hoàn thiện và phát triển các bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán các bệnh do hbv (hepatitis), hcv (hepatitis c virus) và hpv (human papillomavirus)

So sánh kết quả của quy trình với kết quả khi sử dụng những phương pháp khác trên 20 bệnh phẩm mỗi loại Phát hiện HBV Định lượng HBV Versant™ HBV DNA 3.0 assay bDNA BayerPhát hiện HCV

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (đã chỉnh sửa)

DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM

HOÀN THIỆN VÀ PHÁT TRIỂN CÁC BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DO HBV (HEPATITIS B VIRUS), HCV (HEPATITIS C VIRUS),

HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS)

Chủ nhiệm dự án : PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

Cơ quan chủ trì : Công ty TNHH CNSH KHOA THƯƠNG

Năm 2008

MỤC LỤC

Trang

2 Triển khai sản xuất thử nghiệm 44

Hướng dẫn sử dụng 82 Phụ lục 8 Quy trình sản xuất và kiểm tra chất lượng 120 Phụ lục 9 Phân tích hiệu quả kinh tế 129

TỔNG QUAN

Theo Tổ chức Y Tế Thế giới (WHO), bệnh truyền nhiễm nói chung và bệnh nhiễm khuẩn nói riêng đang có khuynh hướng gia tăng và là mối đe dọa chung trên phạm vi toàn cầu Một số bệnh như viêm màng não, dịch tả, sốt vàng, … sau nhiều năm suy giảm đã gia tăng trở lại tại nhiều quốc gia Nhiều loại bệnh mới nảy sinh với tốc độ nhanh chưa từng có Bệnh Suy đường hô hấp cấp (SARS) bùng nổ tại nhiều quốc gia châu Á vừa qua là một ví du.ï Trước tình hình đó, nhu cầu về những biện pháp hiệu quả để phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị bệnh nhiễm trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết

1 MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CÁC BỆNH NHIỄM : VIÊM GAN SIÊU VI B VÀ C, NHIỄM HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS

1.1 Viêm gan siêu vi B và C

Viêm gan siêu vi là các bệnh nhiễm trùng do nhiều loại siêu vi có ái tính với tế bào gan gây ra, dẫn đến viêm và hoại tử tế bào gan Các bệnh này tuy có triệu chứng tương tự nhau nhưng lại rất khác nhau về nguyên nhân, dịch tễ, lịch sử tự nhiên và tiên lượng Trong số các siêu vi gây viêm gan tìm thấy được cho đến nay bao gồm siêu vi viêm gan A, B, C, D và E, siêu vi B (HBV) và C (HCV) có ý nghĩa quan trọng do sự phân bố địa dư rộng, tỷ lệ nhiễm cao ở một số vùng trên thế giới và có nguy cơ cao dẫn đến tình trạng nhiễm mạn tính và ung thư

Các chẩn đoán viêm gan siêu vi hiện nay chủ yếu dựa vào biểu hiện lâm sàng, sinh thiết gan, xét nghiệm sinh hoá và phản ứng huyết thanh Các biện pháp này trong nhiều trường hợp không cho phép xác định chính xác tác nhân gây bệnh và nhất là không cho biết về trạng thái tồn tại của các tác nhân này ở bệnh nhân

Viêm gan siêu vi B

Bệnh viêm gan siêu vi do HBV có thời gian ủ bệnh biến động trong khoảng 60-110 ngày Tỉ lệ nhiễm HBV mãn tính ở Bắc Mỹ thấp hơn 2% số người bị nhiễm Tỉ lệ này cao hơn nhiều ở châu Á, Phi, các đảo Thái Bình Dương và ở người Eskimo Đây là một vấn nạn y tế lớn - người ta ước chừng có khoảng 300 triệu người mang mầm bệnh mãn tính trên thế giới, và khoảng 3,5 tỷ người sống trong những vùng bệnh lưu hành ở mức độ trung bình hoặc cao Trên 122 triệu

em bé ra đời mỗi năm ở những vùng này và có nguy cơ rất cao trở thành những người mang mầm bệnh ; khoảng 25%-30% những người mang mầm bệnh bị nhiễm trong thời niên thiếu sẽ chết do các bệnh gan mãn tính hay ung thư gan

HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có vật liệu di truyền là một mạch đôi DNA không hoàn toàn có kích thước khoảng 3,2 kb được bao bởi nucleocapsid có chứa kháng nguyên lõi HBcAg, bên ngoài là kháng nguyên bề mặt HBsAg Virus hoàn chỉnh là một tiểu thể hình cầu có đường kính 42-47 nm, được gọi là hạt tử Dane

Do triệu chứng lâm sàng của tình trạng nhiễm HBV không phân biệt được với các dạng viêm gan siêu vi khác nên việc phát hiện bệnh chủ yếu dựa trên các chẩn đoán huyết thanh học Tình trạng nhiễm HBV cấp tính được đặc trưng bởi sự hiện diện của HBsAg và IgM anti-HBc trong huyết thanh Các phương pháp huyết thanh học cho phép phát hiện các thành phần vừa nêu bao gồm phương pháp khuếch tán miễn dịch, thử nghiệm kết dính hồng cầu và những thử nghiệm có độ nhạy cao hơn như miễn dịch enzyme (EIA) và miễn dịch phóng xạ (RIA) có thể phát hiện đến 0,1 ng/ml HBsAg Gần đây người ta phát triển các chẩn đoán phân tử có độ nhạy cao hơn như lai phân tử (slot hoặc dot blot) có thể phát hiện DNA HBV đến hàm lượng 5pg/ml (tương ứng 1,5 x 106 bản sao/ml) Một thử nghiệm lai trong pha lỏng đã thương mại hoá (Abbott) phát hiện được 1,5 pg/ml DNA HBV còn thử nghiệm bDNA (Chiron) phát hiện 2,5 pg/ml DNA HBV PCR có độ nhạy còn cao hơn nhiều, có thể phát hiện được 10-3 pg/ml (tương ứng khoảng 100-1000 bộ gene) [1]

Viêm gan siêu vi C

Siêu vi viêm gan C (HCV), được xếp vào họ Flaviviridae, có vật liệu di truyền là một RNA mạch đơn (+), kích thước khoảng 9,5 kb Virus này không thể nuôi cấy được và được xem là nguyên nhân của phần lớn các trường hợp viêm gan

"không A không B" Mặc dù HCV không gắn chèn vào bộ gene ký chủ nhưng lại có khả năng tồn tại đặc biệt dai dẳng ở người bị nhiễm Sự nhiễm HCV dẫn đến tình trạng bệnh mãn tính trong 50-70% trường hợp Nhiễm cấp tính HCV thường

ít có hoặc có triệu chứng nhẹ, khó nhận biết Chỉ khoảng 10% người nhiễm thải loại hoàn toàn virus, số còn lại chuyển sang tình trạng mãn tính Trong số sau này, ít nhất 60% phát triển viêm gan mạn Khoảng 20% bệnh nhân viêm gan mạn sẽ bị xơ gan và một số chết do mất chức năng gan hoặc do ung thư gan Riêng ở thành phố Hồ Chí Minh, ung thư gan nguyên phát chiếm vị trí thứ ba trong các dạng ung thư và vị trí thứ nhất ở bệnh nhân nam Một công trình nghiên cứu dịch tễ học sự nhiễm HCV cho thấy tỉ lệ lưu hành HCV ở người bình thường là 1,8%, và cao hơn nhiều ở các nhóm người có nguy cơ, từ 50% ở người nhận truyền máu cho đến 96,2% ở người nghiện [2] Việc phát hiện HCV trong máu người bị nhiễm vừa có ý nghĩa cho chẩn đoán và theo dõi điều trị, vừa có tầm quan trọng đặc biệt trong việc sàng lọc để đảm bảo an toàn truyền máu và các sản phẩm từ máu

Biện pháp chẩn đoán HCV đầu tiên là ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) sử dụng kháng nguyên c100 tạo dòng từ bộ gene HCV (Chiron/Ortho Diagnostic Systems) Một loạt các chẩn đoán sử dụng thêm nhiều kháng nguyên tái tổ hợp khác của HCV ra đời sau đó, với độ nhạy và độ đặc hiệu ngày càng cao như ELISA thế hệ thứ hai, RIBA (Recombinant Immunoblot

Assay) thế hệ thứ nhất, thứ hai, thứ ba Tuy nhiên các phương pháp xét nghiệm miễn dịch này có một số nhược điểm như không phát hiện được sự nhiễm ở giai đoạn sớm hoặc không cho kết quả ở người mà hệ thống miễn dịch không hoạt động (immunosuppressed) Các bộ kit dựa trên kỹ thuật PCR được phát triển cho phép phát hiện trực tiếp HCV ngay trong thời kỳ viremia với độ nhạy cao, đến khoảng 2.000 bản sao/ml huyết thanh Thế mạnh của kỹ thuật này được kể là : chẩn đoán sớm và chính xác ở người có nguy cơ cao, phát hiện HCV ở người mang không triệu chứng, ở người có hàm lượng ALT cao, ở người có hệ thống miễn dịch không hoạt động, khẳng định kết quả ELISA dương tính và theo dõi điều trị Amplicor HCV (Roche Diagnostic Systems) là một bộ kit dựa trên kỹ thuật PCR đã được thương mại hóa Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng các biện pháp vừa kể Kỹ thuật bDNA định lượng HBV cũng đã được áp dụng tại Trung Tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo Tp HCM

1.2 Human papillomavirus (HPV)

Ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh thuộc hàng đầu và là nguyên nhân lớn thứ hai gây nên cái chết cho phụ nữ trên toàn thế giới Hàng năm có 440.000 ca bệnh mới chiếm tỉ lệ 5,8% trong các bệnh ung thư [3] Ở Việt Nam, ung thư cổ tử cung cũng là bệnh hàng đầu ở phụ nữ miền Nam và thứ tư ở phụ nữ miền Bắc Theo thống kê về ghi nhận ung thư quần thể ở thành phố Hồ Chí Minh (1998) thì thành phố có thêm 28,6 người trên 100.000 phụ nữ mắc bệnh này mỗi năm Khoảng từ 90-99,7% trường hợp bệnh ung thư cổ tử cung được phát hiện có dấu hiệu của sự nhiễm một hay nhiều loại HPV (human papillomavirus) gây ung thư

Human Papillomavirus (HPV) là một trong những virus lây truyền qua đường tình dục phổ biến, gây ra nhiều loại bệnh khác nhau ở người như mụn cóc,

u nang biểu mô… và liên quan đến nhiều loại ung thư trong đó đáng chú ý nhất là ung thư cổ tử cung ở phụ nữ Đây là virus nhỏ có đường kính khoảng 55nm với bộ gene DNA vòng mạch kép gồm từ 7.200-8.000 cặp base với khoảng 10 khung đọc mở Hiện nay hơn 77 kiểu gene (genotype) khác nhau của virus này đã được xác định ở người đã được giải trình tự Người ta chia HPV sinh dục - nhóm các HPV xâm nhiễm chủ yếu bề mặt niêm mạc, thường thấy ở đường sinh dục - thành hai loại dựa trên khả năng gây ung thư Đó là nhóm "nguy cơ thấp" (low risk), ít có khả năng gây ung thư và nhóm "nguy cơ cao" (high risk), có khả năng gây ung thư cao Gene HPVE6 và HPVE7 của virus có khả năng gắn xen vào bộ gene, phiên mã tạo ra oncoprotein E6 và E7 Các protein E6 và E7 của các HPV "nguy

cơ cao" có khả năng gắn kết cao với các protein p53 (có chức năng tiêu diệt tế bào tổn thương trong giai đoạn G1 của quá trình phân bào) và pRB (có chức năng điều hoà quá trình phân bào) Phức hợp E6/p53 làm mất hoạt tính của p53 khiến

mã là E2F làm tăng sự phiên mã, hoạt hoá quá trình phân bào Gene E6 và E7 được tìm thấy trong các tế bào ung thư HPV dương tính [3]

Phương pháp chẩn đoán tế bào học do Papanicolaou phát minh năm 1949, thường được gọi là PAP test (Pap smear), đã làm giảm đáng kể số tử vong do ung thư cổ tử cung và đã trở nên biện pháp phát hiện sớm ung thư cổ tử cung rất thông dụng Tuy nhiên, biện pháp này không chính xác, dễ cho kết quả âm tính và dương tính giả, và cần được kết hợp với một số kiểm tra khác Một số kỹ

thuật phân tử như PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) được phát triển gần

đây để phát hiện sự hiện diện của DNA HPV trong tế bào cổ tử cung Các kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác định được các type và phân biệt các thương tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV Phương pháp lai trong pha lỏng đã được phát triển thành các bộ kit (Hybrid Capture Tube (HCT), Hybrid Capture II) (Digene Corporation) và được phép sử dụng trong chẩn đoán giúp xác định nhóm HPV "nguy cơ cao" và "nguy cơ thấp" Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ MY09-MY11 [4] và hệ GP5+-GP6+ [5] Các hệ primer này được thiết kế dựa trên trình tự gene L1, cho phép phát hiện sự hiện diện của nhiều type HPV trong bệnh phẩm

1 MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỄM

Cho đến nay, các phương pháp chẩn đoán bệnh nhiễm chủ yếu dựa trên biểu hiện lâm sàng, kết quả soi, cấy vi trùng và các xét nghiệm sinh hoá, miễn dịch cổ điển Tuy vẫn được sử dụng phổ biến, các biện pháp nêu trên đều có những nhược điểm riêng Chẩn đoán dựa trên biểu hiện lâm sàng chỉ tiến hành được khi đã xuất hiện triệu chứng, không đặc hiệu cho bệnh, khó cho phép phân biệt một số bệnh nhiễm trùng ở giai đoạn sớm Kỹ thuật nuôi cấy và định danh có độ nhạy thấp, đòi hỏi một lượng vi sinh vật cao trong bệnh phẩm ; khó tiến hành ở một số vi sinh vật nuôi cấy không được hay phát triển rất chậm và khó khăn do đặc tính tự nhiên ; và đặc biệt không có hiệu quả khi bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó Các phương pháp sinh hóa và miễn dịch là những phương pháp phát hiện gián tiếp thông qua đáp ứng của bệnh nhân nên thường khó cho kết quả chính xác ở giai đoạn sớm của bệnh Các phương pháp này không có độ đặc hiệu cao (trừ phi sử dụng kháng thể đơn dòng trong xét nghiệm miễn dịch, vốn đắt tiền và khó sản xuất) Tóm lại, các biện pháp vừa kể, dù sử dụng riêng lẻ hay kết hợp, thường ít cho kết quả như ý do độ đặc hiệu và độ nhạy không cao, hoặc do thời gian chờ đợi kết quả rất dài ; do đó có ý nghĩa hạn chế cho phục vụ điều trị

Các phương pháp sinh học phân tử ngày càng được phát triển để sử dụng như những công cụ chẩn đoán, điều trị, nghiên cứu dịch tễ học và kiểm tra dịch bệnh trong lĩnh vực bệnh nhiễm Các ưu điểm chính của chẩn đoán phân tử là :

(1) độ đặc hiệu gần như tuyệt đối vì phát hiện trực tiếp vật liệu di truyền của vi sinh vật gây bệnh, (2) độ nhạy rất cao, nhất là đối với kỹ thuật PCR, cho phép phát hiện một lượng vi sinh vật rất nhỏ, (3) thời gian cho kết quả nhanh, (4) có thể được tự động hóa và "kit" hoá Tuy nhiên, chẩn đoán phân tử cũng bao hàm một số nhược điểm : giá xét nghiệm cao, thiết bị đắt tiền, quy trình chẩn đoán không phải lúc nào cũng được chuẩn hóa, kỹ thuật viên phải được đào tạo kỹ Mặc dù vậy, trên thế giới ngày càng phát triển xu hướng sử dụng một cách chọn lọc và có kiểm soát các kỹ thuật sinh học phân tử để bổ sung, hỗ trợ cho các chẩn đoán cổ điển Các bộ kit thương mại hóa dùng để phát hiện các tác nhân gây bệnh được ưa chuộng vì chúng dễ sử dụng, tránh được ngọai nhiễm do khâu chuẩn

bị, sử dụng các hóa chất, sinh phẩm và điều kiện kiểm tra đã được chuẩn hóa Tuy vậy, nhiều tác giả khuyến cáo nên phát triển những phương pháp "tự chế" để đáp ứng với các nhu cầu thực tế nảy sinh và để phù hợp với túi tiền của người bệnh ở các nước đang phát triển

Các chẩn đoán phân tử chủ yếu dựa trên kỹ thuật lai phân tử và PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp dây chuyền)

Các test kits sử dụng mẫu dò (lai phân tử) để phát hiện tác nhân gây bệnh được thương mại hóa sớm và hiện vẫn đang được sử dụng rộng rãi, điển hình như

hệ thống PACE2 (Gen-Probe) nhằm phát hiện đồng thời Neisseria gonorrhoeae và Chlamydia trachomatis hay hệ thống Hybrid capture (Digene, Murex) để phát

hiện HPV (Human Papillomavirus), HSV (Herpes Simplex Virus), CMV (Cytomegalovirus) Các phương pháp vừa kể rất nhanh và đơn giản nhưng có độ nhạy kém, chỉ thật sự có hiệu quả khi số lượng bản sao bộ gene của tác nhân gây bệnh trong bệnh phẩm đạt 104 bản sao/ml Các phương pháp sử dụng mẫu dò có kết hợp khuếch đại tín hiệu như bDNA (branched DNA probe) (Chiron) hay QB replicase (Gene-Trak) được phát triển để cải tiến độ nhạy của phản ứng đến khoảng 500 bản sao bộ gene/ml

Tuy nhiên, các kỹ thuật nhân bản trình tự đích, thông dụng nhất là kỹ thuật PCR, ngày càng chiếm ưu thế do độ nhạy không gì sánh được Bên cạnh ngày càng nhiều bộ kit PCR được các hãng lớn thương mại hóa là vô số các bộ kit và phương pháp được phát triển ngay tại các phòng thí nghiệm lâm sàng để phục vụ nhu cầu tại chỗ Trong các bộ kit này, kỹ thuật PCR kết hợp với điện di, lai phân tử, sử dụng enzyme cắt giới hạn, … cho phép phát hiện các tác nhân gây bệnh với hàm lượng rất thấp, thời gian xét nghiệm nhanh và hoàn toàn đặc hiệu Một vài bộ kit PCR điển hình đã được FDA (Food and Drug Administration)

công nhận để đưa vào sử dụng như : các bộ kit phát hiện Chamydia trachomatis,

Mycobacterium tuberculosis, định lượng HIV (Roche Diagnostic System)

giảm thiểu các xét nghiệm ít đặc hiệu và ít nhạy hơn, giảm thiểu các quy trình chẩn đoán và điều trị không cần thiết cũng như giúp loại bỏ tình trạng nhiễm trùng bệnh viện Bên cạnh đó, các chương trình y tế nhằm sàng lọc và kiểm soát

tác nhân gây bệnh như HPV, Chlamydia, các tác nhân gây bệnh hiện diện trong

máu, … ở mức độ phân tử đối với cá nhân hoặc tập thể những người có nguy cơ cao cũng cũng có ý nghĩa kinh tế xã hội quan trọng Chi phí bỏ ra để đổi lấy lợi ích của chẩn đoán và điều trị sớm ở cá nhân, kiểm soát sự lây lan trong quần thể và các vấn đề khác của y tế cộng đồng là có thể chấp nhận được

Ở nước ngoài, chủ yếu dựa trên các kỹ thuật lai phân tử và PCR, nhiều bộ thử nghiệm (kit) chẩn đoán phân tử đã được thương mại hóa và sử dụng cho chẩn đoán thường quy Các bộ kit này hầu như được cung cấp cho kỹ thuật viên xét nghiệm dưới dạng “sẵn sàng cho sử dụng” giúp giảm thiểu các khâu chuẩn bị có thể dẫn đến ngoại nhiễm; ngoài ra, các hóa chất, sinh phẩm và quy trình đã được kiểm tra và chuẩn hóa đảm bảo tính ổn định và độ tin cậy của xét nghiệm

Ở nước ta và ở Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng, đã có một số nghiên cứu phát triển và thương mại hóa các bộ kit dùng trong chẩn đoán phân tử một số

bệnh truyền nhiễm do các siêu vi gây viêm gan (HBV, HCV), Mycobacterium

tuberculosis, … , như Công ty Nam Khoa Số lượng và chất lượng các bộ kit phát

triển trong nước cho đến nay chưa đáp ứng hết nhu cầu thực tế Hiện nay một số bệnh viện và trung tâm y tế lớn cũng đã bắt đầu thử nghiệm các bộ kit này cũng như một số bộ kit nhập như Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Hoà Hảo, các phòng xét nghiệm của Bệnh viện Đại học Y Dược, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Hoàn Mỹ, … Vấn đề đặt ra hiện nay đối với các bộ kit nhập là chi phí cho một xét nghiệm rất lớn, ví dụ như một xét nghiệm phát hiện HCV sử dụng hệ thống Amplicor (Roche) có giá là 1,5 triệu đồng cho một mẫu thử Còn đối với các kit phát triển trong nước vấn đề lớn là mức độ chuẩn hóa thấp, dẫn đến sự không thống nhất lớn giữa các cơ sở xét nghiệm, kết quả không có độ tin cậy cao Vấn đề về nhân viên kỹ thuật được đào tạo bài bản cũng phải được giải quyết để đảm bảo độ chính xác của phản ứng

Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – bộ môn Di Truyền – trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG Tp HCM đã tiến hành nghiên cứu và nghiệm thu các đề tài có liên quan đến dự án bao gồm :

1 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán một số bệnh nhiệt đới (Sốt xuất huyết Dengue, Viêm gan siêu vi B và C, Viêm não Nhật bản, nhiễm HPV (Human Papillomavirus) – đề tài NCKH trọng điểm ĐHQG Tp HCM, nghiệm thu 2004

2 Xây dựng quy trình phát hiện HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên cứu và chẩn đoán – đề tài Vườn ươm sáng tạo KHKT trẻ – Sở KH & CN Tp HCM, nghiệm thu 2004

3 Xây dựng quy trình định lượng virus viêm gan B trong máu bệnh nhân bằng kỹ thuật real-time PCR – đề tài NCKH trọng điểm ĐHQG, nghiệm thu 2005

4 Xây dựng quy trình định lượng virus viêm gan C bằng kỹ thuật real-time PCR phục vụ cho việc nghiên cứu và điều trị bệnh viêm gan siêu vi C – đề tài Sở

RT-KH & CN Tp HCM, nghiệm thu 2005

Từ các kết quả nghiệm thu trên, chúng tôi tiếp tục hoàn thiện các kit HBV và HCV định tính, HBV và HCV định lượng và đưa thử nghiệm tại các cơ sở y tế có quan hệ hợp tác và nhu cầu sử dụng thông qua việc chuyển giao công nghệ cho Công ty TNHH CNSH Khoa Thương

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Tiến hành triển khai các quy trình và các bộ kit dùng cho chẩn đoán phân tử đối với các tác nhân virus bao gồm HCV, HBV, HPV từ các kết quả nghiên cứu cơ bản đạt được và từ các thành tựu đã công bố trên thế giới

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

1 HOÀN THIỆN CÁC QUY TRÌNH

D Bệnh phẩm

Các mẫu huyết thanh nghi nhiễm HCV, HBV do Bệnh viện ĐH Y Dược, DIAG Center và Trung tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo (Medic) cung cấp trong thời gian từ tháng 9/2005 đến tháng 4/2006 Các mẫu dịch phết cổ tử cung do Bệnh viện Hùng Vương Tp HCM cung cấp trong thời gian từ tháng 9/2005 đến tháng 4/2006

D Các đơn vị tham gia :

- Phòng Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y Dược Tp HCM (BV ĐH Y Dược)

- Phòng PCR – DIAG Center (DIAG Center)

- Phòng PCR – BV Hùng Vương Tp HCM (BV Hùng Vương)

- Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên (ĐH KHTN)

1.1 Độ đúng (Accuracy)

Đơn vị chịu trách nhiệm là ĐH KHTN

Độ đúng của các quy trình được xác định với hai cách tiếp cận :

W So sánh kết quả thu được từ các quy trình thử nghiệm với kết quả đã biết trên 10 bệnh phẩm Cụ thể, kết quả của quy trình phát hiện và định lượng HBV cũng như quy trình phát hiện và định lượng HCV được so sánh với kết quả bDNA và với hàm lượng DNA HBV và HCV đã biết ; kết quả quy trình phát hiện và phân nhóm HPV thì được so sánh với kết quả giải trình tự

Thao tác viên nhận 10 bệnh phẩm từ trưởng nhóm không kèm thông tin gì về bệnh phẩm Đối với mỗi bệnh phẩm, thao tác viên tiến hành tách chiết DNA/RNA và đặt 03 phản ứng PCR/RT-PCR độc lập, sử dụng cùng bộ dụng cụ, cùng lô hóa chất và cùng máy PCR

W Sử dụng các huyết thanh có hàm lượng HBV (5.105 IU/ml) và HCV (5.104 IU/ml) đã biết do WHO cung cấp để kiểm tra độ chính xác của hai quy trình định lượng HBV và HCV Các huyết thanh WHO được sử dụng để kiểm tra độ chính xác của đường cong chuẩn do chúng tôi xây dựng

Các huyết thanh WHO được pha loãng bậc 10 thành ba nồng độ dùng để xây dựng đường cong chuẩn WHO Đường chuẩn WHO và đường chuẩn từ amplicon do chúng tôi xây dựng được sử dụng để định lượng DNA HBV và RNA HCV của 5 bệnh phẩm Các kết quả từ hai phản ứng định lượng được so sánh để rút ra kết luận

1.2 Độ lặp lại :

Các đơn vị tham gia nghiên cứu bao gồm :

Phát hiện HPV

Định nhóm HPV

1) BV ĐH Y Dược 2) BV Hùng Vương Thiết bị sử dụng :

- BV ĐH Y Dược : iCycler 584BR

- DIAG Center : iCycler 582BR iQ5

- BV Hùng Vương : Master Cycler 22331(Eppendorf)

Độ lặp lại của quy trình được định nghĩa là mức độ giống nhau giữa các lần lặp lại khi tiến hành quy trình trong cùng điều kiện và trong những điều kiện khác nhau [6]

Độ lặp lại của các quy trình được khảo sát trên 10 bệnh phẩm đã được kiểm tra dương tính như nêu ở mục 1.1 Các bệnh phẩm này được phân làm ba phần, một phần lưu tại ĐH KHTN, hai phần còn lại được chuyển ngay đến các đơn vị tham gia nghiên cứu

Đối với mỗi mẫu, hai kỹ thuật viên tại ĐH KHTN sẽ tiến hành lặp lại 03 lần Tại mỗi cơ sở y tế tham gia nghiên cứu, một kỹ thuật viên tiến hành tách chiết DNA/RNA và đặt phản ứng PCR/RT-PCR theo quy trình do ĐH KHTN cung cấp

1.3 Xác định ngưỡng phát hiện đối với hai quy trình định lượng HBV và HCV :

Đơn vị chịu trách nhiệm : ĐH KHTN

Thiết bị sử dụng : iCycler 584BR

Các amplicon HBV và HCV dùng để xây dựng đường chuẩn định lượng với nồng độ 1014 bản sao/ml được pha loãng bậc 10 đi từ 100 đến 109 Mỗi quy trình định lượng được tiến hành ba lần trên từng nồng độ pha loãng

1.4 So sánh kết quả của quy trình với kết quả khi sử dụng những phương pháp khác trên 20 bệnh phẩm mỗi loại

Phát hiện HBV

Định lượng HBV Versant™ HBV DNA 3.0 assay (bDNA)

(Bayer)Phát hiện HCV

Định lượng HCV Versant™ HCV RNA 3.0 assay (bDNA)

(Bayer)

Các kết quả từ phương pháp bDNA do Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Hòa Hảo cung cấp

1.5 Tính ổn định theo thời gian của sản phẩm :

Tính ổn định của các kit thử nghiệm được kiểm tra liên tục sau 14, 30, 60,

90, 120, 150, 180 ngày Ở mỗi đợt kiểm tra, lô sản phẩm đã qua các thời gian bảo quản ở -20°C và lô sản phẩm mới pha sẽ được sử dụng song song trên 01 mẫu âm tính và 01 mẫu dương tính với tác nhân cần kiểm tra

1.6 Độ đặc hiệu và độ nhạy lâm sàng

Xác định tỉ lệ người mắc bệnh và không mắc bệnh thực tế dựa trên tổ hợp nhiều phương pháp và so sánh với kết quả thu được với các kit thử nghiệm Kết quả phát hiện HBV, HCV được so sánh với tổ hợp kết quả sinh hóa và miễn dịch; kết quả phát hiện HPV được so sánh với kết quả Pap test

2 TRIỂN KHAI SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM

2.1 Chuyển giao kỹ thuật

Trước khi các kit được đưa thử nghiệm tại các cơ sở y tế tham gia nghiên cứu, chúng tôi tổ chức huấn luyện kỹ thuật thao tác cho các kỹ thuật viên về tất cả các công đoạn của quy trình trong thời gian 1-2 tuần

2.2 Tổ chức sản xuất và cung cấp kit cho các cơ sở y tế tham gia nghiên cứu

2.2.1 Đặt hàng

2.2.2 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu

2.2.3 Pha chế các hỗn hợp tách chiết DNA/RNA, PCR, RT/PCR định tính, PCR/RT-PCR định lượng

2.2.4 Kiểm tra chất lượng các kit

2.2.5 Giao hàng

2.3 Giải quyết các vấn đề “hậu mãi”

NỘI DUNG - KẾT QUẢ

1 HOÀN THIỆN CÁC QUY TRÌNH

1.1 Quy trình phát hiện HBV

1.1.1 Độ đúng

Kết quả phát hiện HBV với kit HBV định tính trên 10 bệnh phẩm lặp lại

ba lần của hai người thao tác được trình bày trong bảng 1 Kết quả đầy đủ được trình bày trong phụ lục 1 Kết quả được tính là dương hay âm tính khi cả 03 lần lặp lại cho cùng kết quả Các kết quả dương/âm tính được đánh giá dựa trên sự phù hợp với kết quả bDNA HBV

Bảng 1 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm của 02 người thao tác

Bệnh phẩm Kết quả 03 lần lặp

lại của người I

Kết quả 03 lần lặp lại của người II

Kết quả định lượng bằng bDNA (bản sao/ml)

Trong số các bệnh phẩm thử nghiệm có 01 bệnh phẩm âm tính với HBV và

10 bệnh phẩm có chứa các hàm lượng virus khác nhau đi từ 130.419 bản sao/ml đến 6.628.213 bản sao/ml Kết quả trên cho thấy quy trình phát hiện HBV phù hợp 100% với kết quả định lượng bằng phương pháp bDNA

1.1.2 Độ lặp lại

Kết quả phát hiện HBV với kit HBV định tính từ 02 cơ sở y tế là BV ĐH Y Dược và DIAG Center được trình bày trong bảng 2

Bảng 2 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm ở 02 cơ sở y tế

1.1.3 So sánh kết quả sử dụng kit HBV định tính với kết quả sử dụng kit Versant (Bayer) trên 20 bệnh phẩm

Bảng 3 Kết quả thu được với kit HBV định tính và kit Versant (Bayer)

Bệnh phẩm Kit Versant (bản sao/ml) Kit HBV định tính

Kết quả (bảng 3) cho thấy :

- 19 mẫu dương tính với kit HBV định tính có hàm lượng HBV từ 3.261 bản sao/ml đến > 108 bản sao/ml ; điều này phù hợp với ngưỡng phát hiện của kit HBV định tính là 103 bản sao/ml

1 2 3 4

- 2 mẫu âm tính có hàm lượng HBV thấp dưới ngưỡng phát hiện của kit Versant HBV DNA

1.1.4 Tính ổn định của sản phẩm theo thời gian bảo quản

Tính ổn định này được đánh giá một cách tương đối dựa trên kết quả dương/âm tính và việc so sánh cường độ tín hiệu quan sát bằng mắt thường giữa các phản ứng sử dụng lô sản phẩm bảo quản và lô sản phẩm mới trên cùng một bệnh phẩm Bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm thu nhận ngay trước khi tiến hành thí nghiệm ; lô mới được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm

Bảng 4 Kết quả khảo sát độ ổn định của kit HBV định tính theo thời gian

Lô bảo quản Lô mới

Thời gian (ngày)

Mẫu (-) Mẫu (+) Mẫu (+)

Kết quả cho thấy kit HBV định tính giữ nguyên hiệu quả trong thời gian

1 2 3 4

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

1 2 3 4 1 2 3 4

1.2 Kit HCV định tính

1.2.1 Độ đúng

Kết quả phát hiện HCV với kit HCV định tính trên 10 bệnh phẩm lặp lại

ba lần của hai người thao tác được trình bày trong bảng 5 Kết quả đầy đủ được trình bày trong phụ lục 2 Tương tự như đối với kit HBV định tính, kết quả được tính là dương hay âm tính khi cả 03 lần lặp lại cho cùng kết quả và được đánh giá dựa trên sự phù hợp với kết quả bDNA HCV

Bảng 5 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm của 02 người thao tác

Bệnh phẩm Kết quả 03 lần lặp

lại của người I

Kết quả 03 lần lặp lại của người II

Kết quả bDNA (bản sao/ml)

1.2.2 Độ lặp lại

Kết quả phát hiện HCV với kit HCV định tính từ 02 cơ sở y tế là BV ĐH Y Dược và DIAG Center được trình bày trong bảng 6

Bảng 6 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm ở 02 cơ sở y tế

Kết quả bảng 6 cho thấy độ lặp lại của quy trình phát hiện HCV là 100% trên 10 mẫu thử nghiệm ở 02 cơ sở y tế Các mẫu này là huyết thanh âm và dương tính có chứa hàm lượng HCV từ 23.055 đến 4.280.137 bản sao/ml được xác định bằng kit Versant (Bayer)

1.2.3 So sánh kết quả sử dụng kit HCV định tính với kết quả sử dụng kit Versant (Bayer) trên 20 bệnh phẩm

Bảng 7 Kết quả so sánh giữa kit HCV định tính với kit Versant HCV trên

20 bệnh phẩm nghi nhiễm HCV

Bệnh phẩm Kit Versant (bản sao/ml) Kit HCV định tính (bản sao/ml)

Kết quả (bảng 7) cho thấy :

- 18 mẫu dương tính với kit HCV định tính có hàm lượng HCV từ 147.029 đến 19.245.820 bản sao/ml ; điều này phù hợp với ngưỡng phát hiện của kit HCV định tính là 103 bản sao/ml

- 2 mẫu âm tính với kit HCV định tính có hàm lượng HCV thấp dưới ngưỡng phát hiện của kit Versant HCV RNA

1.2.4 Tính ổn định của kit HCV định tính theo thời gian bảo quản

Tính ổn định của kit HCV định tính được đánh giá tương tự như đối với kit HBV định tính : đọc kết quả dương/âm tính và so sánh cường độ tín hiệu quan sát bằng mắt thường giữa các phản ứng sử dụng lô sản phẩm bảo quản và lô sản phẩm mới trên cùng một bệnh phẩm Bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm thu nhận ngay trước khi tiến hành thí nghiệm ; lô mới được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm

Bảng 8 Kết quả khảo sát độ ổn định của kit HCV định tính theo thời gian

Lô qua bảo quản Lô mới

Thời gian (ngày)

1 : Thang 192 bp; 2, 3 : mẫu (-) và (+) thực hiện với lô sản phẩm đã qua bảo

quản – A-G : thời gian bảo quản 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 ngày ; 4 : mẫu (+) thực hiện trên lô sản phẩm mới

Kết quả phát hiện HCV với lô kit đã qua các thời gian bảo quản và với lô kit chuẩn bị ngay trước khi tiến hành phản ứng cho thấy kit HCV định tính giữ nguyên hiệu quả sau 180 ngày bảo quản ở điều kiện phù hợp

1 2 3 4

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

1.3 Kit HPV định tính

1.3.1 Độ đúng

Kết quả phát hiện HPV với kit HPV định tính trên 10 bệnh phẩm đã được xác định là dương tính với hai người thao tác được trình bày trong bảng 9

Các số liệu chi tiết được trình bày trong phụ lục 3

Bảng 9 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm của 02 người thao tác

Bệnh phẩm Kết quả 03 lần lặp

lại của người I

Kết quả 03 lần lặp lại của người II

Kết quả giải trình tự

1.3.2 Độ lặp lại

Kết quả phát hiện HPV với kit HPV định tính từ 02 cơ sở y tế là BV Hùng Vương và BV ĐH Y Dược được trình bày trong bảng 10

Bảng 10 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm ở 02 cơ sở y tế

1.3.3 Tính ổn định của kit HPV định tính theo thời gian bảo quản

Tính ổn định của kit HPV định tính được đánh giá tương tự như đối với kit HBV định tính : đọc kết quả dương/âm tính và so sánh cường độ tín hiệu quan sát bằng mắt thường giữa các phản ứng sử dụng lô sản phẩm bảo quản và lô sản phẩm mới trên cùng một bệnh phẩm Bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm thu nhận ngay trước khi tiến hành thí nghiệm ; lô kit mới được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm

Bảng 11 Kết quả khảo sát độ ổn định của kit HPV định tính theo thời gian

Lô bảo quản Lô mới

Thời gian (ngày)

Mẫu (-) Mẫu (+) Mẫu (+)

Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa lô đã qua các thời gian bảo quản khác nhau với một lô chuẩn bị mới Như vậy kit HPV định tính có thể bảo quản ít nhất 180 ngày trong điều kiện phù hợp

1 2 3 4

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Người 1 và Amplicon

R 2 = 0.9994 0

5 10

Bảng 12 Trung bình 3 lần lặp lại của 02 người thao tác trên 10 bệnh phẩm

bản sao/ml)

bản sao/ml)

Hàm lượng DNA amplicon

Z = -

S

Xj : Giá trị trung bình của kết quả nhận được

X : Giá trị đã biết

S : Độ lệch chuẩn

Standard Who và Amplicon

R 2 = 0.9786

0 2000 4000 6000 8000 10000

Bảng 13 Độ đúng của quy trình HBV định lượng với các người thao tác

Mẫu Người thao tác I Người thao tác II

Bên cạnh đó, kết quả so sánh việc sử dụng đường cong chuẩn từ amplicon

do chúng tôi xây dựng với đường cong chuẩn xây dựng từ mẫu chuẩn WHO để định lượng DNA HBV có trong 5 bệnh phẩm được trình bày trong bảng 14 cho thấy có sự phù hợp cao giữa kết quả định lượng sử dụng hai đường cong chuẩn với

hệ số tương quan là 0,9786

Bảng 14 Kết quả định lượng của 05 bệnh phẩm sử dụng đường cong chuẩn xây dựng với amplicon HBV và với DNA HBV WHO

Mẫu Đường cong chuẩn WHO

1.4.2 Khảo sát tính lặp lại của phản ứng real-time PCR

Độ tin cậy của thí nghiệm được thể hiện qua tính lặp lại của một thí nghiệm Tính lặp lại càng cao thì độ tin cậy càng cao Tính lặp lại của phản ứng

real-time PCR được biểu hiện qua hai hệ số biến thiên (variability coefficient)

gồm biến thiên liên phản ứng và biến thiên nội phản ứng Hệ số biến thiên càng

thấp thì tính lặp lại càng cao Biến thiên liên phản ứng là độ biến thiên giữa các

lần lặp lại phản ứng vào các thời điểm khác nhau Biến thiên nội phản ứng là độ

biến thiên giữa các phản ứng được thiết lập vào cùng một thời điểm Chu kỳ

ngưỡng là yếu tố dùng để đánh giá các độ biến thiên này

1.4.2.1 Hệ số biến thiên nội phản ứng (intra-assay variability coefficicent)

Chúng tôi khảo sát hệ số biến thiên nội phản ứng bằng cách tiến hành phản ứng trên đường chuẩn với 5 nồng độ từ 103 đến 107 ; phản ứng trên mỗi

nồng độ được lặp lại 5 lần Kết quả minh họa được trình bày trong hình 6

PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490

Standard Curve Graph for FAM-490

Hình 6 : Hệ số biến thiên nội phản ứng

1, 2, 3, 4, 5 : Amplicon HBV với các nồng độ 10 3 , 10 4 , 10 5 ,10 6 , 10 7 bản sao/phản ứng

10 10 10 10 10

1 2

3 4 5

Bảng 15 : Giá trị Ct của các nồng độ của đường chuẩn

Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5

Bảng 16 : Hệ số biến thiên nội phản ứng của các nồng độ đường chuẩn

Nồng độ Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến

Theo bảng 16, hệ số biến thiên thấp nhất là 0.02 (ứng với các nồng độ 103,

105, 107) và hệ số biến thiên cao nhất là 0.05 (ứng với các nồng độ 104, 106) So sánh với các công trình đã công bố thì hệ số biến thiên trong đề tài là tương đương (Sum & cs, 2004 ; Garson & cs, 2005 ; Zhao & cs, 2005)

1.4.2.2 Hệ số biến thiên liên phản ứng (inter-assay variability coefficicent)

Chúng tôi xác định hệ số biến thiên liên phản ứng trên đường chuẩn gồm

5 nồng độ từ 103 đến 107 Các phản ứng này được lặp lại 5 lần vào 5 thời điểm khác nhau

Ngày 1

10 10 10 10 10

Bảng 17 : Giá trị Ct của các nồng độ của đường chuẩn

Nồng độ Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5

Bảng 18 : Hệ số biến thiên liên phản ứng của đường chuẩn

Nồng độ Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến

1.4.3 Độ lặp lại của quy trình

Từ kết quả định lượng HBV với kit HBV định lượng từ 10 mẫu lặp lại 03 lần đối với hai người thao tác, chúng tôi tính độ lặp lại của quy trình theo công thức [7, 8]:

100 S Trong đó :

CV = - S :

X X : Giá trị chấp nhận của độ lặp lại : CV≤ 2%

Kết quả độ lặp lại của quy trình HBV định lượng được trình bày trong bảng 19 cho thấy đối với cả hai người thao tác có 03 giá trị > 2%

Bảng 19 Độ lặp lại của kit HBV định lượng

Bảng 20 Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm ở 02 cơ sở y tế

Bệnh

phẩm

Kết quả trung bình 03 lần lặp lại tại BV ĐH Y Dược (log10 bản sao/ml)

Kết quả trung bình 03 lần lặp lại tại DIAG Center (log10 bản sao/ml)

Kết quả định lượng bằng bDNA (log10 bản sao/ml)

1.4.4 Xác định ngưỡng phát hiện đối với quy trình định lượng HBV

Chúng tôi pha loãng bậc 10 một dung dịch amplicon có hàm lượng DNA HBV là 1014 bản sao/mlđể đạt 100 € 109 bản sao/ml

Kết quả được trình bày trong hình 8 cho thấy ngưỡng phát hiện của kit HBV định lượng là 101 bản sao/ml máu tương đương với 2 IU/ml

Hình 8 Kết quả định lượng với các nồng độ amplicon HBV từ 10 0 đến 10 9

bản sao/ml

1.4.5 Tính ổn định của kit HBV định lượng

Tính ổn định theo thời gian của kit HBV định lượng được kiểm tra bằng cách so sánh kết quả định lượng bằng 01 lô kit đã qua bảo quản với 01 lô kit chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm trên : (1) các nồng độ amplicon dùng để xây dựng đường chuẩn và (2) trên 01 bệnh phẩm dương tính HBV và 01 mẫu huyết thanh âm tính Tiêu chuẩn dùng để đánh giá là Ct (Chu kỳ ngưỡng – chu kỳ ở đó tín hiệu dương tính vượt trên tín hiệu nền) Kit được xem là ổn định khi giá trị Ct không thay đổi ở các lô được bảo quản theo thời gian so với lô không qua bảo quản

Kết quả được trình bày trong bảng 21

Bảng 21 Kết quả định lượng HBV trên mẫu (+) và (-) với các lô kit mới và kit đã qua thời gian bảo quản

Lô qua bảo quản (Ct) Lô mới (Ct)

Thời gian (ngày)

Gia tri trung binh va da biet

R 2 = 0.9987

0 5 10 15 20 25 30 35

Mặt khác, chúng tôi khảo sát tính ổn định theo thời gian của hỗn hợp pha

sẳn các nồng độ amplicon HBV trong hóa chất PCR real time

60 ngày

90 ngày

120 ngày

150 ngày

180 ngày

Giá trị trung bình

Giá trị đã biết

bDNA và Real-time PCR

R 2 = 0.9738

0 2 4 6 8 10

log real-time PCR

1.4.6 So sánh kit định lượng HBV với kit Versant (Bayer) trên 20 mẫu

Kết quả định lượng HBV DNA trên 20 mẫu huyết thanh bằng kit HBV định lượng được so sánh với kết quả sử dụng kit Versant (Bayer) do Trung tâm Chẩn đóan Y khoa Hòa Hảo cung cấp (bảng 23)

Bảng 23 Kết quả định lượng HBVvới kit Bayer Versant HBV và kit định lượng HBV

Bệnh phẩm Kit Versant (bản sao/ml) Kit HBV định lượng (bản sao/ml)

Hình 11 Hệ số tương quan giữa kết quả kit Versant và HBV định lượng

Kết quả (bảng 23, hình 11) cho thấy quy trình định lượng HBV dựa trên kỹ thuật real-time PCR được chúng tôi xây dựng cho kết quả phù hợp với kết quả của phương pháp bDNA với hệ số tương quan là 0,9423 Theo Abe và cộng sự (1999), khi so sánh hai phương pháp real-time PCR và bDNA thì hệ số tuyến

tính giữa hai phương pháp này là 0,961 Trong một công trình khác (Rafael, 2005), hệ số tuyến tính giữa hai phương pháp real-time PCR và PCR ELISA (Cobas Amplicor HBV Monitor test – Roche Applied Science, Mannheim, Germany) là 0,938

1.4.7 Độ nhạy lâm sàng

Chúng tôi định lượng HBV-DNA trên 100 huyết thanh có HBsAg (+) Kết quả cho thấy cả 100 mẫu đều có HBV-DNA (+) với hàm lượng dao động trong khoảng 102 đến 109 bản sao/ml Trong số 100 bệnh phẩm khảo sát, có 20 bệnh phẩm có chỉ số AST/ALT bình thường (<40) và 80 mẫu có chỉ số AST/ALT cao hơn bình thường Trong số 20 mẫu có chỉ số AST/ALT bình thường, có 5 mẫu có hàm lượng HCV-RNA cao (105 bản sao/ml) Kết quả khảo sát tương quan giữa giá trị AST/ALT với hàm lượng virus (phụ lục 4) cho thấy không có tương quan giữa 2 giá trị này

Bên cạnh đó, chúng tôi tiến hành định lượng HCV-RNA trên 30 mẫu HBsAg (+) kết hợp với xét nghiệm HBeAg Giá trị HBeAg (+) thường có cho thấy tình trạng nhiễm và hoạt động của virus Tuy nhiên, khi bị nhiễm bởi một số dạng đột biến thì giá trị HBeAg sẽ (+) Chính vì vậy, thử nghiệm HBV-DNA là cần thiết để xác định chính xác sự nhiễm Trong 30 mẫu thử nghiệm, có 10 mẫu có giá trị HBeAg (-) với hàm lượng HBV-DNA trong khoảng 102 đến 107 bản sao/ml

1.5 Quy trình định lượng HCV

1.5.1 Độ đúng

Độ đúng của quy trình định lượng HCV được kiểm tra qua hai nội dung : (1) tính phù hợp của kết quả sử dụng kit với giá trị đã biết, ở đây là các hàm lượng DNA amplicon HCV (1014 bản sao/ml) pha loãng, từ hai người thao tác độc lập ; (2) kiểm tra đường cong chuẩn dùng trong định lượng của kit HCV định lượng bằng mẫu chuẩn WHO

Bảng 24 Trung bình 3 lần lặp lại của 02 người thao tác trên 10 bệnh phẩm

Mẫu Người thao tác I (log10

Log 10 nguoi 2 va Amplicon

R 2 = 0.9752

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Z = -

S

Xj : Giá trị trung bình của kết quả nhận được

X : Giá trị đã biết

S : Độ lệch chuẩn

Kết quả tính toán độ đúng của quy trình được trình bày trong bảng 25

Bảng 25 Độ đúng của quy trình HCV định lượng với các người thao tác

Bên cạnh đó, kết quả so sánh việc sử dụng đường cong chuẩn từ amplicon

do chúng tôi xây dựng với đường cong chuẩn xây dựng từ mẫu chuẩn WHO để định lượng RNA HCV có trong 5 bệnh phẩm được trình bày trong bảng 26, hình

13 cho thấy có sự phù hợp cao giữa kết quả định lượng sử dụng hai đường cong chuẩn với hệ số tương quan là 0,998

Standard Who và Amplicon

R 2 = 0.998

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000

1.5.2 Khảo sát tính lặp lại của phản ứng real-time RT-PCR

Tính lặp lại của phản ứng real-time RT-PCR được biểu hiện qua hệ số biến

thiên (variability coefficient) gồm biến thiên liên phản ứng và biến thiên nội phản ứng Hệ số biến thiên càng thấp thì tính lặp lại càng cao Biến thiên liên phản ứng là

độ biến thiên được đo đạc thông qua việc lặp lại phản ứng vào các thời điểm khác nhau và ghi nhận sự sai khác giữa các thời điểm Biến thiên nội phản ứng là độ biến thiên được khảo sát bằng cách đo đạc sự sai khác của các phản ứng diễn ra vào cùng một thời điểm Yếu tố để dựa trên đó để đánh giá sự sai khác ở đây là chu kỳ ngưỡng

1.5.2.1 Hệ số biến thiên nội phản ứng (intraassay variability coefficicent)

Chúng tôi khảo sát hệ số biến thiên nội phản ứng bằng cách tiến hành phản ứng trên đường chuẩn gồm 5 nồng độ từ 103 đến 107 và phản ứng trên đường chuẩn được lặp lại 5 lần

PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490

Standard Curve Graph for FAM-490

Hình 14 Hệ số biến thiên nội phản ứng

Bảng 27 chu kỳ ngưỡng của các nồng độ của đường chuẩn

Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5

Bảng 28 Hệ số biến thiên của các nồng độ

Nồng độ Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên

Theo bảng 28 thì nồng độ 103 có hệ số là 1.09 trong khi đó nồng độ 107 có hệ số là 1.79 Hệ số biến thiên cao nhất của phản ứng real-time RT-PCR HCV là 2.05 ;

so sánh với các công trình thì hệ số biến thiên trong đề tài là tương đương

1.5.2.2 Hệ số biến thiên liên phản ứng (interassay variability coefficicent)

Chúng tôi tiến hành phản ứng trên đường chuẩn gồm 5 nồng độ từ 103 đến 107, phản ứng này được lặp lại 5 lần vào 5 thời điểm khác nhau để khảo sát hệ số biến thiên liên phản ứng

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Hình 15 Hệ số biến thiên liên phản ứng

Bảng 29 chu kỳ ngưỡng của các nồng độ của đường chuẩn

Nồng độ Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5

Bảng 30 Hệ số biến thiên của các nồng độ

Nồng độ Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên

Theo bảng 30 thì nồng độ 103 có hệ số là 8.81 khi đó nồng độ 107 có hệ số là 6.81 Như vậy, hệ số biến thiên cao nhất của phản ứng real-time RT-PCR HCV là 8.81 ; so sánh với các công trình thì hệ số biến thiên trong đề tài là tương đương

1.5.3 Độ lặp lại của quy trình

Từ kết quả định lượng HCV với kit HCV định lượng từ 10 mẫu lặp lại 03 lần đối với hai người thao tác, chúng tôi tính độ lặp lại của quy trình theo công thức :

100 S Trong đó :

CV = - S : Độ lệch chuẩn

X X : Giá trị trung bình của các lần lặp lại Giá trị chấp nhận của độ lặp lại : CV≤ 2%

Kết quả độ lặp lại của quy trình HCV định lượng được trình bày trong bảng 31 cho thấy đối với cả hai người thao tác đều có giá trị < 2%

Bảng 31 Độ lặp lại của kit HCV định lượng

Bảng 32 Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm ở 02 cơ sở y tế

Bệnh

phẩm

Kết quả trung bình 03

lần lặp lại tại BV ĐH Y

Dược (log10 bản sao/ml)

Kết quả trung bình 03 lần lặp lại tại DIAG Center (log10 bản sao/ml)

Kết quả định lượng bằng bDNA (log10 bản sao/ml)

7 6.304203201 5.689012716 6.025305865

1.5.4 Xác định ngưỡng phát hiện đối với quy trình định lượng HCV

Chúng tôi pha loãng bậc 10 một dung dịch amplicon có hàm lượng amplicon HCV là 1014 bản sao/mlđể đạt 100 € 109 bản sao/ml

Kết quả được trình bày trong hình 16 cho thấy ngưỡng phát hiện của kit HCV định lượng là 101 bản sao/ml máu tương đương với 2 IU/ml

1.5.5 Tính ổn định của kit HCV định lượng

Tính ổn định theo thời gian của kit HCV định lượng được kiểm tra bằng cách so sánh kết quả định lượng bằng 01 lô kit đã qua bảo quản với 01 lô kit chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm trên : (1) các nồng độ amplicon dùng để xây dựng đường chuẩn và (2) trên 01 bệnh phẩm dương tính HCV và 01 mẫu huyết thanh âm tính Tiêu chuẩn dùng để đánh giá là Ct (Chu kỳ ngưỡng – chu kỳ ở đó tín hiệu dương tính vượt trên tín hiệu nền) Kit được xem là ổn định khi giá trị Ct không thay đổi ở các lô được bảo quản theo thời gian so với lô không qua bảo quản

Kết quả được trình bày trong bảng 33 cho thấy kit HCV có tính ổn định cho đến ít nhất là 180 ngày trong điều kiện bảo quản phù hợp

Gia tri trung bình va da biet

R 2 = 0.9987

0 5 10 15 20 25 30 35

lo m oi

Bảng 33 Kết quả định lượng HCV với lô kit mới và kit đã qua bảo quản

Lô qua bảo quản (Ct) Lô mới (Ct)

Thời gian (ngày)

Mặt khác, chúng tôi khảo sát tính ổn định theo thời gian của hỗn hợp pha

sẳn các nồng độ amplicon HCV trong hóa chất PCR real time

60 ngày

90 ngày

120 ngày

150 ngày

180 ngày

Giá trị trung bình

Giá trị đã biết

103 31,65 32,14 32,27 31,61 31,1 32,1 31,72 31,79857143 31,5

105 25,3 25,95 25,03 25,57 24,9 25,5 25,08 25,33285714 25,5

107 17,25 18,02 17,83 17,78 16,8 17,2 17,45 17,.47571429 17,2

bDNA và Real-time RT- PCR

R 2 = 0.8778

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1.5.6 So sánh kit HCV định lượng với kit Bayer Versant HCV

Chúng tôi tiến hành trên 20 mẫu huyết thanh và kết quả được trình bày trong bảng 35

Bảng 35 Kết quả định lượng trên 20 bệnh phẩm bằng kit HCV định lượng và kit Versant bDNA

Bệnh phẩm Kit Versant HCV (bản

sao/ml)

Kit HCV định lượng (bản sao/ml)