ứng dụng vi khuẩn methylobacterium sp. trong việc kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành

trong việc kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành Chủ nhiệm đề tài: Kiều Phương Nam Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ 3 Thiếu phương pháp xác định phytohor

i

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 16 tháng 8 năm 2010)

ỨNG DỤNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP TRONG

VIỆC KÉO DÀI TUỔI THỌ HOA CẮT CÀNH

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: KIỀU PHƯƠNG NAM

CÁN BỘ THAM GIA: PGS.TS Bùi Văn Lệ; CN Trần Minh Tuấn; CN Phan Nguyễn Quang

Hưng; CN Trần Thị Trinh; CN Nguyễn Ngọc Trinh; CN Nguyễn Nhữ; CN Lại Trịnh Anh Khoa

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 9/ 2010

ii

XÁC NHẬN CHỈNH SỬA BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 16/8/2010)

Tên đề tài: Ứng dụng vi khuẩn Methylobacterium sp trong việc kéo dài tuổi thọ

hoa cắt cành

Chủ nhiệm đề tài: Kiều Phương Nam

Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

3

Thiếu phương pháp xác

định phytohormone

Bổ sung phương pháp ly trích và xác định hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh (mục 2.3.5)

theo dõi kết quả

Bố cục lại báo cáo để nêu bật vai trò của

vi khuẩn Methylobacterium cũng như theo

nội dung đề tài được duyệt

25

7 Thiếu tên latin Bổ sung tên latin cây hoa cẩm chướng 15

8 Chỉ tiêu hàm lượng diệp

nghiệm ảnh hưởng của bạc nitrate 46

quả xử lý thông kê ở các bảng kết quả

15 Biện luận rõ hơn các kết quả thu được

iv

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài: Ứng dụng vi khuẩn Methylobacterium sp trong việc kéo dài tuổi thọ hoa

cắt cành

Chủ nhiệm đề tài: KIỀU PHƯƠNG NAM

Cơ quan công tác: Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Chuyển hóa Sinh học,

Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp HCM

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ trẻ

Thời gian thực hiện đề tài: 10/2007 – 1/2010

Kinh phí được duyệt: 70 triệu đồng

Kinh phí đã cấp: theo TB số : 147 /TB-SKHCN ngày 31/10/2007

chế phẩm có hoạt tính kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành

- Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm từ vi khuẩn ứng dụng trong việc kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành Hướng tới tạo chế phẩm cho người sử dụng hoa

và phân phối hoa cắt cành

Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt và hợp đồng đã ký)

hiện

Xác định: canh trường nuôi cấy vi khuẩn, canh trường loại

bỏ sinh khối hay sinh khối vi khuẩn có hoạt tính kéo dài

tuổi thọ của hoa cúc và hoa cẩm chướng

Đã thực hiện

So sánh sự lão suy của hoa trong điều kiện có bổ sung vi

khuẩn Methylobacterium sp với các hóa chất khác như:

cytokinine, auxin, AgNO3, aspirine, acetaldehyde, 8-

hydroxyquinoline, ethanol theo các chỉ tiêu cảm quan (thời

gian hoa tàn, mầu sắc hoa, hiện tượng thối gốc, rụng cánh,

Đã thực hiện

Xác định các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm: màu sắc

chế phẩm, mùi của chế phẩm, mật độ vi sinh, hàm lượng

các hóa chất bổ sung vào chế phẩm

Đã thực hiện

Xác định hiệu quả của chế phẩm và tính toán giá thành của

chế phẩm so với chế phẩm đã thương mại hóa trên thị

trường (chế phẩm NH của Trung tâm nghiên cứu khoai tây,

rau và hoa)

Đã thực hiện

vi

TÓM TẮT

Sinh khối vi khuẩn Methylobacterium có đặc tính kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành Việc

phối hợp sinh khối với các thành phần bổ trợ đã tạo nên chế phẩm có giá thành thấp và

hiệu quả Chế phẩm bao gồm: sinh khối vi khuẩn Methylobacterium raditolerans H2T

2.1011 tế bào/lít; Đường sucrose 1,5%, AgNO3 35 ppm, GA3 8 ppm có khả năng kéo

dài tuổi thọ hoa cẩm chướng lên 2,5 lần, hoa đồng tiền, hoa hồng, hoa cát tường, hoa

cúc tăng lên khoảng 2 lần so với cắm trong nước máy Chế phẩm không những gia tăng

tuổi thọ của hoa cắt cành mà còn gia tăng khả năng nở của nụ hoa, hoa nở to, cánh hoa

cứng, màu sắc tươi, cuống hoa cứng và lá vẫn còn xanh Giá thành chế phẩm khoảng 2

ngàn đồng/15g (pha thành 1 lít dung dịch cắm hoa) Chế phẩm cải tiến có tính chất

tương tự nhưng giảm tính gây ô nhiễm (kim loại năng) do thay thế AgNO3 35 ppm

bằng calcium nitrat 200 ppm và tannic acid 400 ppm

ABSTRACT

Methylobacterium bacteria biomass is characterized by long product life cut flowers

The coordination of biomass components should be created off preparations with low

cost and effective We had developed a bioproduct to prolong the life of cut flower,

which consists of 2.1011 CFU/L of Methylobacterium radiotolerans H2T; 1.5%

sucrose; 35 ppm AgNO3; 8 ppm GA3 This product not only increases the life of

Gerbera and Carnation by 2.5 and 1.6 fold, respectively; but also proliferates flower

blossoming; flower size; color and leaves As our rough calculating; its price is

approximately 2000 dong/15g Preparations have improved similar properties but

reduce contaminants (heavy metals) by replacing 35 ppm AgNO3 with 200 ppm

calcium nitrate and 400 ppm tannic acid

vii

MỤC LỤC

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ - ĐỒ THỊ xiii

DANH MỤC HÌNH xv

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN 3

1.1 Hoa cắt cành 3

1.1.1 Hiện tượng lão suy ở thực vật 3

1.1.2 Kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành 5

1.2 Vi khuẩn Methylobacterium 6

1.2.1 Vi khuẩn Methylobacterium trong tự nhiên 7

1.2.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Methylobacterium 8

1.2.3 Sự tương tác giữa vi khuẩn Methylobacterium và thực vật 10

1.2.4 Giả thuyết về sự phân hủy tiền chất trực tiếp tổng hợp ethylene 12

2 NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP 15

2.1 Thời gian & Địa điểm 15

2.2 Vật liệu 15

2.2.1 Đối tượng thí nghiệm 15

2.2.2 Điều kiện thí nghiệm 15

2.2.3 Môi trường 16

2.2.4 Hóa chất 16

viii

2.3 Phương pháp thu nhận kết quả 16

2.3.1 Định lượng hàm lượng diệp lục tố 16

2.3.2 Định lượng protein tổng số 17

2.3.3 Định lượng hàm lượng đường tổng số 19

2.3.4 Phương pháp đánh giá dựa trên cảm quan 20

2.3.5 Ly trích và định lượng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 22

2.4 Bố trí thí nghiệm 25

2.4.1 Khảo sát sự lão suy của hoa cẩm chướng cắt cành trong điều kiện bình thường (cắm hoa với nước) 25

2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của Methylobacterium sp 25

2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của các chất bổ trợ cho vi khuẩn Methylobacterium sp trong chế phẩm 27

2.4.4 Phối hợp nồng độ carbon, AgNO3 và sinh khối vi khuẩn Methlobacterium sp 32

2.4.5 Khảo sát kết hợp các dạng chế phẩm từ canh trường nuôi khuẩn và các chất bổ trợ lên việc kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành 33

2.4.6 Cải tiến chế phẩm 1 34

2.4.7 Thử nghiệm chế phẩm trên các loại hoa cắt cành khác 36

2.4.8 Các thông số kĩ thuật của chế phẩm 37

3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 38

3.1 Khảo sát sự lão suy của hoa cẩm chướng cắt cành trong điều kiện bình thường (cắm hoa với nước) 38

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của Methylobacterium 42

ix

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các chất bổ trợ cho vi khuẩn Methylobacterium sp

trong chế phẩm 44

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của AgNO 3 44

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của Aspirin 46

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của Javel 48

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của Ethanol 50

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của Acetaldehyde 52

3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của GA 3 54

3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của NAA 56

3.3.8 Khảo sát ảnh hưởng của BA 58

3.4 Phối hợp nồng độ carbon, AgNO3 và vi khuẩn tối ưu 60

3.5 Khảo sát kết hợp các dạng chế phẩm 63

3.6 Cải tiến chế phẩm 1 67

3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của Calcium nitrate 67

3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của Tannic acid 68

3.6.3 Khảo sát khả năng thay thế AgNO 3 trong chế phẩm CP1 bởi Tannic acid và Calcium Nitrate 70

3.7 Thử nghiệm chế phẩm trên các loại hoa cắt cành khác 71

3.8 Các thông số kĩ thuật của chế phẩm 73

3.9 Kết luận 76

3.10 Đề nghị 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid

ACS 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase

IAA indole-3-acetic acid

PPFM Pink-Pigmented Facultative Methylotrophic bacteria

xi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng mô tả dựng đường chuẩn 18

Bảng 2.2 Khảo sát sự tương quan giữa OD530nm và nồng độ IAA (mg/l) 23

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm 2.4.4 33

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm 2.4.5 34

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dịch A lên tuổi thọ của hoa cẩm chướng 42

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch B lên tuổi thọ của hoa cẩm chướng 42

Bảng 3.3 Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ dịch A 43

Bảng 3.4 Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong AgNO3 khi hoa đối chứng tàn 44

Bảng 3.5 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức AgNO3 44

Bảng 3.6 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Aspirin 46

Bảng 3.7 Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ Aspirin tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 47

Bảng 3.8 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Javel 48

Bảng 3.9 Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ Javel tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 49

Bảng 3.10 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Ethanol 50

Bảng 3.11 Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ Ethanol tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 51

Bảng 3.12 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Acetaldehyde 52

Bảng 3.13 Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ Ethanol tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 53

xii

chứng tàn 54

Bảng 3.15 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức GA3 55

Bảng 3.16 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức NAA 56

Bảng 3.17 Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ NAA

tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 57

Bảng 3.18 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức BA 58

Bảng 3.19 Hàm lượng Chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ BA

tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 59

Bảng 3.20 Kết quả tính điểm theo cảm quan của thí nghiệm phối hợp nồng độ carbon,

AgNO3 và vi khuẩn tối ưu 60

Bảng 3.21 Hàm lượng Chlorophyll, đường, protein tại thời điểm đối chứng tàn 61

Bảng 3.22 Kết quả tính điểm theo cảm quan của thí nghiệm phối hợp các dạng chế

phẩm từ sinh khối vi khuẩn và các chất bỗ trợ 63

Bảng 3.23 Hàm lượng Chlorophyll, đường, protein của chế phẩm tối ưu so với đối

chứng tại thời điểm đối chứng tàn 63

Bảng 3.24 Số lượng tế bào vi khuẩn còn sống ở các phương pháp bảo quản 66

Bảng 3.25 Thành phần chế phẩm 1 66

Bảng 3.26 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Calcium nitrate 67

Bảng 3.27 Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong Calcium nitrate khi

hoa đối chứng tàn 67

Bảng 3.28 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Tannic acid 68

Bảng 3.29 Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong Tannic acid khi hoa

đối chứng tàn 68

xiii

Bảng 3.30 Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức CP2 70

Bảng 3.31 Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong các chế phẩm khi hoa đối chứng tàn 70

Bảng 3.32 Thành phần chế phẩm 2 kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành 74

DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ - ĐỒ THỊ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Ly trích được thực hiện trong phòng tối với ánh sáng đỏ, có quạt hút không khí 23

Sơ đồ 2.2 Các loại dung dịch cắm hoa A, B 26

Biểu đồ 3.1 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll của hoa cẩm chướng 38

Biểu đồ 3.2 Sự thay đổi hàm lượng protein của hoa cẩm chướng 38

Biểu đồ 3.3 Sự thay đổi hàm lượng đường của hoa cẩm chướng 39

Biểu đồ 3.4 Sự thay đổi hàm lượng auxin của hoa cẩm chướng 39

Biểu đồ 3.5 Sự thay đổi hàm lượng cytokinin của hoa cẩm chướng 40

Biểu đồ 3.6 Sự thay đổi hàm lượng gibberelin của hoa cẩm chướng 40

Biểu đồ 3.7 Hàm lượng sắc tố, protein và đường của hoa cẩm chướng cắm trong dung dịch AgNO3 tại thời điểm đối chứng tàn 45

Biểu đồ 3.8 Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Aspirin khi đối chứng tàn 47

Biểu đồ 3.9 Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Javel khi đối chứng tàn 49

Biểu đồ 3.10 Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Ethanol khi đối chứng tàn 51 Biểu đồ 3.11 Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Acetaldehyde khi đối chứng tàn 53

xiv

Biểu đồ 3.12 Hàm lượng sắc tố, protein và đường của hoa cẩm chướng cắm trong

dung dịch GA3 tại thời điểm đối chứng tàn 55

Biểu đồ 3.13 Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Acetaldehyde khi đối chứng

tàn 56

Biểu đồ 3.14 Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức BA khi đối chứng tàn 58

Biểu đồ 3.15 Hàm lượng chlorophyll ở các nghiệm thức phối hợp nồng độ carbon,

AgNO3 và mật độ vi khuẩn tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn (ngày 8) 61

Biểu đồ 3.16 Hàm lượng chlorophyll của hoa cắm trong các dạng chế phẩm tại thời

điểm đối chứng tàn (ngày 8) 64

Đồ thị 3.1 Sự biến đổi lượng vi khuẩn trong chế phẩm theo thời gian 74

Đồ thị 5.1 Tương quan tuyến tính giữa log (N/ml) và OD610nm phụ lục 0

Đồ thị 5.2 Tương quan tuyến tính giữa OD595nm và nồng độ albumin chuẩn 0

Đồ thị 5.3 Tương quan tuyến tính giữa OD490nm và nồng độ albumin chuẩn 1

xv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vòng đời của hoa (theo chiều kim đồng hồ) 4

Hình 1.2 Ảnh chụp vi khuẩn Methylobacterium sp từ kính hiển vi điện tử [26] 7

Hình 1.3 Vi khuẩn Methylobacterium xâm nhiễm vào cây chủ qua khí khẩu [19] 8

Hình 1.4 Tương tác giữa vi khuẩn Methylobacterium sp và cây chủ 11

Hình 1.5 Mô hình minh họa giả thuyết các bước phức tạp trong việc làm giảm nồng độ ethylene thực vật và đặc tính khác của vi khuẩn Methylobacterium trong việc kích thích tăng trưởng thực vật 14

Hình 2.1 Bảng điểm độ tươi của hoa 21

Hình 2.2 Bảng điểm thân và lá Cẩm chướng 21

Hình 3.1 Hoa cẩm chướng lúc còn tươi và lúc tàn 41

Hình 3.2 Mức độ lão suy của hoa trong các nghiệm thức AgNO3 khi đối chứng tàn 46 Hình 3.3 Mức độ lão suy của hoa trong dung dịch Aspirin 400 và 1000 ppm khi đối chứng tàn 47

Hình 3.4 Mức độ lão suy của hoa trong dung dịch Javel 1:5 và 1:10 khi đối chứng tàn 49

Hình 3.5 Mức độ lão suy của hoa trong dung dịch Ethanol 0,6% và 1,0% khi đối chứng tàn 51

Hình 3.6 Mức độ lão suy của hoa trong Acetaldehyde 4,5 % và 2,5% khi đối chứng tàn 53

xvi

Hình 3.7 Mức độ lão suy của hoa trong NAA 10 ppm khi đối chứng tàn 57

Hình 3.8 Mức độ lão suy của hoa trong BA 6 ppm và 10 ppm khi đối chứng tàn 59

Hình 3.9 Tình trạng hoa cẩm chướng trong dung dịch S1,5; E1 và G1 61

Hình 3.10 Tình trạng hoa cẩm chướng cắm trong các dung dịch ESG, ESG, SK-ASG, ASG và nước cất sau 8 ngày 64

Hình 3.11 Mức độ lão suy của hoa trong các nghiệm thức Tannic acid khi đối chứng tàn 69

Hình 3.12 Hoa cẩm chướng cắm trong chế phẩm CP1 và CP2 71

Hình 3.13 Hoa đồng tiền cắm trong nước cất (đối chứng) và CP2 sau 8 ngày 72

Hình 3.14 Hoa cúc cắm trong nước cất (đối chứng) và CP2 sau 10 ngày 72

Hình 3.15 Hoa hồng cắm trong nước cất (đối chứng) và CP2 sau 6 ngày 73

Hình 3.16 Hoa Cát tường cắm trong nước cất (đối chứng) và CP2 sau 6 ngày 73

1

MỞ ĐẦU

Ngành công nghiệp hoa cắt cành là một ngành công nghiệp năng động và đa dạng

Những thử thách khác nhau trong cuộc cạnh tranh về nguồn giống, kĩ thuật sản xuất

cũng như thị trường tiêu thụ hoa đã tạo nên một “ngành công nghiệp đầy màu sắc” diễn

ra bên cạnh các ngành công nghiệp truyền thống khác Hiện nay, nhu cầu tiêu thụ hoa

tươi đang ngày càng nâng cao, và đi đầu trong ngành công nghiệp này đó chính là các

nước: Hà Lan, Mỹ, Mexico, Colombia, Ecuador, Kenya… Tình hình phát triển ngành

công nghiệp hoa cắt cành của Việt Nam đang có dấu hiệu phát triển rõ rệt, doanh thu từ

việc xuất khẩu hoa tăng liên tục theo từng năm, từ 5,3 triệu USD năm 2004 lên 13 triệu

USD năm 2007, 8,4 triệu USD trong 8 tháng đầu năm 2008; thị trường tiêu thụ chủ yếu

là Nhật, Trung Quốc và một số nước Châu Âu Tuy nhiên, các thị trường trên đòi hỏi

ngày càng cao về chất lượng, mẫu mã Do đó, yêu cầu cần thiết để hoa cắt cành Việt

Nam có thể cạnh tranh được với các nước khác đó chính là cải tiến chất lượng hoa cắt

cành, giảm giá thành sản phẩm Để đáp ứng được nhu cầu của thị trường cũng như

nâng cao khả năng cạnh tranh với các nước khác, công tác xử lý trước và sau thu hoạch

cần được tập trung vì nó quyết định chất lượng của hoa thành phẩm [39]

Một số nghiên cứu về sinh lý hoa khi bảo quản cũng như các phương pháp bảo quản và

các phương thức gia tăng tuổi thọ hoa cắt cành đã được công bố Trong đó, một số tác

giả đã thành công trong việc xây dựng quy trình bảo quản nhiều loại hoa cắt cành như

hồng, cẩm chướng, layơn [1] Để cải thiện chất lượng hoa cũng như tuổi thọ hoa cắt

cành, hiện nay người ta sử dụng các khoáng chất ở dạng dung dịch để bổ sung vào dịch

cắm hoa [2], [38], [39]

Một số nghiên cứu ở Việt Nam đề cập đến vi khuẩn hiếu khí sắc tố hồng và dinh dưỡng

methyl tùy ý, gọi tắt là PPFM (Pink-Pigmented Facultative Methylotrophic bacteria),

được xếp vào chi Methylobacterium Đây là loài thường sống trên bề mặt lá cây và có

nhiều hoạt tính sinh học Nghiên cứu gần đây cho thấy PPFM và một số vi khuẩn dinh

dưỡng methyl khác (Methylomonas methanica, Methylovorus may) có chứa

1-aminocyclopropan-1carboxylate (ACC deaminase) một enzyme phân cắt tiền chất

2

trung gian trong quá trình sinh tổng hợp ethylene, và khả năng tổng hợp cytokinin,

giberrelin, auxin [18], [24]; hơn thế nữa, việc phun PPFM lên cây trồng sẽ làm tăng

năng suất cây trồng [40] Từ các bằng chứng về mối tương tác giữa các chủng PPFM

và cây chủ, và chiến lược phát triển ngành công nghệ hoa cắt cành của Việt Nam,

chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“ỨNG DỤNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP TRONG VIỆC KÉO

DÀI TUỔI THỌ HOA CẮT CÀNH”

Nhằm vào các mục tiêu sau:

- Chứng minh tiềm năng sử dụng vi khuẩn Methylobacterium sp để tạo chế phẩm có

hoạt tính kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành

- Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm từ vi khuẩn ứng dụng trong việc kéo dài

tuổi thọ của hoa cắt cành Hướng tới tạo chế phẩm cho người sử dụng hoa và phân phối

hoa cắt cành

3

TỔNG QUAN

1.1 Hoa cắt cành

Hoa cắt cành là một phần của cây, mang đặc tính của một phát hoa và không

bao gồm rễ cũng như đất trồng Chúng thường nhanh chóng hỏng vì chỉ có thể duy trì

thời gian sống ngắn; quá trình duy trì sự sống này chủ yếu bằng cách hút nước thông

qua thân

Các phương pháp sản xuất hoa chủ yếu phụ thuộc vào điều kiện môi trường

của khu vực trồng và nhu cầu chất lượng Năm 2007, diện tích trồng hoa ở Hoa Kỳ

xấp xỉ 46 triệu m2, và sau đó mở rộng ra gấp 10 lần và đến nay đã hơn 80 triệu m2

Việc chấm điểm hoa cắt cành thường được thực hiện để đảm bảo các tiêu chuẩn nhất

quán Thân thường dài từ 50 – 55 cm cho hầu hết các loại hoa và được cắt ngắn bỏ

những phần thân bị hỏng, những hoa trong tình trạng bệnh hoặc già Việc phân loại

bằng máy có thể tính điểm cho hoa theo chiều dài thân, tuy nhiên tất cả các yếu tố đó

vẫn phải do con người quyết định Những cây hoa cúc được tính theo chùm 250 đến

340 g chứa cả thân, ngoài ra hoa cúc tiêu chuẩn cần có kích thước đồng đều Hoa sau

đó được bọc kín bằng nilon trong điều kiện nhiệt độ thấp, độ ẩm 98% và được vận

chuyển đến trung tâm phân phối [29]

1.1.1 Hiện tượng lão suy ở thực vật

Lão suy là một quá trình tự nhiên có thể coi như một sự phân hóa cuối cùng và

có thể là hoàn toàn nội sinh của thực vật do di truyền quyết định Ở thực vật, khi hoàn

thành chu trình phát triển (sản xuất hột chứa phôi) sẽ vào trạng thái lão suy và chết

(cây hàng năm), hay tiếp tục sản xuất trái và hạt trong nhiều năm nữa (cây lâu năm)

[1], [37]

Lão suy là giai đoạn sống sau cùng của thực vật, bao gồm một chuỗi sự kiện

bình thường không thể đảo ngược dẫn đến sự phá hủy tổ chức tế bào và sự chết của

thực vật [1] Các biểu hiện rõ nhất của sự lão suy là sự mất khả năng phân chia tế bào,

sự giảm hàm lượng RNA do tăng cường độ các quá trình phân giải và ngừng tổng hợp

chúng, các biến đổi về protein và diệp lục tố (ở lá) Song song với sự biến đổi đó,

4

cường độ quang hợp và cường độ hô hấp giảm sút nhanh chóng Đặc biệt sự cân bằng

phytohormone thay đổi nhanh theo hướng làm tăng hàm lượng abscisic acid, ethylene

và giảm hàm lượng các chất tăng trưởng đặc biệt là cytokinin Abscisic acid được xem

là nhân tố hóa già Cùng với ethylene, abscisic acid được hình thành nhanh chóng khi

có những biểu hiện cảm ứng sự hóa già và sự rụng như thiếu nước, thiếu chất dinh

dưỡng, quang chu kỳ không thuận lợi Đối kháng với abscisic acid và ethylene trong sự

hóa già là cytokinin Cytokinin lại kích thích quá trình tổng hợp chlorophyll, nucleic

acid và protein, kích thích quá trình phân chia tế bào, kéo dài tuổi thọ của hoa, lá Vì

vậy, có thể xem cytokinin là nhân tố trẻ hóa trong thực vật Auxin và gibberellin cũng

có tác dụng kiềm hãm sự lão suy Trong một số trường hợp, chúng được sử dụng để

kìm hãm sự lão suy của cam chanh [11]

Hình 0.1 Vòng đời của hoa (theo chiều kim đồng hồ)

Mốc đánh dấu kết thúc đời sống của hoa cắt cành là khi hoa đi vào tình trạng lão

suy và bắt đầu tàn Điều này đặc biệt đúng với hoa hồng: khi cắt cành, hoa thường

không nở, gãy cổ và héo cánh rất sớm so với hoa còn trên cây Ở hoa cẩm chướng, sự

5

héo rũ của cánh hoa đi kèm với sự giảm hấp thu nước, mặc dù không có sự cản trở vận

chuyển của bó mạch nhưng cánh hoa vẫn mất khả năng hấp thu nước [8]

1.1.2 Kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành

Các sản phẩm kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành đều chứa hoạt chất diệt khuẩn để

ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật Các sản phẩm hydrate hóa dễ dàng được hấp

thụ vào thân cây, dịch hòa tan có pH từ 3,0 – 3,5 sẽ giúp cây hút nước tốt hơn Dung

dịch giữ hoa thường có thành phần đường cung cấp năng lượng cần thiết để hoa tiếp

tục nở Ánh sáng có thể gia tăng chất lượng cũng như tuổi thọ của hoa cắt cành Thông

thường hoa cắt cành được xử lý cắm đứng trong dung dịch trong thời gian ngắn,

thường ít hơn 24 giờ ở nhiệt độ thấp, sau đó được vận chuyển đi Hiện nay, mối quan

tâm đến công tác bảo quản hoa cắt cành, đặc biệt là hoa cẩm chướng đã được nhiều

công trình nghiên cứu công bố STS là một trong những chất được sử dụng rộng rãi

trong việc bảo quản hoa cẩm chướng thương mại, mục đích làm kéo dài thời gian sống

của hoa cẩm chướng cắt cành sau khi thu họach STS là một tác nhân gây ức chế hoạt

động của ethylene, làm chậm sự lão suy nhanh chóng của hoa Tuy nhiên, điều lo lắng

của các nhà nghiên cứu hiện nay chính là vấn đề ô nhiễm môi trường do kim loại nặng

bởi các chất thải STS được đưa ra môi trường ngày càng gia tăng trong những năm gần

đây, điều đó đòi hỏi phải phát triển một chất thay thế khác Takashi Onozaki và cộng

sự (1998) đã chứng tỏ ảnh hưởng của calcium nitrate kết hợp với AIB

(α-aminoisobutyric acid) để kéo dài tuổi thọ hoa trong điều kiện cắm bình Trong khi đó

Michalczuk và cộng sự (2001) đã chứng tỏ hiệu quả kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành bằng

việc kết hợp calcium nitrate và tannin Theo đó, thời gian kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành

có thể gia tăng từ 1,2 đến 1,4 lần so với đối chứng [28], [29], [20], [35]

Ở hoa lan cắt cành, GA3, abscisic acid, ABA, indole – 3 – acetic acid có ảnh

hưởng đến mức độ lâu tàn của hoa với các mức độ khác nhau phụ thuộc nổng độ sử

dụng [20] Đó cũng chính là cơ sở để tìm ra các hoạt chất có thể kết hợp với vi khuẩn

Methylobacterium để tạo ra một sản phẩm kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành có hiệu quả

cao

6

1.2 Vi khuẩn Methylobacterium

Chi Methylobacterium gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng, dinh dưỡng

methyl tùy ý (PPFM – Pink Pigmented Faculatively Methylotrophic) Chúng phân bố

rộng rãi trong tự nhiên, hiện diện trong nhiều môi trường khác nhau bao gồm: đất, đất

bùn ao hồ, nước sạch, nước mưa, không khí, bề mặt lá cây, nốt sần ở rễ thực vật, các

loại hạt giống, thực phẩm, mỹ phẩm, môi trường bệnh viện Một vài loài được tìm thấy

trên băng ở hai cực và trong miệng của bệnh nhân (chủng độc)…Đa số vi khuẩn thuộc

chi Methylobacterium có khả năng sử dụng các hợp chất một carbon như methane,

methanol, formaldehyde, formate…cũng như các hợp chất nhiều carbon làm nguồn

cung cấp năng lượng và nguồn carbon chủ yếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển

[13], [18], [23], [30], [34]

Trong giới vi sinh vật, chi Methylobacterium có vị trí phân loại như sau [18]

Giới : Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp : Alphaproteobacteria

Bộ : Rhizobiales

Họ : Methylobacteriaceae

7

Hình 0.2 Ảnh chụp vi khuẩn Methylobacterium sp từ kính hiển vi điện tử [33]

A Nhóm vi khuẩn Methylobacterium phân lập từ diệp quyển hoa đồng tiền

B Vi khuẩn Methylobacterium sp.bơi nhờ một roi đơn

C Vi khuẩn M extorquens phân lập từ căn quyển hoa đồng tiền

1.2.1 Vi khuẩn Methylobacterium trong tự nhiên

Vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các hợp chất có độc tính đối

với các sinh vật khác nên loài vi khuẩn này có khả năng tồn tại ở nhiều môi trường

khắc nghiệt khác nhau, kể cả trong môi trường chứa muối Ag+, một chất diệt khuẩn

mạnh Vi khuẩn Methylobacterium thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, do vậy chúng

8

thường được phân lập từ các nguồn nước sạch chứa oxy hòa tan và các tầng mặt nước

của ao hồ Chính vì khả năng thực hiện nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau nên

Methylobacterium giữ vai trò quan trọng trong các chu trình carbon trong tự nhiên

đồng thời tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học có giá trị [21]

Đa số các công trình nghiên cứu đều cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn

Methylobacterium sp trên bề mặt lá, thân của thực vật (như: cây Lolium perenne,

dương xỉ, Phaseolus vulgaris và gần đây là rêu Funaria hygrometrica [14], [22], [21],

[24] Khi sử dụng các phương pháp lai tại chỗ với các mẫu dò đặc trưng cho chi

Methylobacterium, đã chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium sp có hiện diện bên trong

chồi của cây Thông (Pinus sylvestris) hay nằm bên trong các bó mạch các cây họ Cam

Chanh Gần đây chúng còn được ghi nhận trên nhụy và rễ cây hướng dương [22], [31],

[33]

Hình 0.3 Vi khuẩn Methylobacterium xâm nhiễm vào cây chủ qua khí khẩu [26]

1.2.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Methylobacterium

Hầu hết các vi khuẩn chi Methylobacterium đều có sắc tố hồng, tế bào hình que

(0,8 – 1,0 µm), thường có dạng phân nhánh hoặc một số dạng bất thường khác đặc biệt

thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng tạo nên dạng kết hoa hồng

9

(rosettes) [18] Chúng có khả năng di động nhờ vào một tiêm mao ở cực hay gần cực,

tuy nhiên một số loài lại không có khả năng di động Đa số các loài vi khuẩn

Methylobacterium sp là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi Tế bào của

chúng thường chứa một lượng lớn các thể bắt màu với thuốc nhuộm sudan hay các hạt

volutin Tuy nhiên một số loài có cấu trúc thành tế bào nhiều lớp và con đường biến

dưỡng citrate đặc trưng của nhóm vi khuẩn Gram âm

Khả năng tăng trưởng của vi khuẩn Methylobacterium chậm, khuẩn lạc thường

có màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một vài chủng không tăng trưởng được trên môi

trường nutrient agar Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường glycerol – pepton (GP) agar

sau 7 ngày nuôi cấy sẽ có màu từ hồng nhạt đến đỏ cam, trong khi đó trên môi trường

Methanol Mineral Salt (MMS) agar thường có màu hồng nhạt đồng nhất Ở môi trường

nuôi cấy lắc lỏng tĩnh, vi khuẩn tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt và bám nhiều

vào thành bình lắc, điều này chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium sp hầu hết là các

chủng vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Các chủng vi khuẩn này là những vi khuẩn hóa dị

dưỡng, có khả năng tăng trưởng trên môi trường bổ sung formaldehyde (ở nồng độ

thấp), formate và methanol Tuy nhiên, cũng có một số loài sử dụng được các hợp chất

methylamine, trừ loài M organophilum là loài duy nhất có khả năng sử dụng methane

làm nguồn cung cấp carbon và năng lượng Ngoài ra, trong một vài điều kiện nuôi cấy

đặc biệt, Green và cộng sự (1992) đã đề cập đến một số loài vi khuẩn

Methylobacterium có khả năng hình thành sắc tố bacteriochlorophyll (màu hơi lục,

tương tự chlorophyll ở thực vật ) [18]

Chu trình serine là phương thức chuyển hóa các hợp chất một carbon của tất cả

các loài vi khuẩn PPFM Trong đó, sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình

tricarboxylic acid (TCA) sẽ tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho vi khuẩn sử

dụng Bên cạnh đó, các chu trình này cũng liên kết với chu trình PHB để tạo ra các sản

phẩm dự trữ cho vi khuẩn (poly – β – hydroxybutyrate) Nhiệt độ phát triển tối ưu cho

vi khuẩn Methylobacterium là 30oC trong môi trường pH trung tính Tuy nhiên một số

loài đặc biệt có thể sống ở nhiệt độ cao 37oC hoặc thấp 4oC, vẫn phát triển ở pH 4 và

10

pH 10 Trong số các loài PPFM thuộc chi Methylobacterium, loài M exorquens được

nghiên cứu nhiều nhất và được coi là vi khuẩn tiêu biểu cho chi Methylobacterium

[41]

Tất cả các loài đều không đòi hỏi nhân tố tăng trưởng và không khả năng phân

giải các hợp chất như casein, tinh bột, gelatin, cellulose, lecithin và DNA Enzyme

urease hiện diện ở tất cả các loài thế nhưng tất cả các loài đều không tạo ra các

enzyme: β – gatactosidase, L – ornithine decarboxylase, L – lysine decarboxylase, L –

arginine dihydrolase Một số loài có thể khử nitrite thành nitrate, khả năng sinh indole,

H2S, thử nghiệm methyl red và Voges – Proskauer âm tính [18]

Tất cả các loài PPFM đều mẫn cảm với kháng sinh như: kanamicin, tetracilin,

framycetin, albamycin T, gentamycin Trong đó, tetracilin có hoạt tính ức chế mạnh

đối với vi khuẩn Methylobacterium Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn cũng có thể

kháng được nhiều kháng sinh như: cephalothin, nalidixic acid, penicillin, acitracin,

carbenicillin, coslistin sulfate, polymyxin B và nitrofurantoin [18] Mặt khác một số

chủng có khả năng kháng chlorine, nên có thể hiện diện trong nước máy [21]

Methylobacterium có mối quan hệ họ hàng gần gũi với các loài vi khuẩn thuộc

chi Agrobacterium và Rhizobium, điển hình là loài Methylobacterium nodulans phân

lập từ nốt sần của các cây Crotalaria Loài vi khuẩn này không có sắc tố hồng như các

loài vi khuẩn Methylobacterium khác nhưng có trình tự 16S tương đồng với chi

Methylobacterium và có vai trò trong việc hình thành nốt sần ở rễ cây họ đậu tương tự

như vi khuẩn Rhizobium bởi sự hiện diện của các gen nod, nifH đóng vai trò tương tự

các gene cố định đạm Tuy nhiên vai trò của các gene này vẫn còn trong quá trình kiểm

tra vì có một loài Methylobacterium mới tuy có gen nifH nhưng lại không có chức năng

tạo nốt sần ở rễ cây [32], [34]

1.2.3 Sự tương tác giữa vi khuẩn Methylobacterium và thực vật

Do phân hủy pectin từ mô thực vật, những tế bào thực vật phát triển thải ra một

lượng methanol ở dạng khí Vi khuẩn PPFM thuộc chi Methylobacterium phân bố trên

11

bề mặt của lá có khả năng phát triển nhờ vào hợp chất C1 như là nguồn carbon và

nguồn năng lượng duy nhất Nghiên cứu của Kutschera (2007) cho thấy với sự xuất

hiện của vi khuẩn Methylobacterium đã kích thích sự phát triển của rêu và địa tiền Từ

đó, mô hình tương tác giữa vi khuẩn và thực vật được lập ra trong đó vi khuẩn sẽ tiêu

thụ methanol do thực vật tiết ra Tương tác giữ vi khuẩn và thực vật là một tương tác

có lợi, trung tính hoặc có hại cho quá trình quang hợp của chủng chủ tùy thuộc vào loại

vi khuẩn cộng sinh, hội sinh hay là nguồn bệnh 3

Năm 1997, Holland đã đề cập đến mối quan hệ cộng sinh cổ xưa giữa cytokinin

do vi khuẩn Methylobacterium tiết ra và thực vật bậc thấp [12], [26] Sự thay đổi về

mật độ vi khuẩn có thể do những điều kiện khác nhau trên bề mặt của cây chủ như lá,

nó được gọi là “diệp quyển” và bị ảnh hưởng bởi các nhân tố môi trường (gió, mưa,

ánh sáng mặt trời…) Phần mặt của rễ được gọi “căn quyển”, tuy nhiên đây là môi

trường ít bị thay đổi đối với vi sinh vật Vi khuẩn Methylobacterium có thể sống tự do

ở vùng diệp quyển và cả căn quyển

Hình 0.4 Tương tác giữa vi khuẩn Methylobacterium sp và cây chủ [26] Tế bào thực

vật sản xuất các sản phẩm thải (1) , đưa ra ngoài và vi khuẩn bắt lấy (2), sau đó giải

phóng các ion NH 4 + (3) Tế bào ngoại bào vi khuẩn kích thích sinh ra auxin và

cytokinin (4), đưa tín hiệu từ vi khuẩn vào tế bào thực vật (5) Các phytohormone

ngoại sinh kích thích sự phát triển của thể giao tử (6)

12

Khả năng tương tác của vi khuẩn Methylobacterium và thực vật được thể hiện

qua nhiều công trình nghiên cứu như là khả năng kích thích sinh trưởng ở cây địa tiền

trong điều kiện in vitro [16], kích thích tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô anh thảo

(Streptocarpus proxilus) [23] sinh tổng hợp vitamin B12 và kích thích sự hình thành

chồi trên cây rêu …[23], [24]

Tuy nhiên, nói đến mối quan hệ giữa vi khuẩn Methylobacterium và thực vật,

chúng ta cần đề cập đến khả năng sinh tổng hợp phytohormone của chúng Chi

Methylobacterium tận dụng nguồn cơ chất tiết ra từ thực vật và tổng hợp các chất có

hoạt tính sinh học ngoài phytohormone cung cấp lại cho cây chủ [3] Nhiều nghiên cứu

khác nhau cũng chứng tỏ không chỉ thực vật mới có khả năng tổng hợp phytohormone

mà cả vi khuẩn cũng có thể [1] Điều này thể hiện qua các cơ chế khác nhau, trong đó

có khả năng tiết auxin (indole – 3 – acetic acid, indole – 3 pyruvic acid, indole – 3 –

butyric acid), cytokinin (zeatin, trans – zeatin, trans – zeatin riboside)

Khi sử dụng các phương pháp sinh hóa và tế bào học, các nhà khoa học thấy

rằng vi khuẩn Methylobacterium nuôi trong môi trường lỏng sản sinh cytokinin và hòa

trong dịch nuôi cấy IAA (indole – 3 – acetic acid) cũng được sinh ra và giữa các chủng

Methylobacterium khác nhau nồng độ IAA sinh ra cũng khác nhau Tuy nhiên, việc bổ

sung L – Tryptophan – một tiền chất của auxin, là yêu cầu cần thiết để kích thích vi

khuẩn tiếp tục chuyển hóa indole – 3 – acetic acid [17], [22]

1.2.4 Giả thuyết về sự phân hủy tiền chất trực tiếp tổng hợp ethylene [27]

Các vi khuẩn kích thích thực vật (plant growth promoting rhizobacteria –

PGPR) có khả năng thúc đẩy sự phát triển của thực vật vì làm giảm nồng độ ethylene

Trong quá trình sinh tổng hợp ethylene, methionine được chuyển thành S-adenosyl

methionine (SAM), 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC), và ethylene trong ba

phản ứng liên tiếp nhau Chúng được xúc tác bởi enzyme SAM synthetase, ACC

synthase (ACS) và ACC oxydase (ACO) (theo thứ tự trên) Trong phản ứng thứ hai, rất

nhiều ACC được sản xuất và tiết ra từ hạt hoặc rễ thực vật cùng với các phân tử thông

thường khác hiện diện trong dịch tiết của cây và rễ ACC trong dịch tiết thực vật có thể

13

được lấy bởi vi khuẩn và sau đó được thủy phân bởi enzyme, ACC deaminase sẽ

chuyển thành ammonia và α – ketobutyrate Để duy trì sự cân bằng nồng độ ACC trong

và ngoài, nhiều ACC sẽ được thực vật tiết ra và một phần được lấy đi bởi quá trình

sinh tổng hợp ethylene Cơ chế này làm suy giảm hàm lượng ethylene sinh ra bởi thực

vật một cách hiệu quả Do đó, việc kéo dài rễ thực vật bởi PGPR có thể là một nguyên

nhân trực tiếp do sự hiện diện của ACC deaminase và nhiều bằng chứng nghiên cứu

chứng minh ACC deaminase là một trong như cơ chế then chốt của vi khuẩn rễ, kích

thích sự tăng trưởng thực vật, đặc biệt kéo dài rễ Sự hiện diện của ACC deaminase

được nghiên cứu trong nhiều PGPR khác nhau như Enterobacter cloacae, Rhizobium

và Pseudomonas, Variovorax, Alcaligenes, Bacillus… ACC deaminase trong vi khuẩn

có thể tìm thấy trên lá và hoa cũng như hạt và rễ và mô hình trên dựa trên tương tác của

vi khuẩn với hạt và rễ và có thể thích hợp đối với toàn bộ cơ thể thực vật Nghiên cứu

khả năng kích thích sự phát triển của thực vật bởi vi khuẩn Methylobacterium đã được

ghi nhận, hoạt tính ACC deaminase của chủng Methylobacterium và các bước phức tạp

khác nhau trong việc làm giảm hàm lượng ethylene đã được đề xuất trong mô hình kích

thích tăng trưởng thực vật bởi ACC deaminase của PGPR Ba trong năm chủng

Methylobacterium được tìm thấy có hoạt tính ACC deaminase Dù cho những nghiên

cứu trước đây đưa ra các dữ liệu về chuỗi hoạt động phức tạp trong quá trình làm giảm

ethylene bởi vi khuẩn chứa ACC deaminase, vai trò của IAA của của vi khuẩn trong

việc làm giảm bớt hàm lượng ethylene cần thêm nhiều nghiên cứu khác

Hoạt động và sự sinh tổng hợp Ethylene được điều chỉnh bởi các hormone khác

nhau Auxin kích thích tổng hợp Ethylene bằng cách sinh tổng hợp mới (de novo) ACC

synthase ACC, cytokinin và brassinosteroid (BR) lại làm gia tăng auxin, kích thích

thực vật sản xuất ethylene IAA và cytokinin tập trung trong dịch chiết của cây cải dầu

gia tăng khi nhiễm vi khuẩn Methylobacterium Sự gia tăng hoạt tính của ACS được

quan sát trong cây xử lý khuẩn có thể là nguyên nhân gây gia tăng hàm lượng IAA và

cytokinin Vi khuẩn trên bề mặt của thực vật cùng với IAA nội sinh của thực vật có thể

cảm ứng ACC synthase chuyển hóa SAM thành ACC và sau đó ACC được thủy phân

14

bởi enzyme ACC deaminase thành amonia và α – ketobutyrate Hai sản phẩm này sẽ

được vi khuẩn Methylobacterium giải phóng ra khỏi tế bào, làm giảm lượng ACC trong

tế bào thực vật [27]

Hình 0.5 Mô hình minh họa giả thuyết các bước phức tạp trong việc làm giảm nồng

độ ethylene thực vật và đặc tính khác của vi khuẩn Methylobacterium trong việc kích

thích tăng trưởng thực vật [27]

Mô hình được chia làm hai: con đường sinh tổng hợp ethylene trong thực vật và ACC

được phân hủy trong Methylobacterium làm suy giảm hàm lượng ethylene trong thực

vật : các bước biến đổi hóa lý trong cơ chế đó: sự gia tăng trong tích lũy các hợp chất:

sự ngăn chặn sinh tổng hợp ethylene Methylobacterium làm gia tăng hormone và tách

ACC, tiền chất trực tiếp của ethylene, ngăn chặn ethylene ức chế kéo dài rễ

Từ những bằng chứng về sự sinh tổng hợp phytohormone (auxin, cytokinin)

cũng như khả năng kiểm soát hàm lượng ethylene ở thực vật của PPFM và định hướng

về chế phẩm kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành của đề tài trước, chúng tôi tiến hành khảo sát

tiềm năng của vi khuẩn Methylobacterium trong việc tạo ra chế phẩm sinh học kéo dài

tuổi thọ hoa cắt cành

15

2.1 Thời gian & Địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2007 đến tháng 12/2009 tại trại thực nghiệm

Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - cơ sở Linh Trung

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Chủng vi sinh vật

- Chủng Methylobacterium radiotolerans H2T do Phòng thí nghiệm Công

nghệ Sinh học Thực vật và chuyển hóa Sinh học – ĐH Khoa học Tự nhiên

phân lập và định danh [5]

Hoa cắt cành

- Hoa Cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L., loại chùm và đơn) được trồng

tại công ty Báo đáp – DasaFarm - Đà Lạt Đây là loài hoa phụ thuộc

ethylene

- Hoa hồng nhung, Hoa cúc mua từ Chợ hoa Hồ Thị Kỷ Thành phố Hồ Chí

Minh,chọn hoa chưa xứ lý với các chất có tác dụng kéo dài tuổi thọ

2.2.2 Điều kiện thí nghiệm

Vận chuyển hoa

Hoa tươi được bao gói và vận chuyển về phòng thí nghiệm Trước khi được cắt

và cắm trong các nghiệm thức thì hoa được ngâm gốc trong nước máy

Cách tiến hành

Hoa được cắt bằng dao lam để vết cắt không bị dập, vị trí cắt cách cuống

khoảng 10cm đối với hoa hồng, 20cm đối với hoa cúc và cẩm chướng Tránh lấy

những phần mô đã bị hóa gỗ Sau đó đem rửa sạch cành Cắt chéo xiên thân Cắt bỏ

hết những lá gần gốc sao cho khi cắm không có lá nào chìm trong dung dịch cắm

16

Ngâm cành hoa vào trong các dịch thử nghiệm Quan sát các chỉ tiêu đánh giá hàng

ngày

Điều kiện cắm hoa: Thời gian chiếu sáng:16 giờ/ngày; Nhiệt độ: 25 ± 20C; Độ ẩm

trung bình: 75-80 %; Cường độ ánh sáng: 3000 lux

2.2.3 Môi trường

Môi trường CMS (dùng nhân sinh khối vi khuẩn Methylobacterium sp.)

CMS là môi trường khoáng Murashige – Skoog (1962) có bổ sung thêm:

2.3 Phương pháp thu nhận kết quả

2.3.1 Định lượng hàm lượng diệp lục tố [2]

Ở hoa cắt cành, bộ lá xanh, cứng không bị vàng cũng là một đặc điểm mang vẽ mỹ

quan cho cành hoa Về mặt sinh học, bộ lá còn đóng vai trò dự trữ và sinh tổng hợp

dinh dưỡng cho cành hoa Chính vì vậy, chỉ tiêu về tình trạng bộ lá trong các thí

nghiệm đóng vài trò quan trọng và chỉ tiêu hàm lượng diệp lục tố sẽ góp phần phân tích

các kết quả vệ bộ lá của cành hoa

17

Phương pháp đo đạc hàm lượng diệp lục tố như sau:

- Rửa sạch 5g lá cây, sau đó nghiền, chiết bằng acetone, rồi thu dịch sắc tố,

sau đó đo thể tích dịch lọc (bảo quản trong bình tối màu bịt giấy bạc)

- Đo OD ở các bước sóng 662 nm, 645 nm

- Dùng cuvette đối chứng bằng acetone, pha loãng mẫu 10 lần để đo OD

- Hàm lượng diệp lục tố trong 1g lá được tính theo công thức:

Ca+b= 7,05 A662 + 18,09 A645

- Hàm lượng (trong 1g lá) = Ca+b.10.V/5

- Với Ca= 11,24A662 – 2,04A645

Cb= 20,13 A645 – 4,19 A662

2.3.2 Định lượng protein tổng số

Cách tiến hành:

Chuẩn bị mẫu protein

Hòa tan vào 4ml đệm phosphate

Lọc

Tủa bằng Ethanol tỉ lệ 1:1, ly tâm

Nghiền với nước cất Cánh hoa

Dịch chiết thô

Dịch trong

Thu tủa

Dịch protein

18

Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford [2]

Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng tạo màu với Comassie (Comassie Brilliant Blue

– CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595

nm, cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp này có độ

nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài g protein/ml, nhanh và dễ thực hiện

Nguyên liệu và hóa chất:

- Dung dịch mẫu protein

- Dung dịch albumin 1mg/ml cân chính xác 10mg albumin pha trong 1ml nước

cất Lắc đều cho tan, giữ 20oC Khi dùng pha loãng 100 lần được dung dịch

albumin có nồng độ 0,1 mg/ml

- Dung dịch thuốc thử Bradford:

Coomassie Brilliant Blue (CBB) 0,001g Ethanol tuyệt đối 4,70 g

19

- Bổ sung vào 1 ống nghiệm thành phần với thể tích như sau: Nước cất: 0,8ml;

Dung dịch protein mẫu: 0,2ml; Dung dịch thuốc thử: 5ml

- Đo OD mẫu ở bước sóng 595 nm

- Dựa vào đường chuẩn ngoại suy ra nồng độ protein cần

Tổng protein = nồng độ protein x độ pha loãng x thể tích mẫu

2.3.3 Định lượng hàm lượng đường tổng số

Mục đích: khi hoa lão suy, hàm lượng đường cũng giảm theo [36] Do đó theo dõi sự

suy giảm hàm lượng đường tổng số sẽ đánh giá được độ bền của hoa

Bố trí thí nghiệm:

- Cắt cánh hoa, rửa sạch rồi nghiền nhuyễn bằng cối trong cồn 90o theo thứ tự

sau: 1-2g nguyên liệu + 10ml cồn 90o; Đun cách thủy (sôi 3 lần) rồi lọc lấy

rượu 1; Bã: cho 10ml cồn 80o (đun 2 lần, để nguội) chiết 2 lần; Bã: rửa 2, 3 lần

với cồn 80o, thu rượu 2; Rượu 1, 2 đun cách thủy đến khi vừa cạn khô; Cho

thêm 50ml nước cất → dung dịch mẫu

Dựng đường chuẩn:

- Dùng 7 bình định mức

- Cho vào các bình theo thứ tự lượng dung dịch sucrose 0.1% từ 1-7ml; Cho

nước cất cho đủ 50ml; Lấy mỗi bình 1ml, cho thêm 1ml phenol 5% và 5ml

H2SO4 đậm đặc; Để yên 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi đun cách thủy 10-20 phút

đến khi xuất hiện màu thì đo OD490nm; Dùng ống thử không bằng nước cất

Xác định hàm lượng đường và hiệu suất:

- Hút 1ml mẫu + 1ml phenol 5% + 5ml H2SO4 đậm đặc

- Đo OD490nm, suy ra nồng độ đường

Hàm lượng đường = Nồng độ x Độ pha loãng

20

2.3.4 Phương pháp đánh giá dựa trên cảm quan

Chỉ tiêu cảm quan được đánh giá theo hệ thống thang điểm của Đề tài nghiên

cứu phát triển một số chế phẩm xử lý sau thu hoạch cho hoa cắt cành, Viện khoa học

Nông nghiệp miền Nam [10]

Độ tươi của hoa:

 1 điểm: hoa héo tàn, đổi màu, bông hoa gục xuống

 3 điểm: cánh hoa bắt đầu mềm, có biểu hiện bạc màu hoặc đổi màu

nhưng chưa héo

 5 điểm: cánh cứng, rất tươi, gần như không có biểu hiện bạc màu

Độ tươi của lá:

 1 điểm: bộ lá héo không có khả năng phục hồi

 3 điểm: một vài lá bắt đầu mềm, đầu lá héo, màu lá nhạt

 5 điểm: bộ lá còn tươi, sáng màu

Tình trạng gốc:

 1 điểm: có nhiều nhớt ở gốc, dịch quanh gốc có mùi hôi

 3 điểm: có nhớt xuất hiện ở gốc, gốc bị thâm

 5 điểm: không có hoặc có rất ít nhớt xuất hiện ở gốc, dung dịch không có

mùi hôi

Tình trạng thân:

 1 điểm: thân bị thâm đen, mềm, gãy, đốt thân mềm, gãy

 3 điểm: thân bắt đầu dập một vài chỗ, đốt thân hơi mềm, thân vẫn thẳng

 5 điểm: thân vẫn xanh, đốt thân cứng, thân thẳng

Các biểu hiện không bình thường của hoa:

Mô tả khi phát hiện

21

Thời gian cắm trung bình (theo đơn vị ngày) tại thời điểm hoa biểu hiện rõ các

hiện tượng lão suy (bạc màu, vàng lá, kém tươi hoặc rũ xuống)

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 cây (8-10 bông hoa /nghiệm thức) (cẩm

chướng);

Kết quả được thống kê trên phần mềm SPSS 15.0 Trình bày dưới dạng bảng

với số liệu biểu thị: Giá trị trung bình sai số chuẩn Các số hạng trong cùng một cột

nếu có cùng mẫu tự (không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức α = 0,05), nếu khác

mẫu tự (có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức α = 0,05) Sự phân hạng được thực hiện

theo phương pháp so sánh Tukey’s b

Hình 2.1 Bảng điểm độ tươi của hoa

Hình 2.2 Bảng điểm thân và lá Cẩm chướng

22

2.3.5 Ly trích và định lượng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

 Nguyên tắc:

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có thể được trích ly nhờ sự dùng dung môi

hữu cơ metanol, etanol, acetone, chloroform…và thay đổi pH thích hợp Sau đó, sự c ô

lập các chất này được thực hiện nhờ phương pháp sắc ký

Hoạt tính của auxin (AIA), cytokinin (zeatin), giberelin (GA3) và Acid abscisic

xác định thông qua sinh trắc nghiệm

 Vật liệu:

 Vật liệu li trích, hột xà lát, hột dưa chuột

 Hóa chất: Eter etylic, Metanol, Acid acetic, NaHCO3 8%, HCl 1%,

80%

Cô cạn Dịch tan trong nước (1ml)

Chỉnh pH 2,5 bằng HCl 1N,

Pha ether (dịch trích ở

pha acid) trích ở pha trung tính) Pha n-butanol (dịch

Định lượng auxin, acid

abcisic, gibberelin Định lượng cytokinin

Rửa bằng NaHCO 3 8%

NNaHCO

Chỉnh pH 7 bằng NaOH 1N Lóng với n-butanol bão hòa (3 lần) Rửa bằng NaHCO 3 8%

23

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Ly trích được

thực hiện trong phòng tối với ánh sáng đỏ, có quạt hút không khí [7]

 Định lượng auxin thô bằng phương pháp so màu [15]:

Dựng đường tương quan giữa nồng độ IAA (mg/l) và OD530nm

Chuẩn bị 6 ống nghiệm và cho vào mỗi ống các chất theo bảng sau:

Bảng 2.2 Khảo sát sự tương quan giữa OD 530nm và nồng độ IAA (mg/l)

Chú thích: ODi : giá trị OD530nm ở nồng độ IAA là i

ODo : giá trị ODcủa nước cất

- Các ống nghiệm được lắc đều, ủ tối trong vòng 1 giờ Sau đó

đem đi đo OD ở bước sóng 530nm

- Tính kết quả: ODchuẩn = ODi – ODo

IAA

Định lượng nồng độ IAA trong mẫu :

Tiến hành bổ sung vào ống nghiệm các thành phần sau:

- Auxin trích ly được, pha loãng với nước cất: 5ml

- Thuốc thử Salkowski : 3ml

Các ống nghiệm được lắc đều, ủ tối trong 1 giờ để auxin phản ứng với thuốc thử

Salkowski Sau đó đem đo OD ở bước sóng 530nm

Tính kết quả: OD = ODmẫu - ODo , dựa vào đường tương quan giữa nồng độ IAA

chuẩn và giá trị OD530nm , suy ra nồng độ auxin có trong dịch nuôi cấy

 Xác định hoạt tính cytokinin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm

trên tử diệp dưa chuột [7]

Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa

24

Chọn những hạt dưa chuột có kích thước đều nhau, rửa sạch, ngâm trong 1 giờ

Sau đó đặt hạt vào đĩa petri có lót giấy thấm nước, ủ tối trong vòng 24 giờ

Khi rễ mầm vừa nhú ra khỏi vỏ hạt khoảng 2-5 mm, lấy ra, lột vỏ cứng và lớp

vỏ lụa, tránh làm tổn thương tử diệp

Dùng giấy thấm quấn quanh lam, đặt vào trong đĩa petri, mỗi đĩa 1 lam

Cân 5 mảnh tử diệp (sau khi được thấm khô cẩn thận trên giấy thấm) bằng cân phân

tích Đặt 5 mảnh tử diệp lên lame mặt trong của tử diệp úp xuống, vào mỗi hộp petri

Nhỏ 10ml dung dịch BA có các nồng độ khác nhau từ 0-1 mg/l Các hộp petri được đặt

ở phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục với cường độ 300 lux, nhiệt độ 28 ± 20C, ẩm

độ ≥ 85% Sau 2 ngày, thu tử diệp, thấm khô và cân lại để xác định sự sai biệt trọng

lượng trước và sau khi thí nghiệm Dựng đường tương quang tuyến tính giữa độ sai

biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột ∆m (g) với nồng độ BA (mg/l)

Định lượng cytokinin trong mẫu:

Tiến hành sinh trắc nghiệm trên ở trên tử diệp dưa chuột tương tự như thí

nghiệm dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa

chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l), nhưng thay dung dịch BA bằng 10ml dung dịch

cytokinin trích từ hoa cẩm chướng và một mẫu thay bằng nước cất để làm đối chứng

Dựa vào đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa

chuột ∆m (g) và nồng độ BA (mg/l), suy ra lượng cytokinin trong hoa

 Xác định hoạt tính Gibberellin thô bằng phương pháp sinh trắc

nghiệm trên hạt xà lách [7]

Hạt xà lách, rửa sạch và ngâm trong nước 1 giờ Hạt được gieo vào hộp petri với

giấy thấm ẩm, trong tối Sau 24h, khi rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ, đặt 10 hạt xà lách

vừa nãy mầm vào các erlen (mẫu, GA3 tinh khiết 10mg/l, nước cất), ( chú ý đừng để

các hạt này ngập chìm trong dung dịch) Bao phủ becher bằng giấy parafin và đặt vào

trong phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục với cường độ 3000 lux, nhiệt độ 28 ±

20C, ẩm độ ≥ 85 % Sau 72 giờ, đo chiều cao của trụ hạ diệp cây mầm xà lách bằng

thước mm (tính từ gốc đến bên dưới tử diệp) Sự sai biệt về chiều cao trụ hạ diệp trong