nghiên cứu một số công thức phối hợp cao dược liệu có tác dụng giảm cân

2 LỜI GIỚI THIỆU Chè xanh và Sen đã được sử dụng trong nhiều bài thuốc giảm cân, chống béo phì.. Đề tài nghiên cứu phối hợp cao chiết xuất từ hai dược liệu trên vào thức ăn với tỷ lệ ca

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

X * W

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU MỘT CÔNG THỨC PHỐI HỢP CAO DƯỢC LIỆU

CÓ TÁC DỤNG GIẢM CÂN

Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

2

LỜI GIỚI THIỆU

Chè xanh và Sen đã được sử dụng trong nhiều bài thuốc giảm cân, chống béo phì Tuy nhiên, độc tính và tác dụng giảm cân khi phối hợp hai dược liệu này vẫn chưa được nghiên cứu Đề tài nghiên cứu phối hợp cao chiết xuất từ hai dược liệu trên vào thức ăn với tỷ lệ cao chiết 3% (CTa), 5% (CTb) và nghiên cứu tác dụng giảm cân của hai công thức này trên chuột nhắt với chế ăn độ

giàu chất béo (HF) Chuột Swiss albino đực trở nên béo phì sau 4 tuần cho ăn

thức ăn giàu chất béo so với nhóm chuột cho ăn thức ăn thường Sau 9 tuần thử nghiệm, chuột được cho ăn theo CTa và CTb giảm cân đáng kể so với chuột ăn thức ăn giàu chất béo Kết quả nghiên cứu cho thấy hai công thức này không biểu hiện độc tính cấp ngay khi dùng liều 6g/kg (liều cao nhất có thể cho chuột uống) và CTa, CTb có tác dụng giảm cân và chống béo phì

INTRODUCTION

Camellia sinensis and Nelumbo nucifera have been mentioned to be beneficial

for the suppression of obesity However, the effect and toxicity of a combination of these plants still remain unclear In this study, formula a (CTa) and b (CTb) were prepared from extracts of above-mentioned plants Anti-obesity effects of these two formulae were investigated in the mice fed

on a high-fat (HF) diet Male Swiss albino mice became obese by feeding the

HF diet over 4 weeks compared to normal diet group Mice fed on HF containing 3% (CTa) and 5% (CTb) gained significantly less body weight than that of control animal fed on HF diet alone during a 9-week experimental period Acute toxicity study of these formulae revealed normal behaviour and

no mice was dead even at 6g/kg (highest dose that could be administered through oral route for mice) Our results suggest that CTa may be useful in the treatment of obesity and related disorders as anti-obesity agents

3

MỤC LỤC

MỤC LỤC 3

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH SÁCH BẢNG 5

DANH SÁCH HÌNH 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 8

1.1.TỔNGQUANVỀTHỪACÂNVÀBỆNHBÉOPHÌ 8

1.2.TỔNGQUANVỀCHÈXANHVÀLÁSEN 11

1.3.PHƯƠNGPHÁPXÁCĐỊNHĐỘCTÍNHCẤP 19

1.4.CÁCMÔHÌNHTHỬTÁCDỤNGCHỐNGBÉOPHÌ 21

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1.NGUYÊNVẬTLIỆU 24

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1.KIỂMNGHIỆMDƯỢCLIỆU 36

3.2.KẾTQUẢCHIẾTXUẤTVÀTIÊUCHUẨNHÓACAO 47

3.3.THỬNGHIỆMĐỘCTÍNHCẤPCỦACÔNGTHỨCPHỐIHỢPCAO DƯỢCLIỆUTRÊNCHUỘT 57

3.4.THỬNGHIỆMTÁCDỤNGGIẢMCÂNCỦACÔNGTHỨCPHỐI HỢPCAODƯỢCLIỆUTRÊNCHUỘT 59

3.5 KẾTQUẢTHỬNGHIỆMĐỘCTÍNHBÁNTRƯỜNGDIỄN 65

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

4

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NICE Nation Institute of Clinical Excellence

HF High-fat

TT Thuốc thử

5

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Các hành vi của chuột cần chú ý trong thời gian theo dõi 30

Bảng 2.2 Thành phần của 100 g thức ăn chuột 32

Bảng 3.1 Dự thảo tiêu chuẩn lá Chè xanh 40

Bảng 3.2 Độ ẩm của lá Sen 44

Bảng 3.3 Tỷ lệ tạp chất của lá Sen 44

Bảng 3.4 Tỷ lệ vụn nát của lá Sen 44

Bảng 3.5 Hàm lượng alkaloid toàn phần của lá Sen 46

Bảng 3.6 Kết quả chiết xuất của các dược liệu 47

Bảng 3.7 Độ tan trong nước của cao Chè xanh và lá Sen 49

Bảng 3.8 Độ tan trong EtOH 96% của cao Chè xanh và lá Sen 49

Bảng 3.9 Độ ẩm của cao Chè xanh và lá Sen 50

Bảng 3.10 Độ tro toàn phần của cao Chè xanh và lá Sen 50

Bảng 3.11 Tro không tan trong HCl của cao Chè xanh và lá Sen 50

Bảng 3.12 Hàm lượng tannin trong cao Chè xanh 53

Bảng 3.13 Hàm lượng tannin và alkaloid trong cao lá Sen 54

Bảng 3.14 Dự thảo tiêu chuẩn cao Chè xanh 55

Bảng 3.15 Dự thảo tiêu chuẩn cao lá Sen 56

Bảng 3 16 Kết quả thử nghiệm độc tính cấp đường uống 57

Bảng 3.17 Theo dõi cân nặng chuột nhóm 1 59

Bảng 3.18 Theo dõi cân nặng chuột nhóm 2 60

Bảng 3.19 Theo dõi cân nặng chuột nhóm 3 60

Bảng 3.20 Theo dõi cân nặng chuột nhóm 4 61

Bảng 3.21 Theo dõi cân nặng chuột nhóm 5 61

Bảng 3.22 Khối lượng trung bình của các nhóm chuột thử nghiệm 62

6

Bảng 3.23 Thể trọng chuột trong thử nghiệm độc tính mãn 66Bảng 3.24 Đánh giá chức năng gan khi sử dụng cao dược liệu 66Bảng 3.25 Đánh giá chức năng thận khi sử dụng cao dược liệu 67Bảng 3.26 Đánh giá ảnh hưởng của cao dược liệu đến thông số triglycerid 68Bảng 3.27 Đánh giá ảnh hưởng của cao dược liệu lên thông số bạch cầu 68Bảng 3.28 Đánh giá ảnh hưởng của cao dược liệu lên thông số hồng cầu 69Bảng 3.29 Đánh giá ảnh hưởng của cao dược liệu lên thông số của tiểu cầu 70

7

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Dược liệu Chè xanh 11

Hình 1.2 Dược liệu Sen 16

Hình 2.1 Chuột được nuôi trong lồng với đầy đủ thức ăn và nước uống 24

Hình 2.2 Dụng cụ đun hồi lưu (a) và máy cô quay chân không (b) 25

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu Chè xanh 26

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu lá Sen 27

Hình 3.1 Lá Chè xanh 36

Hình 3.2 Vi phẫu phiến lá Chè xanh 37

Hình 3.3 Các thành phần trong vi phẫu phiến lá Chè xanh 37

Hình 3.4 Các cấu tử soi bột lá Chè xanh 38

Hình 3.5 Lá Sen khô 41

Hình 3.6 Vi phẫu lá Sen 42

Hình 3.7 Các thành phần trong vi phẫu lá Sen 42

Hình 3.8 Các cấu tử soi bột lá Sen 43

Hình 3.9 Cao Chè xanh 48

Hình 3.10 Cao lá Sen 48

Hình 3.11 Sắc ký lớp mỏng của cao Chè xanh (a) và lá Sen (b) 52

Hình 3.12 Vi phẫu gan một mẫu đại diện của lô chứng và lô thử 71

Hình 3.13 Vi phẫu thận một mẫu đại diện của lô chứng và lô thử 72

8

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ THỪA CÂN VÀ BỆNH BÉO PHÌ

Thừa cân và béo phì là những rối loạn dinh dưỡng thường gặp ở các quốc gia trên toàn thế giới Vấn đề này làm cho chất lượng cuộc sống của người bệnh

bị giảm sút và tạo gánh nặng khổng lồ trên hệ thống chăm sóc sức khỏe [7,14] Nhiều bằng chứng cho thấy thừa cân và béo phì có liên quan mật thiết đến nguy cơ mắc phải các bệnh mạch vành, loạn lipid huyết, không dung nạp glucose, kháng insulin và tăng huyết áp [7,17,20] Do đó, nhiều quốc gia đã xem chương trình phòng chống thừa cân và béo phì là biện pháp cơ bản để phòng ngừa các bệnh nói trên

Một người gọi là béo phì khi có BMI ≥ 25 đối với người Châu Á, hay BMI ≥

30 đối với người Châu Âu (Chỉ số BMI được tính bằng cân nặng (kg) chia bình phương chiều cao (m2)) [7,22] Hiện nay, ở Việt Nam nói riêng và trên toàn thế giới nói chung, tỷ lệ người thừa cân và béo phì đang tăng nhanh đến tốc độ báo động Trên thế giới, hiện nay có khoảng 1 tỷ người thừa cân và hơn 300 triệu người béo phì Tỷ lệ béo phì tăng từ 10 – 40% trên hầu hết các quốc gia ở Châu Âu trong suốt thập kỷ qua [7,20] Sự tăng trưởng kinh tế, tốc

độ đô thị hóa, sự thay đổi lối sống,…đang làm tỷ lệ thừa cân và béo phì tăng lên nhanh chóng bởi những nguyên nhân sau :

+ Công nghiệp hóa, đô thị hóa và cuộc cách mạng công nghệ đã mang lại nhiều thuận tiện cho con người, làm giảm tiêu thụ năng lượng cần thiết cho sinh họat hằng ngày Tuy nhiên, những những thuận tiện này lại làm mất đi điều kiện họat động thể lực

Một số phương pháp hiện đang được sử dụng để quản lý và điều trị thừa cân

và béo phì gồm: chế độ ăn, họat động thể lực, sử dụng thuốc và phẫu thuật Việc giảm cân đem lại các lợi ích:

+ Giảm nguy cơ tử vong và bệnh tật kết hợp với béo phì Nhiều nghiên cứu cho thấy giảm 10 kg cân nặng dẫn tới:

Giảm 20 – 25% tỷ lệ tử vong chung Giảm 30 – 40% tỷ lệ tử vong liên quan đến đái tháo đường Giảm 40 – 50% tỷ lệ tử vong do ung thư liên quan đến béo phì + Việc giảm nhẹ từ 5 – 10% cân nặng so với trước can thiệp góp phần cải thiện các rối loạn sức khỏe đi kèm như đái tháo đường tuýp 2, tăng huyết áp, bệnh tim mạch và kéo dài tuổi thọ [7,19]

Hiện nay, loại thuốc được cả FDA và NICE công nhận dùng để điều trị béo phì trong thời gian dài là orlistat (Xenical) và sibutramin (Reductil, Meridia) Ngoài ra, còn có rimonabant (Acomplia) đang được FDA xem xét để sớm đưa

ra thị trường Các thuốc này cho phép duy trì giảm cân khoảng 10% trong 1 –

2 năm Tuy nhiên, nhiều tác dung phụ đã được ghi nhận và thường làm bệnh nhân ngừng sử dụng thuốc và không hợp tác điều trị [17,20,22]

Trong khi đó, Chè xanh và lá Sen đã được sử dụng trong rất nhiều bài thuốc giảm cân cổ truyền Dịch chiết từ lá Sen có tác dụng ngăn cản hoạt động của

10

α – amylase và lipase, làm giảm hấp thu lipid và tăng chuyển hóa lipid, điều hòa sự tiêu thụ năng lượng [25] Chè xanh giúp tăng cường năng lực phân giải

mỡ thừa và thúc đẩy phản ứng oxy hoá của mỡ, làm tăng sử dụng năng lượng

và giúp giảm cân Các catechin trong Chè xanh có khả năng ức chế hoạt động của các men phân giải mỡ của dạ dày và tuyến tụy, do đó giảm sự nhũ hoá, phân giải và hấp thu chất béo Cafein trong Chè có thể tăng cường hoạt động của các polyphenol trên tác dụng kiểm soát cân nặng và tích luỹ năng lượng [12,23] Với những tác dụng trên Chè xanh và lá Sen đã và đang được sử dụng rộng rãi để điều trị thừa cân và béo phì ở nhiều quốc gia trên thế giới [12,23,24, 25]

Tuy nhiên, tác dụng chống béo phì của các dược liệu này chỉ được nghiên cứu khi dùng riêng lẻ Việc phối hợp các cao chiết dược liệu duy trì tác dụng chống béo phì và giảm độc tính thì chưa được nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần giải quyết một vấn đề xã hội - y tế ngày càng phát triển, giúp ngăn ngừa các bệnh nguy hiểm (đái tháo đường, bệnh mạch vành, cao huyết áp, cao lipid máu, thấp khớp…) trong cộng đồng, góp phần nâng cao năng suất lao động xã hội do giảm số người béo phì, tiết kiệm ngoại tệ nhập khẩu thuốc trị béo phì Hơn nữa, đề tài thành công sẽ góp phần nâng cao khả năng sử dụng nguồn dược liệu, thế mạnh của đất nước, trong việc bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ cộng đồng

Chè - Camellia sinensis (L.) O Kuntze

Tên đồng nghĩa: Thea sinensis L.T.chinensis Seem

Tên khác: trà, mạy chà (Tày)

Tên nước ngoài: Tea plant (Anh), arbre à thé, théier (Pháp)

Mô tả

Cây nhỡ, thường xanh, cao 1 – 6 m Lá mọc so le hình trái xoan, dài 4 – 10

cm, rộng 2 – 2,5 cm, có mũi ở đỉnh Phiến lá lúc non có lông mịn, khi già thì dày, bóng, mép khía răng cưa rất đều Hoa to với 5 – 6 cánh màu trắng mọc riêng lẻ ở nách lá, có mùi thơm, nhiều nhị Quả nang thường có 3 van, chứa mỗi ô một hạt gần tròn, đôi khi nhăn nheo Quả mở bằng lối cắt ngăn, hạt không có phôi nhũ, lá mầm lớn, có chứa dầu

Hoa tháng 9 – 10, quả tháng 11 – 3

Hình 1.1 Dược liệu Chè xanh

Nơi trồng và thu hái

Gốc ở Bắc Bộ và nam Trung Quốc, được truyền sang Myanma, Thái Lan, Việt Nam Chè được trồng ở khắp nơi trên nước ta, tập trung nhiều ở Vĩnh Phú, Hà Giang, Bắc Thái, Quảng Nam, Đà Nẵng đến Đắc Lắc, Lâm Đồng Cây ưa khí hậu ẩm, đất chua và cần được che bóng ở một mức độ nhất định

để đảm bảo hương thơm Chè thường được thu hái vào mùa xuân, khi bẻ cả cành lá nấu nước uống gọi là Chè xanh hoặc hái búp và lá non vò rồi sao để làm Chè hương pha nước uống gọi là trà Nếu cho lên men mới sấy khô làm Chè mạn hay chế thành Chè đen

Thành phần hoá học

Thành phần hóa học của Chè phụ thuộc vào tuổi và giống Chè, điều kiện đất đai, địa hình, kỹ thuật canh tác, mùa thu hoạch,… Búp Chè gồm:

Nước: 75 – 82 %

Tannin: là hỗn hợp catechin (30 – 35 %) Theo kết quả nghiên cứu Chè ở

nước ta: lá thứ nhất có 37,77 %, lá thứ hai có 34,74%, lá thứ ba có 30,77% tannin Các polyphenol gồm acid gallic: epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epigallocatechin gallate (EGCg), epicatechin gallate (ECg),…, là thành phần chủ yếu bị biến đổi trong quá trình chế biến Chè đen

13

Alkaloid: Cafein là alkaloid chính (2,5 – 4,5%) Trong lá thứ nhất: 3,39%, lá

thứ hai: 4,20%, lá thứ ba: 3,4%, lá thứ tư: 2,10% Ngoài ra, còn có lượng rất nhỏ theophyllin (0,02 – 0,04%), theobromin (0,05%), adenin và xanthin

Protein và acid amin: Protein thường kết hợp với tannin Trong Chè người ta

đã tìm thấy có 17 acid amin Các acid amin này kết hợp với đường và tannin tạo ra andehyd có mùi thơm của Chè đen và làm cho Chè xanh có dư vị tốt

Glucid và pectin

Flavonoid: kaemferol, quercetrin, myricetin…

Dầu thơm: 0,007 – 0,009% trong lá tươi, chủ yếu là α, ß hexenal; ß, γ hexenol

và các aldehyd

Vitamin A, B1, B2, PP và nhiều nhất là vitamin C

Ngoài ra, còn có các men (amylase, glucosidase, protease, perotease, peroxidase và poly-phenoloxidase…) và các muối vô cơ

Trong nụ Chè có cafein (2 – 2,5%), nước (10%), muối vô cơ và các men

Tác dụng dược lý

Catechin trong Chè xanh có tác dụng ngăn cản hoạt động của dịch tụy và dịch ruột, ngăn tích lũy mỡ, kích thích sự sinh nhiệt và oxy hóa chất béo do đó, tăng tiêu hao năng lượng và chất béo trong cơ thể, kể cả năng lượng rút ra từ lớp mỡ dư ở người Ngoài ra, catechin còn làm giảm lượng triglycerol và cholesterol toàn phần trong cơ thể

Chống đái tháo đường: Dùng Chè với liều 10 g/kg và dùng Alloxan (gây

thoái hóa tế bào tụy và hoại tử đảo tụy) thì đường huyết không tăng

14

Tác dụng trên vitamin B: Tăng chuyển thiamin thành thiamin pyrophosphate

nên làm giảm lượng thiamin trong cơ thể, do đó nên dùng thêm 10 mg thiamin để giải quyết tình trạng thiếu thiamin khi dùng Chè thường xuyên

Tăng tiêu hao năng lượng và chất béo: Catechin trong Chè xanh có tác dụng

ngăn cản hoạt động của dịch tụy và dịch ruột, ngăn tích lũy mỡ, kích thích sự sinh nhiệt và oxy hóa chất béo Nó còn làm giảm mức độ triglycerol và cholesterol toàn phần trong cơ thể [12,23,24]

Chống oxy hóa: Hoạt lực của hai catechin (epicatechin và epigallocatechin)

và ba flavonoid (kaemferol, quercetrin, myricetin) trong Chè mạnh hơn vitamin E từ 1,3 – 32 lần

Tannin trong Chè còn có tác dụng săn se niêm mạc, dẫn đến giảm hấp thu nhiều chất như Fe, Ca,…và dễ dẫn đến táo bón Người ta lợi dụng tính chất này để chữa tiêu chảy

Cafein, theophyllin và theobromin trong Chè có tác dụng kích thích thần kinh, kích thích não, tăng cường sức làm việc của trí óc và cơ, tăng hô hấp, tăng cường và điều hòa nhịp tim, lợi tiểu và kích thích ăn ngon

Hàm lượng fluor khá cao trong Chè tốt cho răng, Chè tươi có vitamin C cao giúp cơ thể tăng sức đề kháng, một số chất có tác dụng của vitamin P (flavonol và polyphenol), giúp bền thành mạch

Công dụng

Dùng trong các trường hợp: tinh thần mệt mỏi, ngủ nhiều, đau đầu, mắt mờ, sốt khát nước, tiểu tiện không lợi, ngộ độc rượu, béo phì Thường dùng lá Chè tươi nấu nước uống hay dùng Chè khô hãm nước sôi uống

Dùng ngoài nấu nước rửa vết thương bỏng hay lở loét thì chóng lên da non

15

Các bài thuốc có Chè

Chữa phù thủng: dùng Chè tươi 300 g, nấu nước uống, ngày 2 – 3 lần

Chữa tiêu chảy hay đi lỵ: dùng búp Chè, búp ổi, mỗi thứ một nắm, sao vàng

sắc uống hoặc nhai một nắm Chè hương khô

Chữa bỏng: nấu nước Chè đặc, dội vào vết bỏng rồi rửa sạch, lấy lòng trắng

Sen – Nelumbo nucifera

Tên đồng nghĩa: Nelumbium nelumbo (L.) Druce, N speciosum Willd

Tên khác: Liên, ngậu (Tày), bó bua (Thái), lùi ngó (Dao)

Tên nước ngoài: Sacred lotus, chinese water – lily, indian lotus, egyptian bean, baladi bean (Anh), lotussacré, nélumbo (Pháp)…

Mô tả

Cây thảo, sống ở nước, to khoẻ, cao hơn 1 m Thân rễ (ngó Sen) mập, mọc bò dài trong bùn, bén rễ ở những mấu, từ đó mọc lên thân và lá Lá hình tròn vượt lên khỏi mặt nước, đường kính 30 – 40 cm, màu lục xám, mép nguyên, lượn sóng, giữa lá thường trũng xuống, mặt sau đôi khi điểm những đốm màu tía, gân hình khiên, hằn rõ Cuống lá đính ở giữa lá, dài 1 m hay hơn, có nhiều gai cứng nhọn

16

Hình 1.2 Dược liệu Sen Hoa to, mọc riêng rẽ trên cuống dài và thẳng, phủ đầy gai nhọn, đường kính 8 – 12 cm, màu hồng, hồng đỏ hay trắng, có 3 – 5 lá đài, màu lục nhạt, rụng sớm Cánh hoa nhiều, những cánh ở ngoài to, khum lòng máng, những cánh giữa và trong nhỏ hẹp dần, giữa cánh hoa và nhị có những dạng chuyển tiếp Nhị rất dài, màu vàng, chỉ nhị mảnh, có phần phụ (gạo Sen) màu trắng và thơm Bộ nhụy gồm nhiều lá noãn rời nằm trên một đế hoa hình nón ngược (gương Sen)

Quả bế có núm nhọn, thường gọi là hạt Sen, phần ngoài mỏng và cứng có màu lục tía, phần giữa mềm chứa tinh bột màu trắng ngà và phần trong là mầm dày, màu lục sẫm

Mùa hoa tháng 5 – 6, mùa quả tháng 7 – 9

Bộ phận dùng

Lá Sen thu hái vào mùa thu, bỏ cuống (dùng lá Sen khô)

Hạt còn màng đỏ bên ngoài (liên nhục)

Quả thu hái khi chín (liên thạch)

17

Tâm Sen là cây mầm trong hạt Sen (liên tâm)

Gương Sen đã lấy quả (liên phòng)

Tua Sen bỏ hạt gạo ở đầu (liên tu)

Lá Sen thu hái vào mùa thu, bỏ cuống (liên diệp)

Thân rễ (liên ngẫu)

Nơi trồng và thu hái

Cây của miền Malaysia và vùng đông dương Mọc hoang và cũng được trồng nhiều, thu hái các bộ phận của cây quanh năm

Thành phần hóa học

Lá Sen chứa alkaloid (0,77 – 0,84%), gồm nuciferin, nornuciferin, roemetin, anonain, liriodenin, pronuciferin, o – nornuciferin, armeparin, N – norarmeparin, methyloclaurin, nepherin, dehydroemerin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N – methylisococlaurin, trong đó nuciferin là alkaloid chính Ngoài ra còn có quercetin, isoquercetin, leucocyanidin, leucodelphinidin nelumbosid, tannin, vitamin C và acid hữu cơ

Tác dụng dược lý

Lá Sen có tác dụng ngăn cản hoạt động của α – amylase và lypase, làm giảm hấp thu lipid và carbohydrat, tăng chuyển hóa lipid, điều hòa lên sự tiêu thụ năng lượng, do đó, có tác dụng chống béo phì [25]

Các nghiên cứu trên Sen ở Việt Nam cho kết quả: dịch chiết và alkaloid toàn

phần của lá Sen có tác dụng an thần, tăng trương lực và co bóp cơ tử cung thỏ, chống co thắt cơ trơn ruột gây ra bởi histamin và acetylcholin Lá Sen có tác dụng chống choáng phản vệ, tác dụng an thần của lá Sen mạnh hơn tâm

18

Sen Lá Sen có tác dụng bảo vệ đối với các loạn nhịp tim Cao cồn có tác dụng mạnh hơn cao nước, cơ chế là do tăng ngưỡng kích thích tâm trương và giai đoạn trơ của tâm nhĩ và tâm thất LD50 của cao lá Sen tiêm phúc mạc trên chuột nhắt trắng là 17 mg/kg thể trọng Alkaloid toàn phần của lá Sen có tác dụng ức chế loạn nhịp tim thực nghiệm, tác dụng này có phần tốt hơn cả ajmalin

Nuciferin có tác dụng an thần kéo dài giấc ngủ gây bởi pentobarbital trên chuột nhắt trắng Trên điện não, có tác dụng tăng cường quá trình ức chế trong các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác vận động và thể lưới thân não (tăng thành phần sóng chậm delta và giảm thành phần sóng nhanh beta)

Trong thử nghiệm invivo, flavonoid toàn phần của lá Sen có khả năng ức chế

quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan chuột nhắt trắng một cách rõ rệt

Công dụng

Lá Sen chữa chảy máu (đại, tiểu tiện ra máu, chảy máu chân răng, xuất huyết dưới da), ngày dùng 15 – 20 g, dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán

Lá Sen được dùng để giảm cân và chữa béo phì

Ở Trung Quốc, lá Sen chủ trị tức ngực có nóng sốt, tiểu tiện ít, đỏ, ho ra máu, kinh nguyệt nhiều, dùng ngoài chữa dị ứng với sơn (sắc nước rửa)

Bài thuốc chứa lá Sen

An thần gây ngủ

Viên nén lá Sen: cao mềm lá Sen 0,03 g, bột mịn lá Sen 0,09 g, tá dược làm thành 1 viên, uống 3 – 6 viên 3 giờ trước khi đi ngủ

19

Siro lá Sen gồm: cao mềm lá Sen 4 g, cồn 45% 20 ml, siro đơn vừa đủ

1000 ml

Chữa máu hôi không hết sau sinh

Lá Sen sao thơm, tán nhỏ, uống với nước hay đồng tiện, hoặc lá Sen sắc uống ngày 20 – 30 g

Chữa sốt xuất huyết

Lá Sen, ngó Sen (hoặc cỏ nhọ nồi), Rau má, mỗi vị 30 g, bông Mã đề 20 g Nếu có xuất huyết tăng thêm lá, ngó Sen lên 40 – 50 g, sắc uống ngày 1 thang

Chữa xuất huyết não và các biến chứng kèm theo ở bệnh nhân tăng huyết áp:

Lá Sen, Cam thảo, mỗi vị 15,5 g, Đỗ trọng 12,5 g, Sinh địa, Mạch môn, Tang

kí sinh, Bạch thược, mỗi vị 10 g Sắc uống, ngày 1 thang, tác dụng làm hạ huyết áp, chức năng nói và cử động các chi được cải thiện

LD50 là thông số quan trọng để đánh giá độc tính của một loại thuốc Từ LD50

có thể suy ra liều dùng cho những thử nghiệm dược lý kế tiếp

20

1.3.1 NGUYÊN TẮC

Chuột nhắt được chia thành các nhóm giống nhau Những chuột ở cùng nhóm

sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát nhưng các liều này sẽ thay đổi theo từng nhóm chuột Sự đánh giá kết quả dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm

1.3.2 QUAN SÁT VÀ GHI NHẬN KẾT QUẢ

Ghi nhận các biểu hiện độc và mức độ nghiêm trọng: sự xuất hiện độc tính, tiến triển và phục hồi hoặc chết qua từng thời gian của từng nhóm

Thời gian theo dõi là thời gian mà động vật thí nghiệm còn có biểu hiện độc

và chết do thuốc gây nên Thông thường nếu uống cần thời gian là 72 giờ Các con vật chết trong thời gian quan sát, phải mổ xác xem chết do nguyên nhân gì Những con vật còn sống sau thời gian theo dõi cũng nên mổ để xem các phủ tạng và cơ quan trong cơ thể có những thay đổi bất thường gì không 1.3.3 TRƯỜNG HỢP KHÔNG THỂ XÁC ĐỊNH LD50

Về nguyên tắc, khi nói đến xác định độc tính cấp là phải xác định LD50 Tuy nhiên cũng có những trường hợp không xác định LD50 Có nhiều thuốc cho uống với liều rất cao mà con vật không chết Một con chuột nhắt, chỉ có thể cho uống với thể tích tối đa một lần là 1ml Cao dược liệu chỉ có thể cô đến một mức độ nào đó, nếu cô quá sẽ thành cao đặc và không thể qua kim để cho uống được Kết quả có thể gặp hai trường hợp:

Trường hợp 1

Đã thử đến liều có động vật thí nghiệm chết, nhưng không có liều nào đạt mức độ gây chết 100% hoặc gần 100% Khi đó, tuy không xác định được

21

LD50, nhưng ta vẫn xác định được liều tối đa mà không có con vật nào chết, gọi là liều dưới liều chết (infralethal dose) và được ký hiệu là LD0 Trong nghiên cứu, để xác định LD50 thì thông thường gấp 2-3 lần LD0 Vì vậy liều tương đối an toàn Ds dùng cho thực nghiệm dược lý ban đầu được lấy giá trị 1/5 LD0 (nếu xác định được LD50 thì liều Ds bằng 1/10 LD50)

Trường hợp 2

Tất cả các liều thử nghiệm đều không có con vật nào chết, thì liều lớn nhất đã thử Dmax chưa chắc là liều LD50 và liều tương đối an toàn Ds dùng cho thực nghiệm dược lý ban đầu có thể bằng 1/5 Dmax hoặc lớn hơn Dmax là tùy theo kinh nghiệm của nhà nghiên cứu dược lý

1.4 CÁC MÔ HÌNH THỬ TÁC DỤNG CHỐNG BÉO PHÌ [15]

Để thử tác dụng các thuốc điều trị tăng cân và béo phì, một số phương pháp

đã được xây dựng với các mô hình sau:

1.4.1 GÂY BÉO PHÌ BẰNG THỨC ĂN

Béo phì được gây ra trên chuột bởi chế độ ăn chứa dầu bắp và sữa đặc Chuột được chia thành 2 nhóm: một nhóm cho ăn thức ăn bình thường, nhóm còn lại cho ăn thức ăn thường thêm vào dầu bắp và sữa đặc Chất thử nghiệm được dùng bằng cách cho chuột ăn, uống, hay tiêm phúc mô Trọng lượng chuột và khối lượng thức ăn được ghi nhận và thay thức ăn mới mỗi 3 – 4 ngày

1.4.2 GÂY BÉO PHÌ BẰNG TỔN THƯƠNG VÙNG DƯỚI ĐỒI

Sự ăn nhiều quá mức ở chuột được quan sát thấy sau khi có tổn thương vùng dưới đồi Chuột được nuôi 5 – 9 ngày để thích nghi với ăn thức ăn béo, sau đó cho nhịn đói qua đêm, bị rạch gây tổn thương vùng dưới đồi Sau phẫu thuật,

22

tất cả những chuột này ăn nhiều quá mức và trở nên béo phì so với nhóm chứng

1.4.3 GÂY BÉO PHÌ BẰNG GOLD-THIOGLUCOSE

Tiêm phúc mô hay tiêm bắp gold-thioglucose sẽ gây béo phì ở chuột Tác động này là do sự phá hủy vùng dưới đồi và khu vực ngoài vùng dưới đồi của não Vào tuần thứ 6, chuột được tiêm phúc mô liều 30 – 40 mg/ kg gold-thioglucose Trọng lượng chuột và khối lượng thức ăn được ghi nhận trong 3 tháng và so sánh với nhóm chứng không tiêm

1.4.4 GÂY BÉO PHÌ BẰNG MONOSODIUM GLUTAMATE

Tình trạng béo phì có thể gây ra ở chuột bởi sự tiêm dưới da nhiều lần của monosodium glutamate ở giai đoạn sớm Ngay sau khi sinh, chuột được tiêm dưới da mỗi ngày 2 g/kg monosodium glutamate trong 5 ngày liên tiếp Nhóm chứng tiêm nước muối sinh lý Chuột được tập ăn vào tuần thứ 3, nuôi ở nhiệt

độ chuẩn và chu kỳ sáng tối nhân tạo, được cung cấp thức ăn thường và nước uống Trọng lượng chuột và khối lượng thức ăn tiêu thụ được ghi lại mỗi tuần

1.4.5 GÂY BÉO PHÌ BẰNG ĐỘT BIẾN GEN

Động vật biến đổi di truyền đưa ra một phương pháp mới nghiên cứu sự phát triển của béo phì và khả năng trị liệu Hiệu lực của sự chèn vào những vật liệu

di truyền mới ở động vật có vú sẽ sản sinh ra những chuột to béo với sự tăng khối lượng mô mỡ [13]

Chuột mang một đột biến lặn trên nhiễm sắc thể, biểu hiện thành các kiểu hình dị thường, bao gồm: trưởng thành bị béo phì, cao insulin huyết và già cỗi Đột biến này là do sự thay đổi serin thành prolin ở carboxypeptidase E

23

Một đột biến lặn khác trên nhiễm sắc thể biểu hiện thành ba kiểu hình: mù, điếc và trưởng thành bị béo phì [14] Để đáp ứng với sự tăng cân, những chuột này dần tăng thức ăn đưa vào tương ứng với trọng lượng cơ thể và tăng mức insulin huyết để duy trì đường huyết bình thường Sự thoái hóa võng mạc không ngừng ở chuột béo lùn này là kết quả từ sự mất hoạt tính chết theo chương trình của những tế bào nhận kích thích ánh sáng với điện đồ võng mạc bất thường nhận thấy vào tuần tuổi thứ ba [16]

Chè xanh mua tại chợ Tân Bình, thành phố Hồ Chí Minh

Các dược liệu được lưu mẫu tại ban khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố

Hồ Chí Minh

2.1.2 SÚC VẬT

Chuột nhắt đực trắng (chủng Swiss abino, 5 – 6 tuần tuổi, khối lượng từ 18 –

22 g) được cung cấp bởi viện Pasteur, TP HCM Chuột được nuôi ổn định một tuần bằng thức ăn thường trước khi tiến hành thử nghiệm

Hình 2.1 Chuột được nuôi trong lồng với đầy đủ thức ăn và nước uống 2.1.3 HÓA CHẤT VÀ THUỐC ĐỐI CHIẾU

Ethanol, methanol, chloroform, butanol, diethyl ether, ethyl acetate (PA, Trung Quốc)

Các thuốc thử định tính tannin, saponin, alkaloid

25

Bản mỏng tráng sẵn silicagel F254, cỡ hạt 0,015 – 0,04 mm

Casein (Trung Quốc), hỗn hợp vitamin và khoáng chất (Wou, Pháp)

Thức ăn chuột (viện Pasteur)

Orlistat (Xenical®) viên 120 mg

2.1.4 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

Bộ dụng cụ đun hồi lưu dùng để chiết xuất

Bếp cách thủy, bếp điện, tủ sấy áp suất thường, tủ sấy chân không, tủ nung Cân phân tích Sartorius, bình hút ẩm, chén nung

(a) (b)

Hình 2.2 Dụng cụ đun hồi lưu (a) và máy cô quay chân không (b) Đèn soi UV Viber Lourmat hai bước sóng 254 nm, 365 nm

Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Unicam

Máy cô quay Buchi R300, kính hiển vi

Lá Chè xanh tươi được loại bỏ lá dập và rửa sạch

2.2.2 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU

Lá Sen được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn DĐVN III về các chỉ tiêu: mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, độ tro, tỷ lệ vụn nát, tạp chất, định tính và định lượng [5]

Chè xanh không có quy định trong DĐVN III nên được kiểm nghiệm với chỉ tiêu: mô tả, soi bột, vi phẫu và định tính tannin theo tiêu chuẩn tự xây dựng 2.2.3 CHIẾT XUẤT

Các dược liệu sau khi đã xử lý, được chiết theo các quy trình sau:

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu Chè xanh

27

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu lá Sen 2.2.4 TIÊU CHUẨN HÓA CAO DƯỢC LIỆU

Các cao dược liệu được tiêu chuẩn hóa với các chỉ tiêu:

- Độ tan trong nước

- Độ tan trong cồn cao độ

28

2.2.5 THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÔNG THỨC PHỐI HỢP CAO DƯỢC LIỆU TRÊN CHUỘT [4,6]

Điều kiện thí nghiệm

Thuốc thử nghiệm: các bột cao được hòa vào trong nước cất

Dụng cụ thí nghiệm: kim đầu tù cho chuột uống, dụng cụ mổ, dụng cụ pha

thuốc

Chuẩn bị động vật thí nghiệm: Chuột mua về được để ổn định trong khoảng

thời gian 1 tuần, được cung cấp đầy đủ khẩu phần ăn và nước uống Chuột phải nhịn đói 16 giờ trước thử nghiệm (chuột vẫn uống nước bình thường)

Đường dùng thuốc: đường uống

Thể tích dùng thuốc: 10 ml/kg thể trọng

Số lần dùng thuốc: dùng một lần duy nhất trong một ngày trong khoảng thời

gian từ 8-9 giờ sáng

Phương pháp thử

Việc thăm dò liều ban đầu được thực hiện qua 2 giai đoạn:

- Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều gồm 6 chuột)

- Giai đoạn xác định

Phải theo dõi các lô thật chặt chẽ trong 72 giờ đầu sau khi dùng thuốc Sau đó nếu thấy cần thiết thì theo dõi trong suốt 2 tuần tiếp theo

Thử nghiệm sơ khởi

Dùng 6 con chuột với 1 liều bất kỳ, với thể tích tối đa là 10 ml/kg chuột Nếu kết quả chết cả 6 con thì thăm dò với 6 con khác với liều giảm một nữa Nếu

Liều tối đa dung nạp: không có thú vật chết (d1)

Liều tối thiểu làm chết tất cả thú vật thử nghiệm (d2)

(d1), (d2) là giới hạn khoảng cách mà từ đó ta phải tìm những liều để thử nghiệm xác định

Chỉ tiêu đánh giá kết quả

Theo dõi kỹ trong thời gian 72 giờ sau khi dùng thuốc Sau đó, theo dõi thêm

2 tuần tiếp theo và ghi chép đầy đủ chi tiết mỗi diễn biến Ghi giờ cho uống thuốc, giờ xuất hiện các triệu chứng khác thường, giờ chuột chết (nếu có) và tình trạng ngộ độc trước khi chuột thí nghiệm chết

30

Bảng 2.1 Các hành vi của chuột cần chú ý trong thời gian theo dõi

Hệ thống cơ quan Quan sát và thử

nghiệm

Dấu hiệu chung của độc tính

Hành vi Hung hăng, phát âm khó

khăn, bồn chồn, tê dại Vận động Co giật, tê liệt, run, mất điều

hòa, sự giảm trương lực cơ, liệt cơ, tăng co thắt cơ

Hệ thống thần kinh

trung ương và hệ thần

kinh vận động

Phản ứng lại các kích thích khác

Dễ kích thích, thụ động, mất cảm giác (gây tê, mê), tăng cảm giác

Phản ứng não và tuỷ sống

Chậm chạp, lờ đờ, mất cảm giác

Trương lực cơ Co cứng hay mềm nhũn Kích thước đồng tử Giãn đồng tử, co đồng tử

31

Các triệu chứng Tiêu chảy, táo bón

Hình dáng bụng Đầy hơi, teo ruột, tăng co

bóp

Dạ dày ruột

Độ chắc và màu sắc của phân

Không điển hình hoặc phân đen

Âm hộ và tuyến vú Sưng tấy

Cơ quan sinh dục

Da và lông Màu, tình trạng Ửng đỏ, phát ban, da nhăn

nheo, xù lông Màng nhầy Màng kết, miệng Tiết dịch, xung huyết, xuất

huyết, chứng xanh xám, bệnh vàng da

Nhãn cầu Lồi nhãn cầu, co giật nhãn

cầu Mắt

Tính trong suốt Bị mờ đục Ghi nhận số súc vật chết trong từng lô, lập bảng phân suất tử vong

Xét nghiệm đại thể ngay sau khi chết đối với chuột bị chết và làm xét nghiệm đại thể sau khi kết thúc thử nghiệm đối với súc vật còn sống Xác định LD50

theo phương pháp Karber-Behrens

Thành phần thức ăn cho chuột

Bảng 2.2 Thành phần của 100 g thức ăn chuột

Thức ăn béo (HF) CT a CT b

HF + Orlistat 0,012%

36

CT a: HF + 3% cao dược liệu (cao Chè xanh : cao lá Sen = 1:1)

CT b: HF + 5% cao dược liệu ( cao Chè xanh : cao lá Sen = 1: 1)

33

Đánh giá kết quả

Các số liệu được trình bày dưới dạng: TB ± SEM Sử dụng phần mềm thống

kê SPSS ver 13 để thống kê các số liệu Phân tích các số liệu bằng phép kiểm Kolmogorov-Smirnov cho thấy có sự phân bố không bình thường ở một số dãy số liệu Do đó, việc thống kê trong đề tài này sử dụng phép kiểm Kruskal-Wallis, tiếp theo là phép kiểm Mann-Whitney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị p<0,05

2.2.7 THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN

Điều kiện thí nghiệm

Thuốc thử nghiệm: bột cao được hòa vào trong nước cất

Dụng cụ thí nghiệm: kim đầu tù để cho uống, dụng cụ mổ, dụng cụ pha thuốc Động vật thí nghiệm: Chuột mua về được để ổn định trong khoảng thời gian 1 tuần, được cung cấp đầy đủ khẩu phần ăn và nước uống

Đường dùng thuốc: đường uống

Chuột thử nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 2 lô:

Số lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Thời gian nuôi: 60 ngày

Chuột ở cả hai lô được nuôi dưỡng trong cùng điều kiện và cùng chế độ dinh

dưỡng

Theo dõi và đánh giá kết quả

Chuột được cho uống thuốc 1 lần mỗi ngày vào buổi sáng, đưa thẳng thuốc

vào dạ dày chuột bằng bơm tiêm có đầu tù Trong thời gian thử nghiệm, theo

dõi tình trạng chung của chuột về thể trọng, mức tiêu thụ thức ăn, khả năng

hoạt động, tình trạng phân, nước tiểu, lông…

Sau thời gian thử nghiệm, chuột ở tất cả các lô được lấy máu để làm xét

nghiệm, các mẫu máu được chia làm 2 loại:

- Mẫu máu đựng trong ống có chứa EDTA tránh đông được giữ lạnh để làm

xét nghiệm công thức máu như: số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, số

lượng tiểu cầu, hematocrit… tại phòng xét nghiệm huyết học, Bệnh viện Chợ

Rẫy, TP Hồ Chí Minh trên máy phân tích huyết học tự động Excell 22

(Drew- Mỹ)

- Mẫu máu đựng trong ống không có EDTA được dùng làm xét nghiệm xác

định các thông số thuộc chức năng của gan, thận tại phòng xét nghiệm sinh

Các thông số theo dõi

- Các thông số huyết học: số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hematocrit…

- Thông số thuộc chức năng gan: GPT, GOT, protein

- Thông số thuộc chức năng thận: creatinin huyết, urea huyết

- Các thông số khác: triglycerid, …

36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

37

Hình 3.2 Vi phẫu phiến lá Chè xanh

1 Biểu bì trên 2 Mô mềm giậu 3 Gỗ 4 Libe

5 Vòng sợi trụ bì 6 Mô mềm 7 Thể cứng 8 Biểu bì dưới

Hình 3.3 Các thành phần trong vi phẫu phiến lá Chè xanh

38

A Biểu bì trên với mô mềm giậu B Biểu bì dưới có lông đơn bào

C Lỗ khí ở biểu bì dưới D Bó libe - gỗ

E Thể cứng và calci oxalat hình cầu gai

Soi bột

Mảnh biểu bì mang lỗ khí; cương thể vách dày trong suốt, hình dạng thay đổi; lông che chở đơn bào; tinh thể calci oxalat hình cầu gai; mảnh mạch vạch

Hình 3.4 Các cấu tử soi bột lá Chè xanh

A Mảnh biểu bì mang lỗ khí B Cương thể

C Calci oxalat hình cầu gai D Mạch vạch

A B

C D

39

Định tính

Lấy 5 g dược liệu, cắt nhỏ, cho vào bình nón 50 ml, thêm 30 ml nước nóng, đun trên bếp cách thủy sôi 10 phút, lắc đều khi đun Lọc lấy dịch lọc trong dùng làm các phản ứng định tính sau:

Phản ứng với dung dịch protein

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, cho thêm 1 giọt thuốc thử gelatin muối Phản ứng dương tính nếu có tủa trắng đục (+)

Phản ứng với muối kim loại nặng

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm vào 1 giọt FeCl3 1% Phản ứng dương tính khi có tạo tủa xanh rêu (+)

Từ những kết quả nghiên cứu trên, tiêu chuẩn dược liệu lá Chè xanh được đề xuất như sau: