sử dụng kỹ thuật pcr -rflp để phát hiện đột biến kháng lamivudine và đột biến basal core promter của virus viêm gan b

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ --- BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU ĐỀ TÀI SỬ DỤNG KỸ THUẬT NE

PHIẾU ĐĂNG KÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KH-CN

Tên đề tài: SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B

Thời gian nghiên cứu:

Thời gian bắt đầu:

Thời gian kết thúc

12 Tháng 9/2006 9/2007

Tên cán bộ phối hợp nghiên cứu:

1 PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM

2 GS.BSCKII Phạm Hòang Phiệt – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM

3 ThS Nguyễn Chí Vinh – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM

4 CN Hoàng Ngọc Diễm Mi – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM

5 CN Hồ Thị Thanh Thủy – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM

Tĩm tắt kết quả nghiên cứu

1 Đã xây dựng Quy trình xác định đột biến basal core promoter bằng kỹ thuật Nested PCR - RFLP, khả năng phát hiện đột biến ở 30% (3x103 bản sao/ml)

2 Đã xây dựng Quy trình xác định đột biến kháng lamivudine rt180, rt204 bằng kỹ thuật Nested PCR – RFLP, khả năng phát hiện đột biến ở 10% (1x103 bản sao/ml), độ nhạy 6,25x102 bản

sao/ml Đã tạo được các dòng mang đột biến 180M-204V có tỉ lệ tương đồng về trình tự gene

96,3% và dòng 204I có tỉ lệ tương đồng 95,8% trên plasmid pGEM-T

3 Đã thử nghiệm 2 quy trình trên 127 mẫu huyết thanh bệnh nhân, đột biến basal core promoter

chiếm tỉ lệ 32% trên nhóm khảo sát, đột biến kháng lamivudine chiếm tỉ lệ 74,4% trên nhóm

khảo sát phổ biến ở 2 dạng 204I và 180M-204V Các kết quả xác định đột biến phù hợp với lâm

sàng

Kiến nghị về quy mơ và đối tượng áp dụng kết quả nghiên cứu:

1 Kiến nghị sử dụng quy trình để ứng dụng cho các bệnh nhân viêm gan B đang điều trị

lamivudine, trước tiên là các bệnh nhân của Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM

2 Kiến nghị chuyển giao kết quả nghiên cứu cho Công ty TNHH CNSH Khoa Thương để

tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn và phổ biến quy trình

3 Đề nghị mở rộng nghiên cứu về tình hình kháng lamivudine trong bệnh nhân viêm gan B

tại TPHCM hiện nay, có thể thực hiện các khảo sát theo thời gian điều trị (1, 2, 3 năm)

hoặc theo phân loại thuốc sử dụng (lamivudine, entecavir, telbivudine)

Chức vụ Chủ nhiệm đề tài Cơ quan

chủ trì đề tài

Chủ tịch Hội đồng Đánh giá chính thức

Cơ quan quản lý đề tài

Họ và tên Nguyễn Chí Vinh Nguyễn Cơng Tĩnh Nguyễn Văn Thanh Phan Minh Tân

Ký tên

Đĩng dấu

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

-

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU) ĐỀ TÀI

SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL

CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS NGUYỄN CHÍ VINH

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2008

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

-

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU)

ĐỀ TÀI

SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL

CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS NGUYỄN CHÍ VINH

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ

CỐ VẤN CHUYÊN MÔN:

1 PGS.TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG

2 GS.BSCKII PHẠM HOÀNG PHIỆT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2008

THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI:

09/2006 – 01/2008

ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI:

Khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM

Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM

THÀNH PHẦN THAM GIA:

ThS Nguyễn Chí Vinh: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y dược

CN Hoàng Ngọc Bảo Mi: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y dược

CN Dương Thị Thanh Hương: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y dược

CN Hồ Thị Thanh Thủy: Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên

CN Nguyễn Vũ Trung Kiên: Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên

CN Ngô Thị Thanh Tuyền: Trung tâm xét nghiệm Diag Center

CỐ VẤN CHUYÊN MÔN:

PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương – Bộ môn Di truyền

Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM GS.BSCKII Phạm Hoàng Phiệt – Khoa Xét nghiệm

Bệnh viện Đại học Y dược TP.HCM

Bảng ghi chú các chữ viết tắt:

Antiviral : Thuốc kháng virus

BCP : Basal core promoter

BET : Ethidium bromide

bp : base pair – cặp base

DNA : Deoxyribonucleic acid

dATP : 2’-deoxyadenosin- 5’- triphosphate

DW : Distilled water – nước cất vô trùng

EDTA : Ethyldiamin tetra-acetic acid

HBV : Hepatitis B Virus, Virus viêm gan B

OLT : Orthotopic liver transplant – ghép gan

PCR : Polymerase chain reaction

Phage : Thực khuẩn thể

Plasmid : Thể mang DNA mục tiêu – dùng trong kỹ thuật tạo dòng Primer : Mồi – dùng trong phản ứng PCR

RFLP : Restriction fragment length polymorphisms –

tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn rpm : rounds per minute – vòng trên phút

Sequencing : Giải trình tự nucleotide

Taq : Thermus aquaticus

YMDD : Tyrosine Methionine Aspartate Aspartate

Wt : Wild type – hoang dại

PHẦN 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

PHẦN 2:

NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP

PHẦN 3:

KẾT QUẢ – BÀN LUẬN

MỤC LỤC

TrangBảng ghi chú các chữ viết tắt

Mục lục

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Việt Nam thuộc vùng nhiễm và bệnh lý do HBV nặng, số lượng bệnh

nhân có chỉ định điều trị lớn

1

2 Chẩn đoán được đột biến Basal core promoter và đột biến kháng

lamivudine sẽ giúp ích cho việc theo dõi và điều trị bệnh viêm gan B

1

3 Nested PCR-RFLP là kỹ thuật đơn giản và tiện ích để xác định đột biến

Basal core promoter và đột biến kháng lamivudine

7

PHẦN 2: NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP

1 Tạo vật liệu cho quy trình

1.1 Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core

1.2 Tạo dòng lưu trữ các dạng cơ bản của đột biến kháng lamivudine,

từ đó tạo các sản phẩm PCR chứng dương

8

2 Thử nghiệm thay đổi một số yếu tố

2.1 Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay cho phương pháp

2.2 Nested PCR thay cho PCR 1 bước 10 2.3 Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới hạn 11 2.4 Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3% 12

3 Thử khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có hỗn hợp HBV đột

3.3 Độ nhạy của quy trình xác định đột biến kháng lamivudine 13

4 Thực hiện 2 quy trình đã được cải tiến trên huyết thanh bệnh nhân

4.1 Xác định đột biến Basal core promoter trên huyết thanh bệnh nhân 14 4.2 Xác định đột biến kháng lamivudine trên huyết thanh bệnh nhân 14

PHẦN 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

1 Kết quả về việc tạo vật liệu cho quy trình

1.1 Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core 15

promoter

1.2 Tạo dòng lưu trữ các dạng cơ bản của đột biến kháng lamivudine,

từ đó tạo các sản phẩm PCR chứng dương 15

2 Kết quả về việc thử nghiệm thay đổi một số yếu tố

2.1 Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay cho phương pháp

2.2 Nested PCR thay cho PCR 1 bước 23 2.3 Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới hạn 25 2.4 Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3% 26

3 Kết quả về việc thử khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có

hỗn hợp HBV đột biến/hoang dại

3.1 Khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh hỗn hợp

3.1.1 Khả năng phát hiện đột biến Basal core promoter trong huyết

3.1.2 Khả năng phát hiện đột biến kháng lamivudine trong huyết

3.2 Độ nhạy của quy trình xác định đột biến kháng lamivudine 35

4 Kết quả về việc thực hiện 2 quy trình đã được cải tiến trên huyết thanh

bệnh nhân

4.1 Xác định đột biến Basal core promoter trên huyết thanh bệnh nhân 37 4.2 Xác định đột biến kháng lamivudine trên huyết thanh bệnh nhân 40

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt:

1 Nguyễn Hữu Chí, Bệnh viêm gan siêu vi, trang 69-140, NXB ITAXA 1993

2 Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, 1997

3 Hồ Huỳnh Thùy Dương, Kỹ thuật Di truyền, Giáo trình sau đại học 2005

4 Đinh Dạ Lý Hương, Bùi Hữu Hoàng, Trần Thiện Tuấn Huy, Trần Ngọc Bảo, Viêm gan siêu vi B – từ cấu trúc siêu vi đến điều trị, NXB Đà Nẵng, 2000

5 Trương Thị Xuân Liên, Virus học, Bài giảng sau đại học 2005

6 Phạm Hoàng Phiệt, Diễn biến tự nhiên của nhiễm siêu vi viêm gan B mạn tính, Sinh hoạt thường kỳ lần II Hội gan mật TP HCM, 1999

7 Trương Bá Trung, Điều trị thêm Adefovir dipivoxyl trên bệnh nhân viêm gan B kháng lamivudine, Hội nghị Tiếp cận đa phương với bệnh viêm gan virus B/C, TP HCM 10/2006

8 Cao Văn Viên, Bệnh viện Việt Đức, Những điều cần biết khi bị nhiễm viêm gan B, vietduchospital.edu.vn

Tài liệu Tiếng Anh:

9 Allen MI, Two sensitive PCR-based methods for detection of Hepatitis B virus variants associated with reduced susceptibility to Lamivudine, Journal of Clinical microbiology, 1999, p 3338-3347

10 Chang TT, Lai CT, Four years of lamivudine treatment in Chinese patients with chronic hepatitis B, J Gastroenterol Hepatol 2004;19:1276-1282

11 Clavel F, Hance AJ, HIV drug resistance, N Engl J Med 2004; 350:1023-1035

12 Dan Yang H, PCR restriction fragment length polymorphism in detection of YMDD variants of viral polymerase in hepatitis B virus patients treated with lamivudine, 2002

13 Dary T., Michael Craig, Outcomes after HBV treatment failure due to resistance, Clinical Care Options 2006

14 Doo E., Liang TJ, Molecular anatomy and pathophysiologic implications of drug resistance in hepatitis B virus infection, Gastroenterology 2001;120:1000-

23 Jake Liang T, Michael Craig, Summary of mutations associated with resistance

to HBV drugs, Clinical Care Options, 7, 2006

24 Kakumu S., Prevalence of hepatitis B, hepatitis C and GB virus/ hepatitis G virus in liver disease patients and in habitants in Ho Chi Minh City, VietNam, J Med Virol 54, pp 243-248

25 Kenji Abe, Naoto Aiba, Complete nucleotide sequence of hepatitis B virus, 6/2003

26 Kenji Abe, Tran Thien Tuan Huy, Characteristics of core promoter and precore stop codon mutants of hepatitis B virus in Viet Nam, Journal of medical virology 2004,74:228-236

27 Kenji Abe, Traàn Thieän Tuaán Huy, Molecular epidemiology of Hepatitis B and

C virus infection in Asia, Pediatrics International, 2004

28 Lai CL, Dienstag J, Prevalence and clinical correlates YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B, Clin Infect Dis 2003;36:687-696

29 Lai CL, Leung N, A 1-year trial of telbivudine, lamivudine, and the combination in patients with Hepatitis B e antigen-positive chronic Hepatitis B, Gastroenterology 2005;129:528-536

30 Levine, 2002, Efficacies of entecavir against lamivudine-resistant Hepatitis B virus replication and recombinant polymerases in vitro, Antimicrobial agents and chemotherapy, Aug.2002, p.2525-2532

31 Liaw YF, Chien RN, Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy, Hepatology 1999,30:567-572

32 Locarnini S, Molecular virology and the development of resistant mutants: implications for therapy, Semin Liver Dis 2005(suppl 1):9-19

33 Locarnini S, Michael Craig, Assessing HBV virologic markers, Clinical Care Options 2006

34 Lok AS, Lai CL, Long-term safety of lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B, Gastroenterology 2003; 125:1714-1722

35 Maria H., Hepatitis B treatment – new directions for future therapy

36 Melegan M., hepatitis B virus mutants associated with 3TC and famciclovir administration are replication defective, Hepathology 27, pp628-633

37 Meyer PR, Matsuura SE, Differential removal of thymidine nucleotide analogues from blocked DNA chains by human immunodeficiency virus reverse transcriptase in the presence of physiological concentrations of 2’-deoxynucleoside triphosphates, Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:3465-3472

38 Naeger LK, Margot NA, Increased drug susceptibility of HIV-1 reverse transcriptase mutants: analysis of enzyme processivity, chain-terminator removal and viral replication, Antivirther 2001; 6:115-126

39 Paul Martin, Michael Craig, Natural history of hepatitis B virus infection, Clinical Care Options 2006

40 Perrillo R., Hepatitis B – Treatment strategies for current available drugs,

Current hepatitis reports, Volume 2, Number 2, 05/2003

41 Qi X, Ray AS, In vitro characterization of anti-HBV afficacy and intracellular metabolism of tenofovir, J Hepatol 2005; 42(suppl 2):A75

42 Robinson W.S., Hepatitis B virus and hepatitis D virus – principles and practice

of infectious diseases, 1995, 1406-1428

43 Schuurman R, Nijhuis M, Rapid changes in human immunodeficiency virus type 1 RNA load and appearance of drug resistance virus populations in persons treated with lamivudine (3TC), J Infect Dis 1995;171:1411-1419

44 Stephen Locarnini, Molecular virology and the development of resistant mutants: implications for therapy, Liver disease 25, 2005

45 Steven Han, UCLA Division of Digestive Diseases, Liver 411 Educational

articles, 2003

46 Sugauchi F., Epidemiologic and virologic characteristic of hepatitis B virus genotype B having the recombination with genotype C, Gastroenterology 2003, 124:925-932

47 Sugauchi F., Hepatitis B virus of genotype B with or without recombination with genotype C over the precore region plus the core gene, J Virol 2002, 76:5985-

51 Yuen MF, Sablon E, Factors associated with hepatitis B virus DNA breakthrough in patients receving prolonged lamivudine therapy, Hepatology 2001;34:785-791

52 Zarski 2004, Hepatitis B: Treatment strategies for current available drugs Josee Gauthier – Eric J Bourne, Quantitation of hepatitis B viremia and emergence of YMDD variants in patients with chronic hepatitis B treated with lamivudine, The journal of infectious disease 1999, 180:1757-62

53 World Health Organization Fact Sheet/204, Hepatitis B, 2000

53 Kenji Abe, Characteristic of HBV in Ghana: Full length genome sequences

indicate the endemecity of Genotype E in West Africa, Journal of Medical

Virology 78, 2006, 178-184

PHỤ LỤC:

Phụ lục 1: Kết quả định lượng HBV DNA so sánh

D10 Unknown 9T 9 14.98 7.335 2.26E+07 2.26E+07 N/A

E11Unknown 10B 20 15.54 7.171 1.48E+07 1.48E+07 N/A

Mẫu 1T đến 10T: Mẫu theo thứ tự 1 đến 10, tách chiết bằng phương pháp Tủa

Mẫu 1B đến 10B: Mẫu theo thứ tự 1 đến 10, tách chiết bằng phương pháp Boom

Phụ lục 2: Đối chiếu kết quả giải trình tự và kết quả PCR-RFLP phân tích đột

biến Basal core promoter

Kết quả PCR-RFLP

Kết luận

Hoang dại

T1762A1764Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại

T1762A1764

T1762A1764

Hoang dại

T1762A1764Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại Hoang dại

T1762A1764

T1762A1764

Phù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợp Phù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợp

Phụ lục 3: Một số kết quả đối chiếu giữa giải trình tự và PCR-RFLP

phân tích tại codon rt180

Kết quả PCR-RFLP

180 LỈM 180wt

Phù hợpPhù hợp

180 LỈM 180wt

180 LỈM

180 LỈM

180 LỈM 180wt

180 LỈM 180wt

180wt 180wt 180wt

180 LỈM 180wt

180 LỈM

180 LỈM

180 LỈM 180wt

180 LỈM 180wt

Phù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợp Phù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợp

Phụ lục 4: Một số kết quả đối chiếu giữa giải trình tự và PCR-RFLP

phân tích tại codon rt204

Kết quả PCR-RFLP

204wt

204 MỈV

204 MỈI 204wt

204 MỈV 204wt

204 MỈV

Phù hợpPhù hợpPhù hợp(thiếu V)Phù hợp(thiếu V)

Phù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợpPhù hợp

Phụ lục 5: Một trình tự bộ gen của HBV dùng để so sánh

AUTHORS Takahashi,K., Brotman,B., Usuda,S., Mishiro,S and Prince,A.M TITLE Full-genome sequence analyses of hepatitis B virus (HBV) strains recovered from chimpanzees infected in the wild: implications for

an origin of HBV JOURNAL Virology 267 (1), 58-64 (2000)

MEDLINE 20115968 REFERENCE 2 (bases 1 to 3182) AUTHORS Mishiro,S

TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (16-SEP-1999) Shunji Mishiro, Toshiba General Hospital, Department of Medical Sciences; 6-3-22 Higashi Oh-i, Shinagawa,

Tokyo 140-8522, Japan (E-mail:izumi@s.email.ne.jp)

ORIGIN

1 aactccacaa cattccacca agctctgcta gaccccagag taaggggcct atactttcct

61 gctggtggct ccagttccgg aacagtaaac cctgttccga ctactgcctc acccatatcg

121 tcaatcttct cgaggactgg ggaccctgca ccgaacatgg agaacacaac atcaggattc

181 ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata

241 ccacagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggagc acccacgtgt

301 cctggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaatt

361 tgtcctggct atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tattcctctt catcctgctg

421 ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactaccaag gtatgttgcc cgtttgtcct

481 ctacttccag gaacatcaac taccagcacg ggaccatgca agacctgcac gattcctgct

541 caaggcacct ctatgtttcc ctcttgttgc tgtacaaaac cttcggacgg aaactgcact

601 tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc gcaagattcc tatgggagtg ggcctcagtc

661 cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc

721 actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacaacatc

781 ttgaatccct ttttacctct attaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttgaacc

841 ctaataaaac caaacgttgg ggctactccc ttaacttcat gggatatgta attggaagtt

901 ggggtacttt accgcaagac catattatac taaaactcaa gcaatgtttt cgaaaactgc

961 ctgtaaatag acctattgat tggaaagtat gtcagagaat tgtgggtctt ttgggctttg

1021 ctgccccttt tacacaatgt ggctatcctg ccttaatgcc tttatatgca tgcatacaat

1081 ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatatctga

1141 acctttaccc cgttgcccgg caacggtcag gtctctgcca agtgtttgct gacgcaaccc

1201 ccactggatg gggcttggct attggccatc gccgcatgcg tggaaccttt gtggctcctc

1261 tgccgatcca tactgcggaa ctcctagcag cttgttttgc tcgcagccgg tctggagcga

1321 aactgatcgg aacagacaac tctgttgttc tctctcggaa atacacctcc tttccatggc

1381 tgctagggtg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg

1441 cgctgaatcc cgcggacgac ccgtctcggg gccgtttggg tctctaccgt ccccttcttc

1501 atctgccgtt ccggccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggtctcc ccgtctgtgc

1561 cttctcatct gccggtccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac

1621 cgtgaacgcc caccaggtct tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc

1681 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaagg actgggagga

1741 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt

1801 ctgttcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcatg ttcatgtcct

1861 actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgacccgtat

1921 aaagaatttg gagcttctgt ggagttactc tcttttttgc cttctgactt ctttccttct

1981 attcgagatc tcctcgacac cgcttctgct ctgtatcggg aggccttaga gtctccggaa

2041 cattgttcac ctcaccatac agcactcagg caagctattc tgtgttgggg tgagttgatg

2101 aatctggcca cctgggtggg aagtaatttg gaagacccag catccaggga attagtagtc

2161 agctatgtca atgttaatat gggcctaaaa atcagacaac tactgtggtt tcacatttcc

2221 tgtcttactt ttggaagaga aactgttctt gagtatttgg tgtcttttgg agtgtggatt

2281 cgcactcctc ctgcttacag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact

2341 actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga

2401 aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtatccc

2461 ctggactcat aaggtgggaa actttactgg gctttattct tctactgtac ctgtctttaa

2521 tcctgagtgg caaactccct cctttcctca cattcattta caggaggaca ttattaatag

2581 atgtcaacaa tatgtgggcc ctcttacagt taatgaaaaa aggagattaa aattaattat

2641 gcctgctagg ttctatccta accttaccaa atatttgccc ttggacaaag gcattaaacc

2701 atattatcct gaacatgcag ttaatcatta cttcaaaact aggcattatt tacatactct

2761 gtggaaggct ggcattctat ataagagaga aactacacgc agcgcctcat tttgtgggtc

2821 accatattct tgggaacaag agctacagca tgggaggttg gtcttccaaa cctcgacaag

2881 gcatggggac aaatctttct gttcccaatc ctctgggatt ctttcccgat catcagttgg

2941 accctgcgtt cggagccaac tcaaacaatc cagattggga cttcaacccc aacaaggatc

3001 actggccaga ggcaaatcag gtaggagcgg gagcattcgg gccagggttc accccaccac

3061 gcggcggtct tttggggtgg agccctcagg ctcagggcac attgacaaca gtgccggtag

3121 cacctcctcc tgcctccacc aatcggcagt caggaagaca gcctactccc atctctccac

3181 ctctaagaga cagtcatcct caggccatgc agtgg

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài: “ SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH

ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B ”

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Chí Vinh

Cơ quan công tác: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y dược TP.HCM

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng, từ tháng 9/2006 đến tháng 9/2007, gia hạn đến hết tháng 2/2008

Kinh phí được duyệt: 50.000.000 đồng (Năm mươi triệu đồng)

Kinh phí đã cấp: 50.000.000 đồng (Năm mươi triệu đồng)

Mục tiêu: Xây dựng 2 quy trình cải tiến trên cơ sở quy trình của Allen MI và K Takahashi, ứng dụng 2 quy trình cải tiến trên huyết thanh bệnh nhân để xác định:

- Đột biến kháng lamivudine

- Đột biến Basal core promoter

Nội dung: Đề tài đạt được các nội dung như đã đăng ký

Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện

Tạo vật liệu cho quy trình Đã tạo được:

- Sản phẩm PCR chứng dương của đột biến kháng lamivudine (rt180, rt204)

- Sản phẩm PCR chứng dương của đột biến Basal core promoter (1762/1764)

- Plasmid lưu trữ các dạng cơ bản của đột biến kháng lamivudine

Thử nghiệm thay đổi một số yếu tố Đã thực hiện các cải tiến:

- Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay cho phương pháp Boom

- Nested – PCR thay cho PCR 1 bước

- Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới hạn

- Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3%

Thử khả năng phát hiện đột biến

trong huyết thanh có hỗn hợp HBV

hoang dại và đột biến Mục tiêu là

phát hiện được đột biến ở tỉ lệ 30%

Xây dựng quy trình kháng

lamivudine có độ nhạy 103-104 bản

sao/ml

Khảo sát khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có hỗn hợp HBV đột biến và hoang dại Khẳng định quy trình có thể xác định đột biến trong huyết thanh hỗn hợp với

tỉ lệ 10% đột biến (đối với ĐB kháng lamivudine) và 30% đột biến (đối với ĐB Basal core promoter)

Đã xây dựng được quy trình kháng lamivudine có độ nhạy 6.25x102 bản sao/ml

Ứng dụng 2 quy trình đã được cải

tiến: Số lượng mẫu dự kiến gồm 30

mẫu kháng lamivudine và 30 mẫu

Basal core promoter (số mẫu cho

mỗi loại có thể thay đổi theo sự chỉ

định xét nghiệm của bác sĩ điều trị)

- Đã ứng dụng 2 quy trình cải tiến trên tổng số 127 mẫu huyết thanh bệnh nhân, gồm:

* 102 mẫu kháng lamivudine

* 25 mẫu Basal core promoter

Việt Nam là một trong những nước nằm trong vùng lưu hành cao của HBV Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy Việt Nam có tỉ lệ nhiễm virus viêm gan B cao,

ước tính tỉ lệ nhiễm trong cộng đồng khoảng 15%, trên 12 triệu người đang bị

nhiễm Một phần tư trong số đó sẽ viêm gan tiến triển dẫn đến xơ gan nếu không được điều trị Như vậy số lượng bệnh nhân viêm gan B có chỉ định điều

trị rất lớn [4], [6]

2 Chẩn đoán được Đột biến Basal core promoter và Đột biến kháng lamivudine sẽ giúp ích cho việc theo dõi và điều trị bệnh viêm gan B

2.1 Đột biến basal core promoter

Thông thường khi một bệnh nhân viêm gan B mạn tính có sự chuyển huyết thanh từ HBeAg sang HbeAb là tình hình bệnh ổn định, sự nhân bản của virus

viêm gan B bị ức chế Tuy nhiên, qua theo dõi điều trị có một số bệnh nhân

HBeAg âm tính mà virus vẫn hoạt động (biểu thị qua HBV DNA) Các bệnh nhân này vẫn tiến triển bệnh nhanh và cần được tiếp tục điều trị Một số trong các bệnh nhân này có mang HBV đột biến – liên quan đến sự giảm biểu hiện của HBeAg, là 2 kiểu đột biến sau:

- Đột biến Basal core promoter: do đột biến kép A1762T/ G1764A

- Đột biến Precore: do đột biến G1896A, hình thành codon stop 28 từ UGG thành UAG

Mức độ giảm biểu hiện HBeAg tùy thuộc vào loại đột biến trên Basal core promoter và sự phối hợp của chúng (bảng 1.1) Ngoài ra, đột biến này được xem là có liên quan đến ung thư gan, hiện diện ở 74,3 % các trường hợp bệnh nhân ung thư gan [48], [49]

Bảng 1.1: Mức độ giảm biểu hiện HBeAg do các đột biến điểm phối hợp Loại đột biến trên

Basal core promoter

Mức độ tăng sao chép bộ gene HBV (lần)

Mức độ biểu hiện HBeAg (%)

Mức độ giảm biểu hiện HBeAg (%)

“dấu hiệu kép” cần chẩn đoán trong trường hợp bệnh “âm ỉ” [25], [49]. Kenji Abe sử dụng phương pháp giải trình tự để phân tích đột biến Basal core promoter và precore trên 39 bệnh nhân viêm gan B cấp tính Việt Nam và 76

bệnh nhân viêm gan B mạn tính (thực hiện ở Nhật) Ghi nhận bước đầu cho thấy tỉ lệ xuất hiện đột biến Basal core promoter là 30,4%, cao hơn gấp 4 lần

so với đột biến precore (7,6%) [26] [27]

2.2 Đột biến kháng lamivudine

Lamivudine là một thuốc kháng HBV dùng bằng đường uống đầu tiên của thế giới được FDA chấp thuận từ năm 1996 và có mặt ở thị trường Việt Nam vào năm 2000 Lamivudine {(-) 2’-deoxy- 3’-thiacytidine} là chất tương tự của nucleoside dideoxy cytidine trong tự nhiên, có tác dụng ức chế mạnh sự nhân đôi của virus Do tính ức chế virus viêm gan B mạnh và độ an toàn rất cao, kết hợp với việc dễ sử dụng và giá cả thấp nên đã được ứng dụng rộng rãi để điều trị bệnh nhân viêm gan virus B Tuy nhiên, do bệnh nhân thường phải điều trị lâu dài, vấn đề kháng thuốc đã bùng nổ làm mất hiệu quả điều trị ban đầu Các đồng phân nucleoside (-tide) được chia thành 3 nhóm dựa vào cấu trúc:

• Loại1: L-nucleoside như lamivudine, emtricitabine, telbivudine, clevudine (đồng phân của cytosine)

• Loại 2: Phosphonate không vòng như adefovir, tenofovir, pradefovir

• Loại 3: Pentane vòng như entecavir, carbovir, abacavir

Vì sao các đột biến dẫn đến tính kháng thuốc:

Có 2 cơ chế sinh hóa lý giải cho tính kháng thuốc[23]

- Cơ chế thứ nhất: Một số đột biến gây ra trở ngại về mặt không gian làm cho reverse transcriptase (của HIV) hoặc DNA polymerase (của HBV) nhận diện được sự khác biệt về cấu trúc của những đồng phân nucleoside (-tide) so với các nucleotide tự nhiên Do vậy các đồng phân này bị loại trừ, không được kết hợp vào chuỗi DNA Kết quả là chu kỳ sao chép của virus vẫn được hoàn tất

- Cơ chế thứ hai: Một số đột biến làm tăng cường sự phân hủy nhóm pyrophosphoryl Enzyme của virus phát huy khả năng loại bỏ các đồng phân nucleoside (-tide) đã phosphoryl hóa vừa mới gắn vào chuỗi DNA thông qua adenosine triphosphate hay pyrophosphate Kết quả là chuỗi DNA được tiếp tục hoàn tất

Vị trí xúc tác của enzyme HBV polymerase là YMDD (Tyrosine Methionine Aspatate Aspatate) Đây chính là vùng bảo tồn motif của polymerase Khi có đột biến tại vị trí nucleotide tương ứng trên gene mã hóa cho polymerase thì sẽ làm thay đổi vùng bảo tồn motif này – virus mang biến thể YMDD Các nghiên cứu về cấu trúc phân tử cho thấy những đột biến này gây ra tính kháng lamivudine do chúng tạo ra sự cản trở về mặt không gian tại vị trí xúc tác, làm thay đổi hoạt tính xúc tác [28], [31] Đó chính là các đột biến thay thế ở codon

mã hóa cho L180 (domain B) và M204 (domain C) của reverse transcriptase Hoặc cũng được hiểu là codon mã hóa cho L528 và M552 của polymerase (JO

Tenney-AAC-2004-09), (JO Lai-Gastro-2005-08), (F Zoulim, Journal of Clinical Microbiology 2002-10)

Hình 1.1: Vị trí đột biến gene tương ứng với vùng bảo tồn motif YMDD của

HBV polymerase

“M – Methionine” là vị trí rt204 (reverse transcriptase)

Chủng virus viêm gan B kháng với lamivudine có motif YMDD của enzyme HBV DNA polmerase bị thay đổi: Methionine ở rt204 bị thay thế bởi Valine (M204V) hoặc Isoleucine (M204I) Thêm vào đó đột biến M204V thường đi kèm với thay thế Leucine ở rt180 bởi Methione (L180M) Dạng M204I và L180M/M204V là 2 dạng đột biến thường gặp nhất Các chủng virus đột biến thường xuất hiện từ sau 6-9 tháng điều trị Mức độ kháng thuốc lamivudine kiểu YMDD gia tăng dần theo thời gian điều trị: 14%, 38%, 49%, 66%, 69%

sau 1, 2, 3, 4, 5 năm [52]

Phát hiện sớm gene kháng thuốc là việc cần thiết:

Trên lâm sàng, nếu phát hiện sớm các trường hợp bệnh nhân kháng lamivudine thì sẽ giúp ích cho điều trị

• Kháng kiểu gene (genotypic resistance): Những thay đổi về Nucleotide tại các vị trí xác định rt204, rt180 xuất hiện từ 2 đến 6 tháng trước khi có các biểu hiện kháng thuốc trên lâm sàng Vào giai đoạn này chỉ có thể phát hiện đột biến trên gene Tình trạng này gọi là kháng kiểu gene Việc xác định kháng kiểu gene vào giai đoạn sớm là rất cần thiết

• Kháng kiểu hình (phenotype resistance): Sau 2-6 tháng kể từ khi xuất hiện đột biến kháng trên gene, một số bệnh nhân có đáp ứng giai đoạn đầu lại có HBV DNA tăng (HBV DNA tăng lên 1 log10 khi đang điều trị) và men ALT cũng tăng lên theo Tình trạng này gọi là kháng

“rào cản di truyền” (genetic barrier) và đã đúc kết các trường hợp này như sau:

- Với lamivudine: Quan trọng nhất là đột biến rt204 Đột biến rt180 cũng được xem xét Đột biến rt173 không được quan tâm

- Với adefovir: Quan trọng nhất là đột biến rt236 Đột biến rt181 và rt238 ít được quan tâm

- Với entecavir: Cần có 3 đột biến mới có tính kháng thuốc, bao gồm 2 đột biến kháng lamivudine rt204, rt180 và một trong các đột biến rt202, rt250

Các đột biến kháng thuốc được phân thành 3 cấp độ: thấp (low), trung bình (intermediate), cao (high) Ví dụ, M204V/I được xem là gây ra tính kháng lamivudine ở cấp độ cao, trong khi L180M gây ra tính kháng trung bình

Allen MI [9] đã khảo sát các đột biến tại codon rt180 và rt204 bằng 3 phương pháp khác nhau: PCR-sequencing, PCR-probe, PCR-RFLPø Sau khảo sát, Allen

MI đề nghị sử dụng hai phương pháp sau vì có ưu điểm hơn so với phương pháp PCR-sequencing, đặc biệt khi khảo sát trên số lượng mẫu lớn Kỹ thuật PCR-RFLP phát hiện được đột biến trong dạng hỗn hợp đột biến và hoang dại với tỉ lệ đột biến là 10%

Dan Yang H [12] cũng khảo sát đột biến rt180 và rt204 bằng kỹ thuật RFLP nhưng sử dụng các mồi khác (P2:575-596; P4:849-822; P5:588-614;

PCR-P6:769-739; P3:711-740) và các enzyme giới hạn khác (FokI, Alw441, SspI)

Anna S F Lok theo dõi đột biến kháng lamivudine rt180 và rt204, thực hiện trên 33 bệnh nhân HBV mạn tính điều trị lamivudine, lấy mẫu huyết thanh nhiều lần với tổng số mẫu là 159 Nghiên cứu được thực hiện bằng kỹ thuật INNO-LiPA (Innogenetic line probe assay) Nhóm nghiên cứu này có nhận định là INNO-LiPA có ưu điểm hơn Sequencing vì phát hiện được các trường hợp hỗn hợp hoang dại và đột biến

3 Nested PCR-RFLP là kỹ thuật đơn giản và tiện ích để xác định đột biến Basal core promoter và đột biến kháng lamivudine

Hiện nay trên thế giới có 4 nhóm kỹ thuật được dùng để phát hiện các đột biến kháng lamivudine và Basal core promoter, đó là: Phân tích trình tự chuỗi DNA (DNA sequencing), PCR đặc hiệu mẫu dò (PCR probe), PCR-RFLP và INNOLiPA (Innogenetic line probe assay) Mỗi kỹ thuật có những ưu và nhược điểm riêng của nó tùy hoàn cảnh thực tế Tại Việt Nam một số hạn chế bệnh nhân đã được phát hiện đột biến kháng lamivudine bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide hoặc INNOLiPA Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy các kỹ thuật này khó có khả năng đáp ứng được nhu cầu do giá thành cao, đòi hòi điều kiện máy móc phức tạp Bởi vậy chúng tôi bắt tay vào nghiên cứu triển khai kỹ thuật PCR-RFLP để chẩn đoán đột biến chính kháng lamivudine ở Việt Nam Trong thực hành lâm sàng, kỹ thuật PCR-RFLP cũng được sử dụng nhiều nhất để xác định kháng lamivudine

Có thể nói, việc hình thành quy trình PCR-RFLP để xác định đột biến kháng lamivudine và đột biến Basal core promoter có ý nghĩa ứng dụng vì vừa đơn giản về kỹ thuật, vừa tiết kiệm về giá thành

Trên cơ sở là quy trình của 2 tác giả K Takahashi và Allen MI, chúng tôi thực hiện 2 quy trình cải tiến, bao gồm việc ra các vật liệu cho quy trình cải tiến như tạo dòng, tạo chứng dương (vốn không sẵn có trong các quy trình của tác giả), thử nghiệm thay đổi một số yếu tố, thử nghiệm về khả năng phát hiện đột biến

ở dạng hỗn hợp, xác định độ nhạy của quy trình cải tiến, so sánh độ tương đồng về trình tự gene lấy kết quả giải trình tự làm chuẩn, đồng thời thử nghiệm quy trình trên một số hạn chế bệnh nhân để khẳng định kỹ thuật

1 Tạo vật liệu cho quy trình

Các chứng dương được tạo ra ở 2 dạng tùy vào sự cần thiết trên thực tế:

- Đối với quy trình xác định đột biến Basal core promoter: tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương

- Đối với quy trình xác định đột biến kháng lamivudine: tạo dòng lưu trữ các dạng đột biến cơ bản, từ đó tạo ra các sản phẩm PCR chứng dương

1.1 Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core promoter

1762T/1764A

Chọn huyết thanh bệnh nhân có HBV đột biến Basal core promoter, thực hiện Nested PCR với tổng thể tích lớn (200 μl), giải trình tự kiểm chứng, bảo quản để làm chứng dương

1.2 Tạo dòng lưu trữ các dạng cơ bản của đột biến kháng lamivudine, từ đó tạo các sản phẩm PCR chứng dương

Chọn huyết thanh bệnh nhân có HBV mang các đột biến L180M/M204V, M204I, thực hiện Nested PCR Việc tạo dòng được thực hiện với plasmid

pGEM-T, enzyme T4 DNA ligase, vi khuẩn E coli DH5α-lacZ, môi trường nuôi

cấy Luria Bertani, Xgal 2%, IPTG 20%, Ampiciline 50 μg/ml Chọn lọc dòng, kiểm tra các dòng bằng cách PCR trực tiếp vi khuẩn tái tổ hợp Tiếp tục chọn

Trình tự nucleotide Vị trí mồi trên

bộ gene của HBV

Nhiệt độ nóng chảy

Tm (oC) ep1.1

720-741 648-669 839-819

58.6 52.6 50.8 48.9 52.8 54.3

53.6 60.1 46.4

2 Thử nghiệm thay đổi một số yếu tố

2.1 Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay cho phương pháp Boom

Thu nhận huyết thanh của 10 bệnh nhân viêm gan B có HBV DNA dương tính Mỗi mẫu huyết thanh được tách chiết DNA theo 2 phương pháp là Boom và Tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987) đi từ một thể tích huyết thanh ban đầu (100 μl) và thu nhận cùng một thể tích dịch chiết DNA cuối cùng (50 μl), định lượng

HBV DNA theo quy trình của Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM Kết quả định lượng HBV DNA được so sánh đối chiếu

Phenol pH 8 và Guanidin thiocyanate có trong Trizol pH 8 có tác dụng làm biến tính protein và phá hủy cấu trúc màng, nhờ đó DNA virus sẽ được giải phóng và được thu lại bằng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987) Cho 800 μl Trizol pH8 vào eppendorf 1.5 ml Thêm 100 μl huyết thanh, vortex, để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng Thêm 200 μl chloroform, trộn đều, li tâm

13000 rpm/ 10 phút Trong eppendorf 1.5 ml khác có chứa 600 μl isopropanol, thêm 600 μl dịch nổi sau li tâm, trộn đều, để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng Li tâm 13000 rpm/ 10 phút Loại bỏ dịch nổi, thu cặn Thêm 1ml ethanol 70%, li tâm 13000 rpm/ 5 phút Thu cặn Ủ khô cặn ở 60oC/ 10 phút Hòa tan cặn hoàn toàn với 50 μl TE 1X, có được 50 μl dịch chiết DNA Bảo quản dịch chiết DNA

ở -20oC cho đến khi sử dụng

2.2 Nested PCR thay cho PCR 1 bước

Từ HBV DNA, thực hiện PCR 1 bước và Nested-PCR So sánh cường độ tín hiệu của đoạn gene mục tiêu được thể hiện trên điện di Tiếp tục chọn thể tích sản phẩm PCR1 để Nested-PCR có tín hiệu tốt nhất bằng cách sử dụng các thể tích sản phẩm PCR1 khác nhau: 3,0 μl; 2,5 μl; 2,0 μl; 1,5 μl; 1,0 μl; 0,5 μl; 0,25

μl

- Để phân tích đột biến Basal core promoter:

Sử dụng cặp mồi “ngoài” ep 1.1 và ep 1.2 cho phản ứng PCR1, cặp mồi

“trong” ep 2.1 và ep 2.2 cho phản ứng PCR2 Sản phẩm cuối cùng có kích thước 307 bp

* PCR 1: Tổng thể tích 25 μl (master mix 12,5 μl; mồi 0,25 μl; HBV DNA

10,0 μl; nước cất vô trùng đủ thể tích)

* PCR 2: Tổng thể tích 25 μl (master mix 12,5 μl; mồi 0,25 μl; 1,0 μl sản

phẩm PCR1; nước cất vô trùng đủ thể tích)

- Để phân tích đột biến rt180: Sử dụng cặp mồi “ngoài” chung là PS21 và S7R,

cặp mồi “trong” là F3 và B2 Sản phẩm cuối cùng có kích thước 191 bp

- Để phân tích đột biến rt204: Sử dụng cặp mồi “ngoài” chung là PS21 và S7R,

cặp mồi “trong” là F1 và B2 Sản phẩm cuối cùng có kích thước 119 bp

Chương trình PCR: Chương trình PCR được dùng chung cho tất cả các bước

2.3 Phản ứng ủ thích hợp cho các Enzyme giới hạn

Sử dụng một nồng độ enzyme (10 IU) với các thời gian ủ khác nhau trên cùng

một sản phẩm Nested PCR 100 nmol/l Xác định thời gian ủ thích hợp so với

thời gian ủ trên lý thuyết (1 giờ)

Tiến hành các phản ứng RFLP với thể tích 20 μl, gồm: 10,0 μl sản phẩm

Nested PCR rt180/rt204 nồng độ 100 nmol/μl; 2,0 μl buffer 10X của

NlaIII/NdeI; NlaIII / NdeI 10 IU, nước cất vô trùng đủ thể tích Thực hiện phản

ứng thủy giải ở 37oC với các mốc thời gian dừng phản ứng khác nhau: 15 phút,

30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút Điện di phân tích kết quả

2.4 Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3%

Thực hiện cùng quy trình với 2 cách điện di khác nhau, nhận xét ưu điểm của điện di microfluidic so với điện di agarose 3%

- Điện di agarose: Các sản phẩm Nested PCR-RFLP được phân tách qua điện

di trên gel agarose 3% có chứa ethidium bromide trong dung dịch đệm TAE 1X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM, pH8) Các nucleic acid tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Quá trình điện di được thực hiện ở hiệu điện thế 70 volts trong thời gian

30 phút Quan sát các sản phẩm Nested PCR-RFLP dưới bàn đèn tử ngoại Kích thước của các sản phẩm Nested PCR-RFLP được nhận biết qua so sánh với Thang trọng lượng phân tử DNA 100 bp hoặc 50 bp

- Điện di microfluidic: Điện di microfluidic được thực hiện trên chip DNA

1000, mỗi chip gồm 12 giếng Điện di microfluidic sử dụng thể tích mẫu rất nhỏ (1 μl) Trong một điện trường được kích hoạt bằng tia lazer, DNA di chuyển về phía cực dương Dữ liệu về kích thước DNA và hàm lượng DNA của mỗi giếng được xử lý bằng máy vi tính

3 Thử khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có hỗn hợp HBV hoang dại/đột biến

3.1 Khả năng phát hiện đột biến Basal core promoter trong huyết thanh hỗn hợp có HBV đột biến/hoang dại

Pha trộn huyết thanh có HBV hoang dại và HBV mang đột biến theo tỉ lệ đột

biến/hoang dại giảm dần 90/10, 70/30, 50/50, 30/70, 10/90 với nồng độ HBV

DNA chung là 104 bản sao/ml Thực hiện quy trình để xác định đột biến