nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ đất (naja kaouthia) và hổ chúa (ocpgs.tsphiophagus hannah) trên thỏ

Xác định khả năng trung hòa của huyết thanh kháng độc tố đối với nọc toàn phần trên chuột - Huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ đất có khả năng trung hòa với nọc rắn hổ đất và nọc

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(đã chỉnh sửa theo ý kiến của Hội Đồng nghiệm thu ngày 5/11/2009)

NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM TẠO HUYẾT THANH KHÁNG ðA ðỘC TỐ

HAI LOẠI RẮN HỔ ðẤT (Naja kaouthia),

VÀ HỔ CHÚA (Ophigophagus hannah) TRÊN THỎ

Chủ nhiệm đề tài:

1 PGS.TS NGUYỄN LÊ TRANG

2 Th.S NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 11/ 2009

đất (Naja kaouthia) và hổ chúa (Ophigophagus hannah) trên thỏ

2 Th.S NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

Thời gian thực hiện đề tài: 23 tháng (11/2007- 9/2009)

Kinh phí được duyệt: 320.000.000 đồng

Kinh phí cấp đợt 1: 240.000.000 đồng theo TB 224 -12/11/2007

Kinh phí cấp đợt 2: 48.000.000 đồng theo TB 83 - 21/4/2009

2 Danh sách những người tham gia đề tài:

3 Mục tiêu: Nghiên cứu thử nghiệm tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loại rắn hổ

đất (Naja kaouthia) và hổ chúa (Ophigophagus hannah) trên thỏ

lực của độc tố đổi ion Biorex-70

- Đã xác định được các thành phần gây độc chính trong nọc hai loại rắn Kết quả được

Tạo huyết thanh kháng độc tố

của hai loại rắn trên thỏ

- Lô I: 3 thỏ (đánh số 17, 18, 19) được gây miễn dịch với độc tố peak 3.1 của nọc rắn hổ đất

- Lô II: 4 thỏ (đánh số 13, 14, 15, 16) được gây miễn dịch với độc tố peak 3 của nọc rắn hổ chúa

- Lô III: 4 thỏ (đánh số 7, 8, 11, 12) được gây miễn dịch với cả hai loại độc tố trên

Sau quá trình gây miễn dịch, thu nhận kháng huyết thanh và lưu trữ kháng thể dưới dạng tủa trong ammonium sulfate bão hòa 50%, 40C

giá kháng thể đặc hiệu tăng dần và cao nhất trong huyết thanh sau lần tiêm thứ 3 và hơi giảm trong huyết thanh sau lần tiêm thứ 4

- Sử dụng huyết thanh sau lần tiêm thứ 3 và thứ tư để thực hiện phản ứng trung hòa trên chuột

Xác định khả năng trung hòa

của huyết thanh kháng độc tố

đối với nọc toàn phần trên chuột

- Huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ đất có khả năng trung hòa với nọc rắn hổ đất

và nọc rắn hổ chúa

- Huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ chúa không có khả năng trung hòa với nọc hổ chúa (theo qui trình gây miễn dịch của đề tài) Đây là một vấn đề cần được nghiên cứu thêm

- Huyết thanh kháng đa độc tố của hai loài rắn

hổ đất và rắn hổ chúa có khả năng trung hòa với nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa Kháng huyết thanh đa giá có thể cải thiện hiệu giá trung hòa đối với nọc rắn hổ chúa so với tác dụng trung hòa chéo của huyết thanh kháng độc tố thần kinh rắn hổ đất Tuy nhiên tác dụng trung hòa đối với nọc rắn hổ đất bị giảm

2 Độc tố của nọc rắn hổ đất và hổ chúa sau tinh chế

3 Các thành phần gây độc của nọc hổ chúa và hổ đất sau tinh chế

4 Kết quả xác định độc lực của các thành phần gây độc

5 Kháng thể thỏ kháng độc tố của rắn hổ đất và hổ chúa ở dạng tủa trong ammonium sulfate bão hòa 50%

6 Kết quả xác định hiệu lực trung hòa nọc toàn phần của 3 loại kháng thể thỏ (kháng độc tố hổ đất, kháng độc tố hổ chúa, kháng độc tố hỗn hợp) sau tinh chế trên chuột

7 Báo cáo nghiệm thu đề tài

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH ĐA ĐỘC TỐ KHÁNG HAI LOÀI

RẮN HỔ ĐẤT (Naja kaouthia) VÀ HỔ CHÚA (Ophigophagus hannah)

TRÊN THỎ

Các phân đoạn độc tố thần kinh có trọng lượng phân tử thấp được tinh chế từ nọc của hai loài rắn hổ đất và hổ chúa Đây là những phân đoạn độc tố gây chết chủ yếu trong nọc Kháng huyết thanh được chế tạo bằng cách gây miễn dịch trên 3 lô thỏ:

lô I- gây miễn dịch với độc tố thần kinh của nọc rắn hổ đất; lô II- gây miễn dịch với độc tố thần kinh của nọc hổ chúa và lô III- gây miễn dịch với phức hợp hai loại độc tố trên

Huyết thanh kháng độc tố rắn hổ đất của thỏ ở lô I có khả năng trung hòa nọc hổ đất với hiệu giá là 60 LD50/mL huyết thanh, đồng thời có tác dụng trung hòa chéo nọc rắn hổ chúa với hiệu giá là 13,3 LD50/mL huyết thanh Huyết thanh kháng đa độc tố của thỏ ở lô III có khả năng trung hòa nọc hổ đất với hiệu giá là 35 LD50/mL huyết thanh và trung hòa nọc hổ chúa với hiệu giá là 25 LD50/mL huyết thanh Huyết thanh kháng độc tố rắn hổ chúa của thỏ lô II không có khả năng trung hòa nọc hổ chúa cũng như phân đoạn độc tố hổ chúa

PRODUCTION OF ANTI-POLYTOXINS AGAINST TWO ELAPID VENOMS :

Naja kaouthia AND Ophiophagus hannah

Low molarcular weigh neurotoxin fractions were isolated from the venom of

Naja kaouthia and Ophiophagus hannah These fractions were the major lethal toxin

fractions in these venoms Antisera were prepared by immunizing rabbits with the

Naja kaouthia neurotoxin fraction (group I), the Ophiophagus hannah neurotoxin

fraction (group II) and the mixture of both neurotoxin fractions (group III), respectively The potency of sera from group I and group III rabbits against the

toxicity of the Naja kaouthia venom were 60 LD50 and 35 LD50/ml serum The

serum of group II rabbits gave no protection against the toxicity of the Ophiophagus hannah venom as well as of the Ophiophagus hannah neurotoxin fraction The potency of sera from group I and group III against the toxicity of the Ophiophagus hannah venom were 13 LD50 and 25 LD50/ml serum

Nam

4

3.5.2 Kỹ thuật ELISA hai kháng nguyên kẹp kháng thể 12

ammonium sulfate 50% độ bão hòa

4.1.2.1 Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia) 18

a) Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine 18

b) Tinh chế độc tố của nọc rắn hổ đất qua sắc ký trao đổi ion BioRex -70 19

c) Phân tích độ tinh khiết peak 3.1 trên điện di gel SDS-PAGE gradient 8-

18%

20

4.1.2.2 Tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ chúa (Ophigophagus hannah) 21

a) Tinh chế qua sắc ký lọc Sephadex G-50 superfine 21

18%

4.1.3 Gây miễn dịch và theo dõi đáp ứng miễn dịch 25

4.1.3.2 Theo dõi đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch kép

Xác định khả năng trung hòa của huyết thanh kháng độc tố đối với nọc

toàn phần trên chuột

Khả năng trung hòa đối với nọc hổ đất toàn phần

Khả năng trung hòa đối với nọc hổ chúa toàn phần

Khả năng trung hòa đối với độc tố peak 3 của nọc hổ chúa

APS Ammonium persulfate

BSA Bovine serum albumin

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

FLT Fatal Limit Time

LD50 Lethal dose: liều gây chết tối thiểu 50% số súc vật thí nghiệm LMT Last Mortality Time

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

PBS Phosphate buffered saline

SDS Sodium dodecylsulfate

Bảng Nội dung Trang

1 Tóm tắt quá trình tinh chế độc tố nọc rắn hổ đất 26

2 Tóm tắt quá trình tinh chế nọc rắn hổ chúa 30

3 Hiệu lực trung hòa của kháng huyết thanh đối với nọc rắn

2 Phản ứng cộng hợp NHS-LC-Biotin II vào protein 18

5 Phân tách nọc rắn hổ đất bằng sắc ký lọc G-50 Superfine 24

6 Tinh chế độc tố của nọc rắn hổ đất bằng sắc ký trao đổi ion

BioRex-70

25

7 Kết quả điện di kiểm tra độ tinh khiết của peak 3.1 (nọc hổ

đất) sau sắc ký trao đổi ion

27

8 Phân tách nọc rắn hổ chúa bằng sắc ký lọc Sephadex G-50

Superfine

28

9 Phân tách peak 3 bằng sắc ký trao đổi ion BioRex-70 29

10 Kết quả điện di kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn

độc tố nọc hổ chúa sau sắc ký trao đổi ion

30

11 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp

khuếch tán kép trên thạch Ouchterlony

32

12 Đường biểu diễn mức độ kháng thể trong huyết thanh của

từng con thỏ sau mỗi lần tiêm miễn dịch với độc tố nọc rắn

hổ đất

33

13 Đường biểu diễn mức độ kháng thể trong huyết thanh của

từng con thỏ sau mỗi lần tiêm miễn dịch với độc tố nọc rắn

hổ chúa

34

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

số rất gần với Việt Nam con số này là 9.000 người/năm (2) Tuy nhiên con số này có thể còn cao hơn do có nhiều nạn nhân không đến điều trị tại các cơ sở y tế mà dùng các bài thuốc dân gian nên không thống kê được Tình trạng trên rất giống với nước ta

Ở nước ta chủ yếu có 2 họ rắn độc là rắn hổ (Elapidae) và rắn lục (Viperidae)

Theo các thống kê sơ bộ, rắn hổ là họ rắn chủ yếu gây ra tử vong cho nạn nhân Các

loài rắn trong họ rắn hổ thường gây tai nạn là hổ đất (Naja kaouthia), hổ chúa (Ophigophagus hannah) và cạp nong (Bungarus fasciatus)

1.2 Độc tố nọc rắn hổ:

Nọc rắn là hỗn hợp phức tạp của nhiều loại protein khác nhau về độc tính cũng như chức năng Trong họ rắn hổ thành phần gây chết chủ yếu là các độc tố liên kết với thụ quan hậu khớp thần kinh cơ (3) Các độc tố liên kết mạnh vào các tiểu đơn vị alpha của thụ thể nicotinic acetylcholine gây ra ức chế dẫn truyền thần kinh cơ, làm liệt cơ sườn và gây chết do làm nạn nhân ngừng hô hấp (4) Các độc tố này là các peptides có trọng lượng phân tử thấp 6000 - 8000 dalton (3) Trong họ rắn hổ, rắn hổ đất là loài rắn

có thành phần độc tố có trọng lượng phân tử thấp chiếm tỷ lệ cao nhất (20-30% tổng lượng protein của nọc thô) So với nọc rắn hổ đất, trong nọc rắn hổ chúa, thành phần protein có trọng lượng phân tử thấp chỉ chiếm khoảng 8% tổng lượng protein toàn phần Vì thế độc lực của nọc rắn này cũng thấp đi đáng kể so với độc lực của nọc rắn

hổ đất (5) Nhưng khả năng gây độc của nó cũng rất cao do khi cắn lượng nọc độc đưa vào nạn nhân nhiều

1.3 Huyết thanh kháng nọc rắn hổ:

Dùng huyết thanh kháng nọc rắn được xem như là phương pháp điều trị hiệu quả nhất để trung hòa các độc tố tác động hệ thống và gây nguy hiểm đến tính mạng nạn nhân (6)

Huyết thanh kháng nọc cổ điển được sản xuất từ huyết thanh của ngựa hay cừu được gây miễn dịch cao độ với nọc toàn phần của một loài rắn (huyết thanh kháng nọc đơn đặc hiệu – monospecific antivenom) hay hỗn hợp nọc của nhiều loài rắn (huyết thanh kháng nọc đa đặc hiệu – polyspecific antivenom) Huyết thanh kháng nọc rắn vì vậy chứa kháng thể kháng nhiều thành phần trong nọc không quan tâm đến độc tính cũng như tính sinh miễn dịch của từng thành phần Do đó, trong kháng huyết thanh này chứa một số lớn các kháng thế kháng các thành phần kháng nguyên không gây độc trong nọc và dẫn đến làm phải tiêm một lượng lớn protein lúc điều trị (7) Mặt khác các thành phần gây độc nhất trong nọc cũng không nhất thiết là những thành phần có tính sinh miễn dịch mạnh nhất, đặc biệt là trong trường hợp của những độc tố có trọng lượng phân tử thấp (8, 9, 10)

Trong nọc rắn hổ, các độc tố có trọng lượng phân tử thấp có tính sinh miễn dịch thấp hơn rất nhiều so với các thành phần có trọng lượng phân tử cao Theo tác giả Leera Chinonavanig (11), huyết thanh đơn giá kháng nọc rắn hổ chúa được gây miễn dịch trên thỏ không cho kháng thể chống lại các protein trong vùng có trọng lượng phân tử thấp của các độc tố hậu khớp thần kinh cơ của nọc hổ chúa Kháng huyết thanh đơn giá đặc hiệu với nọc rắn cạp nong và nọc rắn hổ đất có tỷ lệ thấp kháng thể kháng các độc tố có trọng lượng phân tử thấp của các loài rắn này Phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn hổ này với độc tố nọc rắn hổ khác hầu như không phát hiện được, trừ một phản ứng thấp giữa huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất với nọc rắn hổ chúa (11)

Do đó tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ có hiệu lực điều trị là một điều rất khó khăn Tại Queen Saovabha Memorial Institute, Thái Lan dưới 20% số ngựa được gây miễn dịch với nọc rắn hổ đất sản xuất được kháng huyết thanh có hiệu lực điều trị (12) Điều này lý giải tại sao huyết thanh kháng nọc rắn hổ được cung cấp trên thị trường có hiệu giá thấp (10-100 LD50/ml huyết thanh) (13)

Do hiệu giá thấp, trong các trường hợp bị rắn hổ cắn, lượng huyết thanh cần dùng

để điều trị rất lớn từ 30 – 600 ml (13) vì vậy khoảng một nửa nạn nhân xuất hiện các phản ứng quá mẫn (14, 15) Dùng phân đoạn độc tố để gây miễn dịch có thể tăng hiệu lực bảo vệ của huyết thanh kháng nọc, giảm lượng huyết thanh điều trị, trong khi tránh được sự tạo thành kháng thể không cần thiết với phần protein không gây độc (16) Gây miễn dịch tạo ra các kháng thể đặc hiệu với độc tố sẽ tăng hiệu quả điều trị, giảm thiểu nguy cơ gây các phản ứng nguy hiểm đòi hỏi phải can thiệp với adrenaline (17) Huyết thanh kháng độc tố đã được nghiên cứu tại một số nước trên thế giới và nhận thấy có hiệu giá trung hòa cao hơn hẳn huyết thanh kháng nọc toàn phần (18, 19, 20, 21, 26)

1.4 Huyết thanh đơn giá và huyết thanh đa giá kháng nọc rắn:

Huyết thanh kháng nọc rắn độc được sản xuất tại nhiều nước trên thế giới, chủ yếu là huyết thanh đơn giá và thường các huyết thanh này hiếm khi có tác dụng trung hòa chéo với các loài rắn độc khác trong cùng vùng địa lý (5) Vì thế việc điều trị hiệu quả phụ thuộc vào việc xác định chính xác loài rắn gây tai nạn Đối với các bác sĩ thường là khó hay không thể quyết định được dùng loại kháng huyết thanh đơn giá nào trong trường hợp loài rắn gây tai nạn không xác định được, đặc biệt khi các triệu chứng nhiễm độc hệ thống tương tự do bị loài rắn cùng họ gây nên Chỉ khoảng 20% các trường hợp bị rắn độc cắn có thể xác định chính xác loài rắn gây tai nạn (2) Ngoài

ra huyết thanh kháng nọc được sử dụng để điều trị nạn nhân càng sớm càng tốt, thời gian tiêu hao cho việc chờ xác định rõ ràng dấu hiệu và triệu chứng chẩn đoán có thể gây nguy cơ cao hơn cho nạn nhân Sử dụng kháng huyết thanh đơn giá sai đã làm chết một số nạn nhân bị rắn cắn (22)

Huyết thanh đa giá, được sản xuất đầu tiên vào năm 1911 (23), chứa những kháng thể đặc hiệu có khả năng trung hòa một số nọc được sử dụng khi gây miễn dịch Thông thường, huyết thanh kháng nọc đa giá được sản xuất để chống lại tất cả các loài rắn có liên hệ trong một vùng đặc thù Huyết thanh này có thể được dùng để chữa trị cho các nạn nhân bị nhiễm độc nặng ngay lập tức mà không cần xác định loài rắn gây độc Điều trị bằng huyết thanh đa giá góp phần làm giảm đáng kể số người chết trong

những trường hợp loài rắn cắn không xác định được Một số thầy thuốc chống lại có định kiến việc sử dụng huyết thanh đa giá vì cho rằng nó ít hiệu quả hơn huyết thanh đơn giá Điều này thật sự là không đúng Khi một huyết thanh đa giá được sản xuất kháng lại một số loài rắn trong cùng họ (ví dụ như giữa các loài rắn lục) thì hiệu giá kháng thể trung hòa chống lại từng loại nọc có thể cao hơn khi kháng huyết thanh đơn giá được sử dụng (24) Tác động hiệp lực của một số nọc trong quá trình gây và trung hòa miễn dịch sẽ bị mất khi chúng đi từ các loài rắn không có liên hệ về phân loại (ví

dụ như giữa rắn hổ và rắn lục) Thông thường sản xuất một loại kháng huyết thanh đa giá thì đơn giản và ít tốn kém hơn là sản xuất nhiều loại huyết thanh kháng nọc đơn giá Mặt khác, huyết thanh đa giá còn có thuận lợi là khả năng trung hòa chéo cao hơn; quá trình sản xuất, pha chế thuận tiện, kinh tế hơn; bảo quản và dự trữ dễ dàng hơn (24)

1.5 Tình hình sản xuất huyết thanh kháng nọc trên thế giới và tại Việt Nam:

Hiện nay trên thế giới đã có 50 nước sản xuất huyết thanh kháng 185 loại nọc độc Do thành phần nọc rắn thay đổi theo từng vùng địa lý, địa dư nên WHO khuyến cáo các quốc gia nên tự sản xuất huyết thanh kháng các loài rắn độc của quốc gia mình

Ở Việt Nam đã có bệnh viện Chợ Rẫy, bệnh viện Bạch Mai (Hà Nội) sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn chúa toàn phần (25, 38) Viện quốc gia sản xuất Vắc xin và chế phẩm sinh học sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất theo qui trình gây miễn dịch với độc tố thần kinh có hiệu giá trung hòa rất cao so với huyết thanh kháng nọc rắn toàn phần (26) Và huyết thanh này đã được tiến hành thực địa trên bệnh nhân và chứng minh được hiệu quả điều trị cũng như tính an toàn tốt (27)

1.6 Đặt vấn đề:

Tác động gây chết trên chuột của nọc rắn hổ chúa và nọc của các rắn thuộc loài

Naja chủ yếu là do phân đoạn protein có trọng lượng phân tử thấp gây nên (29) Ở

nước ta, rắn hổ đất và hổ chúa là hai loài rắn độc gây tử vong trên người với tỷ lệ cao nhất, đồng thời hai loại độc tố gây chết được tách từ nọc của chúng có trình tự amino

acid tương đồng cao (28) Vì thế, chúng tôi dự định thực hiện nghiên cứu qui trình tạo

huyết thanh đa giá kháng độc tố của loài rắn hổ đất (Naja kaouthia) và loài rắn hổ chúa (Ophigophagus hannah) qua đó khảo sát khả năng trung hòa độc lực nọc rắn toàn phần

của chúng Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo huyết thanh đa

giá dựa trên độc tố đối với các loài rắn cùng họ rắn hổ phổ biến tại Việt Nam

CHƯƠNG II : NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1. Xác định độc lực của nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia) và hổ chúa (Ophigophagus hannah)

2.2 Tinh chế các thành phần gây độc của hai loài rắn: hổ đất (Naja kaouthia) và

hổ chúa (Ophigophagus hannah)

2.3. Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn hổ đất Naja kaouthia

2.4. Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn hổ chúa Ophigophagus hannah

2.5 Xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu với các độc tố bằng phản ứng ELISA

2.6. Tạo huyết thanh kháng đa độc tố của hai loại rắn hổ đất và rắn hổ chúa

2.7. Xác định hiệu lực trung hòa của từng loại kháng huyết thanh với nọc toàn phần của hai loại rắn trên

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.2 Phương pháp xác định độc lực của nọc và độc tố rắn hổ đất và hổ chúa:

Độc lực của nọc hoặc dung dịch có độc tố được biểu hiện bằng giá trị LD50 (lethal dose 50%)

LD50 là liều tối thiểu gây chết 50% số súc vật thử nghiệm; nọc càng độc giá trị LD50 càng thấp

Động vật dùng trong thử nghiệm có thể là thỏ, chuột lang hay chuột nhắt trắng Nhưng thông thường nhất người ta dùng chuột nhắt trắng

Đường tiêm có thể là tiêm dưới da, tiêm bắp, tiêm trong phúc mạc, tiêm tĩnh mạch hay tiêm trong màng não Đường tiêm khác nhau có thể cho những kết quả LD50 khác nhau [30] Thông thường, liều gây chết khi tiêm tĩnh mạch < tiêm màng não < tiêm dưới da Đường tiêm tĩnh mạch đuôi chuột cho kết quả có tính đồng nhất cao và được sử dụng trong các qui trình chuẩn

Để kết quả thu được có độ lặp lại cao, các điều kiện tiến hành thí nghiệm phải được tuân thủ chặt chẽ Trọng lượng và tuổi chuột phải ít dao động (18-20 gam đối với chuột nhắt trắng) Các con chuột này phải khỏe mạnh, cùng giới tính, cùng một dòng, không mang thai Đường tiêm vào mỗi con chuột phải giống nhau, tiêm chậm (0,2 ml trong 15 giây) Nhiệt độ môi trường ấm và ổn định trong suốt quá trình quan sát (48 giờ) [31]

Các loài động vật khác nhau, nhạy cảm với nọc cũng khác nhau Cùng một loài nhưng khác dòng sự đáp ứng cũng khác nhau

Thành phần nọc cũng có thể thay đổi từ cá thể này đến cá thể khác trong cùng loài rắn Thậm chí nó có thể thay đổi tại những khoảng thời gian khác nhau trong cùng một cá thể Các thay đổi này có thể do nguồn gốc địa lý, chế độ ăn uống, tuổi rắn …

[32] Thực hiện tốt xét nghiệm nọc sử dụng trong xét nghiệm nên lấy từ một hỗn hợp nọc của một số lớn rắn hổ có nguồn gốc khác nhau [33]

Tiến hành thử nghiệm:

3.1.2.1 Các thông số kỹ thuật:

Súc vật: chuột nhắt trắng 18-20 gam

Đường tiêm : tĩnh mạch đuôi

Liều tiêm: 0,2 ml/chuột

Đơn vị tính: liều gây chết 50% súc vật thí nghiệm được diễn tả bằng µg/ chuột

Số chuột cho một lô: 3 con

3.1.2.2 Gây nhiễm:

* Pha dung dịch nọc thử nghiệm:

Cân 10 mg nọc rắn pha trong 10 mL

* Lô chứng : 3 con, mỗi con nhận 0,2 ml nước muối sinh lý, còn sống sau 48 giờ

* Lô thí nghiệm: Pha các dung dịch thử nghiệm trong nước muối sinh lý có nồng

độ liên tục cách nhau một tác nhân độ pha loãng

Chọn các nồng độ gây nhiễm sao cho trong các nồng độ này có hai điểm gây 0%

và 100% số chuột chết

Tiêm 0,2 ml cho mỗi chuột Mỗi lô 3 chuột

q Đọc kết quả sau 48 giờ

q Tính kết quả theo phương pháp Spearman - Karber:

Log LD 50 = X 0 + d/2 -dΣR i /n

Với Xo: log của độ pha loãng có nồng độ thấp nhất gây ra 100% số chuột chết

d: log của tác nhân độ pha loãng

n: số chuột trong mỗi lô

Ri: số chuột chết trong mỗi lô

3.2 Phương pháp tinh chế độc tố từ nọc rắn hổ đất và nọc rắn hổ chúa (phụ lục1):

3.2.1 Vật liệu:

- Nọc rắn: dạng tinh thể có màu từ vàng nhạt đến vàng đậm

- Gel sắc ký lọc Sephadex G-50 Superfine

- Gel sắc ký trao đổi ion BioRex 70

- Các hóa chất khác sử dụng đều ở mức độ phân tích

3.2.2 Phương pháp:

Quá trình tinh chế độc tố từ nọc rắn được tiến hành theo phương pháp Karlsson [30] qua hai giai đoạn sắc ký :

* Sắc ký lọc Sephadex G - 50 Sperfine

* Sắc ký trao đổi ion BioRex 70

- Nồng độ protein trong các đoạn sắc ký được xác định qua quang phổ ở 280 nm

- Độc lực của các phân đoạn protein sau sắc ký được đánh giá trên chuột nhắt trắng 18-

20 gam

- Đánh giá độ tinh khiết của các phân đoạn protein sau các giai đoạn sắc ký bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) gradient 8-18% với Sodium dodecylsulfate (SDS) sau khi đã xử lý các protein bằng dithiothreitol (DTT)

3.3 Phương pháp tạo huyết thanh kháng độc tố của hai loài rắn hổ đất và hổ chúa (phụ lục 2):

3.3.1 Vật liệu:

- Thỏ dùng để gây miễn dịch được chọn từ những con thỏ non khoảng 2 tháng tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng khoảng 1-1,5 kg, được nuôi trước 1 tháng Sau đó chọn những con thỏ khỏe mạnh có trọng lượng trên 2kgđể gây miễn dịch

- Độc tố nọc rắn hổ đất và hổ chúa sau tinh chế

- Tá chất Freund toàn phần (complete Freund’s complete adjuvant) Aldrich)

- Tá chất Freund bán phần (incomplete Freund’s incomplete adjuvant) (Sigma-Aldrich)

(Sigma-3.3.2 Phương pháp:

3.3.2.1 Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn hổ đất và hổ chúa:

* Lô I: 3 thỏ (đánh số 17, 18, 19) được gây miễn dịch với độc tố peak 3.1 của nọc rắn

hổ đất để tạo huyết thanh kháng độc tố rắn hổ đất Liều tiêm mũi thứ 1 là 32 µg/thỏ và giảm ½ liều ở những mũi tiêm kế tiếp nhằm chọn lọc các dòng tế bào B sản xuất kháng

thể có ái lực cao

* Lô II: 4 thỏ (đánh số 13, 14, 15, 16) được gây miễn dịch với độc tố peak 3 của nọc

rắn hổ chúa để tạo huyết thanh kháng độc tố rắn hổ chúa Liều tiêm mũi thứ 1 là 50 µg/thỏ và giảm ½ liều ở những mũi tiêm kế tiếp

3.3.2.2 Tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai loài rắn hổ đất và hổ chúa:

* Lô III: 4 thỏ (đánh số 7, 8, 11, 12) được gây miễn dịch với cả hai loại độc tố trên

để tạo huyết thanh kháng đa độc tố Liều tiêm mũi thứ 1 là 32 µg độc tố peak 3.1 của nọc rắn hổ đất/thỏ và 50 µg độc tố peak 3 của nọc rắn hổ chúa/thỏ và giảm ½ liều ở những mũi tiêm kế tiếp

3.4 Phương pháp kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ:

Phương pháp này sử dụng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch, đây là một kỹ thuật cổ điển, dùng để phân tách các kháng thể trong mẫu thử nghiệm về tính đặc hiệu với kháng nguyên

3.4.1 Nguyên tắc:

Làm một thạch agar 1% trên phiến kính Đục các giếng ở các vị trí đã định Cho các dung dịch kháng nguyên, kháng thể vào đúng giếng đã định Kháng nguyên và kháng thể sẽ khuếch tán trong gel Khi gặp nhau chúng sẽ hình thành phức hợp và sẽ tủa nếu nồng độ kháng nguyên và kháng thể tương ứng Hình của vết tủa cho phép phân tách về phản ứng giữa các thành phần trong các giếng

3.4.2 Vật liệu:

- Agarose

- Dung dịch huyết thanh thỏ trước khi gây miễn dịch

- Dung dịch huyết thanh thỏ sau lần tiêm thứ 2

- Hóa chất khác đều đạt mức độ phân tích

Hình 1: Phản ứng cộng hợp NHS-LC-Biotin II vào protein

- Toxin alpha (8mg/ml) trong đệm 50 mM NaHCO3 ; pH 8.5

- Dung dịch NHS-LC-Biotin II: 0.23 mmoles/ml trong đệm DMSO

Protein +

H

NH2

(CH2)4C

- Cho 25µl dung dịch NHS-LC-Biotin II vào 1ml dung dịch toxin alpha

- Ủ 4°C trong 2 giờ

- Tách dẫn xuất Biotin thừa qua cột Biogel P- 200 đã được cân bằng trước với đệm PBS Hứng đoạn 2ml

- Chọn các đoạn có protein bằng cách đo ở bước sóng 280nm

3.5.2 Kỹ thuật ELISA hai kháng nguyên kẹp kháng thể:

- Pha rắn sử dụng là phiến nhựa 96 giếng

- Dung dịch độc tố 0.25 µg/ml trong đệm Na2CO3 0.075 M, pH 9.6 Ủ vào mỗi giếng

100 µl dung dịch trên qua đêm tại nhiệt độ phòng

- Rửa các giếng 3 lần với đệm PBS – 0.05% Tween 20 để loại bỏ độc tố còn thừa

- Bão hòa phiến nhựa bằng dung dịch PBS – 1% BSA - 0.05% Tween 20 trong 45 phút, tại 37°C

- Rửa các giếng 3 lần với đệm PBS – 0.05% Tween 20

b) Cho kháng thể trong huyết thanh kết hợp với độc tố trên pha rắn:

- Cho 100 µl mẫu huyết thanh pha loãng 1/100 vào mỗi giếng

- Ủ 37°C trong 60 phút

- Rửa 3 lần với đệm PBS – 0.05% Tween 20 để loại bỏ protein còn thừa

c) Cho độc tố – biotin kết hợp với kháng thể trên pha rắn:

- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch toxin – biotin 0.5 µg/ml pha trong đệm bão hòa Ủ 37°C trong 60 phút

- Rửa phiến 3 lần với dung dịch PBS – 0.05% Tween 20 để loại bỏ các chất không bám

d) Cho Streptavidin – Peroxydase (Streptavidine PO) kết hợp với biotin trên pha rắn:

- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch streptavidin – PO 1/ 100 pha trong đệm bão hòa Ủ 37°C trong 60 phút

- Rửa phiến 3 lần với dung dịch PBS – 0.05% Tween 20 để loại bỏ những chất không bám

Khi một lượng lớn của muối ammonium sulfate được thêm vào dung dịch protein, các ion muối sẽ thu hút và tách các phân tử nước ra khỏi phân tử protein Bị mất nước, các phân tử protein sẽ bị đẩy đến tương tác với nhau và bắt đầu kết tập lại (Hình 4) Khi đủ lượng muối thêm vào chúng sẽ kết tủa Nếu quá trình này được thực hiện tại nhiệt độ lạnh, protein sẽ kết tủa mà không bị biến tính Mỗi loại protein tủa ở một nồng độ bão hòa AS đặc trưng

Các IgG và transferin tủa ở những nồng độ AS thấp hơn (35-45%) các proteins khác của huyết thanh, đặc biệt albumin ở nồng độ cao hơn (70%S)

Mục đích của giai đoạn này là thu được IgG và loại bỏ phần lớn albumin và các protein huyết thanh khác

Hình 3: Protein trong đệm ammonium sulphate

3.6.2 Vật liệu:

- Muối ammonium sulfate

- Dung dịch kháng huyết thanh sau lần tiêm nhắc lại thứ 3,4

tủa Rửa tủa bằng dung dịch ammonium sulfate 50% bão hòa, 3 lần Bảo quản tủa tại

4°C trong dung dịch ammonium sulfate 50% bão hòa

3.7 Phương pháp xác định hiệu lực trung hòa độc lực nọc toàn phần của kháng thể kháng độc tố trên chuột:

Kỹ thuật này được thực hiện bằng cách trộn nọc với kháng huyết thanh theo những

tỷ lệ khác nhau Có thể thực hiện theo hai cách, hoặc cố định lượng nọc (thường được xác định bằng giá trị LD50) và thay đổi lượng kháng huyết thanh, hoặc cố định lượng kháng huyết thanh và thay đổi lượng nọc Hỗn hợp trên được ủ ở 37°C trong 15 hay

30 phút trước khi tiêm vào động vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng) bằng đường tĩnh mạch đuôi Những động vật này được theo dõi về triệu chứng bị liệt mềm trong vòng

48 giờ Từ số chuột chết và sống, tính ra lượng nọc mà 1ml kháng huyết thanh có khả năng trung hòa Người ta có thể diễn tả kết quả này bằng số đơn vị LD50 trên một mililít kháng huyết thanh hay bằng số mg nọc khô trên một mililít kháng huyết thanh [34]

Đôi khi nhiều nhà nghiên cứu thích tiến hành các xét nghiệm theo những trình

tự diễn ra trong tự nhiên bằng cách tiêm nọc vào dưới da trước, sau đó tiêm kháng huyết thanh vào tĩnh mạch sau [35] Khoảng cách giữa hai lần tiêm ảnh hưởng nhiều đến kết quả thí nghiệm Tuy nhiên phương pháp này hầu như không có thuận lợi nào hơn phương pháp trên

Trên thực tế bao giờ nọc cũng tồn tại trong cơ thể trong một khoảng thời gian nào đó, đôi khi là rất lâu trước khi kháng huyết thanh được đưa vào Một số nhà nghiên cứu đã đưa ra một số thông số đánh giá khác như:

• FLT (Fatal Limit Time): khoảng thời gian từ khi tiêm một liều gây chết của nọc đến khi xuất hiện cái chết đầu tiên của súc vật thí nghiệm

• LMT (Last Mortality Time): khoảng thời gian từ khi tiêm một liều gây chết của nọc đến khi xuất hiện tất cả các súc vật thí nghiệm đều chết

• Người ta nhận thấy rằng khả năng bảo vệ của kháng huyết thanh sẽ tăng khi nó được đưa vào trước FLT [36] Tuy nhiên, LMT hay FLT đều lệ thuộc vào một

số phản ứng sinh lý phức tạp, khác nhau tùy theo loài động vật và con vật và tùy theo loài và con rắn gây độc

Hiện nay cho dù chúng ta muốn chuẩn hóa phương pháp xác định khả năng trung hòa nọc của một kháng huyết thanh thì phương pháp ủ hỗn hợp nọc và kháng huyết thanh trước vẫn được sử dụng rộng rãi do nó phụ thuộc ít nhất vào các hoạt động dược động học của kháng huyết thanh cũng như động học của độc tố ở con vật mà nó chỉ phụ thuộc vào nồng độ của kháng thể và khả năng trung hòa của nó [37]

* Tiến hành thực nghiệm:

3.7.1 Vật liệu và các thông số kỹ thuật:

- Súc vật: chuột nhắt Swiss trắng 18-20 gam

- Đường tiêm: tĩnh mạch đuôi

- Liều tiêm: 0,2 ml/chuột

- Đơn vị tính: liều gây chết 50% súc vật thí nghiệm được diễn tả bằng số đơn vị

LD50 có thể trung hòa được / 1 ml huyết thanh nguyên

- Số chuột cho một lô: 3 con

3.7.2 Phản ứng trung hòa:

3.7.2.1 Chuẩn bị dung dịch nọc rắn (độc tố):

Nọc rắn được pha trong nước muối sinh lý, ly tâm loại cặn; lượng nọc được tính sao cho dung dịch thu được có độ hấp thụ quang tại bước sóng 280 nm (A280) ở trong khoảng 0,9 – 1 Lấy một thể tích xác định dung dịch này tương đương với 3 LD50 để thực hiện phản ứng trung hòa

3.7.2.2 Thực hiện phản ứng trung hòa:

Dung dịch huyết thanh được pha loãng thành loạt theo bậc hai

Ủ 200µL dung dịch kháng huyết thanh với 3 LD50 của dung dịch nọc hay độc tố tại 37°C trong 30 phút

Tiêm 0,2 ml hỗn hợp trên vào tĩnh mạch đuôi chuột

Quan sát kết quả trong vòng 48 giờ kể từ lúc tiêm

Công hiệu bảo vệ của kháng huyết thanh được tính theo công thức sau:

Hiệu giá bảo vệ (LD 50 /ml) = (T-1)/ D*V