13.000v/p, 20 phút, 4oC Thu dịch nổi sang eppendorf mới

- Thêm 450 l choloroform-isoamylalcohol (49: 1) Ly tâm 13.000v/p, 20 phút, 4oC Thu dịch nổi sang eppendorf mới

- Thêm 450 l isopropanol lạnh, ủ - 20oC trên 1h Ly tâm 13.000v/p, 30 phút, 4oC Thu tủa

- Rửa tủa hai lần bằng 1ml ethanol 70% lạnh Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút, 4oC Thu tủa, phơi khô ở nhiệt độ phòng

- Hòa tan cặn RNA trong 20 l DEPC-H2O, giữ ở - 20oC để dùng cho các khảo sát sau