tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn giao tử nội và ngoại nhập

Kinh phí đã cấp: - Đợt 1: 180.000.000 đồng, theo TB số: 246, TB-SKHCN ngày 30/11/2005 - Thiết lập quy trình kĩ thuật hoàn thiện nhằm chủ động tạo được nguồn phôi từ công nghệ thụ tinh in

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu

ngày 26 tháng 03 năm 2009)

TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG CÔNG NGHỆ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN

GIAO TỬ NỘI VÀ NGOẠI NHẬP

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PHAN KIM NGỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/2009

TÓM TẮT

Nhân giống bằng công nghệ phôi hiện đại là giải pháp khả thi nhất góp phần triển khai thành công Chương trình Quốc gia 200.000 bò sữa Đề tài tiến hành nhằm nghiên cứu và hoàn thiện quy trình tạo phôi bò bằng công nghệ thụ tinh ống nghiệm tại khu vực Tp HCM đồng thời góp phần đào tạo cán bộ kỹ thuật cho lĩnh vực CNSH động vật Nội dung 1: buồng trứng được thu nhận tại lò

mổ và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm trong nước muối sinh lý sau đó thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút bằng kim tiêm 18G và xi lanh 5ml, nuôi chín trong môi trường C1 (TCM -199 bổ sung FBS, EGF) và tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh ngoại nhập Kết quả thụ tinh được đánh giá thông qua phôi 2 tế bào Tiến hành sinh thiết và xác định giới tính phôi nang bằng kỹ thuật PCR và LAMP Nội dung 2: trứng thu nhận bằng phương pháp siêu âm, sau khi nuôi chín, tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh ngoại nhập Tiến hành sinh thiết và xác định giới tính phôi dâu

và phôi nang bằng kỹ thuật PCR Nội dung 3: thụ tinh trong ống nghiệm giữa trứng đông lạnh (do phòng thí nghiệm tự đông lạnh và trứng mua) và thử nghiệm cấy truyền phôi cho các bò mẹ mang thai hộ Kết quả nội dung 1: tỷ lệ trứng chín 69,83 ± 8,04% (Trứng thu tại lò mổ Vissan) và 81,19 ± 2,75% (Trứng thu tại lò

mổ Long An); tỷ lệ thu tinh 48,43 ± 6,74%; 18,01 ± 4,91% phát triển đến giai đoạn phôi nang; sinh thiết phôi bằng kỹ thuật PCR và LAMP lần lượt đạt tỉ lệ 41,53% và 46,29% Kết quả nội dung 2: tỷ lệ trứng chín đạt 82,78 ± 7,01%; tỷ lệ thu tinh đạt 67,83 ± 2,61%; 27,32 ± 3,68% phát triển đến phôi nang; sinh thiết phôi đạt tỷ lệ 47,86% Kết quả nội dung 3: tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm đạt 11,67% (trứng do phòng thí nghiệm tự đông lạnh) và có 46/144 phôi (3,72%) phát triển đến giai đoạn phôi nang và có 02 bê cái ra đời khỏe mạnh

Từ khóa: nuôi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm, đông lạnh trứng,

đông lạnh phôi, xác định giới tính phôi, chuyển phôi

ABSTRACT

Breeding by modern embryo production technology is the most feasible solution, contributing to the success of the 200,000 milk cows National Program The main target of our research is studying and improving bovine embryo

production process by in vitro fertilization technology in Ho Chi Minh city,

simultaneously, contributing to train technicians of animal biotechnology field

In the first experiment, cow ovaries were obtained from abattoir and transported to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution at 33 to 35oC The cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered by aspiration of 2 to 8 mm follicles using an 18-gauge needle attached to 5ml syringe Oocytes with a two or three layers of cumulus cells (CC) and homogeneous cytoplasm were washed in flushing medium Groups of 25 to 30 oocyte were placed in 100 µl drops of C1

maturation medium (TCM-199 medium supplemented with 10% FBS, 0.2 mM sodium pyruvate, 50µg/ml gentamicin, 10ng EGF) under sterile mineral oil at 38.5◦C in an humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2 in air for 22h - 24 h Mature oocytes were inseminated with imported sperm suspension to a final concentration of 1.106 sperms/ml at 38.5◦C in a humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2 in air The insemination rate is evaluated by 2-cell embryo Sex of blastocyst embryos were determined by PCR and LAMP technique In the second experiment, the cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered by ultrasound guided ovum pick-up technique After 22- 24h culture, mature oocytes were inseminated with sperm suspension Sex of morula and blastocyst embryo is determined by PCR In the last experiment, IVF was performed with cryopreservated oocytes (from our lab or purchase) The morulas and blastocysts created by this procedure were transferred into the recipient cows

In the first experiment, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after IVM are 69.83 ± 8.04% (Vissan slaughter - house) and 81.19 ± 2.75% (Long An slaughter - house); insemination rates are 48.43 ± 6.74% and 18.01 ± 4.91% blastocysts The rates of successful sex determination by PCR and LAMP

technique are 41.53% and 46.29%, respectively In the second experiment, the rate of MII oocytes after IVM is 82.78 ± 7.01%; insemination rate is 67.83 ± 2.61%; and having 27.32 ± 3.68% blastocysts The rate of successful sex determination by PCR is 47.86% In the last experiment, insemination rate is 11.67% (oocytes from our lab) and two calves were born

Keywords: in vitro maturation, in vitro fertilization, cryopreservation,

vitrification, embryo biopsy, embryo transfer

MỤC LỤC

Trang

Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt và tiếng Anh) I

Mục lục IV Danh sách các chữ viết tắt VII

Danh sách bảng VIII Danh sách hình IX

1 Tên đề tài/dự án

Chủ nhiệm đề tài/dự án

Cơ quan chủ trì

Thời gian thực hiện

Kinh phí được duyệt

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 5

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng

thu nhận từ lò mổ và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh

16

2.1.1 Chuẩn bị trứng 16

2.1.3 Thụ tinh trong ống nghiệm 20

2.1.6 Xác định giới tính bằng kĩ thuật PCR và LAMP 23

2.2 Nội dung 2: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng

thu từ siêu âm và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh

28

2.3 Nội dung 3: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng

CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN

3.1.1 Kết quả thu nhận và nuôi trứng trửơng thành 32

3.1.3 Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 36

3.2.1 Kết quả thu nhận và nuôi trưởng thành trứng 42

3.2.2 Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 44

3.2.3 Kết quả nuôi phôi

3.2.5 Kết quả xác định giới tính 46

3.3.2 Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 49

3.4.1 So sánh kết quả nuôi chín trứng từ các nguồn trứng khác nhau 58 3.4.2 So sánh kết quả IVF từ các nguồn trứng khác nhau 58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

PHỤ LỤC

ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm

IVM In Vitro Maturation Nuôi trưởng thành trong ống nghiệm LAMP Loop mediated isothermal amplification

Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt MII Methaphase II Kỳ methaphase của nhiễm phân II MPF Maturation Promoting Factor Nhân tố thúc đẩy sự trưởng thành PCR Polymere Chain Reaction Phản ứng chuỗi

PN Pronuclear Tiền nhân

PTN Phòng thí nghiệm

PVP polyvinylpyrolidone

PZD Partial Zona Disection Tiêm tinh trùng vào khoang quanh noãn

SUZI Subzonal Sperm Injection Tạo lỗ thủng nhân tạo ở màng zona

TE Trophoblast embryonic Lớp dưỡng bào phôi

ZP Zona pellucidae Lớp màng trong suốt bảo vệ trứng

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2 1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 Error! Bookmark not defined Hình 2 2 Rửa buồng trứng Error! Bookmark not defined Hình 2 3 Thu nhận trứng từ buồng trứng Error! Bookmark not defined Hình 2 4 Cọng rạ chứa trứng Error! Bookmark not defined

Hình 2 5 Giải đông cọng rạ chứa tinh trùng trong water bath 370C .Error!

Bookmark not defined

Hình 2 8 Cách hút phôi vào cọng rạ Error! Bookmark not defined Hình 2 9 Hút phôi vào cọng rạ Error! Bookmark not defined Hình 2 10.Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2 Error! Bookmark not defined Hình 2 11 Một số hình ảnh siêu âm thu nhận trứng bò Error! Bookmark not

defined

Hình 2 12 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3 Error! Bookmark not defined

Hình 3 1.Trứng bò trước khi IVM (a) và sau khi IVM (b; c); trứng trưởng thành xuất hiện thể cực thứ nhất sau 22 – 24h nuôi (d) Error! Bookmark not defined

Hình 3 2 Phôi 4 tế bào Error! Bookmark not defined Hình 3 3 Phôi 8 tế bào Error! Bookmark not defined Hình 3 4 Phôi dâu Error! Bookmark not defined Hình 3 5 Phôi nang Error! Bookmark not defined

Hình 3.6 Xác định giới tính phôi bò bằng phản ứng PCR M: thang chuẩn, Giếng 1: thịt bò đực, Giếng 2: Thịt bò cái, Giếng 3, 4: Phôi đực, Giếng 5, 6,7: Phôi cái,

Giếng 8, 9: Phôi không xác định Error! Bookmark not defined Hình 3.7 Xác định giới tính phôi bò bằng phản ứng LAMP Error! Bookmark

not defined

Hình 3.8 Trứng bò trước khi IVM (a) xuất hiện thể cực sau khi IVM (b) Error!

Bookmark not defined

Hình 3.9 Phôi 2 tế bào (a) 8 tế bào (b), phôi morula (c) và phôi nang (d) Error!

Bookmark not defined

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR, các mẫu phôi bò đực (a), bò cái (b)

Error! Bookmark not defined

Hình 3.11.Phôi 2 tế bào, thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh với trứng đông lạnh

Error! Bookmark not defined Hình 3 12 Trứng đã thụ tinh (phôi 2) từ IVF trứng mua Error! Bookmark not

defined

Hình 3.13 Phôi bò (a) 4-8 tế bào, (b) 16 tế bào, (c) morula và (d) phôi nang

Phôi này thu được từ IVF từ trứng đông lạnh Error! Bookmark not defined

Hình 3.14 Bê cái sinh ra từ phôi tạo ra trong ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào

ngày 17/04/2008 tại gia đình ông Nguyễn Văn Cường Error! Bookmark not

defined

Hình 3.15 Bê cái sinh ra từ phôi tạo ra trong ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào

ngày 26/02/2008 tại gia đình ông Võ Văn Sa Error! Bookmark not defined

Hình 3.16 Bê cái (có đốm trắng dười bụng) sinh ra từ phôi tạo ra trong ống

nghiệm từ trứng đông lạnh vào ngày 26/02/2008 Error! Bookmark not defined

Biểu đồ 3 1 Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng thu tại lò mổ Error! Bookmark

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3 1 Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng thu tại lò mổ Error! Bookmark

not defined

Bảng 3 2 Kết quả đông lạnh trứng từ nguồn trứng thu nhận tại lò mổ Error!

Bookmark not defined

Bảng 3 3 Kết quả thụ tinh từ trứng thu nhận từ lò mổ Error! Bookmark not

defined

Bảng 3 4.Các giai đoạn phát triển của phôi từ nguồn thu ở lò mổ Error!

Bookmark not defined

Bảng 3 5.Sự chuyển tiếp của phôi lên các giai đoạn chính Error! Bookmark not

defined

Bảng 3 6 Kết quả xác định giới tính phôi Error! Bookmark not defined Bảng 3.7 Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng siêu âm Error! Bookmark not

defined

Bảng 3.8 Tỷ lệ trứng thụ tinh từ nguồn trứng thu nhận bằng siêu âm Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.9 Các giai đoạn phát triển của phôi từ nguồn trứng thu nhận bằng

phương pháp siêu âm Error! Bookmark not defined Bảng 3.10 Kết quả xác định giới tính phôi bằng PCR Error! Bookmark not

defined

Bảng 3.15 Các giai đoạn phát triển của phôi từ nguồn trứng đông lạnh Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.16 Sự chuyển tiếp của phôi lên các giai đoạn chính ở trứng đông lạnh

Error! Bookmark not defined Bảng 3.17 Các giai đoạn phát triển của phôi từ nguồn trứng đông lạnh Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.18 Các giai đoạn của phôi trước khi đông lạnh Error! Bookmark not

defined

Bảng 3.19 Bê sinh ra từ việc cấy truyền phôi tạo ra trong ống nghiệm Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.20 Kết quả nuôi trứng chín từ các nguồn trứng Error! Bookmark not

defined

Bảng 3.21 Kết quả IVF từ các nguồn trứng Error! Bookmark not defined

PHẦN MỞ ĐẦU

1 TÊN ĐỀ TÀI

TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG CÔNG NGHỆ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN GIAO TỬ NỘI VÀ NGOẠI NHẬP

Chủ nhiệm đề tài: Phan Kim Ngọc

Cơ quan chủ trì: Trường ĐH KHTN, ĐH Quốc gia TPHCM

Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ tháng 12/2006 đến tháng 12/2008

Kinh phí được duyệt: 305.000.000 đồng

Kinh phí đã cấp:

- Đợt 1: 180.000.000 đồng, theo TB số: 246, TB-SKHCN ngày 30/11/2005

- Thiết lập quy trình kĩ thuật hoàn thiện nhằm chủ động tạo được nguồn

phôi từ công nghệ thụ tinh in vitro làm tiền đề cho khả năng ứng dụng quy

trình vào sản xuất quy mô công nghiệp nguồn phôi bò với chất lượng cao

và giá thành hạ, nguyên liệu cho công tác phát triển và nhân nhanh đàn bò sữa của Tp Hồ Chí Minh

- Thử nghiệm nghiên cứu một số quy trình nhằm bảo quản nguồn phôi in

vitro tạo ra cho công tác cấy truyền về sau, quy trình xác định giới tính

phôi (nhằm chọn được phôi cái)

(2) Góp phần đào tạo cán bộ kỹ thuật cho lĩnh vực CNSH động vật

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng lò mổ và tinh trùng nhập ngoại đông lạnh

Nội dung 2: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng siêu âm bò lai F2 và tinh trùng nhập ngoại đông lạnh

Nội dung 3: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng đông lạnh và tinh trùng đông lạnh nhập ngoại

4 SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI

1.7.1 Kết quả khoa học

- 01 Quy trình tạo phôi và xác định giới tính phôi bằng kĩ thuật PCR và LAMP bằng trứng thu từ lò mổ với tinh trùng đông lạnh Trong quy trình này bao gồm: quy trình chuẩn bị trứng, chuẩn bị tinh trùng, thụ tinh IVF, nuôi phôi, sinh thiết phôi, xác

định giới tính phôi và đông lạnh phôi (Xem Phụ lục 1)

- 01 Quy trình tạo phôi và xác định giới tính phôi bằng kĩ thuật PCR và LAMP bằng trứng thu từ siêu âm và tinh trùng đông lạnh Trong quy trình này bao gồm: quy trình chuẩn bị trứng, chuẩn bị tinh trùng, thụ tinh IVF, nuôi phôi, sinh thiết phôi, xác

định giới tính phôi và đông lạnh phôi (Xem Phụ lục 2)

- 01 Quy trình tạo phôi bằng trứng đông lạnh và tinh trùng đông lạnh Trong quy trình này bao gồm: quy trình chuẩn bị trứng, quy trình đông lạnh trứng, chuẩn bị tinh

trùng, thụ tinh IVF, nuôi phôi, và đông lạnh phôi (Xem Phụ lục 3)

1.7.2 Kết quả sản phẩm

Đã tạo được 2 bê cái khỏe mạnh

1.7.3 Kết quả đào tạo

- 1 nghiên cứu sinh (Nghiên cứu sinh: Nguyễn Thị Thương Huyền); với đề tài Tiến sĩ: Khảo sát tác động làm lạnh lên màng thụ tinh ở trứng đông lạnh

- 2 Thạc sĩ: Đặng Thị Thu Thủy (Tạo phôi bò trong ống nghiệm từ nguồn trứng đông lạnh); Ngô Hồng Anh (Xác định giới tính phôi bò bằng kĩ thuật LAMP)

- 8 Cử nhân: + Đặng Hoàng Lâm: Xác định giới tính bằng kĩ thuật PCR và LAMP

+ Khưu Bảo Hoàng: Thiết lập quy trình sinh thiết phôi bò giai đoạn 4-8

tế bào

+ Trần Thị Thanh Khương: Tạo phôi bò bằng kĩ thuật ICSI

+ Quách Hoa Thiên Cung: Tạo phôi bò bằng kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

+ Trần Duy Bình: Khảo sát tác động của EGF lên sự trưởng thành trứng

1.7.4 Bài báo, báo cáo đã công bố

- 01 bài đăng trong Hội nghị Công nghệ sinh học trong nông nghiệp tại Đại học Nông Lâm, 2007 (Ứng dụng kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm tạo phôi bò)

- 01 bài đăng trong Hội nghị Sinh hóa và Sinh học Phân tử, Hà Nội, 2008 (Xác định giới tính phôi bò bằng kĩ thuật LAMP)

- 01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, 2008 (Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ)

- 01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2009 (Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ; đang chờ phản biện)

- 01 bài đăng trong Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2009 (Thử nghiệm cấy truyền phôi bò đông lạnh đã xác định giới tính từ thụ tinh trong ống nghiệm của giao tử đông lạnh; đang chờ phản biện)

- 01 bài đăng trong Tạp chí Sinh học, 2009 (So sánh hiệu quả tạo phôi của trứng thu từ lò mổ, siêu âm và đông lạnh với tinh trùng đông lạnh; đang chờ phản biện)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1.1 Tình hình ngiên cứu ngoài nước

Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization_IVF) được tiến hành lần đầu tiên trên thỏ bởi Dauzier et al vào năm 1954 Kỹ thuật này được Brackett

ứng dụng vào chăn nuôi bò sữa từ năm 1982 Từ đó, IVF được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi ở các nước chăn nuôi phát triển

Quy trình IVF gồm những bước cơ bản: thu nhận và chọn lọc giao tử đực

và cái; thụ tinh; nuôi hợp tử phát triển thành phôi; cấy truyền phôi tươi hoặc phôi đông lạnh cho con cái nhận phôi Mỗi bước trong quy trình đều đóng vai trò quan trọng như nhau nhằm đảm bảo được khả năng hình thành và phát triển phôi tối

đa

Nguồn trứng sử dụng cho IVF có thể thu từ những động vật sống được kích hoạt bằng kích dục tố để gây rụng trứng hàng loạt; từ buồng trứng động vật

giết mổ hay sử dụng trứng đông lạnh Theo Long et al (1993), các nang trứng có

đường kính 2-8 mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng được sử dụng cho việc thu nhận các trứng chưa trưởng thành phục vụ cho kĩ thuật IVF Trong kĩ thuật IVF, nếu sử dụng các trứng chưa trưởng thành cần có sự hỗ trợ của quá trình nuôi

trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM) Ngoài ra, sử dụng trứng đông

lạnh trong quá trình IVF cũng là một thử thách lớn vì tỉ lệ thụ tinh và phát triển phôi không cao do những tổn thương khó phục hồi ở màng nội chất và màng zona pellucida của trứng trong quá trình bảo quản Theo Shinichi Hochi (2003),

tỉ lệ trứng thụ tinh sau rã đông là 36% và tỷ lệ phát triển lên blastocyst là 5% Vì thế, việc sử dụng nguồn trứng đông lạnh ngoại nhập cần tuân thủ nghiêm ngặt quy trình giải đông trứng của nhà cung cấp nhằm đảm bảo được tỉ lệ sống cao nhất của nguồn giao tử này

Sự xâm nhập thành công của tinh trùng vào các tế bào trứng đã được thực hiện với tinh tươi hoặc tinh đông lạnh qua giải đông Ở nhiều phòng thí nghiệm,

do khó khăn trong bảo quản lạnh nên tinh tươi vẫn là nguồn tinh trùng chính cho

các nghiên cứu IVF Tuy nhiên, theo nghiên cứu, trong tinh dịch tươi có một số thành phần không có lợi cho hoạt động của tinh trùng Mục đích của các phương pháp thu nhận tinh trùng theo các nghiên cứu nhằm chọn được các tinh trùng bình thường có độ di động tốt, loại được các tế bào chết, các vi sinh vật và các chất độc, hoạt hóa đầu tinh trùng, tạo thuận lợi cho quá trình thụ tinh với trứng

Hệ thống thụ tinh IVF đòi hỏi nghiêm ngặt về các điều kiện nhiệt độ, độ

ẩm, thời gian thụ tinh, áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy Hầu hết các môi trường IVF cần bổ sung những yếu tố có vai trò hoạt hóa tinh trùng, tăng khả năng hoạt động của chúng Ngoài ra, cũng bổ sung những yếu tố cần thiết giúp chúng duy trì khả năng thụ tinh Bên cạnh đó, môi trường IVF cũng ảnh hưởng

đến tỉ lệ thụ tinh đa tinh trùng Martinez-Mardrid et al (2001) đã sử dụng hai môi

trường IVF khác nhau gồm môi trường đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi trường Tyrode cải tiến (mTALP) để so sánh Kết quả này cho thấy, trong mTALP tinh trùng có tỉ lệ xâm nhập cao hơn (92-94% so với 61-67%) Vì thế, lựa chọn môi trường IVF thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng để giảm tối thiểu tỷ lệ đa tinh trùng nhưng đạt tỉ lệ thụ tinh cao

Hệ thống nuôi phôi phải đảm bảo các điều kiện đặc biệt về áp suất thẩm thấu Do đó, các yếu tố bảo vệ áp suất thẩm thấu được sử dụng như taurine, hypotaurine, sorbitol Ngoài ra, huyết thanh thường được sử dụng với hàm lượng cao hơn so với môi trường nuôi trứng nhằm kích thích khả năng phân chia các nguyên bào phôi, đặc biệt trong giai đoạn phát triển muộn của phôi (từ giai đoạn phôi dâu trở lên) Trong nhiều thập kỉ qua, đã có nhiều nghiên cứu và pha chế nhiều môi trường nuôi cấy khác nhau như môi trường Whitten cải tiến, môi trường NCSU, môi trường ISU và môi trường Beltsville 3 đã cho phép hơn 70%

phôi (thu nhận in vivo) phát triển đến giai đoạn phôi nang

Wilmut và Kowon (1973) lần đầu tiên thực hiện kĩ thuật đông lạnh phôi

bò bằng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có thành phần Dimethyl sulfoxide (DMSO) với quy trình đông lạnh chậm (0,2oC/phút) và giải đông nhanh đã cấy chuyển thành công cho bò mang mang thai Tiếp theo sau là những

nghiên cứu của Willadsen et al (1977-1978); Truoson et al (1978; Lehsen et al (19787); Schneider et al (1980) nhằm đổi mới phương pháp đông lạnh theo xu

hướng đông lạnh và giải đông nhanh nhưng vẫn đảm bảo được sức sống của phôi

và đã thu được kết quả tốt ở cả chuột và bò Hiện nay, kĩ thuật đông lạnh phôi đã

được đơn giản hóa rất nhiều và tiến đến phương pháp một bước do Leibo et al (1982) và Reinard et al (1982) đã thiết lập Với phương pháp này, phôi sống đạt

trên 80% sau khi giải đông và tỉ lệ thụ thai đạt 50-60% Việc trữ lạnh phôi có thể

áp dụng trên cả phôi giai đoạn sớm và muộn với các quy trình và thành phần chất bảo quản hơi khác nhau nhằm đảm bảo tối đa sức sống của phôi

Cấy truyền phôi là quá trình chuyển phôi vào cá thể nhận giúp cho sự phát triển bình thường của phôi đến giai đoạn phát triển hoàn chỉnh Hiệu quả của kĩ thuật này giúp tạo được thế hệ con nhanh thông qua việc cấy chuyển hàng loạt

các phôi được tạo ra in vivo hoặc in vitro; và nguồn phôi sử dụng có thể là phôi

tươi hoặc phôi đông lạnh Kĩ thuật cấy truyền phôi được thực hiện lần đầu tiên trên thỏ (1890) do Walter Heap thực hiện Vào năm 1951, bê đầu tiên trên thế

giới ra đời nhờ kĩ thuật này do Willet et al tiến hành Sau đó, Bilton và More

(1972), Wilmut và Rowson (1973) thành công việc cấy truyền phôi bò đông lạnh Tiếp theo là sự thành công của cấy truyền hai phôi bò từ kĩ thuật cắt đôi phôi

(William et al., 1984) Năm 1992, kĩ thuật nhân bản vô tính đã thành công với 5

phôi bò được tạo ra từ một phôi Nhìn chung, công nghệ kỹ thuật cấy truyền phôi

đã được nghiên cứu và ứng dụng ở hầu hết các nước trên thế giới, đặc biệt là các nước chăn nuôi phát triển

Kỹ thuật đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa áp dụng thành công trên trứng bò (Martino và cs.,1996b) Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đông lạnh và rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa là 88% (Nakaga, 1989); 80% (Shaw, 1991); 95% (O’Neill, 1997); 99% (Lane, 2001); 90% (Kim, 2006) Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh và rã đông là 85% (Otoi,1998); 87% (Asada, 2002); 88% (Men, 2002); đặc biệt Chian thu được tỷ lệ trứng bò sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)

Năm 2004, Chian đã thành công trong việc đông lạnh và giải đông trứng đạt tỷ lệ 92% trứng sống sau rã đông với phương pháp thủy tinh hóa, khi sử dụng

chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO)

Vào năm 2005, Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và rã đông trứng heo bằng phương pháp thủy tinh hóa sử dụng Cryotop, với nồng độ EG trong dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu được tỷ lệ sống sau rã đông là 54 – 56% Cũng trong thời gian này Yunus Cetin và Ayhan Bastan đã bảo quản trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa với các chất bảo quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20% so với nhóm đối chứng là 79,6% Trong năm này R.D Martin và cs đã đông lạnh trứng bò chưa chín bằng phương pháp thủy tinh hóa,

sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứng sống là 20% so với nhóm đối chứng là 74,6% Gần đây, người ta đã công bố ứng dụng phương pháp thủy tinh hóa trong dự trữ trứng người Trong công bố ngày 19/6/2006, Kuwayama cho đông lạnh 111 trứng, trong đó 94,5% sống sau khi được rã đông và tỷ lệ thụ tinh bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intra cytoplasmic sperm injection_ICSI) đạt 41,9%

Ở động vật hữu nhũ, quá trình xác định giới tính là một mô hình về sự

“đóng mở” di truyền các chương trình nối tiếp nhau trong suốt sự phát triển của các thể Gene chủ đạo có vai trò khởi đầu cho những sự kiện hình thái mang tính

di truyền là gene sry Ở bò, SRY được biểu hiện trong giai đoạn phôi 4 – 8 tế bào

đến giai đoạn phôi nang Tiềm năng của kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) trong chẩn đoán tiền sinh ở phôi bò và chuột được chứng minh vào năm 1988 bởi King và Wall Chẳng bao lâu sau việc xác định giới tính bằng PCR trên các phôi bò đã được áp dụng thực tế trong chăn nuôi gia súc mang lại nhiều lợi ích kinh tế Bởi vì, thông qua đó, người ta có thể chọn lọc được các phôi cần cấy chuyển nhằm giảm chi phí sản xuất

PCR được thiết kế để thu nhận các đoạn sản phẩm có kích thước khác nhau trên nhiễm sắc thể Y và trình tự trên nhiễm sắc thể dinh dưỡng Các sản phẩm này được phân biệt bằng điện di trên gel agarose Trong các báo cáo trước đây, hiệu suất xác định giới tính phôi bằng PCR là 90-95% và độ chính xác đạt 93-98%

Schroder và cs (1990) đã công bố công trình xác định giới tính phôi bò giai đoạn 6-7 ngày tuổi dựa trên phản ứng PCR Đầu tiên, tác giả thiết lập phản ứng bằng cách sử dụng các tế bào bạch cầu Sau đó, quy trình được áp dụng trên các mẫu sinh thiết có từ 1-3 tế bào thu nhận từ phôi Kết quả xác định giới tính bằng PCR được so sánh với phương pháp chuẩn đoán tế bào là nhuộm nhiễm sắc thể và phương pháp lai tại chỗ được tiến hành song song trong thử nghiệm này Kết quả cho thấy phương pháp PCR cho hiệu quả phân tích cao hơn so với hai phương pháp còn lại

Peura và cs (1991) với công trình xác định giới tính phôi bò bằng kĩ thuật PCR đã khẳng định thêm tính khả thi của PCR trong xác định giới tính phôi Trong bước đầu thiết lập quy trình, tác giả đã sử dụng tế bào bạch cầu và xác định độ chính xác của phương pháp là 100% ở tất cả các mẫu kiểm tra khi so sánh giữa kết quả xác định bằng PCR và kết quả phân tích hình thái học Sau đó, quy trình đước áp dụng trên các mẫu sinh thiết có từ 20-30 tế bào thu nhận từ phôi dâu Lopes và cs (1992) công bố kết quả sử dụng các mẫu sinh thiết gồm 4-

20 tế bào từ phôi cho phản ứng PCR xác định giới tính

Bredbacka và cs (1994) nghiên cứu quy trình xác định giới tính phôi bằng

kĩ thuật PCR Trong công trình này, các tác giả thực hiện sinh thiết phôi ở giai đoạn phôi dâu và lấy đi 2-8 tế bào từ phôi để thực hiện việc xác định giới tính Trong nghiên cứu, các tác giả chỉ sử dụng mồi đặc hiệu cho giới tính đực mà không sử dụng mồi cho các trình tự mồi cho các trình tự chung của hai giới để kiểm tra hiệu quả nhân bản của phản ứng Các tác giả cho rằng việc sử dụng mồi cho các trình tự chung này là không cần thiết nếu như đã thực hiện việc kiểm tra

sự hiện diện của mẫu sinh thiết trước khi thực hiện phản ứng PCR Tuy nhiên, một số phản ứng cho kết quả không rõ ràng

Hiện nay, một phương pháp đơn giản và hiệu quả hơn PCR trong xác định giới tính được sử dụng, đó là phương pháp LAMP LAMP (loop-mediated isothermal amplification) là sự khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua loop LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm của tác giả Tsugunori Notomi, đây là một phương pháp khuếch đại DNA có tính đặc hiệu, hiệu quả cao và thời gian ngắn Phương pháp này sử dụng đặc tính của DNA

polymerase và một loạt 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện toàn bộ 6 trình

tự cách xa nhau trên DNA đích Phương pháp này dựa trên sự tổng hợp DNA thay thế chuỗi tự xoay vòng được thực hiện bởi một DNA polymerase với hoạt động thay thế chuỗi cao và một bộ hai mồi trong và hai mồi ngoài được thiết kế đặc biệt Ở các bước khởi đầu của phản ứng LAMP cả bốn mồi được sử dụng, nhưng sau đó trong suốt phản ứng chu kỳ chỉ các mồi trong được sử dụng để tổng hợp DNA thay thế chuỗi Các mồi trong được gọi là mồi trong tiến trước (Forward inner primer - FIP) và mồi trong tiến sau (Backward inner primer - BIP) và mỗi một mồi có chứa hai trình tự riêng biệt tương ứng với trình tự sense

và antisense của DNA đích, một cho việc mồi ở giai đoạn đầu tiên và cái còn lại

là tự mồi trong các giai đoạn sau Để dễ dàng hơn cho việc giải thích, trình tự (khoảng 23 -24 nt) bên trong hai đầu của vùng đích cho khuếch đại trên DNA chỉ định lần lượt là F2c và B2 Hai trình tự trong (khoảng 23-24 nt) cách 40 nt từ đầu của F2c và B2 được chỉ định là F1c và B1 và hai trình tự (17-21 nt) bên ngoài đầu F2c và B2 được chỉ định là F3c và B3 Trình tự của FIP và BIP sẽ được thiết

kế như sau:

• FIP chứa F1c , một đoạn TTTT và một trình tự (F2) bổ sung với F2c

• BIP sẽ chứa trình tự (B1c) bổ sung cho B1, một đoạn TTTT và B2

• Hai mồi bên ngoài là B3 và trình tự (F3) bổ sung cho F3c

Mẫu DNA chứa trình tự đích và bốn mồi bị biến tính bởi nhiệt và nhanh chóng cho vào đá sau đó Phản ứng LAMP được khởi đầu bằng việc thêm mảnh lớn Bst DNA polymerase thực hiện ở 65oC trong 1h

Sinh thiết phôi là một giai đoạn quan trọng được thực hiện trước kỹ thuật PCR hay LAMP Tuy nhiên, việc lấy ra một số lượng tế bào từ phôi có khả năng làm giảm sức sống của phôi nếu như thao tác không chuẩn Trong hầu hết các trường hợp sinh thiết, khoảng 10-20% của khối tế bào phôi được tách ra Việc sinh thiết phôi được thực hiện chủ yếu bởi các kỹ thuật vi thao tác

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Từ thập niên 1990, lĩnh vực chăn nuôi ở Việt Nam đã từng bước thực hiện những chiến lược phát triển theo định hướng công nghệ sinh học Tuy nhiên, những bước nghiên cứu đầu tiên vẫn còn nhiều khó khăn do yếu kém vể kỹ thuật

và thiếu thốn về kinh phí Mặc dù vậy, nhiều nghiên cứu thuộc lĩnh vực ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học trong nhân giống vẫn được triển khai Trong đó, việc áp dụng các kỹ thuật cao như công nghệ thụ tinh ống nghiệm, cấy truyền phôi, xác định giới tính phôi đã mở ra một hướng mới cho việc nhân nhanh và cải tạo hiệu quả các giống vật nuôi Đặc biệt, những kỹ thuật này đã được nghiên cứu, áp dụng trên bò - một đối tượng quan trọng nằm trong chương trình định hướng phát triển nông nghiệp chung của cả nước

Ở nước ta, sự ra đời Bộ môn Cấy truyền phôi vào năm 1989 thuộc Viện Chăn nuôi Quốc gia làm tiền đề cho khả năng nghiên cứu, ứng dụng và chuyển giao kỹ thuật này trong cả nước Cuối năm 1989, 50 phôi bò đông lạnh cùng các chuyên gia nước ngoài (Cuba) đã hỗ trợ cho Viện Chăn nuôi tổ chức cấy phôi Vào năm 1990, Viện Công nghệ sinh học thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã ứng dụng công nghệ cấy truyền phôi trên bò Năm 1996 và 1997, 150 phôi đông lạnh được nhập và hai chuyên gia New Zealand đã đến Việt Nam tiến hành kỹ thuật cấy truyền phôi bò sữa cho đàn bò miền Nam và Hà Nội Kết quả chuyển giao kỹ thuật cho thấy, một số bê ra đời, sinh trưởng, phát triển và sinh sản bình thường, đặc biệt năng suất sữa cao hơn hẳn so với bò bình thường, với tỷ lệ mang thai đạt 42,86% (18/42) và tỷ lệ bê con sinh ra là 33,3% (14/42) Trên cơ sở đó, tiềm năng áp dụng các kỹ thuật trên là hoàn toàn có thể cho điều kiện chăn nuôi bò ở nước ta

Một bước tiến hơn nữa trong việc chủ động tạo nguồn phôi cho việc cấy chuyển đã được ghi nhận tại Viện Công nghệ sinh học của nhóm tác giả Nguyễn

Thị Ước và cs (1999) với hướng ứng dụng công nghệ thụ tinh in vitro tạo phô bò

trên đối tượng bò vàng địa phương Việt Nam và bò lai Hà - Ấn Hướng nghiên cứu khẳng định về khả năng tạo được nguồn phôi ở quy mô công nghiệp và giá thành rẻ để thay thế công nghệ sản xuất phôi bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiều Kết quả cho thấy tỷ lệ thụ tinh đạt 54,7-60,9% và tỷ lệ phát triển thành phôi dâu

và phôi nang từ 22,8-26,9% tùy theo giống bò dùng khai thác trứng Tuy nhiên, các tác giả khẳng định cần cải thiện quy trình nuôi trưởng thành trứng nhằm nâng cao tỷ lệ tạo phôi có khả năng cấy chuyển

Nghiên cứu xây dụng ngân hàng tế bào và phôi đông lạnh là hướng cần quan tâm khi mà khả năng thành công của công nghệ thụ tinh nhân tạo và cấy phôi đã đạt được Thông qua đó sẽ hỗ trợ rất nhiều cho việc cấy chuyển phôi được chủ động hơn, đơn giản hóa các quá trình trao đổi giống gia súc giữa các khu vực, bảo quản mẫu để sử dụng trong các dây chuyền công nghệ sinh sản, bảo

vệ đa dạng các loại vật nuôi và động vật hoang dã Từ những định hướng đó, nhóm tác giả Bùi Xuân Nguyên và cs (1999) đã tiến hành xây dựng ngân hàng động lạnh tế bào và phôi của các động vật như chuột, dê, trâu, bò với các phương pháp đông lạnh khác nhau Kết quả nghiên cứu trên phôi bò cho thấy, tỷ lệ thành

công phôi sống in vitro đạt được dao động từ 50-90% tùy thuộc loại phôi bò được khai thác sử dụng (phôi từ bò gây rụng trứng, từ quy trình thụ tinh in vitro,

từ kỹ thuật vi thao tác) và phương pháp đông lạnh

Trong thực tế chăn nuôi, đối với những đàn bò khai thác sữa thì bò cái là đối tượng cần quan tâm; ngược lại, đối với đàn bò cần khai thác tinh thì con đực

là cần thiết Vì thế, việc điều khiển và chọn giới tính vật nuôi luôn được quan tâm từ nhiều góc độ khác nhau Trên cơ sở đó, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, LAMP với những ưu điểm về thời gian và kỹ thuật đơn giản để chọn lọc giới tính phôi ở giai đoạn phát triển sớm là một công nghệ được

áp dụng trên nhiều đối tượng khác nhau, trong đó có bò, ở nhiều quốc gia trên thế

giới Dựa trên những tham khảo trên, các tác giả Bùi Linh Chi et al (1999) thuộc

Viện Công nghệ sinh học đã áp dụng kỹ thuật này để xác định giới tính nguồn phôi bò được tạo ra trong điều kiện phòng thí nghiệm phục vụ cho công tác cải tạo giống và phát triển nhanh đàn bò sữa Việt Nam trong giai đoan 2000-2010 Các tác giả đã thiết lập được quy trình PCR với các cặp mồi đặc hiệu giới tính do

tổ chức INRA (Pháp) cung cấp và hướng dẫn Kết quả thử nghiệm đã khẳng định

về khả năng xác định chính xác giới tính phôi ở các giai đoạn khác nhau từ 2 tế bào đến giai đoan phôi nang

Nhóm tác giả Lê Văn Ty et al (1999) đã báo cáo về khả năng áp dụng kỹ

thuật vi thao tác vào công nghệ phôi, đặc biệt là phôi bò Các tác giả đã sử dụng

kỹ thuật vi thao tác để cắt mảnh phôi sử dụng cho việc xác định giới tính phôi với

tỷ lệ sống đạt 80% sau cắt; tiêm tinh trùng vào trứng đạt tỷ lệ tạo phôi là 70-90% với phương pháp cải tiến

Vào năm 2003, nhóm nghiên cứu Nguyễn Văn Lý et al thuộc Viện Chăn

nuôi Quốc gia đã báo cáo đề tài “Nghiên cứu tạo đàn bê bằng phôi thụ tinh trong ống nghiệm” với khả năng hình thành một quy trình khép kín từ việc tạo phôi

trong điều kiện in vitro và cấy chuyển cho bò nhận phôi Kết quả thụ tinh in vitro đạt được là 50,6%; tỷ lệ phôi dâu và phôi nang sau nuôi cấy in vitro 32,37% Kết quả về tỷ lệ phát triển phôi đạt cao hơn so với nhóm tác giả Nguyễn Thị Ước et

al (1999) Tỷ lệ bò mang thai sau cấy chuyển phôi tươi và phôi đông lạnh là

40% và 35% Cùng hướng nghiên cứu trên, nhóm tác giả Nguyễn Hữu Đức và cs (2003) thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã trình bày về kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi bò Lai Sind Trong nghiên cứu này, tỷ lệ phân chia đạt 72,9% và tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang đạt 25,88% Kết quả này thấp hơn so với hai nhóm tác giả Nguyễn Thị Ước và cs (1999) và nhóm Nguyễn Văn Lý và cs (2003) Tỷ lệ bò mang thai là 25% và có 6 bê con ra đời từ kết quả cấy truyền phôi

Bò sữa vẫn là đối tượng được quan tâm hàng đầu của ngành chăn nuôi nước ta Do đó, vấn đề nghiên cứu sản xuất bò sữa giống thương phẩm bằng cấy phôi thụ tinh trong ống nghiệm và xác định giới tính đã được nhóm tác giả Nguyễn Thị Ước và cs (2003) tiếp tục thực hiện trong nghiên cứu, các tác giả sử dụng giống bò sữa Holstein có năng suất sữa từ 6000 – 8000 lít/chu kì làm nguồn khai thác trứng và nguồn tinh trùng từ bò đực giống Holstein hướng sữa (Gir) Các phôi tạo ra được kiểm tra giới tính bằng kĩ thuật PCR giới tính trước cấy truyền, các phôi cái được chọn cho cấy truyền vào bò nhận Kết quả tạo phôi đạt

tỷ lệ phát tiển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang là 60% Kết quả xác định giới tính phôi cho thấy số phôi cái chiếm tỷ lệ trung bình 54,5% Tỷ lệ thụ thai sau cấy truyền đạt 64% và có sáu bê cái được sinh ra Như vậy, kết quả nghiên cứu khẳng định khả năng tạo được bê cái do cấy phôi thụ tinh trong ống nghiệm và xác định giới tính đầu tiên ở Việt Nam

Tóm lại, công nghệ phôi nói chung gồm nhiều kỹ thuật như kỹ thuật nuôi

trưởng thành các loại tế bào giao tử, kỹ thuật thụ tinh in vitro, vi thao tác, kỹ

thuật đông lạnh và cấy phôi với khả năng là sản xuất và đánh giá sớm chất lượng phôi là con đường ngắn nhất nhằm nâng cao hiệu quả chăn nuôi ở nước ta Công nghệ phôi có thể có những đóng góp quan trọng trong lĩnh vực phát triển chăn nuôi của Việt Nam, đặc biệt là trong chăn nuôi bò sữa Đàn bò sữa ở nước ta hiện nay xấp xỉ 108.000 con (Thành phố Hồ Chí Minh có 70.000 con) chỉ có khả năng cung cấp 20% nhu cầu tiêu thụ sữa hiện nay (Theo Cục chăn nuôi, 2008) Để đạt được mức tiêu thụ sữa/đầu người hiện nay Việt Nam cần có đàn bò sữa đạt một triệu con Chương trình quốc gia về phát triển chăn nuôi bò sữa của Việt Nam đề

ra kế hoạch phấn đấu đạt 200.000 con vào năm 2010 Trong những năm vừa qua, biện pháp được triển khai là nhập bò sữa thương phẩm nước ngoài như Mỹ, Úc, nhưng thực tế chăn nuôi cho thấy khả năng thích nghi của bò nhập rất thấp và chi

phí là rất cao

Do đó, nhân giống bằng công nghệ phôi hiện đại là giải pháp khả thi nhất góp phần triển khai thành công Chương tình Quốc gia 200.000 bò sữa Với các quy trình công nghệ phôi đã được nghiên cứu thành công, chúng ta có thể tổ chức dây chuyền công nghệ sản xuất công nghiệp bò sữa cao sản Chương trình này sẽ giúp tiết kiệm cho nhà nước một khoảng chi phí rất lớn từ 6.000 tới 10.000 tỉ VNĐ so với việc phải nhập bò (giá thành hạ 25-35%)

Nhìn chung, trên những tiền đề nghiên cứu đã đạt được thì khả năng ứng dụng các kỹ thuật công nghệ vào lĩnh vực chăn nuôi ở nước ta là có thể dựa vào những đơn vị nghiên cứu được đầu tư các trang thiết bị công nghệ kỹ thuật cao của cả nước, đặc biệt tại các tỉnh thành lớn như Hà Nội, Tp Hồ Chí Minh

1.2 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Sự ra đời của Kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, Đông lạnh và Cấy truyền phôi đã đem lại nhiều hứa hẹn trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là nhân nhanh giống gia súc ở nước ta Nhiều công trình đã nghiên cứu và triển khai ứng dụng trong nhiều năm qua nhưng chưa thật sự đáp ứng yêu cầu đặt ra là nhân nhanh số lượng

bò sữa có chất lượng cao cho thành phố Hồ Chí Minh nói riêng và cả nước nói chung

Những mặt hạn chế của các đề tài đã tiến hành có thể liệt kê như sau:

- Nhập phôi bò sữa chất lượng cao để cấy truyền cho bò địa phương: tuy được bò sữa chất lượng cao nhưng chi phí quá đắt (khoảng 300 USD/phôi); mặt khác, những bò sữa này do nguồn gen hoàn toàn mới nên thích nghi kém với điều kiện nước ta Do vậy, việc ứng dụng đại trà là không khả thi

- Thụ tinh nhân tạo từ nguồn tinh trùng bò sữa ngoại nhập: việc thụ tinh này đòi hỏi một thời gian khá dài (một năm bò chỉ động đực một lần) và sau 2 - 3 thế hệ thì mới có thể tạo ra được bò sữa mang tính trạng mong muốn, thông thường bò sữa tạo theo kiểu này thì thế hệ F2 mới có đặc tính di truyền mong muốn (mất chừng 2 - 3 năm mới được 1 con bò sữa) Ngoài ra, một trở ngại lớn của chương trình này là: bê con tạo ra không thể kiểm soát được giới tính, trong khi đó, bò cho sữa là bò cái Vì thế, việc áp dụng chương trình này ở nông thôn vấp phải khó khăn vì người dân thường không đồng ý thụ tinh bò sữa do họ sợ bò sữa sinh ra là bò đực và chắc chắn là không có giá trị kinh tế bằng bò thịt

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo phôi bò giai đoạn

blastocyst bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn giao tử nội và ngoại nhập”

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Trứng bò từ các nguồn: thu nhận tại lò mổ, trứng siêu âm, trứng mua, trứng đông lạnh

Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ mua tại Trung tâm Nghiên cứu và chuyển giao tiến bộ kỹ thuật chăn nuôi – Viện Chăn nuôi Địa chỉ: 80 Nguyễn Văn Nghi, Phường 7, Quận Gò Vấp, Tp Hồ Chí Minh

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG THỰC TIỄN

Đào tạo cán bộ kỹ thuật cho lĩnh vực Công nghệ sinh học động vật

Bước đầu xây dựng các quy trình về thụ tinh trong ống nghiệm, xác định giới tính phôi bò

Có khả năng ứng dụng thực tiễn cao

CHƯƠNG 2

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 NỘI DUNG 1: TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG TRỨNG THU NHẬN TỪ LÒ MỔ VÀ TINH TRÙNG NGOẠI NHẬP ĐÔNG LẠNH

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1

2.1.1 CHUẨN BỊ TRỨNG

- Hóa chất

NaCl 0,9%: nước muối sinh lý sử dụng để rửa và giữ mẫu buồng trứng

trong thời gian vận chuyển từ lò mổ đến PTN Dung dịch nước muối sinh lý được hấp khử trùng, để nguội dưới 450C, trước khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin 0,1 mg/ml (S9137, Sigma)

Dung dịch D – PBS: môi trường sử dụng để thu dịch nang trứng Trước khi

sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,1mg/ml

quan trọng giúp trứng phát triển và trưởng thành Môi trường C1 cần ủ ấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng

Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng

ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt

Hyaluronidase (H4272, Sigma): dạng dung dịch được sử dụng để phá các tế

bào cumulus quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM

Môi trường VS 1: TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG: dung để cần bằng trứng

Môi trường VS 2: TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose: dung để bảo quản trứng ở -196oC

- Dụng cụ

Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mĩ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120µm, mouth pipette, cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), máy ép nhựa, bình đựng nitơ lỏng, một số dụng cụ thủy tinh: bercher, erlen…

để giữ mẫu Dùng gạc vô trùng lau khô buồng trứng rồi chuyển vào becher chứa

D – PBS có kháng sinh đã làm ấm để giữ mẫu

Thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút: Sử dụng đầu kim 18G gắn vào syringe 5ml hút khoảng 1ml dung dịch D –PBS có kháng sinh đã làm ấm trong

becher (không phải becher giữ mẫu) Đâm mũi kim vào các nang có đường kính

từ 2 - 8mm (Hình 2.3), hút dịch nang cho đến khi được khoảng 3ml thì chuyển dịch vào đĩa petri nhựa Φ60 và các đĩa chứa dịch nang trứng được chuyển vào tủ

ấm 38,5oC từ 5–10 phút để lắng Sau đó soi tìm và phân loại trứng dưới kính hiển

vi đảo ngược (hoặc kính hiển vi soi nổi) ở độ phóng đại 40 lần

Hình 2.2 Rửa buồng trứng Hình 2.3 Thu nhận trứng từ buồng

trứng

Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành

3 loại: A, B và C Trong đó, trứng A và B còn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một phần

™ Nuôi trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM)

- Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở lên) từ đĩa D – PBS cho vào các giếng có môi trường W1 và C1để rửa

- Sau đó cho khoảng 10 đến 20 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuôi chứa môi trường C1 (loại đĩa 4 giếng chứa 100 µl/giếng

và phủ dầu khoáng)

- Nuôi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa Lưu ý: Môi trường C1 cần ủ ấm 38,5oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng

- Sau 22 - 24h nuôi cấy, chuyển các trứng có cumulus giãn nở rộng sang các vi giọt sạch môi trường C1 chờ để thụ tinh

Trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả trưởng thành sau khi IVM, tất cả các trứng sau khi IVM bị tách bỏ lớp cumulus bằng mouth pipette và hyaluronidase Trứng cho là trưởng thành sẽ có 1 thể cực, tế bào chất sáng, đều

™ Đông lạnh trứng (dùng cho nội dung 3)

Sau 22 – 24h nuôi, chọn những trứng chín đem đông lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) 2 bước: Trứng được cân bằng trong môi trường

VS1 (TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG) 45 giây, sau đó chuyển qua môi trường VS2 (TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose) trong 25 giây Sau đó chuyển trứng vào cọng rạ (straw) trong vòng 30 giây Cách chuyển trứng vào cọng rạ như sau: hút 1 khoảng môi trường VS2, sau

đó hút một khoảng đệm khí, hút tiếp một đoạn môi trường VS2 rồi dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7 trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối cùng hút thêm một đoạn môi trường VS2 (Hình 2.4) và hàn đầu cọng rạ bằng máy

ép nhựa Đưa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác nhanh)

Nguồn tinh trùng: tinh trùng nhập ngoại giống tốt, được mua tại Trung

tâm Chuyển giao Khoa học Kĩ thuật, Viện Chăn nuôi

Giải đông tinh trùng

- Cọng rạ chứa tinh từ bình nitơ lỏng được giải đông trong bình nước ấm ở

nhiệt độ 35-37o C trong 30 - 40 giây

Hình 2.5 Giải đông cọng rạ chứa tinh trùng

trong water bath 37 0 C

Thu nhận và hoạt hóa tinh trùng

Tinh trùng sau khi giải đông được pha loãng và hoạt hóa trong môi trường

BO bổ sung sodium caffeine benzoate 0,3885mg/ml và heparin 4µl/ml, sau đó li tâm 2 lần, 1800 vòng/phút trong 5 phút Ở lần li tâm cuối, phần lắng dưới đáy ống falcon được pha loãng bằng môi trường BO sao cho đạt mật độ 5-6x106 tinh trùng/ml Dịch huyền phù này dùng để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 giếng (100µl/giọt), phủ dầu khoáng, giữ trong tủ ấm 38,50C, 5% CO2 Như vậy, mỗi vi giọt chứa khoảng 5-6.105 tinh trùng Lượng tinh trùng này được sử dụng cho thụ tinh 15-20 trứng trong một vi giọt Nghĩa là cần khoảng 25 đến 30 ngàn tinh trùng để thụ tinh cho 1 trứng

2.1.3 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

lượng môi trường nuôi trứng kèm theo thì càng tốt Đặt đĩa trên vào tủ nuôi ở 38,5oC; 5% CO2 trong 5-6 giờ Sau đó, quan sát đánh giá kết quả thụ tinh

2.1.4 NUÔI PHÔI VÀ ĐÁNH GIÁ PHÔI

2.1.4.1 Chuẩn bị

Môi trường nuôi cấy phôi (môi trường CR1aa) ít nhất là 2 giờ trước khi lấy phôi/trứng đã thụ tinh Môi trường này cũng ủ trong tủ ấm 38,50C, 5% CO2, bão hòa hơi nước

Mouth pipette: đường kính pipette 100µm

2.4.2 Tiến hành

- Sau khi thụ tinh 5-6 giờ thụ tinh, các tế bào trứng được loại bỏ cumulus bằng mouth pipette có gắn pipette pasteur Các hợp tử giả định được chuyển vào các vi giọt môi trường CR1aa, đĩa nuôi được phủ dầu khoáng và nuôi ở 38,5oC; 5%

CO2 Sự phân chia của hợp tử được đánh giá dựa vào sự phân chia tế bào 46 – 48

giờ sau thụ tinh Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành đánh giá tốc độ phân chia: Tốc

độ phân chia được xác định dựa trên số phôi phân chia trong số phôi/trứng trong một giọt nuôi cấy ban đầu Sau 5 ngày nuôi cấy bổ sung huyết thanh vào giọt

nuôi cấy: Thêm 5µl FBS đã được lọc vô trùng và làm ấm vào mỗi giọt nuôi cấy

Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy đánh giá sự phát triển của phôi: Đánh giá sự phát triển của phôi đến giai đoạn blastocyst

2.1.5 SINH THIẾT PHÔI

- Tạo đĩa vi giọt chứa môi trường sinh thiết phôi:

+ Dùng nắp đĩa X tạo các vi giọt 50µl môi trường CR1aa

+ Tạo 1 vi giọt 100µl Tyrode (T1788, Sigma) ở giữa đĩa

+ Sau đó phủ dầu khoáng đầy vi giọt

+ Cho vào tủ ấm, ủ ấm ít nhất 3 giờ trước khi tiến hành sinh thiết

: vi giọt chứa 50µl môi trường CR1aa

: vi giọt 100µl Tyrode

Hình 2.6 Cách bố trí đĩa sinh thiết

2.1.5.2 Tiến hành

- Khoan màng pellucida: Khoan màng pellucida bằng Tyrode

+ Chỉnh vi giọt chứa Tyrode vào vùng trung tâm Hạ zona drilling pipette hút khoảng 10µl Tyrode

+ Nâng zona drilling pipette lên, chỉnh vi giọt chứa phôi vào vùng trung tâm

+ Hạ holding pipette xuống, điều chỉnh phôi và giữ phôi bằng holding pipette

+ Hạ zona drilling pipette xuống, tiếp cận phôi, vừa tiến lại gần vừa đẩy từ

từ và nhẹ nhàng dung dịch Tyrode ra, không được đâm vào phôi (Hình 2.7A), đến khi tạo một lỗ thủng vừa phải trên màng zona (Hình 2.7 B), lấy zona drilling pipette ra (Hình 2.7 C)

Hình 2.7 Khoan màng Zona pellucida bằng Tyrode

- Hút 2-8 tế bào lớp lá nuôi phôi (TE) bằng biopsy pipette Chuyển các cụm tế bào này vào eppendorf 0,2 ml (eppendorf PCR nắp phẳng)

- Sau đó, chuyển phôi sau khi sinh thiết vào đĩa nuôi, đặt vào tủ ấm 5%

DNA phôi được tách chiết bằng phương pháp nhiệt

- Bổ sung 5 µl Tris-HCl 10 mM pH 8,0 vào các eppendorf 0,2 ml chứa sẵn cụm 2-8 tế bào sau khi sinh thiết

- Đun eppendorf này ở 95o C trong 5 phút để tách DNA (sử dụng máy PCR)

- DNA phôi có thể lưu trữ trong tủ lạnh -20oC

Cặp mồi S4

Năm 2004, Kageyama et al đã xác định một trình tự lặp lại đặc hiệu cho

con đực ở bò và đặt tên là S4 S4 là một trình tự lặp lại cao và là một đơn vị lặp lại 1,5 kb chứa những trình tự lặp lại khác nhau bên trong Phân tích FISH cho thấy S4 nằm ở toàn bộ cánh dài và vùng lân cận cánh ngắn trên nhiễm sắc thể Y Nhóm này trong khi thử nghiệm nhiều cặp mồi PCR cho trình tự S4 đã phát hiện một cặp mồi cho ra sản phẩm 178 bp đặc hiệu đực, thêm vào đó là sản phẩm 145

bp cho ở cả đực lẫn cái Nguồn gốc của sản phẩm 145 bp chưa được rõ, nhưng nó được dùng như là mẫu đối chứng dương cho con cái trong xác định giới tính Sau khi khuếch đại DNA bằng cặp mồi này kết quả thu được với con đực là hai vạch trên gel khi điện di và con cái chỉ có một vạch

Tiến hành

Hỗn hợp phản ứng bao gồm:

- 5 µl DNA phôi (từ việc tách trên)

- 15 pmol mỗi mồi

- Với 5 phút pre-heat và 5 phút ở 720C sau khi hoàn tất 45 chu kì, sau đó hỗn hợp

sẽ được giảm nhiệt độ xuống 40oC trong 5 phút

Phương pháp LAMP khuếch đại trình tự đặc hiệu gen SRY trên nhiễm sắc thể Y Kết quả điện di, con đực sẽ hiện một smear dài trên vạch điện di, con cái thì không

Hỗn hợp phản ứng:

- 5µl DNA phôi hay DNA từ thịt bò

- 1,6µM mồi trong

- 0,2µM mồi ngoài

Thiết lập phản ứng LAMP với các mồi đặc hiệu cho giới tính đực có trình

tự như sau: (Theo Hiroki Hirayama và cs., 2003)

FIP:5’AGCTATGTGGCATGTGGATCCTTCCCTGGAAATGTTTAAGTG-3’

BIP:5’TAAAGCCAGACACAGAGGTCACTTTTGCTTCTCTTTCCTGCTTC-3’

Đọc kết quả

Đánh giá kết quả bằng phương pháp điện di

Sau khi phản ứng PCR và LAMP đã hoàn tất, các mẫu được chạy điện di trong gel agarose 2% đối với phản ứng LAMP và gel agarose 3% đối với phản ứng PCR Gel được đổ bằng TAE 1X

Dung dịch nạp mẫu được trộn lẫn với mẫu

Điện di đuợc thực hiện trong 30 phút với PCR và 20 phút với LAMP trong TAE 1X

Sau đó gel được nhuộm trong dung dịch 0,5µg/ml ethidium bromide Kết quả sẽ được quan sát trên bàn đèn điện di

2.1.7 ĐÔNG LẠNH PHÔI

2.1.7.1 Chuẩn bị dung dịch

Dung dịch 1: Môi trường PBS + 15% FCS

Dung dịch 2: Môi trường PBS + 10% Glycerol

2.1.7.2 Tiến hành

Hút phôi vào cọng rạ

Phôi sau khi được đánh giá phân loại đạt tiêu chuẩn được rửa bằng dung dịch 1 ít nhất 3 lần, tiếp theo chuyển phôi sang dung dịch 2 trong 5 phút và cuối cùng nạp phôi vào cọng rạ (1 phôi/cọng rạ), hàn cọng rạ bằng máy ép, để cân bằng trong cọng rạ 15 phút

Hình 2.8 Cách hút phôi vào cọng rạ

Hình 2.9 Hút phôi vào cọng rạ

Để tránh nhầm lẫn trong việc chọn phôi, trên cọng rạ phải ghi một số thông tin như: giống, chất lượng phôi, giai đoạn phát triển của phôi

Quy trình đông lạnh phôi

Đặt sẵn chương trình trên máy đông lạnh như sau:

- Đưa phôi vào máy, hạ nhiệt độ xuống – 7oC, giữ phôi 5 -10 phút Tốc độ

hạ nhiệt 1oC/phút

- Tạo đá: lấy pank và bông nhúng vào nitơ lỏng, sau đó, kẹp vào phía đầu của cọng rạ (đầu có nút bấc), sau đó để vào máy 5 phút, nếu môi trường đã thành đá là quá trình tạo đá đã hoàn thành

- Hạ nhiệt độ từ -7oC xuống -33oC hoặc 35oC với tốc độ 0,2 - 0,4oC/phút Giữ phôi ở nhiệt độ này 5 -10 phút Sau đó, đưa cọng rạ có chứa phôi thẳng vào nitơ lỏng -196oC bảo quản với thời gian mong muốn

2.2 NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG TRỨNG THU TỪ SIÊU ÂM VÀ TINH TRÙNG NGOẠI ĐÔNG LẠNH

Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2

Ở nội dung 2, các bước làm giống với nội dung 1, chỉ khác ở nguồn trứng Trứng trong nội dung 2 được thu nhận từ bò sống bằng phương pháp siêu âm, cụ thể khâu chuẩn bị trứng như sau:

Trứng được thu nhận từ bò cho trứng bằng phương pháp siêu âm qua âm đạo Bò cho trứng là bò sữa thế hệ F2 (Holstein Friesian) đã sinh 3 - 4 lần Việc thu nhận được thực hiện 2 lần/tuần Trứng được giữ trong môi trường, nhiệt độ được duy trì ở 36oC, nhanh chóng vận chuyển về phòng thí nghiệm Tiến hành lọc lại dịch chứa trứng để giảm thể tích dịch, và rót dịch vào đĩa Petri nhỏ, tìm trứng trên kính hiển vi soi nổi

Chọn những trứng loại A và loại B đem nuôi cấy (xem phần 2.1) Sau khi nuôi 22 – 24h, chọn những trứng chín để chuẩn bị thụ tinh trong ống nghiệm