Nghiên cứu đặc điểm của Gen Defensin phân lập từ cây đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek)

Trong những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về khả năng kháng côn trùng, kháng nấm, kháng virus đã được tiến hành trên một số loại cây trồng khác nhau.. Tuy nhiên, các nghiê

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DEFENSIN PHÂN LẬP

TỪ CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata L Wilczek)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2014

LỜI CAM ĐOAN

.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2014

Tác giả luận văn

Phan Hải Cường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn để tôi c hoàn thành b Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này

Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, K –

tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy cô Khoa Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè và đồng

nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2014

Tác giả luận văn

Phan Hải Cường

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

3

9

1.2.1 9

11

1.3 DEFE 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

U 22

2.1.1 Vật liệu…… ……….… 22

22

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………24

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử……… 24

2.2.2 Phương pháp xác định trình tự nucleotide và xử lý số liệu 31

Chương 3 32

DEFENSIN 1 T 32

cDNA DEF 1 33

DEF 1 t 6 33

cDNA DEF1 35

3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA GEN DEF 1……… 39

44

44

2 44

45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid

cDNA Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung đƣợc tổng hợp

từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngƣợc) DEF1 Defensin 1

DEPC diethyl pyrocarbonate

DNA deoxyribosenucleic acid

dNTP deoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid

E coli Escherichia coli

et al

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb Kilo base

kGy Kilogray

mRNA messenger ribonucleic acid

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RNA Ribonucleic Acid

TAE Tris acetat EDTA

VSV Vi sinh vật

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1. 22

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 25

Bảng 2.3. 1 26

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen 26

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 29

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony - PCR 31

Bảng 3.1 Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen DEF1 của giống đậu xanh VN6 và các trình tự có mã số AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế 37

Bảng 3.2 Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein DEF1 ở giống đậu xanh VN6 và trình tự mang mã số AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế 38

3.3. 39

3.4. 1 (%) 40

Bảng 3.5. 1 (%) 41

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một loại cây công nghiệp

quan trọng của nền nông nghiệp châu Á, có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao

Về mặt dinh dưỡng, hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 24% – 28 %), chứa 1,3% lipid, glucid 60 % và các chất khoáng như Ca, Fe, Na Cùng nhiều loại vitamin tan trong nước như A, B1, B2, C Hệ thống rễ cây đậu xanh có những nốt sần ở rễ, trên nốt sần có chứa các vi khuẩn cố định đạm giúp tăng giá trị dinh dưỡng cho đất

Ở nước ta, cây đậu xanh là một trong những cây trồng truyền thống, có khả năng cung cấp dinh dưỡng cao, dễ tiêu hoá, là cây phân xanh, cải tạo đất trống xói mòn, chính vì vậy cây đậu xanh là một trong ba cây công nghiệp ngắn ngày chính, sau lạc, đậu tương Nước ta có nhiều thuận lợi để phát triển sản xuất nông nghiệp song cũng có nhiều cơ hội tốt để sâu hại phát sinh phát triển và phá hại nghiêm trọng các loại cây trồng ngoài đồng ruộng cũng như trong kho bảo quản sau thu hoạch Sau khi thu hoạch nếu không có sự bảo quản hoặc bảo quản không tốt sẽ làm nông sản hao hụt rất lớn cả về số lượng

và chất lượng Nguyên nhân dẫn đến sự hao hụt đó là sâu mọt hạt, chúng không những làm thiệt hại về số lượng nông sản, làm giảm chất lượng, giảm giá trị thương phẩm, gây mùi khó chịu, mầu sắc không bình thường mà còn là nguyên nhân ảnh hưởng tới sức khoẻ người tiêu dùng

Hiện nay trong các kho dự trữ đậu đỗ đang bị các loài sâu mọt gây hại

như: Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis (L.), mọt đậu đỏ Bruchus quadrimaculatus, mọt đậu nành Ancanthoscelides obtectus, mọt đậu tằm Bruchus rufimanus Đặc biệt là Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis (L.) thuộc họ Bruchid, bộ Coleoptera, đây là loài dịch hại chủ yếu và nguy hiểm

Chúng không những gây hại trong kho dự trữ mà chúng còn lan truyền và gây

hại cả ở ngoài đồng ruộng Mọt đậu xanh gây hại trên các loại đậu: Đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen trong đó hại nặng nhất là đậu xanh Sự thiệt hại do chúng gây ra là rất lớn, làm ảnh hưởng đến nền kinh tế quốc dân,

do đó công tác phòng trừ sâu mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cấp thiết cần được quan tâm nghiên cứu Chính vì vậy, việc chọn tạo các giống đậu xanh có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu sâu bệnh, côn trùng đáp ứng nhu cầu thực tiễn là nhiệm vụ cần thiết đối với ngành chọn giống đậu xanh

Trong những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về khả năng kháng côn trùng, kháng nấm, kháng virus đã được tiến hành trên một số loại cây trồng khác nhau Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt

hại hạt của cây trồng rất phức tạp và có liên quan đến gen defensin 1 (DEF1)

DEF1 ở thực vật ức chế sự phát triển của một loạt các loại nấm, một số loại virus, một số loại côn trùng gây hại lương thực Tuy nhiên, các nghiên cứu về mối liên quan giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen DEF1 với khả năng kháng mọt gây hại ở hạt đậu xanh còn ít được công bố

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên

cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm của gen defensin phân lập từ cây đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek)”

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được trình tự cDNA DEF1 phân lập từ cây đậu xanh

tạo nguyên liệu phục vụ thiết kế vector chuyển gen kháng mọt ở đậu xanh

3 Nội dung nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh

Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek), có bộ NST 2n = 22,

là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn

Độ, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các

nước Đông và Nam Á Dạng dại của V radiata cũng được tìm thấy ở

Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [14]

Phân loại khoa học của cây đậu xanh:

Giới (regnum): Plantae

Ngành (division): Magnolyophita

Lớp (class): Magnolyopsida

Bộ (order): Fabales

Họ (Familia): Fabaceae

Chi (genus): Vigna

Loài (species): V radiata

Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna, Haydonia, Plactropic, Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm các loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn được gọi là nhóm đậu châu Á, bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V radiata, V mungo, V aconitifolia, V angularis, V umbellata [2]

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh

Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả và

hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt

Đặc điểm của rễ

Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70 - 100 cm Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm

Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến đổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây Tuy nhiên, bộ rễ của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năng chịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém Nếu bộ rễ phát triển tốt thì bộ lá xanh nâu, cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy Ngược lại, bộ rễ phát triển kém thì cây sẽ chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ

bị lép [10], [14] Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định

đạm Rhizobium Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2 - 3 lá thật

và đạt tối đa khi cây ra hoa rộ Trên mỗi cây có khoảng 10 - 20 nốt sần, tập trung chủ yếu ở cổ rễ Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đường kính dao động từ 4 - 5 mm, so với đậu tương và lạc thì nốt sần của cây đậu xanh ít và nhỏ hơn Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còn các lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn Người ta nhận thấy rằng những nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động mạnh hơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng Trung bình mỗi vụ, 1

ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85 - 108 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn [11], [12]

Đặc điểm của thân và cành

Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng 40

- 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có màu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu sáng bao bọc Trên thân chia 7 - 8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng Độ dài của các lóng thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác Các lóng dài khoảng 8 - 10 cm, các lóng ngắn chỉ 3 - 4 cm Từ các đốt mọc ra các cành,

trung bình có 1 - 5 cành Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triển mạnh gọi là cành cấp I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2 - 3 mắt, từ các mắt này mọc ra các chùm hoa Các đốt thứ 4, 5, 6 thường là mọc ra các chùm hoa Thời kỳ trước khi cây có 3 lá chét thì tốc độ tăng trưởng của thân chậm, sau đó mới tăng nhanh dần đến khi ra hoa và hoa rộ, đạt chiều cao tối đa lúc

đã có quả chắc Đường kính trung bình của thân từ 8 - 12 mm và tăng trưởng

tỷ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây [14]

Đặc điểm của lá

Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách Trên mỗi thân chính có 7 - 8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá đơn Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá Cả hai mặt trên

và dưới của lá đều có lông bao phủ Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên, các lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn Chỉ số diện tích lá (m2

lá/m2 đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch

Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc vào giống, đất trồng và thời vụ [2], [14]

Đặc điểm của hoa

Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to, xếp xen kẽ nhau ở trên cuống Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ

ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắt đều có khả năng ra hoa Thường sau khi cây mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoa hình thành, sau 35 - 40 ngày thì nở hoa Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10

cm và có từ 10 - 125 hoa Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màu xanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt Hoa đậu xanh thường nở rải rác, các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi còn chậm hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây [14] Trên cùng một cành, các chùm hoa cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10 - 15 ngày Trong một chùm hoa cũng vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh lệch 10 - 15

ngày Hoa nở được 24 giờ là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là quả chín Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây Công thức hoa là: K5C5A10G1 Thời gian nở hoa chia thành 3 nhóm:

Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài 16 ngày

Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp 30 ngày

Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày

Đặc điểm của quả

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2 gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen gặp nắng dễ bị tách vỏ Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có từ 5 - 10 hạt Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn Mật độ lông phụ thuộc vào đặc điểm của giống và khả năng chống chịu của cây Những giống đậu xanh chống chịu bệnh khảm vàng virus và sâu đục quả có mật độ lông dày, vào thời

kì chín hoàn toàn lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến [1], [2] Các quả của những lứa hoa đầu lại thường chín chậm hơn các quả ra lứa sau đó, nhưng quả to và hạt mẩy hơn Các quả của những đợt hoa ra sau thường ngắn,

ít hạt, hạt không mẩy, màu hạt cũng nhạt và bé hơn Các quả sinh ra từ các chùm hoa trên thân nhiều quả và quả to, dài hơn quả của các chùm hoa ở cành Quả đậu xanh chín rải rác, có khi kéo dài đến 20 ngày [11]

Đặc điểm của hạt

Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất dinh dưỡng Hạt gồm vỏ hạt, rốn hạt 2 lá mầm và mầm non Mầm non là nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn, thân chính và lá kép đầu tiên

Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi và có nhiều màu sắc khác nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả Ruột hạt màu vàng, xanh, xanh nhạt Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêu

quan trọng để đánh giá chất lượng của hạt Mỗi quả có từ 8 - 15 hạt Hạt của những quả trên thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành Hạt của các quả lứa đầu cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau Số lượng hạt trung bình trong một quả là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh Trọng lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống, thời vụ

và chế độ canh tác Trọng lượng 1000 hạt đậu xanh từ 50 đến 70 gam [1]

1.1.3 Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh

Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12% nước, các vitamin B1, B2, C… các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K… [14]

Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giá chất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinh trong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàm lượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm Trong đó, hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây là protein và lipid

Protein

Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn cung cấp đạm dễ tiêu hoá cho con người và một số vật nuôi Trong hạt đậu xanh, các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28% và được chia thành hai nhóm: nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức tạp Trong nhóm protein đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số loại khác Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt Protein đậu xanh có chứa đầy đủ các tính chất chung nhất của protein [14] Ngoài ra, protein đậu xanh còn có một số tính chất riêng biệt như khả năng hút nước và dầu tạo nhũ tương, khả năng hoà tan trong nước Đó là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu và công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu xanh

Protein đậu xanh được đánh giá là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủ các amino acid không thay thế và hàm lượng của chúng tương đối trùng với tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông lương thế giới (FAO)

và tổ chức y tế thế giới (WHO) đưa ra [21]

Lipid

Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không hoà tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ether, petroleum ether, benzen Lipid cũng là thành phần cấu tạo quan trọng của màng sinh học, là nguồn dự trữ nhiên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng cho sự nẩy mầm của hạt Tuy hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp (trung bình khoảng 1,3%) [14], nhưng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá phẩm chất và khả năng bảo quản hạt

1.1.4 Tầm quan trọng của cây đậu xanh

Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 23 - 28%), ngoài ra còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 56 - 60,2% , nước 12% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P cùng nhiều loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, valine Hạt đậu xanh không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu

có giá trị Hạt đậu xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon,

bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi đỗ và một số

đồ uống Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa Thân, lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi [1], [2]

Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học, vỏ hạt đậu xanh có vị ngọt, mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách độc [16]

Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất Nhờ hệ

rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium

có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [14]

1.2

mọt gây hại hạt đậu xanh

Đậu xanh có thể bị nhiễm nấm, vi khuẩn, virus ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau Một số bệnh điển hình có thể gặp là: Bệnh đốm lá đậu xanh

(do nấm Sercostora); Bệnh đốm nâu hại lá đậu xanh (Phyllosticta phaseolina Sacc); Bệnh lở cổ rễ đậu xanh (do nấm Rhizoctonia solani); Bệnh gỉ sắt hại đậu tương, đậu xanh (Uromyces appendiculatuss); Bệnh khảm vàng hại đậu xanh, đậu tương (Bean yellow mosaic virus); Bệnh khảm lá đậu xanh, đậu tương (Soybean mosaic virus); Bệnh mọt hại đậu xanh (Callosobruchus chinensis Linnes) Trong số các bệnh thường gặp ở đậu xanh thì bệnh mọt hại đậu xanh do Callosobruchus chinensis Linnes gây ra thiệt hại tương đối lớn

[4]

Mọt đậu xanh có tên khoa học là Callosobruchus chinensis

Linnes thuộc họ Bruchidae, bộ Coleoptera Mọt trưởng thành là con đực dài

khoảng 2,5 mm, rộng 1,64 mm còn mọt cái dài 3 mm, rộng 1,8 mm [51], [54] Thân hình bầu dục ngắn, toàn thân màu đen nâu, màu nâu đỏ hay trà nâu, có nhiều lông nhỏ màu đen nâu, màu vàng nâu hay màu trắng xám Ðầu nhỏ, quặp về phía trước Râu đầu mọc ở ngay miệng mép lõm của mắt, râu đầu có

11 đốt, râu con cái hình răng cưa, râu con đực hình quạt lược Gốc râu, thân râu màu hồng nâu, và càng về phía đầu râu màu càng đậm Ðầu màu nâu tối đến màu đen, phủ đầy chấm lõm và lông nhung màu vàng kim thưa thớt, mảnh khảnh Mép sau ngực trước ở giữa có 2 khóm lông hình bầu dục dài màu xám trắng Sống giữa xuyên dọc ở gốc chân môi đến giữa mép sau mắt

Mắt cao và lồi, đoạn trước lõm vào rất sâu, hình chữ U, ngực trước có hình chóp cụt bằng đầu, mặt lưng lồi tròn, mép sau lồi ra phía sau, ở phần chính giữa của phần gốc có một đôi vật lồi dạng u hình trứng dài, phủ đầy lông cứng màu trắng sữa dạng phiến Chiều dài của cánh cứng hơi lớn hơn chiều ngang, trên mỗi cánh cứng có 10 đường vân chạy thẳng, có nhiều lông màu vàng nâu, màu đen nâu hay màu xám trắng Gốc cánh cứng và đầu cánh cứng đều màu đen nâu, giữa lưng có một con đường vân màu đen chạy ngang, phía trước và phía sau đường vân đều có mọc nhiều lông nhỏ màu xám trắng Chân màu nâu vàng, đốt đùi chân sau có 2 đường sống ở phía bụng, có một răng ở phía trước ngọn sống, răng ngoài tù, răng trong dài và thẳng, ngọn tròn [4]

Hình 1.1 Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis Linnes trưởng thành và tác hại

của chúng (Nguồn: FDACS-DPI, Mỹ [54])

Trứng do mọt đẻ ra dài 0,4 - 0,6 mm, hình bầu dục, một đầu bé, một đầu to, màu vàng nhạt, không trong và không có ánh Sâu non khi đã lớn dài khoảng 3,5 mm, màu trắng sữa, hình cong như hình cánh cứng Không có những đường tuyến lưng, trên các đốt lưng ở giữa có 2 đường nhỏ chạy ngang nổi lên, ở giữa 2 đường này tạo thành đường máng nhỏ Sâu non tuổi một có

chân rất nhỏ, tạm thời không phân đốt, cánh ngực trước có răng tù tròn Nhộng dài 3 - 3,5 mm, hình bầu dục to và mập, có nhiều lông nhỏ màu vàng nhạt, đầu cong xuống, có vết cánh và chân rõ rệt [4]

Mỗi năm mọt thường sinh 4 - 5 lứa, nếu sống trong điều kiện thích hợp mọt có thể sinh được 8 - 11 lứa Sâu trưởng thành nở ra hơn 1 ngày chui ra từ

1 lỗ tròn Con đực nở ra độ được hơn nửa giờ bắt đầu giao phối, nhưng nói chung là sau 5 giờ rưỡi sau khi giao phối, con cái bắt đầu đẻ trứng Mọt có thể

đẻ trứng trên quả ở ngoài đồng hay trên hạt ở trong kho, có thể đẻ liên tục 2 -

3 quả trên cùng 1 hạt Thời kỳ trứng kéo dài 4 - 15 ngày, bình quân 6 ngày Thời kỳ sâu non kéo dài 13 - 34 ngày Giai đoạn nhộng kéo dài 3 - 18 ngày Mọt có tính giả chết Mùa đông trung bình con cái sống được 39 ngày, con đực sống 36,4 ngày Mùa hè mọt hay bay bổng ra ngoài kho Ở 220

C - 29,50C

và độ ẩm 88 - 100 % phát dục thích hợp nhất, dưới 100

C, và trên 370C, mọt không có khả năng đẻ trứng [4]

Thời gian thực hiện 1 vòng đời của mọt đậu xanh sai khác nhau rất nhiều, phụ thuộc vào các yếu tố như độ nhiệt, độ ẩm và thức ăn, thời gian đó

từ 18 - 60 ngày Trong điều kiện hoàn toàn thích hợp, một đời con cái có thể

đẻ được 80 - 100 trứng Có những trường hợp điều kiện không thích hợp, mọt

có thực hiện một vòng đời có thể kéo dài đến 196 ngày Thời gian sống của mọt đậu xanh phụ thuộc rất chặt chẽ vào thức ăn Mọt đậu xanh thuộc loại sâu hại phá hại thời kỳ đầu, nó có thể làm hỏng toàn bộ hạt đậu [4]

Mọt gây hại đậu xanh có mặt khắp thế giới, các vùng trồng đậu xanh ở nước ta đều có loại mọt này Nó ăn hại các loại đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu tương, đậu biển, hạt sen, Trong đó đậu xanh là bị thiệt hại nặng nhất

Phòng và trị mọt hại đậu xanh trên thế giới

Callosobruchus có thể phòng trừ bằng xử lý xông hơi methyl bromide

hoặc phosphine, mặc dù sự đăng ký sử dụng sản phẩm này ở nhiều khu vực

có thể bị hạn chế hoặc bị cấm Việc bảo quản kín cũng có hiệu quả trong việc

hạn chế tác hại của loài mọt này

Theo Philips (1994) cho rằng biện pháp hóa học có hiệu quả rất cao đối với mọt đậu Hiệu quả có thể đạt 90 – 99% với các loại thuốc hóa học thuộc nhóm Lân hữu cơ và Pyrethroid [39]

Trộn hạt với dầu thực vật, tro hoặc lá có mùi thơm, cũng có hiệu quả

trong việc hạn chế tác hại của C chinensis Sản phẩm chiết xuất từ cây có tác dụng hạn chế tác hại của C chinensis và các loài dịch hại thuộc họ Bruchidea

khác [33]

Theo Subramanyan và cộng sự (1985) [44], báo cáo về vai trò của

Bacillus thuringensis đối với phòng trừ các loại ngài thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) gây hại trong kho Các nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Mỹ với các loài nhƣ: Plodia interpunctella, Ephestia cautella, E kuehniella và Sitotroga cerealla Kết quả cho thấy chỉ cần sử dụng chế phẩm này với liều

lƣợng > 10 mg/kg đã hạn chế đƣợc sự gây hại của chúng trong kho ngũ cốc [6]

Theo Adler (2001) [24]; Sabah (2001) [42], thì thực vật làm thay đổi tập tính của côn trùng thông qua việc tạo ra mùi vị hấp dẫn hay xua đuổi Phòng trừ côn trùng gây hại kho có thể sử dụng các chiết xuất của thực vật và các hợp chất làm sạch hoặc tổng hợp theo 3 cách:

Dùng mùi vị xua đuổi để ngăn côn trùng ở khu vực xung quanh của hàng hoá đóng gói hoặc xung quanh cửa kho lây nhiễm vào trong kho

Dùng mùi vị hấp dẫn để phát hiện sớm côn trùng gây hại, giám sát kỹ thuật phòng trừ hoặc bẫy bả

Các hợp chất độc đối với côn trùng: Hiệu quả của các chiết xuất từ dầu thực vật đối với côn trùng gây hại trong kho là rất tổng hợp Các loài dịch hại

khác nhau và các pha phát dục khác nhau của cùng một loài dịch hại có phản ứng không giống nhau đối với chiết xuất nhất định Lượng chất tinh khiết trong một chất chiết xuất từ thực vật có thể khác nhau phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, địa lý và giống cây

Phòng và trị mọt hại đậu xanh ở Việt Nam

Theo Bùi Công Hiển và cộng sự (1989)

Phòng trừ tự nhiên là việc làm giảm quần thể côn trùng bởi các yếu tố

tự nhiên (không do con người), đặc biệt là nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến

sự sinh trưởng, phát triển và gây hại của côn trùng (như số lứa trong năm, số trứng đẻ hoặc mức độ gây hại) Ẩm độ và nhiệt độ tác động đến cường độ trao đổi chất của hàng hoá, bảo quản nên có sự ảnh hưởng trực tiếp đến côn trùng gây hại

Ngoài ra yếu tố địa hình ảnh hưởng trực tiếp đến phân bố cây ký chủ và côn trùng gây hại, địa hình có sự tác động đến yếu tố khí hậu (ảnh hưởng đến lượng mưa, nhiệt độ, độ ẩm tương đối của không khí bên trong và ngoài kho Một yếu tố nữa đó là kẻ thù tự nhiên: có rất nhiều loài sinh vật là kẻ thù

tự nhiên của côn trùng gây hại trong kho như côn trùng ký sinh và bắt mồi, vi sinh vật gây bệnh, tuyến trùng ký sinh Lợi dụng những yếu tố trên, con người đã sử dụng nhiều cách khác nhau để lựa chọn khu vực xây dựng kho tàng bảo quản (hướng nhà, loại hình kho, cấu trúc kho, biện pháp phòng trừ

và thời gian phòng trừ, để bảo vệ và khuyến khích sự phát triển một cách

hợp lý kẻ thù tự nhiên của côn trùng gây hại nhằm giữ cho quần thể loài côn trùng gây hại luôn ở dưới ngưỡng gây hại kinh tế

(ii) Phòng trừ bằng biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học là biện pháp làm giảm các quần thể côn trùng gây hại bằng việc sử dụng các sinh vật sống hay các chế phẩm sinh học do con người tạo ra Tổ chức đấu tranh sinh học quốc tế (IOBC, 1971), định nghĩa: Biện pháp sinh học là sử dụng những sinh vật sống hay các sản phẩm hoạt động sống của chúng nhằm ngăn ngừa hoặc làm giảm bớt tác hại do các sinh vật gây ra [13]

Biện pháp sinh học bao gồm các khía cạnh sinh học khác nhau của hệ thống sống ảnh hưởng tới quá trình sinh sản, tập tính và chất lượng thức ăn của côn trùng gây hại Biện pháp sinh học cũng bao gồm việc sử dụng các chất độc có nguồn gốc tự nhiên, các chất xua đuổi hay dẫn dụ, những chất có thể sử dụng trong hệ thống phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại trong kho Biện pháp sinh học tạo ra cơ hội để đấu tranh có hiệu quả chống lại một loài dịch hại riêng biệt mà không gây ảnh hưởng đến các loài dịch hại khác hoặc các loài côn trùng có ích

(iii) Phương pháp phòng trừ bằng cơ học và vật lý

Hiện nay có nhiều quan niệm khác nhau về phòng trừ cơ học và vật lý Có tác giả cho rằng phòng trừ vật lý là bao gồm cả phòng trừ cơ học, có tác giả không nhất trí quan điểm này mà tách phòng trừ cơ học thành biện pháp riêng

Phòng trừ vật lý là việc làm thay đổi môi trường trong kho bằng các yếu tố vật lý làm cho bất lợi đối với sự phát triển của côn trùng gây hại hoặc không cho chúng tiếp cận với hàng hoá bảo quản

Theo Marcos Kogan (1998) [35], đưa ra trên 300 công trình nghiên cứu của các tác giả trên thế giới về phương pháp phòng trừ vật lý và chia ra thành

các nhóm yếu tố như: Quản lý vệ sinh; Sinh thái học; Chiếu xạ; Cơ học, rào chắn vật lý và sử dụng khí trơ

Sử dụng năng lượng điện tử ở mức nhẹ để phòng trừ mọt, thí nghiệm này được tiến hành trong phòng thí nghiệm đối với mọt ở các các giai đoạn khác nhau (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 và 18 ngày tuổi) xử lý ở mức 170 kv trong vòng 20 phút kết quả cho thấy sự nhạy cảm đối với bức xạ điện tử giảm khi tuổi của mọt tăng, giai đoạn trứng dễ nhiễm bức xạ điện tử cao nhưng ngược lại giai đoạn 18 ngày tuổi thì mọt trưởng thành vẫn hoàn toàn phát triển được do vậy để đạt được tỷ lệ chết ở giai đoạn trưởng thành 80 % phải xử lý ở mức năng lượng cao hơn (200 kv tức = 10 kGy) Còn đối với trưởng thành sống sót còn lại thì ảnh hưởng tới sức đẻ trứng, thời gian sống và những con này không có khả năng hoàn thành chu kỳ sống Đây là một biện pháp rất hiệu quả và an toàn vì nó không ảnh hưởng tới khả năng nẩy mầm của hạt đậu [49], [50]

(iv) Phương pháp bức xạ ion

Nhiều công trình nghiên cứu xác định liều gây chết và gây bất thụ ở côn trùng gây hại trong kho cho biết liều chiếu 0,5 kGy đã đủ gây bất thụ cho

các loài ngài thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và ở mức 0,25 kGy đã gây bất thụ cho loài côn trùng cánh cứng (Coleoptera) [6]

(v) Phòng chống bằng thuốc thảo mộc và hoá học

Thuốc thảo mộc dùng để trừ các loài côn trùng gây hại ở ngoài đồng cũng như trong kho tàng đã được con người biết đến ứng dụng từ rất lâu

Goblob và Webley (1980), đã tổng kết nghiên cứu các kết quả nghiên cứu, thử nghiệm và áp dụng thuốc thảo mộc ở nhiều nơi trên thế giới với các loài thực vật khác nhau, trong đó việc tạo ra các chế phẩm thuốc thảo mộc từ

cây Neem Ấn Độ (Azadirachta indica), cỏ mạt (Acorus calamus), cây ruốc cá (Derris spp.), cây thuốc lá, thuốc lào [50]

Hiệu quả của các chiết xuất từ dầu thực vật đối với côn trùng gây hại trong kho là rất tổng hợp Các loài dịch hại khác nhau và các pha phát dục khác nhau của cùng một loài dịch hại có phản ứng không giống nhau đối với chiết xuất nhất định Lượng chất tinh khiết trong một chất chiết xuất từ thực vật có thể khác nhau phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, địa lý và giống cây [42]

Hoá chất mang tích chất thực vật (phytochemicals) được biết đến phổ biến nhất là azadirachtin, chất này được dùng riêng ở dạng thuốc thảo mộc hoặc ở dạng hỗn hợp như một thành phần của lá hoặc dạng chiết xuất (dạng

dung dịch hoặc dạng bột) của cây xoan Ấn độ (neem)(Azadirachta indica) Azadirachtin có tác dụng hạn chế sự đẻ trứng và tiêu diệt côn trùng (sâu non

và trưởng thành) Dầu của cây xoan Ấn độ (Neem) và chất chiết xuất khác hoặc dẫn xuất từ cây neem có thể sử dụng trực tiếp trên hạt [49]

Đánh giá dầu thực vật trừ sâu hại bắt đầu được sử dụng từ những năm đầu của thế kỷ 19 Năm 1927, một công trình nghiên cứu tiến hành tại Mỹ đã ghi nhận hạt dầu bông, hạt lanh, hạt thầu dầu có hiệu quả trừ sâu [50]

Hiện nay bệnh do vi sinh vật, côn trùng gây hại chưa có thuốc đặc trị Tuy nhiên, các biện pháp nêu trên không mang lại hiệu quả cao trong việc phòng trừ đối với bệnh mà lại tốn nhiều thời gian, công sức Vì thế, hướng giải quyết hiệu quả để chống lại bệnh do mọt gây ra hiện nay là tạo ra những giống cây trồng nói chung và cây đậu xanh chuyển gen nói riêng có khả năng kháng loại mọt gây hại này

1.3 DEFENSIN GEN DEFENSIN

Carvalho và cs (2011) đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của defensins

và ứng dụng trong công nghệ sinh học Defensins thực vật là peptide cation phổ biến ở thực vật và thuộc về một siêu họ lớn của các peptide kháng khuẩn được tìm thấy trong các sinh vật gọi chung là defensins Cấu trúc chính của peptide gồm 45-54 amino acid Trong cấu trúc ba chiều, defensins nhỏ và hình cầu, bao gồm một chuỗi xoắn α và phiến gấp nếp β Cấu trúc ba chiều

gồm bốn cầu nối disulfide Defensins thực vật hoạt động mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh ion, tác động đến hoạt động của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật, làm thay đổi trạng thái oxi hoá khử axit ascorbic, vv…[26]

Henrik và cs (2009) đã nghiên cứu sự phát triển và ứng dụng defensins

thực vật Các defensins thực vật được thể hiện trong các cơ quan nội tạng khác nhau và cung cấp một dòng đầu tiên của defensins chống lại sự tấn công mầm bệnh Mặc dù tương tác của các defensins thực vật với tác nhân gây bệnh chưa được hiểu rõ, các peptide này có thể được trải rộng trong cây trồng chuyển gen, kết quả là giúp cây có thể chống lại tác nhân gây bệnh Chức

năng defensins không chỉ giới hạn ở hoạt tính kháng khuẩn, nó còn tham gia

vào các tín hiệu tế bào và điều hoà sự tăng trưởng [31], [32]

Tavares và cs (2008) đã nghiên cứu các peptide kháng khuẩn từ hoa Đánh giá này tập trung vào các tác nhân gây bệnh Các peptide cation hoạt động đa dạng, bao gồm cả sự ức chế các enzym tiêu hóa và ức chế vi khuẩn hoặc nấm Trong nghiên cứu này, đã so sánh được peptide có cấu trúc bậc 3 phân lập từ một số loài hoa Ngoài ra còn nghiên cứu sự tương tác phân tử giữa các peptide và các tác nhân gây bệnh, trong đó bao gồm vai trò của protein màng tế bào và chất béo Các nghiên cứu về các peptide đã góp phần giúp chúng ta hiểu về cơ chế kháng bệnh giúp tạo cây trồng chuyển gen góp phần cải thiện giống cây trồng tăng sức đề kháng tác nhân gây bệnh [45]

Defensins -Vigna radiata 1 (VrD1) là loại defensin thực vật đầu tiên có hoạt tính trừ sâu (kháng sâu bệnh) được ghi nhận Defensin là

một họ peptide cơ bản và giàu cystein gồm có 45 – 54 amino acid được tìm thấy ở nhiều đối tượng thực vật khác nhau như lúa mỳ, lúa mạch, đậu, cải, lúa miến và đậu xanh Chúng thể hiện hoạt tính kháng đối với diện rộng các nấm gây bệnh thực vật Nhiều defensin có khả năng ức chế α-amylase, trypsin Cấu trúc ba chiều của defensin thực vật từ nhiều nguồn dữ liệu khác nhau đã

được xác định thông qua máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Các defensin thực vật có chung một dạng kiểu gấp liên quan đến xoắn α và tấm gấp nếp β ba phiến không song song, được giữ ổn định bởi bốn liên kết disulfide (ngoại trừ PhD1 có năm), tạo thành dạng cystein ổn định α, β đặc trưng (Csαβ) Đặc biệt là dạng cấu trúc đặc trưng của defensin thực vật cũng được tìm thấy ở defensin côn trùng, độc tố bò cạp và protein ngọt, brazzein [34]

VrD1 có ở trong hạt đậu xanh có khả năng kháng mọt, bao gồm 46 gốc peptide với bốn liên kết disulfide VrD1 là chất ức chế mạnh đối với quá trình tổng hợp protein, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm VrD1 dường như là một loại peptide đa chức chăng; nó thể hiện hoạt tính như là chất trừ sâu sinh học, và việc chuyển gen VrD1 để kháng sâu bệnh có thể ứng dụng đối với các cây trồng nông nghiệp quan trọng Trong các defensin thực vật,

VrD1 có trình tự khá tương đồng với chất ức chế α-amylase 2 ở Sorghum bicolor (SIα2) (45% đồng nhất) Defensin thực vật có thể được chia làm 2

nhóm phụ dựa vào hoạt tính kháng α-amylase sâu bọ: nhóm có khả năng ức chế α-amylase và nhóm không có khả năng đó α-amylase (EC 3.2.1.1.) được phát hiện thấy ở nhiều đối tượng động vật, thực vật, côn trùng và VSV, và chúng thủy phân liên kết α-1,4 glucose trong các polymer như tinh bột, và do vậy đóng vai trò chính trong trao đổi carbohydrate [34]

VrD1 ức chế α-amylase của Tenebrio molitor, α-amylase có vai trò chủ

yếu trong tiêu hóa tinh bột ở ruột các loài côn trùng, và sự biểu hiện của chất

ức chế này trong đậu chuyển gen sẽ giúp kháng lại sự phá hoại của các loài mọt Kết quả đó cho thấy hoạt tính kháng sâu bệnh của VrD1 có nền tảng cơ bản là sự ức chế thủy phân các polysaccharide Khi so sánh trình tự và cấu trúc của hai nhóm defensin thực vật khác nhau, người ta phát hiện ra rằng vùng vòng giữa β2 và β3 có thể là vùng gắn của α-amylase Những kết quả thu được thông qua các thí nghiệm điện toán được sử dụng trong nghiên cứu

tương tác VrD1-α-amylase cho thấy tiềm năng cải thiện hoạt tính kháng sâu bệnh của protein VrD1 [34]

VrD1 bộc lộ thành dạng hình cầu gọn có chứa 3 tấm gấp nếp β không song song, một xoắn α, và xoắn 310 Xoắn α (α1) gồm 2 cystein bắt cặp với cystein của phiến β giữa (β3) của tấm gấp nếp β không song song (Cys19

Cys40, Cys23-Cys42). Hai cầu nối disulfide đó giúp duy trì sự bắt cặp của xoắn

-α và tấm gấp nếp β Phiến β2 liên kết với vùng vòng L1 bởi nối disulfide thứ

ba (Cys13-Cys33) Sự hiện diện của ba liên kết disulfide này giúp cấu thành đặc điểm trung tâm của cấu trúc VrD1, hình thành kiểu mẫu CSαβ Cầu nối disulfide thứ tư (Cys3-Cys46) giúp kéo gần đầu N và C lại với nhau [34]

Một đặc trưng trong cấu trúc VrD1 đó là xoắn 310 (Glu8-Gly11) So với các cấu trúc defensin thực vật đã biết khác, VrD1 là dạng đầu tiên được phát hiện có xoắn 310 Đặc điểm khác biệt nổi bật của VrD1 và các defensin thực vật khác là sự thay thế Glu26

bảo thủ cao bởi Arg

Defensin thực vật có khả năng ức chế α-amylase, trypsin, và hai hoạt tính này liên quan đến cơ chế kháng sâu bệnh Trong quá trình tiến hóa, thực vật đã sản sinh ra nhiều loại chất ức chế α-amylase, trypsin và một trong số đó

là chất ức chế α-amylase 1 (α –AI1) ở đậu Hà lan (Pisum sativum) chuyển gen

có khả năng kháng hoàn toàn sâu mọt VrD1 không thể hiện hoạt tính kháng trypsin, mặc dù nó có kháng TMA, điều này mở ra triển vọng sử dụng chất ức chế α-amylase VrD1 trung gian làm cơ sở cho hoạt tính kháng mọt của

defensin này [34]

Chen và cs (2002) đã phân lập gen defensin liên quan đến hoạt động

của côn trùng Tác giả đã phân lập được cDNA giàu protein cysteine (VrCRP) VrCRP được phân lập từ đậu xanh kháng mọt đục hạt VrCRP mã hóa protein dài 73 amino acid, gồm 27 amino acid peptide tín hiệu, có chứa 8 cysteine Dựa vào đặc điểm tương đồng và bảo thủ của các gốc ở các amino acid, người ta cho rằng VrCRP là một thành viên của họ defensin thực vật

VrCRP-TSP đã gây chết ấu trùng Callosobruchus bruchid (gây mọt đậu

xanh) VrCRP là báo cáo đầu tiên về defensin thực hoạt động chống côn trùng

Callosobruchus chinensis [29]

Thomma và cs (2002) đã nghiên cứu defensin thực vật với tác dụng kháng

nấm Đến nay, trình tự của hơn 80 gen defensin thực vật khác nhau từ các loài thực vật khác nhau đã được nghiên cứu Trong cây Arabidopsis thaliana, có ít nhất 13 gen defensin thực vật [48]

Chen và cs (2004) đã nhân bản và biểu hiện chức năng của defensin 1

đậu xanh VrD1 vào nấm men cDNA của gen defensin phân lập từ đậu xanh đã được biểu hiện trong Pichia pastoris và tạo được defensin tái tổ hợp (rVrD1) VrD1 tái tổ hợp đã biểu hiện ức chế sự phát triển của nấm như Fusarium oxysporum, Pyricularia oryza, Rhizoctonia solani, Trichophyton rubrum và ấu trùng mọt Loại protein này cũng ức chế tổng hợp protein trong điều kiện in vitro Các hoạt tính sinh học đó tương tự như defensin biểu hiện ở vi khuẩn Biểu hiện chức năng của VrD1 ở Pichia pastoris đã cung cấp một hệ thống có

tính hữu dụng cao trong nghiên cứu quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của VrD1 sử dụng phương pháp phát sinh đột biến [28]

Loại defensin đậu xanh VrD1 tái tổ hợp đã được chứng minh có hoạt tính kháng nấm và kháng mọt Để nghiên cứu chức năng và sự điều hòa của VrD1, dẫn theo Chen và cs (2005) đã phân lập DNA hệ gen của defensin thực

vật từ Vigna radiata VC6089A và đậu đỏ Vigna angularis DNA của defensin

đậu đỏ VaD1 được giải trình tự và dịch mã ngược thành cDNA VaD1

Defensin VaD1 tinh sạch từ Vigna angularis tương đối đồng nhất Trình tự

amino acid hoàn chỉnh của VaD1 tinh sạch được xác định và hoàn toàn giống với trình tự suy diễn từ cDNA VaD1 VaD1 là protein cơ bản gồm 46 amino acid với bốn cầu nồi disulfide và có độ tương đồng cao với VrD1 (78.3%)

VaD1 có khả năng ức chế sự phát triển của Fusarium oxysporum, Fusarium oxysporum f sp pisi, Staphylococcus epidermidis và Salmonella

typhimurium VaD1 cũng hạn chế quá trình tổng hợp in vitro protein và sự

phát triển của ấu trùng mọt, nhưng có hoạt tính kém hơn VrD1 tái tổ hợp [27]

Liu và cs (2006) [34], đã nêu rõ vai trò của defensin ở đậu xanh trong hoạt động chống côn trùng, chống mọt Defensin của đậu xanh (VrD1) là gen liên quan đến hoạt động của côn trùng Trong số các các defensin thực vật được biết đến, VrD1 là gen đầu tiên gồm 310 amino acid Glu26 được bảo tồn cao

giữa các defensins; VrD1 chứa arginine, có thể tạo ra sự thay đổi trong định

hướng của Trp10, qua đó thúc đẩy sự hình thành của protein VrD1 Hơn nữa, VrD1 ức chế hoạt động của α-amylase α-amylase có vai trò quan trọng trong tiêu hóa tinh bột thực vật trong ruột côn trùng và biểu hiện ở hạt VrD1 hoạt động ức chế hydrolase polysaccharide Đã có nghiên cứu so sánh cấu trúc giữa

hai nhóm các defensins thực vật có đặc trưng khác nhau đối với α-amylase ở côn

trùng cho thấy sự khác nhau giữa β2 β3 là các vị trí liên kết có ảnh hưởng đến amylase Nghiên cứu tương tác VrD1-α-amylase đã cung cấp thông tin có thể được sử dụng để cải thiện hoạt động của côn trùng từ VrD1

α-Cơ chế gây độc đối với các loại nấm của protein này vẫn chưa rõ nhưng defensin đã được chứng tỏ là làm tăng vận chuyển ion K+ ra ngoài màng, tăng hấp thụ Ca2+

của nấm Neurosporao crassa Chất defensin Dm-AMD1 của cây thược dược có thể tương tác đặc hiệu với Sphingolipid của nấm men Saccharomyces cerevisiae Cơ chế gây độc của defensin đối với côn trùng gây

mọt ở hạt đậu xanh là khi côn trùng phá huỷ những hạt đậu xanh thì defensin

đã ngăn chặn sự tiêu hoá của tinh bột khi côn trùng ăn phải những hạt đó và

ức chế sự sinh trưởng phát triển của chúng [39] Những thực vật cung cấp đủ defensin thì sẽ giết chết ấu trùng Bởi vậy, cơ chế tác động của defensin như

là một sự cản trở men phân giải tinh bột làm cho ấu trùng không thể tồn tại được