chế tạo một số bộ phận trong hệ thống phân tích dòng chảy xác định nitrit trong nước nuôi trồng thuỷ sản

BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: CHẾ TẠO MỘT SỐ BỘ PHẬN TRONG HỆ THỐNG PHÂN TÍCH DÒNG CHẢY XÁC ĐỊNH NITRIT TRONG NƯỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chủ nhiệm đề tài: Ths.. NGUYỄN MINH TRÚC Cơ quan

BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài:

CHẾ TẠO MỘT SỐ BỘ PHẬN TRONG HỆ THỐNG PHÂN TÍCH DÒNG CHẢY XÁC ĐỊNH NITRIT TRONG NƯỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Chủ nhiệm đề tài: Ths NGUYỄN MINH TRÚC

Cơ quan chủ trì: Trung Tâm Phát Triển Khoa Học Công Nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng

Kinh phí được duyệt: 50 triệu đồng

Kinh phí đã cấp: 50 triệu đồng theo TB số : 174 TB-SKHCN ngày 01/11/2006 Mục tiêu:

Chế tạo được hệ thống phân tích nitrit theo nguyên lý tiêm dòng chảy dựa vào một số thiết bị có sẵn và thiết kế hệ thống điện tử bằng linh kiện trong nước

Từng bước nghiên cứu khả năng chế tạo trong nước một số bộ phận của hệ thống: tế bào đo dòng chảy theo nguyên lý quang học

Nội dung:

Chế tạo cell quang học và bộ

Hệ thống phối trộn
Vật liệu: ống teflon

Phần mềm xử lý tín hiệu
Đơn giản, chính xác dễ sử dụng

Báo cáo phân tích và bảng số

liệu

Trung thực, khách quan, các số liệu được tối ưu hóa

TÓM TẮT

CHẾ TẠO MỘT SỐ BỘ PHẬN TRONG HỆ THỐNG PHÂN TÍCH DÒNG CHẢY

XÁC ĐỊNH NITRIT TRONG NƯỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Trong đề tài này, hệ thống phân tích nitrit hoạt động theo nguyên tắc tiêm dòng chảy

được chế tạo với các thiết bị và linh kiện trong nước Hệ thống này bao gồm một đầu

dò cho nitrit hoạt động theo nguyên lý quang học và một bộ phối trộn Tế bào dòng chảy trong đầu dò được chế tạo với vật liệu mica có chiều dài 3,5cm và đường kính trong 1,0mm; bộ phối trộn làm bằng ống teflon; nguồn sáng được cấp bởi một đèn LED có bước sóng phát xạ cực đại tại 560nm; bộ phận phát hiện và mạch khuếch đại

được thực hiện với photodiode BPW21 và IC TL081 Đầu dò này được láp ráp với một

bơm nhu động có sẵn và thực hiện sự phân tích nitrit bằng thuốc thử Naptyletylendiamin và acid sulfanilic Các điều kiện phân tích được tối ưu Một số mẫu nước thực tế được áp dụng Kết quả cho thấy hệ thống tự chế tạo này cho độ nhạy

in FIA mode and SFIA mode was 0.00312 mg N/L and 0.00561 mg/L respectively

Mục lục

Tóm tắt đề tài 2

Mục lục 3

Danh sách các chữ viết tắt 5

Danh sách bảng 6

Danh sách hình 7

Chương 1: Tổng quan 10

1 Sự tồn tại của nitrit trong môi trường nước 10

2 Các phương pháp phân tích nitrit 11

3 Phương pháp phân tích tiêm dòng chảy 12

4 Tổng quan về tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài này 17

4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17

4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 17

5 Mục đích nghiên cứu – Ý nghĩa của đề tài 19

5.1 Mục đích nghiên cứu 19

5.2 Ý nghĩa của đề tài 19

Chương 2: Nội dung nghiên cứu 20

1 Sản phẩm cần đạt 20

2 Thiết kế tế bào đo dòng chảy và bộ phối trộn 20

2.1 Tế bào đo dòng chảy 20

2.2 Bộ phối trộn 22

2.3 Độ phân tán 22

3 Thiết kế mạch nhận tín hiệu 22

4 Viết phần mềm 25

5 Nghiên cứu tối ưu và kiểm định quy trình phân tích 27

5.1 Ảnh hưởng của bản chất acid dùng làm môi trường phản ứng 27

5.2 Tỉ lệ pha trộn thuốc thử 27

5.3 Tốc độ của bơm nhu động 28

5.4 Đường chuẩn – giới hạn phát hiện 28

5.5 Ảnh hưởng của nền 28

5.6 Đánh giá quy trình phân tích trên một mẫu thật 28

Chương 3: Kết quả và thảo luận 30

1 Tế bào đo dòng chảy và bộ phối trộn 30

1.1 Tế bào đo dòng chảy 30

1.2 Bộ phối trộn 33

1.3 Độ phân tán và độ bành rộng 37

2 Mạch điện tử nhận tín hiệu 38

4.1 Photodiod và LED 38

4.2 Mạch lọc nhiễu (active low – pass filter) 40

4.3 Modun biến đổi tương tự/số và ngược lại 40

3 Phần mềm 41

5.1 Phần mềm thu nhận tín hiệu 41

4 Tối ưu và kiểm định quy trình phân tích 54

4.1 Ảnh hưởng của acid dùng làm môi trường 54

4.2 Tỉ lệ pha trộn thuốc thử 55

4.3 Tốc độ của bơm nhu động 56

4.4 Khoảng tuyến tính – giới hạn phát hiện 57

4.5 Ảnh hưởng của nền 58

4.6 Phân tích một số mẫu thật 59

Chương 4: Kết luận và kiến nghị 62

1 Kết luận 62

2 Kiến nghị 64

Tài liệu tham khảo 65

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

FIA Flow Injection Analysis: phân tích tiêm dòng chảy liên tục SFIA Stop-Flow Injection Analysis: phân tích tiêm dòng chảy không liên tục

FFT Fast Fourier Transform: Thuật toán biến đổi Fourier nhanh

4 Bảng 4: Diễn giải tác dụng của menu/file

5 Bảng 5: Diễn giải tác dụng của menu/setup

6 Bảng 6: Diễn giải tác dụng của menu/method

7 Bảng 7: Diễn giải tác dụng của các menu/method

8 Bảng 8: Diễn giải chức năng của menu/file

9 Bảng 9: Diễn giải chức năng của menu/view

10 Bảng 10: Diễn giải chức năng của menu/math

11 Bảng 11: Diễn giải chức năng của popup menu

12 Bảng 12: Cài đặt các thông số cho phân tích mẫu nước nuôi tôm sú

13 Bảng 13: So sánh kết quả phân tích nitrit mẫu nước nuôi tôm sú bằng

hai phương pháp TCVN và phương pháp SFIA trong một số mẫu

14 Bảng 14: Chi phí linh kiện phần cứng cho một đầu dò nitrit

15 Bảng 15: Các thông kỹ thuật và vận hành của đầu dò nitrit

DANH SÁCH CÁC HÌNH

1 Hình 1: Cấu tạo một hệ thống FIA một kênh

2 Hình 2: cấu tạo nguyên lý hoạt động của một bơm nhu động

3 Hình 3: Sơ đồ hoạt động của một van tiêm mẫu

4 Hình 4: A – tế bào đo theo nguyên lý quang học kiểu chữ Z; B – Tế

bào đo theo nguyên lý quang học kiểu chữ U; C – Tế bào đo theo

nguyên lý điện hóa kiểu bản mỏng (thin layer); D- nguyên lý điện hóa

kiểu tường phản lực (wall-jet)

5 Hình 5: Cấu tạo một hệ thống FIA để phân tích nitrit đã từng nghiên

cứu trước đây [2 – 5]

6 Hình6: Cấu tạo cắt ngang của tế bào đo dòng chảy tự chế tạo

7 Hình 7: Cấu hình hệ FIA trong thực nghiệm

8 Hình 8: Sồ đồ mạch điện khuếch đại tín hiệu

9 Hình 9: Sơ đồ mạch điện điều khiển bơm nhu động

10 Hình 10: Cấu tạo ngoài và sơ đồ chân của USB1208LS

11 Hình 11: Sơ đồ chân của USB1208LS gắn vào board mạch nhận tín

hiệu

12 Hình 12: Giao diện chính của phần mềm thu nhận tín hiệu

13 Hình 13: Giao diện chính của phần mềm xử lý tín hiệu

14 Hình 14: Tín hiệu của dầu dò nitrit với tế bào dòng chảy có các kích

thước khác nhau (Nitrit 2000ppb, thời gian hút mẫu 20s)

15 Hình 15: So sánh độ tăng của chiều cao pic và độ bành rộng pic khi

tăng chiều dài tế bào dòng chảy

16 Hình 16: Sự phân tán trong hệ thống FIA nghiên cứu (chiều dài bộ phối

trộn: 250cm, thời gian hút mẫu 30s, tốc độ 1,90ml/phút.)

17 Hình 17: Ảnh hưởng của chiều dài bộ phối trộn đến chiều cao của pic

(Nitrit 1000ppb, thời gian tiêm mẫu 60s, tốc độ 1,90ml/phút)

18 Hình 18: Ảnh hưởng của đường kính trong của bộ phối trộn đến chiều

cao và độ bành rộng pic (Nitrit 1000ppb, thời gian hút mẫu 60s x

1,90ml/phút, chiều dài bộ phối trộn 100cm)

19 Hình 19: So sánh chiều cao của pic khi thay đổi cấu tạo hình học của

bộ phối trộn (nitrit 500ppb, thời gian tiêm mẫu 30s x 1,90ml/phút,

chiều dài bộ phối trộn 100cm)

20 Hình 20: Tín hiệu khi thay đổi hình dạng của bộ phối trộn (nitrit

500ppb, thời gian tiêm mẫu 30s x 1,85ml/phút, chiều dài bộ phối trộn

100cm)

21 Hình 21: Hình dạng của pick hi thay đổi cấu tạo hình học của bộ phối

trộn (trích từ tài liệu tham khảo [2])

22 Hình 22: Ảnh hưởng của thời gian tiêm mẫu tới độ phân tán (coil:

23 Hình 23: Phổ phát xạ của LED EL383-2SGYC và phổ hấp thu của

photodiode BPW21, và mắt người

24 Hình 24: Độ tuyến tính của dòng điện thu được theo cường độ chiếu xạ

vào BPW21

25 Hình 25: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên dòng quang điện của BPW21

26 Hình 26: Tín hiệu sau khi có tụ lọc và không có tụ lọc (nitrit 200ppb,

thời gian hút mẫu 10, 20, 30s x 1,90ml/phút)

27 Hình 27: menu file của phần mềm thu nhận tín hiệu

28 Hình 28: menu setup của phần mềm thu nhận tín hiệu

29 Hình 29: menu method của phần mềm thu nhận tín hiệu

30 Hình 30: menu help của phần mềm thu nhận tín hiệu

31 Hình 31: popup menu của đồ thị

32 Hình 32: Mô tả cách tính tỉ lệ S/N

33 Hình 33: Tỉ lệ tín hiệu/ồn khi thay đổi giá trị tính trung bình với tốc độ

lấy mẫu 2 mẫu/giây

34 Hình 34: Sự biến dạng của pic khi thay đổi tẩn số cắt nhiểu lần lượt là

3, 5, 7, 10, 15, 20, tốc độ lấy mẫu 2 mẫu/giây

35 Hình 35: Sự biến dạng của cường độ pic khi thay đổi tốc độ lấy mẫu

36 Hình 36: Trang giao diện chính của phần mềm xử lý tín hiệu

37 Hình 37: Menu file của phần mềm thu nhận tín hiệu

38 Hình 38: Menu View của chương trình xử lý tín hiệu

39 Hình 39: Menu Math trong phần mềm xử lý tín hiệu

40 Hình 40: Menu Help của chương trình xử lý tín hiệu

41 Hình 41: Popup menu của đồ thị

42 Hình 42: Hộp thoại phân tích định lượng

43 Hình 43: Minh họa việc xử lý tín hiệu bằng thuật toán FFT

44 Hình 44: Sự làm nhẵn tín hiệu của thuật toán biến đổi Fourier nhanh

45 Hình 45: Ảnh hưởng của bản chất các loại acid khác nhau sử dụng để

làm môi trường phản ứng (trường hợp không acid sử dụng acid

sulfanilic)

46 Hình 46: Ảnh hưởng của tỉ lệ pha trộn thuốc thử đến chiều cao của pic

nitrit (1000ppb, thể tích tiêm mẫu 400µl, tốc độ bơm 2,4ml/phút)

47 Hình 47: Ảnh hưởng của thành phần chất mang tới chiều cao và hình

dạng của pic (nitrit 81ppb, thể tích tiêm mẫu 400µl, tốc độ bơm

2,4ml/phút)

48 Hình 48: Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhu động lên cường độ pic

(80ppb N-NO2, thể tích tiêm mẫu 350 µl, 100cm coil)

49 Hình 49: Đường chuẩn của chế độ tiêm dòng chảy liên tục Chiều dài

coil 250cm, tốc độ 1,50ml/phút, thời gian tiêm mẫu 90s

50 Hình 50: Đường chuẩn của chế độ tiêm dòng chảy liên tục Chiều dài

coil 100cm, tốc độ 1,50ml/phút, thời gian tiêm mẫu 30s, thời gian dừng

100s

51 Hình 51: Ảnh hưởng độ mặn và Fe(III) đến độ hấp thu

52 Hình 52: Đường chuẩn và mẫu nước nuôi tôm sú và các mẫu thêm

chuẩn

53 Hình 53: Đường chuẩn và mẫu máy và các mẫu thêm chuẩn

Chương

1

Tổng quan

1 Sự tồn tại của nitrit trong môi trường nước:

Nguyên nhân chính sản sinh ra nitrit trong tự nhiên bắt nguồn từ các sản phầm phân hủy từ động thực vật Protein của động thực vật bị phân hủy bởi nhiều loại vi sinh vật

và được chuyển hóa thành các amin tự do, sau đó các amin này bị khử kị khí để giải phóng NH4+ và NH3 có thể biểu diễn theo phương trình hóa học như sau:

đó đã bị ô nhiễm Trong các ao nuôi trồng thủy hải sản, nitrit có nguồn gốc chủ yếu từ

thức ăn thừa, lượng thức ăn thừa này ở tầng đáy bị khử thành amoni, sau đó thành nitrit theo các phương trình (1, 2) Nitrit là một chất độc cho tôm cá vì nó tấn công vào hồng

cầu của máu làm tê liệt hệ thần kinh và hô hấp Do vậy, kiểm tra hàm lượng nitrit là một thông số để đánh giá chất lượng môi trường nước cũng như môi trường nuôi trồng thủy hải sản

2 Các phương pháp phân tích nitrit:

Mặc dù nitrit có thể phân tích bằng các phương pháp như sắc ký ion, ampe…Nhưng có thể nói rằng, phương pháp kinh điển và chủ đạo để xác định nitrit trong tất cả các mẫu là phương pháp trắc quang VIS với cơ chế tạo thành phẩm màu azo của nitrit theo sơ đồ tổng quát như sau:

520-Bảng 1: Các loại thuốc thử dùng trong phương pháp trắc quang xác định nitrit

4-Nitroanilin 8-quinolinol 550 4-Nitroanilin 2-Metyl-8- quinolinol 585 4-Nitroanilin N-(1-Naptyl) etylen diamin hydrolorua 525 o-Nitroanilin Acid 8-Amino-naptylen-2-sulfonic 525 Acid Sulfanilic Naptol-1-1-ol 520 Acid 4-Amino Salicylic Pesorcinol 426 Acid orthanilic Pesorcinol 435 p-Aminophenol N-Etyl naptylamin 537 Acid Anilin-4-Sulphonic Acid N-Phenyl-1-naptylamin-8-Sulphonic 554

Trong các loại thuốc thử nói trên, cặp thuốc thử acid sulfanilic hoặc sulfanilamid và (1-Naptyl) etylen diamin hydrolorua cho độ nhạy tốt nhất và thân thiện với môi trường nhất Đó cũng chính là sự lựa chọn thuốc thử của đề tài này

N-Giới hạn cho phép của nitrit trong nước uống là dưới 0.01mg/l

3 Phương pháp phân tích tiêm dòng chảy:

3.1 Nguyên tắc và cấu tạo:

Phần này sẽ không trình bày sâu về lý thuyết của kỹ thuật FIA mà sẽ trình bày nghiêng về khía cạnh kỹ thuật của nó Lý thuyết của FIA tương đối hoàn thiện, thực ra

là sự kết hợp của lý thuyết phản ứng hóa học và các quá trình động lực học chất lỏng Một trong những tác phẩm tiêu biểu có thể tìm hiểu về phương pháp phân tích này là

cuốn sách “Flow Injection Analysis” của chính những người sáng lập phương pháp là

tác giả được nêu trong tài liệu tham khảo [2] Một nguồn tài liệu tham khảo khác có trực tiếp trên internet có thể truy nhập miễn phí tại địa chỉ www.fialab.com là công ty

do Giáo sư Elo H Hansen sáng lập

Phương pháp phân tích tiêm dòng chảy (Flow Injection Analysis – FIA) được hai nhà khoa học người Đan Mạch Jarda Ruzicka và Elo H Hansen phát minh vào khoảng

đầu những năm 1970 (công trình đánh dấu đầu tiên được công bố vào năm 1975) Đây

là kỹ thuật phân tích kết hợp đồng thời sự tự động hóa vận chuyển mẫu đến đầu dò (detector) và các phản ứng hóa học diễn ra ngay trong quá trình vận chuyển mẫu [1 -2] Một sơ đồ đơn giản của hệ thống FIA có thể được thấy trong hình 1

Hình 1: Cấu tạo một hệ thống FIA một kênh

Mẫu phân tích được tiêm vào dòng chất mang được bơm nhu động đẩy tới bộ phối trộn, trong chất mang có chứa sẵn các thuốc thử sẽ phản ứng với chất cần phân tích, sản phẩm của phản ứng thường là những chất có tín hiệu nhạy với một đầu dò đặt phía cuối hệ thống, đầu dò sẽ cho tín hiệu dạng pic và hiển thị trên máy tính Việc định lượng sẽ dựa trên việc xây dựng đường chuẩn giữa nồng độ chất phân tích với diện tích hay chiều cao của pic

Cấu tạo của một hệ FIA bao gồm các bộ phận sau đây:

1 Bơm nhu động (peristaltic pump): gồm nhiều trục quay đồng thời, các trục

này tỳ lên một ống bằng silicon đàn hồi tốt, khi quay sẽ tạo ra một áp lực hút

đẩy dung dịch chạy trong lòng ống silicon Tùy thuộc vào kích thước của ống và vận tốc quay của trục mà tốc độ chảy của chất lỏng trong ống sẽ

nhanh hay chậm

Hình 2: cấu tạo nguyên lý hoạt động của một bơm nhu động

Ống dẫn chất lỏng trong của bơm nhu động là một ống làm bằng chất

liệu silicon, chịu hóa chất, chịu áp lực cao Màu sắc của các đai trên ống cho



Bơm

Van tiêm mẫu

phép biết được đường kính trong cũng như tốc độ bơm tối đa của ống Bảng

2 cho thấy màu sắc của ống tương ứng với đường kính và tốc độ bơm tối đa theo các nhà sản xuất (nguồn từ hãng FIALabs):

Bảng 2: Các loại ống dùng trong bơm nhu động

Mã màu sắc Đường kính trong

Hình 3: Sơ đồ hoạt động của một van tiêm mẫu

Khi van tiêm mẫu ở vị trí nạp mẫu (LOAD) dòng chất mang được bơm nhu động đẩy vào hệ thống phối trộn theo kênh 1, lúc này chưa có phản ứng diễn ra giữa chất phân tích trong mẫu và thuốc thử, trong khi đó mẫu được hút vào một vòng mẫu (gọi là vòng loop), sau khi nạp đầy vòng mẫu, lượng thừa dung dịch mẫu chảy ra ngoài theo kênh 5

Khi van tiêm mẫu ở vị trí tiêm (INJECT), các kênh được đổi chỗ, dòng chất mang được bơm nhu động đẩy qua vòng mẫu đưa hết mẫu sau khi tiêm

ở vị trí nạp, lúc này bắt đầu có các phản ứng hóa học diễn ra trong lòng ống

dẫn giữa chất cần phân tích và thuốc thử trong chất mang

Với thiết kế như vậy, lượng mẫu được tiêm vào trong hệ thống FIA luôn luôn chính xác giữa các lần tiêm

3 Bộ phận phát hiện (Detector): Có hai nhóm bộ phận phát hiện chính là

nhóm quang học và nhóm điện hóa Nhóm quang học có thể là các thiết bị

đo phổ hấp thu phân tử UV/VIS, quang phổ IR, huỳnh quang kế…Nhóm điện hóa có thể là máy đo điện thế với điện cực màng chọn lọc ion hoặc các

sensor chọn lọc khác, thiết bị đo von-ampe, đo độ dẫn, đo điện lượng… Trong bộ phận phát hiện có một chi tiết gọi là tế bào dòng chảy (flow cell) Tùy thuộc nguyên lý phát hiện là điện hóa hay quang học mà cấu tạo của tế bào dòng chảy cũng khác nhau Hình 4 cho thất cấu tạo tiêu biểu của

tế bào dòng chảy đo theo nguyên lý quang học (A, B) và nguyên lý điện hóa (C, D)

Hình 4: A – tế bào đo theo nguyên lý quang học kiểu chữ Z; B – Tế bào đo theo nguyên

lý quang học kiểu chữ U; C – Tế bào đo theo nguyên lý điện hóa kiểu bản mỏng (thin

layer); D- nguyên lý điện hóa kiểu tường phản lực (wall-jet)

So sánh với các detector cho hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), detector cho một hệ FIA được đơn giản hơn nhiều Detector của HPLC phải giảm thiểu một cách tối đa hiện tượng bành rộng pic để tăng độ phân giải Tuy nhiên, một detector của FIA không cần giảm thiểu độ bành rộng của pic

mà cần phải giữ cho độ bành rộng này lặp lại giữa các lần thí nghiệm Những tính chất về động học, vật lý của detector cho HPLC đều có thể áp dụng cho detector cho FIA Do vậy, một detector trong HPLC hoàn toàn có thể sử dụng trong FIA tuy nhiên điều ngược lại không đúng Một điểm khác nhau quan trọng giữa detector HPLC và FIA là sự khác nhau về tốc độ đọc tín hiệu của mạch khuyếch đại tín hiệu giữa hai loại detector này Detector của FIA có tốc độ đọc dữ liệu nhanh hơn nhiều so với detector của HPLC

Nói chung, những detector với cấu tạo kiểu dòng chảy đều thích hợp để

sử dụng cho FIA Tuy nhiên, detector UV/VIS với nhiều bước sóng là loại

được sử dụng nhiều nhất trong hệ thống FIA Cấu tạo của cell dòng chảy

trong detector này có hình dạng chữ Z hoặc chữ U (hình 4 A, B) Cách cấu

tạo như vậy để loại bỏ bọt khí bị bơm vào hệ thống Đường kính bên trong của cell dòng chảy loại này thông thường từ 0.5 – 1.0mm và chiều dài có thể

đạt 40.0mm Chiều dài tiêu chuẩn là 10,0mm [2]

4 Tổng quan về tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài này:

4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Có thể nói rằng, kỹ thuật FIA được nghiên cứu và cải tiến kỹ thuật rất nhanh Từ lúc mới phát minh là phương pháp tiêm dòng chảy liên tục, đến tiêm dòng chảy gián

đoạn và nhiều cải tiến kỹ thuật cả về hệ thống tiêm mẫu, bộ phối trộn và các thiết bị

phát hiện cho tới ngày nay Các nghiên cứu này có thể tìm thấy trong tài liệu tham khảo [6 – 17] và việc trình hết các cải tiến đó sẽ vượt xa khỏi bản báo cáo này

Ngay từ lúc kỹ thuật FIA ra đời, một trong những ứng dụng đầu tiên của nó là phương pháp tự động hóa để xác định hàm lượng nitrit [1-2] Có thể xem đây là một trong những ví dụ kinh điển nhất Phương pháp sử dụng để xác định nitrit là sử dụng phản ứng tạo phẩm màu azo và sử dụng phương pháp quang phổ VIS để xác định Các phản ứng với thuốc thử diễn ra theo sơ đồ dưới đây:

N HSO3

Hình 5: Cấu tạo một hệ thống FIA để phân tích nitrit đã từng nghiên cứu trước đây

[2 – 5]

Với cấu hình trên, khoảng tuyến tính khi phân tích nitrit cĩ thể thực hiện với nồng

độ từ 0.01 - 2.0 mg (N)/L Quy trình này cĩ thể phân tích nitrit với độ nhạy khoảng

0.005mg N/L và độ lặp lại rất tốt, RSD < 2% Hệ thống như trên cĩ thể được gắn thêm cột khử Cu-Cd để khử nitrat thành nitrit

Hãng FIAlab cũng cơng bố mở trên trang web của họ quy trình phân tích nitrit Theo quy trình đĩ, độ nhạy cĩ thể đạt được mức 0.010mg/L và khoảng tuyến tính trong 0.4 - 10.0 mg N/L cho nitrat và 0.015 - 2.0 mg N/L cho nitrit [18]

Ngồi phương pháp sử dụng đầu dị UV/VIS, đầu dị điện hĩa cũng cĩ thể sử dụng

để phân tích nitrit với điện cực màng chọn lọc ion nitrit [2]

4.2 • Tình hình nghiên cứu trong nước:

Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5942: 1995, hàm lượng nitrit trong nước mặt loại

A khơng vượt qúa 0.01mg/l, loại B khơng vượt quá 0.05 mg/l Ở nước ta, phương pháp xác định nitrit bằng tay được cụ thể hĩa trong các tiêu chuẩn như TCVN 5501:1991, TCVN 6178: 1996, TCVN 6268: 1999 Trong TCVN 6178: 1996, độ nhạy cĩ thể đạt

từ 0.001 đến 0.002 mg N/L với cuvet cĩ chiều dài 40mm [19]

FIA đã có mặt ở Việt Nam từ nhiều năm và đã có một vài ứng dụng để phân tích tự động hóa các chỉ tiêu dinh dưỡng nước như nitrit [20-22] Một số nghiên cứu

của GS Chu Xuân An khoảng những năm 1993 – 1995 cũng ứng dụng kỹ thuật FIA để phân tích nitrit [21] và một số nguyên tố đất hiếm [20] Viện Khoa Học Thủy lợi Nam Bộ trong một chương trình hợp tác với tổ chức SIDA Thụy Điển cũng đã ứng dụng

FIA trong phân tích nitrit/nitrat [22], độ nhạy của hệ thống này đạt 12ppb cho nitrat và

8ppb cho nitrit Nhìn chung các nghiên cứu này khá lẻ tẻ, các công trình và các ứng dụng này vẫn còn dựa vào các thiết bị nước ngoài, việc chế tạo một hệ thống phân tích dòng chảy ở nước ta cho tới hiện nay vẫn chưa được thực hiện

Từ thực tế này cho thấy việc tự chế tạo từng phần tiến tới chế tạo tồn bộ thiết bị trong hệ thống phân tích dịng chảy là một hướng đi phù hợp với thực tế hiện nay Đĩ cũng là nội dung chính của đề tài này

5 Mục đích nghiên cứu – Ý nghĩa của đề tài:

5.1 Mục đích nghiên cứu:

Chế tạo được hệ thống phân tích nitrit theo nguyên lý tiêm dịng chảy dựa vào một

số thiết bị cĩ sẵn và thiết kế hệ thống điện tử bằng linh kiện trong nước

Từng bước nghiên cứu khả năng chế tạo trong nước một số bộ phận của hệ thống:

tế bào đo dịng chảy theo nguyên lý quang học

5.2 Ý nghĩa của đề tài:

Hiện nay nhu cầu về thiết bị đo lường trong các lĩnh vực mơi trường, sản xuất thực phẩm, cơng nghiệp,…ở nước ta rất lớn, nhưng việc trang bị cho một phịng thí nghiệm phân tích địi hỏi chi phí rất cao Trong khi đĩ việc chế tạo thiết bị phân tích trong nước thì cịn nhiều hạn chế Do vậy, đề tài này đặt ra tháo gỡ một phần khĩ khăn về thiết bị cho các phịng thí nghiệm

Vì dầu dị nitrit chế tạo bản thân nĩ cũng cĩ thể hoạt động như một máy trắc quang phân tử vùng bước sĩng hẹp, do vậy cĩ thể dùng trang bị cho các phịng thí nghiệm thực tập trong cơng tác giáo dục thực hành tại các trường đại học

Việc chế tạo thành cơng một hệ thống phân tích dịng chảy giá thành thấp cho riêng nitrit về nguyên tắc cĩ thể chế tạo hoặc ứng dụng cho nhiều chỉ tiêu hoặc thơng số đo lường khác Do vậy, do đĩ đề tài này sẽ mở ra một triển vọng cho một ngành sản xuất mới đĩ là sản xuất thiết bị phân tích dịng chảy giá thành thấp

1 Hệ thống phối trộn - Vật liệu: ống teflon

số liệu được tối ưu hóa

2 Thiết kế tế bào đo dòng chảy và bộ phối trộn:

2.1 Tế bào đo dòng chảy:

Tế bào đo dòng chảy được thiết kế theo dạng chữ U (dạng 4B) Các loại vật liệu PVC, mica, teflon được khảo sát để chế tạo điện cực Chiều dài của tế bào đo được khảo sát thành 10,0mm, 20,0mm, 35,0mm Đường kính trong của tế bào được khảo sát

ở 1,0mm hai mặt của tế bào đo dòng chảy được dán miếng kính thủy tinh bằng nhựa

epoxy chuyên dụng Sau khi tế bào đo đã chế tạo xong, nguồn sáng và photodiod được

ép sát vào bề mặt của tế bào (Hình 6)

Hình6: Cấu tạo cắt ngang của tế bào đo dòng chảy tự chế tạo Sau khi chế tạo xong, tế bào dòng chảy được gắn vào đầu dò nitrit để kiểm tra tín hiệu thu nhận được Thành phần thuốc thử để khảo sát là hỗn hợp gồm: 50ml dung dịch SUL 10mg/mL và 50ml NED 1mg/mL Cấu hình hệ thống FIA lắp ráp như có thể thấy trong hình 7

Hình 7: Cấu hình hệ FIA trong thực nghiệm

Trong cấu hình này, ta sử dụng bơm nhu động có 2 kênh Một kênh cho hỗn hợp thuốc thử (chất mang), kênh còn lại dùng để hút các dung dịch nitrit chuẩn hoặc mẫu

Ống silicon sử dụng là loại lớn có đường kính trong 0.045inch (đai đỏ) Cách vận hành

phần mềm và thao tác thực hiện quy trình phân tích được mô ta chi tiết trong cuốn sổ tay hướng dẫn sử dụng phần mềm đính kèm báo cáo nghiệm thu này

Phần nghiên cứu này nhằm chế tạo được tế bào đo có kích thước và hình dạng phù hợp với những yêu cầu về độ nhạy, độ ổn định

2.2 Bộ phối trộn:

Bộ phối trộn được làm bằng vật liệu teflon Một số loại ống teflon có đường kính trong khác nhau cũng được nghiên cứu khảo sát gồm các loại 1,0mm, 2,0mm, 3,0mm

Đây là những loại ống teflon thông thường sử dụng cho máy HPLC Hình dạng và

chiều dài của ống teflon cũng được nghiên cứu nhằm mục đích tìm ra được hình dạng tối ưu và kích thước phù hợp để có được độ nhạy tốt nhất Cấu hình hệ thống FIA trong phần nghiên cứu này cũng được sử dụng tương tự như trong phần 2.1

2.3 Đo độ phân tán:

Để đo lường độ phân tán của hệ thống này, chúng tôi tiến hành đo lường độ phân

tán với chính sản phẩm diazo tạo thành bằng cách tiến hành phản ứng tạo thành hợp chất diazo giữa nitrit và các thuốc thử bên ngoài hệ thống, sau đó tiến hành tiêm vào hệ FIA Cách tiến hành như sau: Nitrit 200ppb, SUL 5g/ml: 10ml, NED 1mg/ml: 10ml, chờ khoảng 30 phút để bảo đảm phản ứng hóa học xảy ra hoàn toàn Cho hai kênh của bơm nhu động hút dung dịch trên vào hệ thống FIA, đo lường tín hiệu thu được, tính ra nồng độ C0 Sau đó thay một kênh để hút hỗn hợp thuốc thử, kênh còn lại để hút sản phẩm diazo với tốc độ hút 1,90ml/phút, thời gian hút 30s, tương ứng với lượng mẫu hút vào là 850µl, đo lường tín hiệu và tính ra nồng độ Cmax Hệ số phân tán D được tính như sau:

max

C

C D

o

3 Thiết kế mạch nhận tín hiệu:

Mạch nhận tín hiệu được thiết kế với một khuếch đại thuật toán TL081CN Sơ đồ mạch điện này được cho như hình 8 LED phát quang mã số 2SYG560 được sử dụng

có cực đại phát xạ tại bước sóng 560nm gần với bước sóng hấp thu của sản phẩm azo Photodiod được sử dụng là loại BPW21 có cường độ hấp xạ cực đại 550nm Nguồn cho LED được lấy trực tiếp từ modun chuyển đổi tương tự/số USB1208LS (cổng 13) Nhờ vậy cường độ phát xạ của LED được điều khiển trực tiếp từ phần mềm qua USB1208LS

Nguyên tắc hoạt động của mạch: Khi LED phát sáng, cường độ ánh sáng phát ra

được photodiode chuyển thành dòng diện i p, dòng điện này được biến đổi tương ứng

thành điện thế E p qua TL081CN:E p = −R1i p Điện thế này được biến đổi thành số qua USB1208LS và hiển thị trên máy tính Cường độ ánh sáng phát ra bị giảm bớt khi có một chất hấp thụ đặt chính giữa LED và photodiode Theo định luật Lamber – Beer, độ hấp thu tỉ lệ với nồng độ của chất hấp thu

Để giảm nhiễu từ nguồn điện bên ngoài, nguồn cấp cho mạch khuếch đại được lấy

trực tiếp từ cổng USB của máy tính (+5VDC) được chuyển đổi thành ±12VDC với IC

đảo điện áp DC/DC TRACO TEL 3 – 1222 Công suất tối đa của nguồn là 3W

Hình 8: Sồ đồ mạch điện khuếch đại tín hiệu

Mạch điều khiển định thời bơm nhu động được thiết kế với một rờ-le tinh thể rắn (solid state relay) như hình 9

Hình 9: Sơ đồ mạch điện điều khiển bơm nhu động Nguồn kích hoạt cho rờ-le được điều khiển bằng phần mềm qua USB1208LS (port30)

USB1208LS là một board tích hợp 4 tính chất: modun đọc tương tự sang số (analog to digital input), modun xuất số ra tương tự (digital to analog output), modun số đọc/xuất (Digital I/O) Với 4 kênh tương tự sang số, 2 kênh số sang tương tự, 4 kênh digital input, 4 kênh digital output Hình 10 là sơ đồ các chân của modun USB1208LS:

Hình 10: Cấu tạo ngoài và sơ đồ chân của USB1208LS

Sơ đồ chân của modun USB1208LS gắn vào board mạch được cho trong sơ đồ dưới

Tốc độ lấy mẫu của phần mềm có thể được thay đổi từ 1 – 1000 mẫu/giây (tốc độ lấy mẫu tối đa của modun USB1208LS là 1000 mẫu/giây, độ phân giải 12bit) Tín hiệu

được xử lý lọc nhiễu bằng thuật toán biến đổi Fourier nhanh (Fast Fourier Transform)

với mục đích làm cho đường nền nhẵn (smooth) hơn và pic có hình dạng rõ hơn

Hình 12: Giao diện chính của phần mềm thu nhận tín hiệu Phần mềm xử lý tín hiệu cho phép lọc nhiễu, tính diện tích, phương trình hồi quy, tính nồng độ, trình bày bảng số liệu, lưu đồ Như đã đặt ra mục tiêu từ đầu, phần mềm này cũng được thiết kế đơn giản, dễ sử dụng

Hình 13: Giao diện chính của phần mềm xử lý tín hiệu

5 Nghiên cứu tối ưu và kiểm định quy trình phân tích

Quy trình phân tích được tối ưu nhằm đạt được độ nhạy tốt nhất dựa trên các thông số: Thành phần thuốc thử, tỉ lệ trộn thuốc thử, thể tích tiêm mẫu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện… Tất cả những khảo sát này nhằm tìm ra một quy trình phân tích phù hợp Ảnh hưởng của matrix cũng được nghiên cứu trong môi trường nước lợ

5.1 Ảnh hưởng của bản chất acid dùng làm môi trường phản ứng:

Vì phản ứng tạo thành chất trung gian giữa acid nitrous và sulfanilamid diễn ra trong môi trường acid (pH = 0 – 2), do đó cần phải có mặt một acid để tạo môi trường acid đó Một số acid khác nhau được chọn nghiên cứu như: HCl, H2SO4, H3PO4 so sánh với trường hợp không dùng acid làm môi trường Bên cạnh đó, việc thay thế sử dụng sulfanilamid bằng acid sulfanilic cũng được nghiên cứu Vì xét về giá thành, acid sulfanilic rẻ hơn sulfanilamid (tuy độc tính có cao hơn của sulfanilamid) Việc này giúp lựa chọn được môi trường cũng như thành phần thích hợp cho phản ứng tạo màu Kết quả chọn lựa được đánh giá căn cứu trên độ nhạy trong trường hợp với thuốc thử nào cho tốt nhất

Để tiết kiệm được số kênh trong bơm nhu động, các thuốc thử được trộn lẫn với

nhau Tỉ lệ và hàm lượng của mỗi thuốc thử cũng được khảo sát trên cơ sở độ nhạy của phản ứng Bên cạnh đó, bản chất của dung dịch dùng làm chất mang cũng được khảo sát bao gồm: nước cất và chính hỗn hợp thuốc thử

Pha chế các dung dịch có nồng độ:

sulfanilic (viết tắt là SUL):10gam trong 500ml

N-etylenNaptyldiamin (viết tắt là NED): 5 gam trong 500ml

Tỉ lệ thuốc thử về thể tích được khảo sát ở các tỉ lệ: SUL: NED như sau: 1:1; 1:2, 1:3, 1:4, 1:5

5.3 Tốc độ của bơm nhu động:

Vì phản ứng giữa thuốc thử và nitrit xảy ra tương đối chậm, do vậy bơm nhu động cần phải có tốc độ đủ chậm để phản ứng xảy ra với hiệu suất cao nhất có thể Tuy nhiên bơm nhu động lại phải không được quá chậm để giảm thời gian phân tích cho một mẫu Do vậy, tốc độ bơm nhu động cũng được khảo sát nhằm tìm ra vận tốc tối ưu nhằm đạt độ nhạy tốt nhất

5.4 Đường chuẩn – giới hạn phát hiện:

Đường chuẩn được thực hiện với các thể tích tiêm mẫu khác nhau Hai phương

pháp phân tích: phân tích dòng chảy liên tục và phân tích dòng chảy không liên tục (stop flow injection analysis) được thực hiện và so sánh Gới hạn phát hiện được đánh giá theo hệ thức sau theo phương pháp nhanh mà IUPAC, ICH đề nghị[27]:

b

s

3 3

Trong đó b là hệ số góc của đường chuẩn, sre là độ lệch chuẩn của đường chuẩn

5.5 Ảnh hưởng của nền:

Ảnh hưởng của nền nước nuôi trồng thủy sản đã được nghiên cứu rất kỹ lưỡng

trong các tài liệu tham khảo khác Đặc biệt, trong TCVN 6178: 1996 có đề cập về ảnh hưởng của các thành phần nền, trong đó đáng lưu ý là ảnh hưởng của hàm lượng Cl- và

Fe3+ Do đó, trong đề tài này, hai ảnh hưởng của Cl- và Fe3+ được nghiên cứu

5.6 Đánh giá quy trình phân tích trên một mẫu thật:

Mẫu nước nuôi trồng thủy hải sản được lấy từ tại nuôi tôm xã Hiệp Phước, huyện Nhà Bè Bên cạnh đó một số mẫu khác như nước máy, nước ngầm và nước suối đóng chai cũng được phân tích Mẫu thật được phân tích bằng hệ thống FIA tự chế, có sử dụng phương pháp phân tích đối chứng theo TCVN 6178: 1996

Chương

3

Kết quả và thảo luận

1 Tế bào đo dòng chảy và bộ phối trộn:

1.1 Tế bào đo dòng chảy:

Vật liệu chế tạo: vật liệu PVC không thể dùng chế tạo vì các lý do: khi khoan lỗ,

PVC bị chảy do nhiệt từ mũi khoan, bề mặt khoan rất nhám và mũi khoan rất dễ gãy Xét về mặt hóa học, PVC là vật liệu không trơ như teflon và mica, dễ dàng bị hòa tan trong các dung môi hữu cơ, trong khi teflon và mica thì không Đặc tính tính của nhựa teflon là rất mềm và dai, do vậy khi khoan lỗ, bề mặt trong của lỗ rất nhám, mũi khoan cũng không thể khoan với kích thước dài hơn 2,0cm

Vật liệu mica có tính chất giòn, nhiệt nóng chảy cao hơn PVC bề mặt khi khoan lỗ nhẵn, có thể khoan với kích thước dài hơn 2 cm Do vậy trong thực nghiệm chúng tôi

đã chọn vật liệu mica để thử nghiệm

Chiều dài: Về mặt kỹ thuật, khi chiều dài của tế bào dòng chảy càng tăng lên thì

càng khó chế tạo, chiều dài tối đa chúng tôi có thể làm được là 3,5cm Đường kính trong của tế bào được khoan với kích thước 1,0cm giống như kích thước của tế bào dòng chảy ngoại nhập

Về mặt lý thuyết, theo định luật Lamber – Beer, độ hấp thu sẽ tỉ lệ với chiều dài của

tế bào đo Điều này có nghĩa là độ nhạy sẽ tăng khi chiều dài của tế bào đo càng tăng

Điều này có thể thấy như trong hình 14, với kích thước càng tăng, tín hiệu thu được

càng tăng Do vậy, so sánh các loại tế bào dòng chảy chế tạo được, loại 3,5cm cho độ nhạy tốt nhất Hình 14 còn cho thấy hệ thống FIA lắp ráp có tính ổn định và độ lặp lại khá tốt giữa các lần tiêm mẫu

Hình 14: Tín hiệu của dầu dò nitrit với tế bào dòng chảy có các kích thước khác nhau

(Nitrit 2000ppb, thời gian hút mẫu 20s)

Như phần tổng quan đã trình bày, trong FIA độ bành rộng của pic đóng vai trò không quan trọng trong phân tích bằng FIA, miễn là nó được giữa không đổi giữa các lần tiêm mẫu Tuy nhiên, một hệ FIA được xem là không tốt nếu độ bành rộng của pic càng lớn Về mặt lý thuyết, khi chiều dài tế bào càng ngắn, độ bành rộng của pic càng

bé Tuy nhiên kết quả trên không phản ánh được điều này, tức là độ bành rộng của pic không tăng theo chiều tăng của chiều dài của tế bào (hình 15)

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00

Hình 15: So sánh độ tăng của chiều cao pic và độ bành rộng pic khi tăng chiều dài

tế bào dòng chảy

Điều này có nguyên nhân từ sự phân tán giới hạn (D = 1 – 3), mà sự phân tán giới

hạn này lại có nguyên nhân từ sự tiêm một lượng mẫu khá lớn Hình 16 cho thấy kết quả đo lường độ phân tán trong hệ thống

Hình 16: Sự phân tán trong hệ thống FIA nghiên cứu (chiều dài bộ phối trộn: 250cm,

thời gian hút mẫu 30s, tốc độ 1,90ml/phút.)

Độ phân tán tính được có giá trị bằng 1,3 (ở thời gian tiêm mẫu 30s tương đương

850 µl mẫu được tiêm vào) Ở mức độ phân tán giới hạn này dẫn tới một hệ quả có lợi: giữa trạng thái ổn định và trạng thái phân tán có sự sai biệt không đáng kể, do đó ta có thể phân tích mẫu ở trạng thái phân tán có kiểm soát mà vẫn độ nhạy vẫn đạt Điều đó

sẽ giúp giảm thời gian phân tích Do đó về cơ bản, hệ thống FIA tự lắp ráp có độ phân tán đạt yêu cầu cho phân tích Độ phân tán là một giá trị đặc trưng cho một hệ thống FIA, phần 1.3 sẽ bàn luận sâu hơn về giá trị này

Câu hỏi đặt ra là liệu chiều dài của tế bào dòng chảy càng dài thì càng tốt? Thực ra không phải Vì trong nguyên lý phát hiện của detector FIA, sự phát hiện không phải ngay trực tiếp chất phân tích mà là sản phẩm phản ứng giữa chất phân tích và thuốc thử Phản ứng hóa học cần có thời gian diễn tiến Trong tế bào dòng chảy, từ lúc sản phẩm của chất phân tích bắt đầu đi vào tế bào tới lúc nó ra khỏi tế bào phải mất vài giây hoặc có thể hơn 1 phút như kết quả ở trên Trong thời gian đó phản ứng hóa học tiếp tục diễn ra, điều này có thể khiến cho hình dạng của pic bị biến dạng dẫn tới quá trình tính tích phân sẽ không còn chính xác Do vậy, chiều dài của tế bào dòng chảy

cần được tối ưu cho từng hệ thống và phương pháp phân tích Với những kết quả thu

được ở trên và những kết quả nghiên cứu quy trình phân tích như có thể thấy trong các

phần nghiên cứu dưới đây chúng tôi cho rằng tế bào dòng chảy với chiều dài 3,5cm,

đường kính trong là 1,0mm là đạt yêu cầu cho phân tích nitrit

1.2 Bộ phối trộn:

Bộ phối trộn là nơi diễn ra phản ứng hóa học giữa thuốc thử và chất phân tích Cấu tạo của bộ phối trộn này cũng ảnh hưởng tới độ phân tán cũng như độ nhạy, trong đó phải kể đến hình dạng, chiều dài, đường kính trong của bộ phối trộn Để đạt được độ nhạy tốt nhất, trong khi tiết kiệm được thời gian phân tích và thuốc thử cần thiết phải nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố trên

Chiều dài của bộ phối trộn: Khi phản ứng hóa học diễn ra trong hệ thống FIA diễn

ra chậm, nó cần thời gian để diễn tiến Bộ phối trộn giúp cho quá trình hòa trộn giữa thuốc thử và chất phân tích, làm cho phản ứng diễn ra thuận lợi Chiều dài của nó ảnh hưởng đáng kể tới độ phân tán [1-3], nghĩa là chiều dài càng tăng, độ phân tán càng lớn, cường độ pic càng bé, độ nhạy càng giảm Tuy nhiên chiều dài của bộ phối trộn lại

có tác dụng tăng thời gian phản ứng giữa thuốc thử và chất phân tích Chiều dài càng tăng, thời gian phản ứng càng tăng, độ nhạy càng tăng Phản ứng giữa nitrit và các thuốc thử acis sulfanilic và naptyletylendiamin có tốc độ khá chậm, nhất là trong môi trường có nhiều clorua (môi trường nước mặn, nước lợ) [18-19] Do vậy chiều dài của

bộ phối trộn cần được nghiên cứu Ảnh hưởng của nó đến tín hiệu phân tích như có thể thấy trong hình 17