ứng dụng hệ nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan hồ điệp lai ( phalaenopsis hybrid)

cytokinin trên môi trường rắn hoặc bán rắn để kích thích sự hình thành của mô sẹo, phát sinh phôi, chồi và rễ,… Tuy nhiên, có rất nhiều giới hạn trong việc nuôi cấy trên môi trường thạch

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI

ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI

TRONG NHÂN GIỐNG CÂY LAN HỒ ĐIỆP LAI

Sở Khoa học & Công nghệ Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI

ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI

TRONG NHÂN GIỐNG CÂY LAN HỒ ĐIỆP LAI

(Phalaenopsis hybrid)

Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh Chủ nhiệm đề tài: ThS Cung Hoàng Phi Phượng

Danh sách cán bộ tham gia thực hiện :

2 TS Nguyễn Quốc Bình Trung tâm Công nghệ Sinh học

Mục lục i

Danh sách các bảng v

Danh sách các hình vii

Danh sách các chữ viết tắt viii

Lời mở đầu ix

Phần I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các Kỹ thuật vi nhân giống sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào, cơ quan 1

1.1.1 Kỹ thuật vi nhân giống trên môi trường bán rắn 1

1.1.2 Kỹ thuật nuôi cấy lỏng .2

1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời 4

1.1.3.1 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống 4

1.1.3.2 Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 5

1.1.3.3 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống 10

1.1.3.4 Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion system) 16

1.2 Giới thiệu về Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) 1.2.1 Phân loại 18

1.2.2 Mô tả hình thái 19

1.2.2.1 Cơ quan sinh dưỡng 19

1.2.2.2 Cơ quan sinh sản 19

1.2.3 Điều kiện sinh trưởng 20

1.2.3.1 Nhiệt độ và ẩm độ 20

1.2.3.2 Ánh sáng 20

1.2.3.3 Tưới nước 20

1.2.3.4 Bón phân 21

1.2.3.5 Sự thông gió 21

1.2.4 Các phương pháp nhân giống Lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) từ phát hoa 21

1.2.5 Thị trường tiêu thụ 24

PHẦN II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 NỘI DUNG 1:Thu thập mẫu thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống 27

2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường tạo chồi in vitro từ các mắt ngủ của phát hoa .27

2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và

không lắc (lỏng tĩnh) 31

2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc .31

2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng không có lắc 31

2.3 Nội dung 3: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan 31

2.4 Nội dung 4 : Nghiên cứu sự nhân nhanh PLBs trong hệ thống Plantima của Đài Loan .32

2.4.1 Thí nghiệm 4.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLBs trong hệ thống Plantima 32

2.4.2 Thí nghiệm 4.2: Khảo sát tần suất ngập chìm của mẫu cấy cấy lên sự nhân nhanh PLBs trong hệ thống Plantima 32

2.5 Nội dung 5: Nghiên cứu tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan .33

2.5.1 Thí nghiệm 5.1: Khảo sát mật độ PLB, thể tích môi trường nuôi cấy lên tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống Plantima 33

2.5.2 Thí nghiệm 5.2: Khảo sát thời gian ngập và tần suất ngập của mẫu cấy lên tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống Plantima 33

2.6 Nội dung 6: Nghiên cứu sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima của Đài Loan .34

2.6.1 Thí nghiệm 6.1: Khảo sát ảnh hưởng thể tích môi trường, IBA, mật độ nuôi cấy lên sự ra phát triển của cây con trong hệ thống Plantima .34

2.6.2 Thí nghiệm 6.2: Khảo sát thời gian ngập và tần suất ngập của mẫu cấy lên sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima .34

2.7 Chuyển cây con ra vườn ươm: 34

2.8 Điều kiện thí nghiệm 34

2.9 Xử lý số liệu: 35

3.1 NỘI DUNG 1: Thu thập mẫu thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để

vi nhân giống 36

3.1.1 Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường tạo chồi in vitro từ các mắt ngủ của phát hoa .36

* Xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp cho việc tạo nguồn mẫu in vitro .36

* Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự hình thành chồi ở phát hoa 38

3.1.2 Thí nghiệm 1.2: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân PLB * Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hóa PLBs từ mẫu lá của các chồi thu được trong thí nghiệm 1 41

* Xác định nồng độ hormon tối ưu để nhân nhanh PLBs .44

* Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLBs 47

3.1.3 Thí nghiệm 1.3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB 51

3.1.4 Thí nghiệm 1.4: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ NAA khác nhau lên sự hình thành rễ của chồi tái sinh từ PLBs 53

3.2 NỘI DUNG 2: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc hay không lắc 56

3.2.1 Thí nghiệm 2.1 : Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc 56

* Với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang hoặc PLB để nguyên 56

* Với mẫu cấy là PLB dạng cụm 57

3.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng tĩnh 59

* Với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang hoặc PLB để nguyên 59

* Với mẫu cấy là PLB dạng cụm 60

3.3 Nội dung 3: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài

3.4.1 Thí nghiệm 4.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự

nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima 67

3.4.2 Thí nghiệm 4.2 : Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập lên sự nhân

của Đài Loan 83

3.6.1 Thí nghiệm 6.1: Khảo sát ảnh hưởng thể tích môi trường, IBA, mật độ

nuôi cấy lên sự phát triển của chồi Hồ điệp trong hệ thống Plantima 83

3.6.2 Thí nghiệm 6.2: Khảo sát tần suất ngập chìm lên sự phát triển của cây

con trong hệ thống Plantima .91

3.7 Sự sinh trưởng và phát triển của cây Hồ Điệp ngoài vườn ươm .94 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận 99 4.2 Đề nghị 100

PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 101 PHỤ LỤC

BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLBs từ lá 28

Bảng 2.2 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự nhân PLBs 29

Bảng 2.3 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường sử dụng lên sự nhân PLBs. 29 Bảng 3.1 Trung bình số mẫu sạch 36

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi dinh dưỡng 38

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLBs từ lá 41

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh PLBs từ một PLB ban đầu 44

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLBs 47

Bảng 3.6a Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLBs của giống số 1(Dtps Taida

Salu) 51

Bảng 3.6 b Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLBs của giống số 2 (Dtps Taida

FireBird) 51

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của hai giống lan Hồ Điệp 54

Bảng 3.8 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng lắc của giống số 1với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang và PLB để nguyên 56

Bảng 3.9 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng lắc của giống số 1với mẫu cấy là PLBs dạng cụm 58

Bảng 3.10 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh của giống số 1 với

mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang và PLB để nguyên 59

Bảng 3.11 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh của giống số 1 với mẫu cấy là PLB dạng cụm 60

Bảng 3.12 Tóm tắt các kết quả nuôi cấy tối ưu của các dạng PLBs trên môi trường

lỏng 61

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự nhân PLBs trong hệ thống Plantima

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tái sinh chồi từ PLB 80

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên quá trình tái sinh chồi từ PLBs 82

Bảng 3.20 Ảnh hưởng mật độ chồi lên sự phát triển của cây con trong bình Plantima 84

Bảng 3.21 Ảnh hưởng IBA lên sự phát triển của chồi Hồ điệp 87

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên sự phát triển cây con Hồ Điệp 89

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự phát triển cây con Hồ Điệp 91

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 : Hệ thống APCS của Tisserat và Vandercook, 1985 5

Hình 2 :- A : Hệ thống của Aitken – Christie và Davies (1988),- B: Hệ thống của Simonton và cộng sự (1991) 6

Hình 3: Hệ thống RITA® 8

Hình 4: Hệ thống BIT® 9

Hình 5A: Các thành phần của Bình Plantima, Đài Loan 9

Hình 5B: Hệ thống Plantima a Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập; b Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima 10

Hình 6: Các giống lan Hồ Điệp sử dụng trong thí nghiệm 37

Hình 7: Chồi hình thành từ mắt ngủ của phát hoa Hồ Điệp 40

Hình 8: PLBs hình thành từ mẫu lá nuôi cấy trên các môi trường khác nhau 43

Hình 9: PLBs và chồi của giống số 1 (Dtps Taida Salu) trên các môi trường MS có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau 45

Hình 10: PLBs và chồi của giống số 2 (Dtps Taida Firebird) trên các môi trường MS có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau .46

Hình 11: Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự nhân PLBs của giống số 1 và số 2 50

Hình 12: Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB 53

Hình 13: Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ 55

Hình 14:Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng lên sự nhân PLBs của 3 loại mẫu cấy 62

Hình 15: Sơ đồ lắp ráp hệ thống ngập chìm tạm thời của Đài Loan 63

Hình 16: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp trong bình Plantima 66

Hình 17:Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự nhân PLBs 69

Hình 18:Ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự nhân PLBs 72

Hình 19:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLBs 76

Hình 20:Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự tái sinh chồi từ PLBs 79

Hình 21:Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự tái sinh chồi và nhân chồi từ PLBs 81

Hình 22:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự tái sinh chồi từ PLBs .83

Hình 23:Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự phát triển của cây con 86

Hình 24: Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo chồi nách của ở Lan Hồ Điệp lai 88

Hình 25:Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của cây con Hồ Điệp trong bình Plantima 90

Hình 26:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự phát triển của cây con Hồ Điệp 93

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MS: Murashige & Skoog

MS1/2: Murashige & Skoog giảm một nửa khoáng đa lượng

BA: 6-benzyladenin

NAA: -naphthalene acetic acid

IBA : Indole-3 –butyric acid

TIS: Temporary Immersion system (hệ thống ngập chìm tạm thời)

chất ĐHSTTV: chất điều hòa sinh trưởng thực vật

SPSS: Statistical Program Scientific System

Trong những năm gần đây, các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được nhiều nước trên thế giới triển khai và ứng dụng trong nhân giống nhiều loại cây trồng Ảnh hưởng tích cực của hệ thống này đã được thể hiện trong việc tăng sinh chồi, nuôi cấy đốt thân, nuôi cấy củ bi và tạo phôi vô tính Hệ thống này có tác dụng làm tăng chất lượng cây trồng thể hiện ở việc làm tăng cường sức sống của chồi và khả năng tạo phôi soma không bị biến dị ở tần số cao Hiện tượng thủy tinh thể, thường gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến chất lượng mẫu cấy khi nuôi cấy lỏng, có thể được loại bỏ khi sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời hoặc có thể được kiểm soát bằng cách điều khiển thời gian ngập chìm Thực vật được nhân giống trong hệ thống ngập chìm có khả năng thích nghi tốt hơn trong giai đoạn thuần hóa ngoài vườn ươm so với các thực vật được nuôi cấy trong hệ thống bán rắn hay lỏng Với những ưu điểm trên hệ thống ngập chìm tạm thời đang được mở rộng ở quy mô lớn phục vụ trong sản xuất thương mại

Việc ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống hoa kiểng đặc biệt là phong lan ở Việt Nam hầu như còn bỏ ngỏ Xuất phát từ nhu cầu Lan Hồ Điệp

là một loại cây trồng không những có giá trị về mặt thẩm mỹ mà còn có giá trị thương mại cao nhưng khó nhân giống, chúng tôi đã sử dụng lan Hồ Điệp như một đối tượng thực vật trong nghiên cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời để nhân giống loại lan này Mục đích là khảo sát khả năng ứng dụng hệ thống này trong nâng cao số lượng cũng như chất lượng của cây giống Hồ Điệp khi so sánh với các hệ thống nuôi cấy thông thường để góp phần mở ra khả năng sản xuất với số lượng lớn cây giống có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường tại Việt Nam

Tác giả và nhóm thực hiện đề tài xin cảm ơn Sở KHCN TP HCM đã tạo điều kiện trong suốt 2 năm qua để có thể bước đầu hoàn thành đề tài này Chúng tôi hy vọng đề tài này sẽ là tài liệu tham khảo tốt cho những ai quan tâm đến kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời

1.1 Các kỹ thuật vi nhân giống sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào, cơ quan

1.1.1 Kỹ thuật vi nhân giống trên môi trường bán rắn

Vi nhân giống đã trở nên là một phần quan trọng trong ngành nhân giống thực vật (George và Sherrington, 1984) Kỹ thuật phổ biến nhất của vi nhân giống thực vật là nghiên cứu các mô thực vật trên môi trường bán rắn và hiện đang được sử dụng trong hầu hết các quay trình nhân giống mà đặc biệt là sự tái sinh cây từ các tế bào nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo Nhờ những ưu điểm so với các phương pháp nhân giống khác (Debergh, 1987; Litz, 1987; Kyte, 1987; Macdonald, 1986) vi nhân giống thường được sử dụng trong các mục đích sau: nhân giống số lượng lớn những cây giống đồng dạng về kiểu gen, sản xuất giống cây sạch bệnh, sản xuất cây giống đầu dòng sử dụng cho mục đích lai tạo giống mới, bảo quản nguồn gen

• Thực vật thường phát triển nhanh hơn, sức sống cao

• Cây trưởng thành nhanh hơn so với cây nhân giống bằng hạt

Các loài cây thân thảo có thể được nhân giống quanh năm bằng các phương pháp nhân giống truyền thống tuy nhiên số lượng rất hạn chế, vi nhân giống sẽ làm tăng tỉ lệ nhân giống loài cây này lên gấp nhiều lần đủ phục vụ cho mục đích thương mại

Vi nhân giống được xem là công cụ tối ưu phục vụ cho công nghệ di truyền Giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu trữ được lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống vô tính truyền thống

b Nhược điểm

Một số giới hạn trong ứng dụng vi nhân giống đối với tất cả các loài thực vật:

• Giới hạn về sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống, nghĩa là cây con tạo ra thường đồng nhất về mặt kiểu hình

• Tiến trình nhân giống phức tạp (bao gồm nhiều giai đoạn liên quan nhau và kéo dài

5 - 6 tháng trước khi có thể thích ứng và trồng ngoài vườn ươm)

• Giá thành sản phẩm nhân giống còn khá cao

• Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng bổ sung vào môi trường

• Nhân giống nhanh và nhân với số lượng lớn cho đến ngày nay vẫn chưa thực hiện được trên tất cả các loài cây, cụ thể như đối với các loài ngũ cốc thì việc nhân giống vẫn còn nhiều giới hạn

• Sự tái sinh thành cây in vitro thường khó xảy ra, đặc biệt với các cây thân gỗ

Ngoài những khó khăn trên, vấn đề hiện đang được quan tâm nhất là giá thành sản phẩm còn cao Nguyên nhân chính là sự thất thoát do nhiễm vi khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỉ lệ sống sót thấp của cây nuôi cấy trong giai đoạn vườn ươm, giá nhân công chiếm 60 - 70 % tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới, giá thành trang thiết bị (chiếu sáng, bình nuôi cấy, ) và nguyên liệu cơ bản (đường, agar, ) cao Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần sẽ làm giảm đáng kể hiệu quả về sức sinh trưởng và phát triển của thực vật có khi làm tăng tính bất thường về di truyền cho tế bào, ngay cả sự hình thành của rễ chính và rễ thứ cấp có thể không thành công Hạn chế nghiêm trọng nhất trong vi nhân giống trên môi trường bán rắn được xem là tỉ lệ sống sót của cây thấp sau khi được chuyển ra vườn ươm bởi vì sự

khác biệt lớn giữa điều kiện môi trường in vitro và ex vitro và sự cần thiết phải nuôi cấy

vô trùng bắt buộc phải sử dụng các loại trang thiết bị chuyên biệt và đắt tiền

Tất cả những khó khăn trên được xem như trở ngại to lớn cho việc ứng dụng rộng rãi vi nhân giống trong nhân giống các giống thực vật có chất lượng cao

1.1.2 Kỹ thuật nuôi cấy lỏng

Với phương pháp truyền thống thì sự tái sinh của mô thực vật thường được thực hiện bởi việc cho mô thực vật phát triển trên môi trường thạch hay nói cách khác phần lớn các qui trình nuôi cấy mô thường áp dụng việc điều chỉnh hợp lý tỉ lệ giữa auxin và

cytokinin trên môi trường rắn hoặc bán rắn để kích thích sự hình thành của mô sẹo, phát sinh phôi, chồi và rễ,… Tuy nhiên, có rất nhiều giới hạn trong việc nuôi cấy trên môi trường thạch trong đó quan trọng nhất là sự thành lập các độc tố quanh mô nuôi cấy sau khi cây đã sử dụng cạn kiệt chất dinh dưỡng trong môi trường này

Do những hạn chế của nuôi cấy trên môi trường thạch, nhiều nhà khoa học đã hướng đến việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường lỏng Nuôi cấy trên môi trường lỏng có nhiều khía cạnh như nuôi cấy huyền phù tế bào để nhân sinh khối và nuôi cấy để tái sinh cơ quan Ở đây chỉ một khía cạnh là nuôi cấy trên môi trường lỏng để tái sinh cơ quan thực vật hoàn chỉnh là được quan tâm Khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng toàn bộ bề mặt mẫu cấy tiếp xúc với môi trường giúp nâng cao sự phân chia tế bào và tái sinh cơ quan, gia tăng hệ số nhân chồi, rễ, củ, và phôi soma Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, nồng độ các chất trong môi trường đồng nhất và các hợp chất độc trong môi trường xung quanh mô nuôi cấy bị biến đổi nhanh chóng trước khi có thể ảnh hưởng đến

mô

Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, mẫu cấy có thể được cấy trực tiếp vào trong môi trường lỏng hay sử dụng cầu giấy lọc, bình nuôi cấy có thể được đặt trên máy lắc hoặc không Môi trường sử dụng trong nuôi cấy lỏng cũng tương tự như môi trường sử dụng trong nuôi cấy trên thạch, chỉ có khác là không bổ sung agar vào trong môi trường nuôi cấy, do đó các bước chuẩn bị môi trường và tiến hành cấy mẫu cũng gần như tương

tự khi nuôi cấy trên môi trường thạch

Hiện nay, nuôi cấy trong môi trường lỏng thường sử dụng nhằm mục đích nâng cao hệ số nhân chồi, PLBs, rễ, củ, nâng cao khả năng phát sinh phôi ở rất nhiều loài thực vật (Nhut và cộng sự, 2004) Tuy nhiên, nếu chỉ với việc nuôi cấy đơn thuần là trong môi trường lỏng, mô cấy sẽ bị nhận chìm xuống nước kết quả là sẽ tạo ra sự nghèo thoáng khí

có khi làm mô thực vật chết đi, có hiện tượng trương nước, thủy tinh thể Hiện nay, có nhiều giải pháp để khắc phục tình trạng này thông qua một số hệ thống nuôi cấy dựa trên việc sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng: như các hệ thống Bioreactor, hệ thống ngập chìm tạm thời, …

1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời

1.1.3.1 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999:

• Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy

• Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ

• Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ

Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau:

• Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại

• Hệ thống timer dùng để điều khiển chu kỳ ngập

• Hệ thống ống dẫn và van điều khiển

• Các màng lọc thoáng khí

• Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh

Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi cấy khác nhau

1.1.3.2 Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

¾ Hệ thống tilting và hệ thống Rocker

Hai hệ thống này được thiết kế bởi Harris

và Mason (1983) Hệ thống tilting thiết kế một số bình tam giác đặt nghiêng một góc 30 độ đối diện với nhau; công suất của máy này có đặt khoảng

400 bình tam giác 50 ml hay 320 bình tam giác

125 ml Hệ thống Rocker có thể xoay 70 bình trụ tròn miệng rộng có thể tích 910 ml trên các khay của hệ thống một góc 30 – 40 độ cứ sau mỗi 30 giây Hai hệ thống này đều không có hệ thống bổ sung môi trường mới

¾ Hệ thống ngập chìm hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng

Tisserat và Vandercook (1985) thiết kế một buồng nuôi cấy lớn có thể nâng lên hạ xuống, môi trường được bơm vào và rút ra khỏi buồng nuôi cấy theo chu kỳ nhất định trong điều kiện vô trùng Hệ thống nuôi cấy thực vật tự động (APCS, Hình 1) bao gồm hệ thống ống bằng silicone, hai bơm đẩy, hai bình thủy tinh chứa môi trường, một van inox

ba chiều bằng thép không gỉ, một buồng nuôi cây, và một bản điều khiển có gắn các rờ le điện Hệ thống này có thể sử dụng để nuôi cấy thực vật trong một thời gian dài

¾ Hệ thống ngập chìm một phần và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng

Trong hệ thống này mô thực vật luôn được đặt nằm trên phía trên giá đỡ (agar, màn propylene, cellulose) Môi trường lỏng được bổ sung và rút khỏi bình nuôi cây.Chỉ

Hình 1: Hệ thống APCS của

Tisserat và Vandercook, 1985

Mô hình Aitken – Christie và Jones (1987) và Aitken – Christie và Davies (1988) gồm một hệ thống bình chứa điều khiển bán tự động bằng polycarbonate có kích thước

250 x 390 x 120 mm (Hình 2A) Trong hệ thống này, chồi Pinus spp được nuôi trên môi

trường với giá thể agar với hệ thống bổ sung rút và bổ sung môi trường lỏng bằng hệ thống bơm theo một chu kỳ nhất định Môi trường lỏng từ nơi chứa tiếp xúc với mẫu cấy trong khoảng thời gian 4 đến 6 giờ bằng cách sử dụng máy hút chân không, sau đó môi trường sẽ được rút cạn Maene và Debergh (1985) đã chứng minh ảnh hưởng tích cực của việc bổ sung môi trường lỏng hay auxin vào môi trường bán rắn ở giai đoạn cuối của nuôi

A

B

Simonton và cộng sự (1991)

¾ Hệ thống ngập hoàn toàn, trao đổi môi trường lỏng bằng áp lực không

khí và không có chức năng thay mới môi trường

Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) mô tả trong đó có cả những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời được thiết kế gần đây nhất, tất cả đều khá đơn giản và rất dễ sử dụng Hệ thống này cho phép toàn bộ mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, đồng thời bầu không khí trong bình nuôi được làm mới nhờ sử dung bộ phận bơm khí có chức năng vừa cung cấp không khí vào môi trường, vừa đẩy chất lỏng ra vào bình nuôi cây Mẫu cấy được đặt trong bình nuôi thành một khối, điều này giúp chúng ta tiết kiệm được thời gian đặt mẫu trên giá đỡ Môi trường lỏng được đẩy

từ bình chứa môi trường sang bình nuôi cây và ngược lại nhờ một áp lực khí bơm vào bình chứa chất lỏng Để tránh sử dụng nhiều ống nối, bình chứa thường thiết kế gồm hai bình có cùng thể tích Áp suất vượt mức được đưa qua những van solenoid hay một máy nén khí nối với công tắt đã được lập trình Điều này cho phép chúng ta xác định được thời gian và thời điểm ngập nước vào ngăn chứa cây Do những hệ thống này không có bình chứa môi trường mới nên môi trường nuôi cấy phải được thay mới sau 4 – 6 tuần Tuy nhiên việc thay đổi này rất nhanh và không cần thiết phải di chuyển mẫu cấy Các biến thể khác nhau của hệ thống này đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ thống RITA® (the Recipient for Automated Temporary Immersion system), hệ thống bình đôi (BIT®) và hệ thống Plantima

Hệ thống RITA® (hình 3) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa dung tích

1 lít có hai ngăn, ngăn trên chứa mẫu cấy và ngăn dưới chứa môi trường Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng ở ngăn dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian

áp suất vượt mức được duy trì Trong thời gian mẫu ngập trong môi trường lỏng, không khí được sục vào trong môi trường lỏng dưới dạng những bọt khí góp phần làm xoay trở nhẹ mẫu cấy và làm mới không gian bên trong bình nuôi cây, áp suất vượt mức sẽ đẩy

Hình 3: Hệ thống RITA®, Pha 1: mô không ngập trong môi trường, Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy, Pha 3: sự trao đổi khí trong

hệ thống RITA®, Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới

Hệ thống bình đôi BIT® do Escalona và cộng sự (1998) thiết kế chủ yếu phục vụ cho việc nhân sinh khối cơ quan do có thể tích bình chứa lớn hơn và có giá thành thấp hơn Cách dễ dàng nhất để vận hành hệ thống nuôi cấy ngập chìm sử dụng áp lực khí là nối hai bình thủy tinh có dung tích từ 250 ml - 10 L bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại Akita

và Takayama (1994) đã đưa ra một hệ thống tương tự gọi là hệ thống nuôi cấy điều khiển mực chất lỏng bán liên tục để nuôi cấy tạo củ Khoai Tây bi Hệ thống này có sự thoáng khí bắt buộc bên trong ngăn chứa mẫu cấy, chi tiết này không tìm thấy được trên hệ thống BIT®

Hình 5A: Các thành phần của bình Plantima, Đài Loan.

Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và

vị trí các filter Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi công ty Atech, Đài Loan

1.1.3.3 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống

Khi dự định sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong thương mại, điều quan trọng là phải hiểu rõ các đặc điểm về sinh trưởng, quá trình nuôi cấy và chất lượng của mẫu cấy và so sánh giữa chúng với những mẫu được nuôi cấy trong hệ thống thông thường

+ Trong sự nhân nhanh chồi và các đoạn microcutting

Sự ngập chìm tạm thời kích thích sự sinh chồi Aitken – Christie và Jones (1987) chứng minh rằng khi nuôi cấy trong điều kiện có sự ngập đầy môi trường lỏng chồi cây

Pinus radiata sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với trên môi trường bán rắn Hệ thống

này cho phép sự sinh trưởng liên tục của chồi mà không cần phải cấy chuyền mẫu cấy Chồi thu được khi nuôi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao hơn và có chất lượng tốt hơn so với những chồi thu được trên môi trường bán rắn Một chứng minh đầy đủ và thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia

tăng số lượng chồi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chuối (Musa, phụ nhóm AAH) Alvard

và cộng sự (1993) chứng minh rằng sử dụng môi trường lỏng tác động mạnh mẽ vào sự phát triển và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân giống Chuối Sự sinh trưởng của mẫu cấy theo 4 phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng khác nhau được so sánh với cách

vi nhân giống thông thường trên môi trường thạch, sau 20 ngày nuôi cấy có kết quả như sau:

Hình 5B: Hệ thống Plantima, a: Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ

ngập; b: Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima

• Chồi Chuối trong môi trường nuôi cấy lỏng đơn giản hay trên giá thể bằng cellulose có sự nhân chồi bình thường hay không có gì khác biệt

• Chồi trên môi trường bàn rắn có sự ngập một phần và trong môi trường lỏng

Chồi cây Amelanchier x grandiflora Rehd ‘Princess Diana’ được nuôi cấy trên hệ

thống ngập chìm tạm thời được mô tả bởi Simonton và cộng sự năm 1991 và so sánh với chồi nuôi cấy trên môi trường bán rắn hay trong môi trường lỏng của bình trụ tròn nhỏ và trên môi trường bán rắn và môi trường nuôi cấy lỏng không tuần hoàn trong bình nuôi cấy

7 L (Krueger và cộng sự, 1991) Thí nghiệm sử dụng môi trường lỏng trong bình nuôi cấy

7 L có sự tiếp xúc với môi trường lỏng theo chu kỳ cho hệ số nhân chồi là cao nhất so với các nghiệm thức khác So sánh với quy trình thông thường nuôi cấy trên môi trường bán rắn trong những bình trụ tròn nhỏ), những mẫu cấy trong môi trường có sự tiếp xúc với môi trường lỏng theo chu kỳ có hệ số nhân chồi gấp 2,6 lần, trọng lượng chồi gấp 2,1 lần, chiều cao chồi gấp 1,2 lần

Trên đối tượng cây mía Saccharum spp Lorenzo và cộng sự (1998) đã chứng minh

rằng hệ thống nuôi cấy ngập chìm dạng bình đôi đã đẩy mạnh một cách rõ rệt sự hình thành chồi và kéo dài chồi Hệ số nhân (23,9 chồi trong 30 ngày) gấp 6 lần so với quy trình thông thường (3,96 chồi trong 30 ngày; Jimenez và cộng sự, 1995) Kết quả tương tự cũng đã thu được trên ba giống Chuối khác nhau Tương tự như vậy Escalona và cộng sự

(1999) đã sử dụng hệ thống trên để nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus,

trọng lượng tươi và trọng lượng khô sau 42 ngày nuôi cấy Hệ số nhân đã được gia tăng khoảng 300% so với nuôi cấy lỏng và 400% so với nuôi cấy trên môi trường rắn Có gần

5000 cây Dứa thu được từ một hệ thống như vậy

Đỉnh sinh trưởng của Potinera sp (một loài Lan), và Mitragyna inermis (Cow tree)

được nuôi trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời APCS (Tisserat và Vandercook, 1985) phát triển nhanh hơn trên môi trường rắn Dựa trên việc tính trọng lượng tươi và thể tích, cho thấy các chỉ số này được gia tăng bốn lần sau 270 ngày nuôi cấy đối với loài Lan

trên và 1,8 lần sau 45 ngày đối với cây Mitragyna inermsi Thí nghiệm tương tự được tiến hành trên đối tượng Callistephus hortensis, một loài hoa Cúc, chồi của cây này không cho thấy sự khác biệt rõ ràng nào về sự sinh trưởng và phát triển trong điều kiện in vitro,

nhưng khi ra ngoài vườn ươm, những chồi có nguồn gốc từ nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời sinh trưởng và phát triển mạnh hơn so với những cây trong hệ thống thông thường

Đối với cây Cà Phê (Coffea arabica và C canephora), nhân giống bằng các

microcutting trên môi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi Hệ số nhân xấp xỉ 6 – 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự, 1989) Khi sử dụng hệ thống RITA®

hệ số nhân tương tự có thể được đạt tới chỉ trong vòng 5 – 6 tuần (Berthouly và cộng sự, 1995) Ngoài ra sự gia tăng số lượng chồi cũng ghi nhận trên nhiều đối tượng khác như

Nho Vitis vinifera L (Harris và Stevenson, 1982; Harris và Mason, 1983), cây

Arctostaphylos uva ursi (L), Amelanchier alnifolia Nutt, cây Thuốc Lá Nicotiana tabacum ‘Xanthi-nc’ và cây Fuchsia (Fuchsia hydrida ‘Swingtime’) (Stevenson và

Harris, 1980)

+ Trong sự tạo củ bi in vitro

Sự sinh trưởng và sự hình thành củ Khoai tây Solanum tuberosum L được đẩy

mạnh bởi tình trạng ngập chìm tạm thời trong hệ thống bình đôi (Akita và Takayama, 1994) Số củ bi hình thành xấp xỉ 500 – 960 củ sau 10 tuần nuôi cấy nhiều hơn những kết quả trong các công trình trước đó (chỉ khoảng 220 củ trong một lần nuôi cấy (Akita và Takayama, 1993) Trọng lượng tổng số và tính đồng nhất của củ cũng được gia tăng

Ngược lại trong điều kiện nuôi cấy ngập liên tục, không có bất cứ sự hình thành củ nào Teisson và Alvard (1999) đã kiểm chứng lại hiệu quả của nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên

sự tạo củ Khoai tây bằng cách tiến hành thí nghiệm trên hệ thống RITA® đôi dựa trên nguyên tắc hệ thống bình đôi Ba củ bi được hình thành trên một đốt trong 10 tuần nuôi cấy Năm mươi phần trăm củ có trọng lượng lớn hơn 0,5 g Hệ thống này rất có hiệu quả

và nhanh chóng do có từ 3 đến 4 chồi nảy lên từ một củ Một số kết quả tương tự cũng thu được trên 3 giống Khoai tây khác (Teisson và Alvard, 1999)

+ Trong sự phát sinh phôi

- Gia tăng sự phát sinh phôi

Các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được chứng minh thành công hơn trong nuôi cấy phát sinh phôi khi được so sánh với các hệ thống thông thường sử dụng môi trường rắn hay nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Tisserat và Vandercook

(1985) thống kê sự sinh trưởng của phôi cây Cà-rốt và cây Chà Là (Phoenix dactylifera)

trong hệ thống APCS trong đó thời gian ngập chìm là 5 – 10 phút sau mỗi 2 giờ So sánh với những cây nuôi cấy trên môi trường rắn, sự sinh trưởng gấp 1,9 lần trong trường hợp cây Cà-rốt, và 4 lần đối với cây Chà Là trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Thêm vào đó chất lượng cũng như số lượng của phôi soma và cây con Cà-rốt được nâng lên Tương tự một số giống Cà Phê cũng được thử nghiệm, sự phát sinh phôi trong hệ thống ngập chìm tạm thời hiệu quả hơn trong nuôi cấy lỏng lắc (Berthouly và cộng sự, 1995)

- Sự phát triển phôi

Quy trình nhân và chất lượng của phôi soma trên nhiều đối tượng khác nhau đã

được cải tiến bằng nuôi cấy ngập chìm tạm thời Đối với cây Citrus deliciosa, Cabasson

và cộng sự (1997) so sánh hiệu quả của những hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự phát triển của phôi soma Phôi soma lấy từ nuôi cấy huyền phù được chuyển sang môi trường bán rắn, sau đó cấy trở lại trong hệ thống nuôi cấy huyền phù hay nuôi cấy ngập chìm tạm

mầm nhưng chúng đều bị thủy tinh thể Khi nuôi cấy tiếp trong hệ thống nuôi cấy huyền phù với tốc độ khuấy 100 vòng/phút, điều này đã cản trở sự hình thành lá mầm và tiền biểu bì và phôi soma không thể phát triển vượt quá giai đoạn phôi hình cầu Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA® có khả năng đẩy mạnh sự phát triển của phôi soma, trong đó 66% phôi soma hình thành lá mầm và có hình thái tương tự như phôi Escalant

và cộng sự (1994) tiến hành thí nghiệm trên một số loài Chuối trong hệ thống RITA® sau

2 tháng, số lượng phôi soma được hình thành nhiều gấp 3 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch (1375 so với 450 phôi) Nuôi cấy ngập chìm tạm thời gia tăng sự phát sinh phôi thứ cấp từ tế bào biểu bì của phôi sơ cấp Sau 6 tháng từ số lượng ban đầu phôi soma nuôi cấy trong bioreactor thể tích 1 L đã tăng lên 40 lần xấp sỉ khoảng 6000 phôi Ngược lại,sau hai tháng nuôi cấy trên môi trường thạch các phôi chuyển sang dạng callus đặc màu trắng Tỷ lệ chuyển đổi theo cách này cao tới 60 – 70% khi phôi soma có nguồn gốc

từ nuôi cấy ngập chìm tạm thời được chuyển sang môi trường nuôi cấy bán rắn

Đối với cây Cao Su Hevea brasiliensis sự hình thành phôi soma trên môi trường

cho kết quả rất thấp và số lượng cũng như chất lượng phôi soma không đáng kể (Etienne

và cộng sự, 1997b) Sự tạo phôi soma trong nuôi cấy ngập chìm tạm thời gấp đến 4 lần so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn với hơn 400 phôi/g trọng lượng tươi của mẫu nuôi cấy phát sinh phôi Nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng giúp giảm số lượng phôi bị bất thường còn phân nửa cũng như giúp gia tăng tỷ lệ phôi phát triển lên tiếp Hệ thống này

có thể giúp tỷ lệ nảy mầm của phôi lên tới trên 60%, tỷ lệ hình thành trụ trên lá mầm là 35% Theo Teisson và cộng sự (1999) gần 150 phôi soma cây Cao Su ở giai đoạn có lá mầm đã thu được trong một hệ thống RITA® từ tuần thứ tư đến tuần thứ tám sau khi bắt đầu chuyển giai đoạn phát sinh phôi vào trong hệ thống này Tuy nhiên để tái sinh thành cây hoàn chỉnh, những phôi nảy mầm cần được chuyển vào trong môi trường bán rắn do khi cây phát triển thành phần ngọn và phần gốc, đòi hỏi phải đặt cây con luôn đứng thẳng hướng lên trên cùng hướng phát triển của cây Trong hệ thống RITA® không thể đạt được yêu cầu trên vì cây luôn di chuyển mỗi khi môi trường dâng lên ngập theo chu kỳ

Đối với cây Cà Phê, ở loài C canephora sự tạo phôi soma với số lượng lớn có thể

được thực hiện trong các bình tam giác hay các bioreactor, trong đó có thể đạt tới một vài ngàn phôi soma trong một gram dung dịch huyền phù (Berthouly và Etienne, 1999) Cây

Cà Phê C arabica là một loài khó hơn Để phổ biến trên quy mô lớn loài lai F1 của cây

Cà Phê này ở Trung Mỹ, quy trình nhân giống đã thành công với xấp xỉ 20 dòng bằng cách sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA® (Etienne và cộng sự, 1997a) Tùy theo mỗi giống, có thể thu được từ 15000 – 50000 phôi soma trong một gram dung dịch huyền phù tế bào, số lượng phôi soma hình thành khi sử dụng có thể gấp đôi số phôi thu được khi nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác Chất lượng của phôi soma được hình thành trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời rất cao Trong khi tỷ lệ phôi bình thường hình thủy lôi vào khoảng 30% khi nuôi cấy trong bình tam giác hay hệ thống bioreactor (Zamarripa và cộng sự, 1991; Noriega và Sondahl, 1993), tỷ lệ trên trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là trên 90% Điều này dẫn đến tỷ lệ hình thành cây hoàn chỉnh sau khi chuyển lên môi trường bán rắn là rất cao 80 – 90% và đặc biệt là có

thể tái sinh cây thành công bằng cách gieo trực tiếp phôi ra ngoài điều kiện ex vitro

(Etienne-Barry và cộng sự, 1999)

- Sự tạo phôi đồng loạt

Trên các cây thuộc họ cam chanh, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng đã cải thiện tính đồng bộ trong quá trình phát sinh phôi nhờ khả năng ức chế sự phát sinh phôi thứ cấp (Cabasson và cộng sự, 1997) Hệ thống này cũng cải thiện sự đồng bộ trong

suốt quá trình phát triển và nảy mầm phôi Cao Su và cây Cà Phê Arabica so với quá trình

này trên môi trường bán rắn (Etienne và cộng sự, 1997b; Etienne-Barry và cộng sự,

1999) Trên cây Cà Phê Arabica sự đồng bộ hoá quá trình phát triển và nảy mầm của phôi

được cải thiện bằng cách nuôi cấy phôi với mật độ cao (1500 – 3000 phôi trong hệ thống một lít, nhờ đó 66% phôi soma phát triển đồng bộ trong giai đoạn nảy mầm Trên đối

tượng cây Chuối Musa spp (Escalant và cộng sự, 1994), không như những cây thuộc họ

cam chanh, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời giúp đẩy mạnh quá trình tạo phôi soma

1.1.3.4 Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion system)

Thời gian ngập và số lần ngập chìm là những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy cũng như toàn bộ quy trình vi nhân giống Khi những chỉ số này được tối ưu hóa, sản lượng sẽ được gia tăng, quá trình kiểm soát sự phát sinh hình thái tốt hơn và còn có khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thể Đây là ưu điểm lớn nhất của hệ thống TIS so với hệ thống bioreactor thông thường

Không kể đến khả năng ứng dụng trong vi nhân giống cây trồng, hệ thống ngập chìm tạm thời cho thấy là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu những quá trình biến dưỡng khác nhau của thực vật Ví dụ như có thể sử dụng hệ thống này làm mô hình mẫu

để nghiên cứu hiện tượng thủy tinh thể Theo những nghiên cứu hiện nay, thời gian ngập tác động một cách trực tiếp lên hiện tượng thủy tinh thể và trạng thái của nước trong callus và phôi soma của cây Cà Phê Một cách chính xác hơn, một số thông số về nước như hàm lượng nước và thế nước có sự tương đồng với hiện tượng thủy tinh thể và chúng

bị tác động trực tiếp bởi thời gian ngập và số lần ngập Đối với cây Cao Su, hệ thống TIS cho phép nghiên cứu được sự cảm ứng stress oxy hóa trên giai đoạn nuôi cấy phát sinh phôi trong suốt thời gian ngập (Martre và cộng sự, 2001)

Một số nghiên cứu đã chú trọng đến việc tối ưu hóa sự làm khô phôi soma trưởng thành để hướng tới nâng cao hiệu quả tái sinh cây cũng như xác định điều kiện bảo quản trong một thời gian không trong bình Hệ thống RITA® được thiết kế rất tốt để đạt được

sự làm khô từ từ mẫu cấy Độ ẩm tương đối của phần trên nơi mẫu cấy được nuôi có thể được điều khiển bởi dung dịch khoáng bảo hòa được chứa trong phần dưới Những tác động tích cực lên sự phân cực của phôi và tái sinh cây được quan sát thấy trên đối tượng phôi soma cây Cà Phê arabica và cây Cao Su bị làm khô đi dưới điều kiện ngập chìm tạm thời Và rất nhiều hệ thống TIS cũng thích hợp được sử dụng trong nghiên cứu môi trường khí bên trong hệ thống nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy

Từ sau những hệ thống được thiết kế bởi Harris và Mason (1983), một số hệ thống TIS bán tự động đã được thiết kế và những nghiên cứu quan tâm đến kỹ thuật này ngày càng gia tăng Từ một hệ thống Bioreactor phức tạp, những hệ thống TIS dần dần đã được đơn giản hóa và có khả năng sánh với những bình nuôi cấy in vitro phổ biến Những hệ thống đơn giản với giá thành rẻ đang được nghiên cứu và phát triển hiện nay rất thích hợp cho việc sản xuất trên quy mô lớn Những quá trình nhân nhanh phôi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo củ bi có khả năng được tối ưu hoá trên nhiều đối tượng cây trồng từ đó giảm được chi phí sản xuất một cách đáng kể

b Khuyết điểm

Mật độ nuôi cấy là một yếu tố không kém phần quan trọng nhưng hiện nay vẫn chưa được khảo sát một cách sâu rộng Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới, cuối cùng là phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy

Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để có thể tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong những hệ thống này

Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy của mẫu cấy vẫn chưa được đánh giá chính xác

Trong điều kiện nước ta hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy TIS tương đối cao do phải nhập hệ thống này từ nước ngoài như Đài Loan, Pháp, Cuba; do đó

kế ngay trong nước để giảm giá thành Ngoài ra, những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì chúng ta mới có khả năng áp dụng hệ thống TIS rộng rãi trong sản xuất cây giống

1.2 Giới thiệu về Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis)

Lan Hồ Điệp được tìm thấy vào năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius xác định

dưới tên là Angraecum album Đến năm 1753, Linné đổi lại là Epidendrum amabile Vào

năm 1825, khi Blume (nhà Thực vật học người Hà Lan) tìm thấy một loài Lan Hồ Điệp đặc biệt có hoa giống cánh bướm, màu trắng, ông đã định danh một lần nữa là

Phalaenopsis amabilis Tên Phalaenopsis được dùng cho đến ngày nay (Dương Công

Kiên, 2006)

Giống Phalaenopsis được tìm thấy ở vùng châu Á nhiệt đới, cụ thể là ở phía Nam Trung Quốc, Indônêxia, Ấn Độ, Đông nam Châu Á và Úc Năm 1980 Sweet phân loại 46 loài lan Hồ Điệp thành 5 section khác nhau dựa trên các đặc điểm hình thái Sau đó 2 thập niên, Christenson (2001) đã dựa trên mối quan hệ lai tạo, kết hợp với các đặc tính cấu trúc khác để chia 66 loài Hồ Điệp thành 5 giống phụ gồm: Proboscidioides, Aphyllae,

Parishianae, Polychilos, Phalaenopsis Các giống Kingidium spp, Doritis spp được chính

thức xếp vào 2 section trong nhóm Phalaenopsis là Esmeralda (Doritis) và Deliciosae (Kingidium)

Từ lâu Hồ Điệp đã được lai tạo và nhân giống, tạo ra vô số các loài Hồ Điệp lai có màu sắc, hình dáng, kích thước vô cùng phong phú so với những giống Lan rừng ban đầu Các giống lai mới hình thành góp phần tăng thêm tính đa dạng và huyền bí của thế giới hoa Lan

b Lá

Lá dày, mọng nước, có bẹ ôm lấy thân Hình dạng lá đơn giản (elip thuôn dài hoặc hình lưỡi mác) với màu xanh đơn thuần hoặc tạp sắc Thông thường một cây có từ 4-5 lá hoạt động Mỗi trục lá có hai chồi xếp chồng, chồi bên trên cho ra một trục phát hoa sau khi cảm ứng ra hoa, chồi bên dưới cho ra một cây con trong trường hợp có sự cố về hoạt động của đỉnh sinh trưởng ngọn

c Rễ

Rễ bất định, khí sinh, mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ lá Xung quanh rễ có một màng xốp bao bọc Lớp mô xốp này dễ dàng hút nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng cho cây, đồng thời đóng vai trò đặc biệt trong việc giữ nước cũng như ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt Trong lớp xốp này có thể phân lập được nấm và nhiều loài vi khuẩn lam cộng sinh (Tsavkelova,2003) Số lượng rễ khá nhiều, rễ to và hơi dẹp tạo thành một vành đai để tăng diện tích tiếp xúc với ánh sáng

1.2.2.2 Cơ quan sinh sản

a Hoa

Phát hoa hình thành ở nách lá (thường là một phát hoa), có dạng thẳng hay thòng, đôi khi phân nhánh Cả cành hoa nở liên tiếp hơn nửa năm Trung bình một phát hoa cho

7 - 15 hoa Mỗi hoa bền khoảng hai tháng

b Quả

Quả Lan thuộc dạng quả nang, bên trong chứa vô số các hạt nhỏ li ti Hạt Lan được gió mang đến những khoảng cách khá xa như những hạt bụi nhỏ Phần lớn hạt chết vì khó gặp nấm cộng sinh cần thiết cho sự nảy mầm Trong tự nhiên, hạt chỉ nảy mầm khi có sự cộng sinh của nấm Rhizoctonia

1.2.3 Điều kiện sinh trưởng

1.2.3.1 Nhiệt độ và ẩm độ

Hồ Điệp là một trong nhưng loài Lan của vùng nhiệt đới, chịu sự ảnh hưởng của 2 mùa nắng mưa rõ rệt, nó chỉ xuất hiện ở các vùng rừng ẩm hoặc ven suối Không có sự biến động đáng kể về ẩm độ giữa mùa mưa và mùa khô nơi Hồ Điệp sinh sống Nhiệt độ tối thiểu lý tưởng từ 220C - 250C vào ban ngày và 180C vào ban đêm

1.2.3.2 Ánh sáng

Lan Hồ Điệp có biên độ khá rộng về ánh sáng, thích hợp nhất là 30%, vì thế với dàn che có độ che sáng 70% là thích hợp Đây là loài Lan duy nhất chịu được ánh sáng yếu, tuy nhiên không nên đặt Lan Hồ Điệp vào chỗ quá râm mát Ánh sáng rất cần thiết cho sự tăng trưởng và trổ hoa Cây Hồ Điệp ít khi chết vì nắng, trừ trường hợp để ngoài nắng trực tiếp suốt quang kỳ 12 giờ chiếu sáng, cây sẽ bị những vết bỏng do cháy lá và đây là cửa ngõ cho sự xâm nhập của nấm bệnh và virus Tốt nhất là tạo cho Hồ Điệp một ánh sáng gần như khuếch tán Các loại tôn nhựa hoặc vải lưới nylon thưa 1 mm được dùng với mục đích này với 10 - 12 giờ chiếu sáng

Ở Việt Nam, nếu cây Lan Hồ Điệp được trồng với 12 giờ chiếu sáng trong ngày, trong đó khoảng 1 - 2 giờ cây nhận được ánh sáng trực tiếp, cây sẽ phát triển tốt

1.2.3.3 Tưới nước

Là loài đơn thân, không có giả hành nên Lan Hồ Điệp không dự trữ nước, hơn nữa diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn Vì thế phải cung cấp cho chúng một lượng nước đầy

đủ và thường xuyên trong suốt năm nhưng không nên đẫm nước Vào mùa nắng nên tưới

3 lần/ngày Trong mùa mưa mỗi ngày tưới 2 lần (trừ những ngày có mưa), một lần vào 9 giờ sáng và một lần vào 3 giờ chiều Tưới như vậy sẽ đảm bảo cây khô ráo khi trời tối vì đọng nước ở nách lá suốt đêm có thể gây ra sự thối lá

1.2.3.4 Bón phân

Hồ Điệp cần được bón phân theo định kỳ 1 tuần/lần hay 2 tuần/lần trong suốt cả năm Tùy từng độ tuổi của cây mà ta có lượng phân cần bón, tỉ lệ NPK thích hợp Ngoài việc dùng phân vô cơ, ta còn có thể tưới xen kẽ thêm phân hữu cơ với nồng độ loãng có pha thêm thuốc trừ nấm

1.2.3.5 Sự thông gió

Sự thông gió ở Lan Hồ Điệp là tối cần thiết, đây là yếu tố có liên quan đến các bệnh thối lá thường gặp, sự thông gió càng lớn cây càng ít bệnh Tuy nhiên, sự thông gió quá mạnh dễ làm cho cây mất nước và chùn lá (Nguyễn Thiện Tịch và cộng sự, 2003)

Rotor (1949) là người đầu tiên tiến hành nuôi cấy các chồi ngủ trên trục phát hoa của Lan Hồ Ðiệp Về sau phương pháp này được hoàn chỉnh thêm và được xem là bước khởi đầu cho vi nhân giống các loài Lan Các chồi bên của phát hoa biểu hiện 3 kiểu tăng trưởng: vẫn ở trạng thái ngủ, phát triển thành chồi dinh dưỡng, phát triển thành phát hoa thứ cấp

Nhân giống Hồ Điệp qua phương pháp tạo chồi bằng nuôi cấy chồi ngủ trên phát hoa

Phương pháp này được Intuwong và cộng sự, 1972 cải tiến dựa trên phương pháp

mà Rotor đã sử dụng, và các chồi ngủ được nuôi trên môi trường Vaccin-Went cải tiến

Ưu điểm chính của phương pháp này là không gây hại cây mẹ Tuy nhiên phương pháp này cho hệ số nhân rất hạn chế do không có sự hình thành callus Do đó việc tiếp tục cải tiến quy trình và hệ số nhân là một việc làm cần thiết

Nhân giống Hồ Điệp bằng cách gây vết thương trên chồi ngủ của phát hoa

Một số chồi trên phát hoa của Hồ Điệp không phát triển thành chồi nhưng lại hình thành 1 khối callus (Tse và cộng sự, 1971; Hackett và cộng sự, 1973) Chồi bất định hình thành trên bề mặt callus và phát triển thành chồi 12 chồi con có thể hình thành trong 6

tháng trên 1 đốt Điều này đã mở ra hướng mới trong việc cải thiện hệ số nhân giống in

vitro Hồ Điệp qua phương pháp cảm ứng callus Việc bổ sung NAA vào môi trường

Knudson C không thích hợp cho việc hình thành callus, trong khi đó khi bổ sung NAA vào môi trường MS cho thấy có ảnh hưởng tốt lên sự hình thành callus và tái sinh chồi

Nhân giống Lan Hồ Điệp quy mô lớn qua nuôi cấy mô lá của chồi in vitro tái sinh từ

chồi ngủ trên phát hoa

Nhiều nghiên cứu về việc nhân giống vô tính Lan Hồ Điệp qua mô lá đã được thực hiện bởi M Tanaka và cộng sự tại Đại Học Osaka, Nhật Bản (Tanaka et al., 1974; Tanaka

và Sakanishi, 1977, 1980, 1985) Những thí nghiệm bước đầu được tiến hành bằng cách

sử dụng lá mới ra của cây trưởng thành và mẫu lá từ những cây phát triển từ hạt Lá của

cây trưởng thành không có sự hình thành của PLB trong khi đó mẫu lá của những cây in

vitro còn rất non phát triển từ hạt có sự hình thành PLB Khả năng hình thành PLB sẽ

giảm đi khi tuổi của cây cho mẫu lá tăng lên Phương pháp được nêu ngắn gọn ở đây

được phát triển dựa trên mẫu lá có nguồn gốc từ chồi in vitro phát triển từ chồi ngủ trên

phát hoa (Tanaka và Sakanishi, 1977, 1980)

Cắt phát hoa ra thành từng đốt chứa chồi ngủ Các đốt này được xử lý với dung dịch calcium hypochlorite 7% có chứa 0,1% chất giữ ẩm Tween-20 Tiếp theo rửa chúng ba lần bằng nước vô trùng và cắt bỏ phần lá bắc bao bên ngoài chồi ngủ Sau đó những đốt này lại được cắt lần nữa sao cho chiều dài mẫu chỉ còn khoảng 1 – 2 cm, cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường Vacin-Went cải tiến có bổ sung 2,5 ppm BAP Các mẫu lá lấy từ chồi tái sinh từ chồi ngủ được nuôi cấy trên môi trường MS cải tiến để tạo PLBs Sau đó PLBs được nhân nhanh trong môi trường Vacin-Went lỏng có chứa 20% nước dừa (Tanaka và Sakanishi, 1978)

Nhân giống Hồ Điệp bằng phương pháp tạo PLB trực tiếp từ chồi ngủ trên phát hoa

Phương pháp tạo PLBs từ các đoạn cắt đốt phát hoa của Hồ điệp cũng cho kết quả tốt như phương pháp dùng các phần cắt từ lá Hai phương pháp trên đã được công bố trong các nghiên cứu bởi Haas-Von Schmude (1983, 1985)

Đặt các đốt chứa chồi ngủ vào môi trường lỏng MS cải tiến và lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong nhiều tuần Các đốt chứa chồi ngủ còn lại được nuôi cấy trên môi trường tương tự nhưng là môi trường rắn Chồi ngủ trong môi trường nuôi cấy lỏng sẽ phát triển thành PLB trong khi trên môi trường rắn sẽ tạo ra các chồi mới

Cắt lấy mẫu lá từ các chồi mới tái sinh, nuôi cấy các mẫu lá một lần nữa trên cùng môi trường PLBs sẽ xuất hiện dọc theo các cạnh rìa, trên đỉnh của mẫu lá Các PLBs này tiếp tục được cắt và nuôi cấy lắc trong môi trường lỏng MS cải tiến như mô tả ở trên Sau khi PLBs phát triển trong môi trường lỏng, chúng được chuyển sang môi trường rắn để tái sinh thành cây PLBs không có chrorophyll trong tối nhưng chuyển sang màu xanh và phát triển bình thường khi được chiếu sáng Với phương pháp này có thể sản xuất hơn

30000 cây con từ một phát hoa của Hồ điệp Babette “Symphony” trong vòng 3 năm

Nhân giống Hồ Điệp số lượng lớn bằng nuôi cấy phần lóng của phát hoa

Có rất nhiều quy trình trong nhân nhanh Hồ điệp trong những năm gần đây, trong

đó, chồi ngủ lấy từ phần đốt phát hoa thường được dùng làm nguồn nguyên liệu (Fu, 1979a; Kushnir và Budak, 1980; Yoneda và cộng sự, 1983)

Theo một hướng khác, nhân nhanh Hồ Điệp bằng nuôi cấy các lát mỏng thu nhận

từ phần lóng giữa hai đốt của phát hoa đã được nghiên cứu bởi Lin (1986)

Một số nghiên cứu khác

Vào năm 2000, Young và cộng sự đã tiến hành khảo sát khả năng ứng dụng của môt

số hệ thống nuôi cấy Bioreactor trong việc nhân giống qui mô lớn cây Lan Hồ Điệp, trong

đó (PLBs) được hình thành trên mẫu cấy lá in vitro được dùng làm mẫu cấy trong hệ

thống nuôi cấy bioreactor Hệ thống nuôi cấy ngập liên tục (bioreactor hình cột và hình cầu) và hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời (có hay không màng lọc than) được sử dụng để nuôi cấy các mẫu PLBs Hệ thống nuôi cấy với màng lọc than cho thấy là hệ thống thích hợp nhất cho việc nuôi cấy PLBs Khoảng 18000 PLBs thu được từ 20 g mẫu PLBs nuôi

khoảng 0,5 hay 2 đơn vị thể tích khí trên đơn vị thể tích môi trường trong một phút đều thu được sản lượng sinh khối tương tự PLB có nguồn gốc từ nuôi cấy trong các bioreactor được chuyển sang môi trường rắn Murashige-Skoog, Vacin-Went, Knudson C, Lindemann và Hyponex Trong đó môi trường Hyponex là môi trường thích hợp cho việc tái sinh PLB thành cây con với 83% PLB tái sinh thành cây con trong môi trường

Sau đó Tokuhara và Masahiro (2001) đã công bố nghiên cứu về sự hình thành callus

và nuôi cấy huyền phù tế bào Hồ Điệp từ đỉnh sinh trưởng của chồi in vitro tái sinh từ

chồi ngủ trên phát hoa, kết quả của nghiên cứu này cho thấy 73% mẫu cấy đỉnh sinh trưởng của chồi Hồ Điệp nuôi cấy từ chồi ngủ trên phát hoa hình thành được callus phát sinh phôi sau 7 tháng nuôi cấy trên môi trường New Dogashima Medium (NDM) chứa 0,5 µM α-naphthaleneacetic acid (NAA), 4,4 µM 6-benzylaminopurine và 29,2 mM đường sucrose Nồng độ đường này được tăng lên tới 58,4 mM sau 4 tháng từ khi bắt đầu nuôi cấy Các callus được cấy chuyền thành công trong hệ thống nuôi cấy huyền phù trong môi trường NDM lỏng có bổ sung 5,4 µM NAA và 58,4 mM đường sucrose Bằng cách giảm lượng đường trong môi trường xuống còn 29, 2 mM những tế bào có thể tái sinh thành cây qua một quá trình phát trình như các cây Hồ Điệp tái sinh từ hạt Tỷ lệ biến

dị soma của 6 trong 8 giống Hồ Điệp thí nghiệm nhỏ hơn 10% Kết quả này cho thấy có khả năng ứng dụng nuôi cấy callus phát sinh phôi và hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào như là một công cụ và nguồn nguyên liệu trong việc vi nhân giống Lan Hồ Điệp

1.2.5 Thị trường tiêu thụ

Nói về hoa Lan thì khu vực Đông Nam Á ngày nay phát triển rất mạnh Thái Lan

là nước xuất khẩu hoa Lan nhiều nhất thế giới, giai đoạn 1990 - 1995 Thái Lan đã nâng sản lượng cành Lan xuất khẩu từ 15,5 triệu cành (1990) lên 26,5 triệu cành (1995), tăng 171% Tại Malaysia, chính phủ đã quy hoạch 300 ha ở bang Zohor và giao cho Hiệp hội Hoa Lan tổ chức thành khu “Trung Tâm sản xuất hoa kiểng xuất khẩu” Đài Loan là một trong những nước có nền công nghiệp hoa lan phát triển nhất trên thế giới Năm 2004 doanh thu từ hoa lan của Đài Loan đạt 72 triệu USD, chiếm 23% tổng giá trị sản lượng hoa cảnh cả nước, trong đó lan Hồ Điệp là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Đài Loan Sản

lượng Lan Hồ Điệp của Đài Loan hiện đã vượt hơn các nước sản xuất hoa lan khác như Thái Lan, Đức, Nhật, Mỹ, Netherlands Hiện nay chính phủ Đài Loan đã và đang tiến hành xây dựng và phát triển nền công nghiệp hoa cảnh cao cấp đặc biệt là lan Hồ Điệp thành hàng đầu thế giới, thay thế dần diện tích cây nông nghiệp giá trị thấp, tăng cường vốn đầu tư cho các khu công nghiệp Hồ Điệp, đặt mục tiêu sản xuất 250 triệu cây cung cấp cho thị trường thế giới (Griesbach,2002)

Hiện nay, Việt Nam vẫn phải nhập một lượng lớn cây giống và Lan cắt cành từ Thái Lan về để phục vụ nhu cầu trong nước

Ở thành phố, hoa Lan được trồng nhiều ở các quận ven như quận 12, Củ Chi, Bình Chánh,… sản phẩm chủ yếu được tiêu thụ tại thành phố, tuy nhiên thị phần cũng như sản lượng còn rất thấp chỉ chiếm 15%, nguồn hoa từ Lâm Đồng chiếm 35%, còn lại 50% là

từ Thái Lan và Đài Loan Trong đó, Lan Hồ Điệp hiện nay chủ yếu được nhập về từ Đài Loan, một phần nhỏ có nguồn gốc từ Lâm Đồng Trên địa bàn thành phố cũng có một số nơi sản xuất giống Hồ Điệp như vườn Lan An Phú, Quận 2, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, đại học Nông Lâm, tuy nhiên chỉ là sản xuất nhỏ chưa đáp ứng được yêu cầu về chất lượng cũng như giá cả thị trường

Vì thế hiện nay, việc nghiên cứu và nhân giống Hồ Điệp đã được tiến hành ở một

số nơi, nhưng hầu hết đều chưa có thành tựu nào đột biến để ngành nhân giống Lan Hồ Điệp có thể đáp ứng được nhu cầu của thị trường Những thành công hiện nay thường là nhân giống với qui mô sản xuất nhỏ và chỉ trên một vài giống nhất định Trong khi đó việc ứng dụng những kỹ thuật, phương pháp mới trong nhân giống Hồ Điệp trong nước còn rất yếu và hiện nay chỉ có một số cơ sở, trường Đại Học, Viện Nghiên cứu là có hướng phát triển những kỹ thuật mới như sử dụng kỹ thuật nuôi cấy quang tự dưỡng, bioreactor trong ngành vi nhân giống một số loài cây khác nhưng vẫn chưa có thành tựu mới nào trong việc nhân giống Hồ Điệp được công bố

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là một hệ thống không những tận dụng được các ưu điểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy trên thạch mà còn hạn chế được nhược điểm của hai hệ thống nuôi cấy trên giúp tạo ra môi trường nuôi cấy thoáng khí, cây con

ít môi trường trên một mẫu cấy và không sử dụng thạch, hệ số nhân được gia tăng nhiều lần so với khi nhân giống trên hệ thống nuôi cấy thông thường Những lý do nêu trên đã

là cơ sở ra đời của nghiên cứu “Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong

nhân giống cây Lan Hồ Điệp lai (Phalaenopsis hybrid)” nhằm mục đích khảo sát khả

năng ứng dụng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nâng cao số lượng cũng như chất lượng của cây giống Hồ Điệp khi so sánh với các hệ thống nuôi cấy thông thường để góp phần mở ra khả năng sản xuất với số lượng lớn cây giống có chất lượng tốt đáp ứng với nhu cầu thị trường tại Việt Nam

PHẦN 2

NỘI

DUNG NGHIÊN

CỨU

2.1 Nội dung 1: Thu thập mẫu thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để

Vật liệu: - Phát hoa của 5 giống lan Hồ Ðiệp được thu khi hoa đã nở hết trên cành

Chọn những phát hoa to khoẻ, cắt những đốt chứa mắt ngủ dài 4cm, tách bỏ vỏ bao quanh mắt ngủ (nhẹ nhàng, không làm tổn thương mắt ngủ) Tình trạng mắt ngủ phải còn trắng xanh hay hơi đỏ của màu phát hoa, loại bỏ những mắt ngủ bị hoá đen và bị trày sướt Tiến hành khử trùng mẫu chọn thời gian và nồng độ chất khử trùng thích hợp cho tỉ lệ mẫu sống và vô trùng cao nhất

Phương pháp:

-Tiến hành khử trùng: Lau nhẹ mắt ngủ bằng cồn 70o và cho vào erlen sạch Sau đó tiến hành lắc với xà phòng loãng trong 3 phút và rửa lại bằng nước cất để loại bỏ hết xà phòng, dùng giấy nhôm bịt kín miệng erlen và cho vào tủ cấy

Mẫu được khử trùng với cồn 70o trong 1 phút, sau đó được khử trùng với dung dịch javel có nồng độ khác nhau (trong 100ml dung dịch javel có bổ sung 2 giọt Tween 20, và lắc đều) Sau khi khử trùng được 25 phút tiến hành rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng (3 lần) để loại bỏ hết javel và Tween 20

-Tiến hành cấy mẫu: cắt bỏ những phần mẫu bị javel làm tổn thương (trắng) ở 2 đầu, sau đó cấy mẫu vào môi trường MS Mẫu nuôi cấy được đặt trong điều kiện: 25oC, 12 giờ chiếu sáng và ẩm độ là 80%

Mỗi nghiệm thức có 15 mắt ngủ, thí nghiệm được tiến hành lập lại 3 lần, quan sát và ghi nhận kết quả sau 2 tuần khử trùng