nghiên cứu khả năng kháng phân bào thực nghiệm của một số bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở mức độ tế bào và phân tử

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA TỪNG VỊ TRONG SỐ 5 VỊ CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA ..... Trong định hướng phát triển về YHCT trên, Đề tài “Nghiên c

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO THỰC NGHIỆM CỦA MỘT SỐ BÀI THUỐC CỔ TRUYỀN HOẶC DÂN

GIAN Ở MỨC ĐỘ TẾ BÀO VÀ PHÂN TỬ

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

(Ký tên)

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 6/ 2010

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i  

DANH MỤC CÁC BẢNG iv  

DANH MỤC CÁC HÌNH v  

PHẦN MỞ ĐẦU 1  

TỔNG QUAN 5  

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 13  

2.1 VẬT LIỆU SINH HỌC 13  

2.2 PHƯƠNG PHÁP 14  

2.2.1 Phương pháp thu nhận cao nước từ bài thuốc 14  

2.2.2 Phương pháp nuôi tế bào 14  

2.2.3 Phương pháp SRB (Sulforhodamin B) 15  

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính caspase 16  

2.2.5 Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang 18  

2.2.6 Phương pháp phân tích DNA bộ gene (“thang DNA”) 19  

2.2.7 Phương pháp flow cytometry 20  

2.2.8 Phương pháp microarray 21   

2.2.9 Phương pháp real-time RT-PCR 22  

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25  

1 TUYỂN CHỌN CÁC BÀI THUỐC CÓ TÁC ĐỘNG KHÁNG PHÂN BÀO 25  

2 THU NHẬN DỊCH CHIẾT TỪ BÀI THUỐC 27  

3 SÀNG LỌC CÁC CAO CHIẾT DỰA VÀO TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO TRÊN BA DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ NUÔI CẤY IN VITRO 27  

4 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM NGỪNG CHU TRÌNH TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA 33  

4.1 Khả năng làm ngừng phân bào của bài thuốc BT3 trên dòng tế bào HeLa 33  

4.2 Khả năng cảm ứng apoptosis của bài BT3 trên dòng tế bào HeLa 35  

4.2.1 Kết quả thử nghiệm caspase 36 

4.2.2 Quan sát sự biến đổi hình thái tế bào apoptosis 37  

4.2.3 Phân tích sự phân mảnh của DNA bộ gene 38 

5 NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA TỪNG VỊ TRONG SỐ 5 VỊ CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA 39  

5.1 Kết quả sàng lọc độc tính tế bào của 5 vị trong bài thuốc BT3 39  

5.2 Kết quả xác định giá trị IC 50 của nước sắc từng vị 43  

5.3 Kết quả xác định khả năng cảm ứng apoptosis của các vị có độc tính tế bào cao trong bài thuốc BT3 45  

5.3.1 Kết quả xác định hoạt tính caspase-3 45  

5.3.2 Kết quả thử nghiệm DNA phân mảnh 46  

5.3.3 Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang tế bào HeLa xử lí với nước sắc Hoàng liên và Hoàng cầm 47  

6 KHẢO SÁT BIỂU HIỆN TỔNG THỂ CỦA CÁC GENE Ở TẾ BÀO HELA XỬ LÝ

VỚI BÀI THUỐC - XÁC ĐỊNH CÁC GENE ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC 49  

7 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO BÀI THUỐC BT3 VÀ CÁC VỊ 53  

7.1 Hoàng liên 53  

7.2 Hoàng cầm 57  

7.3 Hoàng bá 60  

7.4 Bạch thược 63  

7.5 Chi tử 66  

7.6 Xây dựng TCCS cao toàn phần 69  

8 XÂY DỰNG “DẤU VÂN TAY HÓA HỌC” VÀ “DẤU VÂN TAY SINH HỌC” CỦA BÀI THUỐC BT3 75  

8.1 Xây dựng “dấu vân tay hóa học” bằng kỹ thuật HPLC 76  

8.2 Xây dựng “dấu vân tay sinh học” 78  

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 83  

TÀI LIỆU THAM KHẢO 100  

PHỤ LỤC 105 

7.1 CƠ SỞ DỮ LIỆU CỦA 5 BÀI THUỐC 105  

7.2 DỮ LIỆU KHẢO SÁT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DỊCH CHIẾT NƯỚC BÀI THUỐC TRÊN DÒNG TẾ BÀO NUÔI CẤY 133  

7.3 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ CÁC GIÁ TRỊ APOPTOSIS 137  

7.4 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ GIÁ TRỊ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO (IC 50 ) và APOPTOSIS CỦA CÁC VỊ TRONG BT3 140  

7.5 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÔ MICROARRAY SỰ BIỂU HIỆN GENE 142  

7.6 KẾT QUẢ REALIME-PCR ĐỊNH LƯỢNG 192  

7.7 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH “dấu vân tay hóa học” BẰNG KỸ THUẬT HPLC 198  

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Thuật ngữ

AIF Apoptosis-Inducing Factor: nhân tố cảm ứng apoptosis

AO acridine orange

ATF4 Activating transcription factor 4

BAX B-cell lymphoma-extra large

BCL-2 B-cell lymphoma 2

BSA Bovine serum albumin

Cdc2 cell division cycle 2

Cdc25C cell division cycle 25 homolog C

CEBPB CCAAT/enhancer-binding protein beta

CHOP Cyclophosphamide, Hydroxydaunorubicin (doxorubicin), Oncovin

(vincristine), and Prednisone/prednisolone COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Bệnh tắt nghẽn phổi mãn

tính Cpt Camptothecin

CREB3L2 cAMP responsive element binding protein 3-like 2

CRYAB crystallin, alpha B

Ct Cycle Threshold: Chu kỳ ngưỡng

CYP4F11 cytochrome P450, family 4, subfamily F, polypeptide 11

DDIT3 DNA damage-inducible transcript 3:

DEVD Asp-Glu-Val-Asp

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxiribonucleic acid

E’MEM môi trường Eagle’s Minimum Essential Medium

EB ethidium bromide

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EIF2A Eukaryotic translation initiation factor 2A

FAM129A Family with sequence similarity 129, member A

FBS Fetal Bovine Serum

FDA Food and Drug Administration: Cục quản lý Thuốc và Thực phẩm

Hoa Kỳ GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenease:

GDF15 Growth differentiation factor 15

HeLa tế bào ung thư cổ tử cung

Hep-2 tế bào ung thư thanh quản

HepG2 tế bào ung thư gan

HL-60LNCaP tế bào ung thư ruột kết

HPLC High-Performance Liquid Chromatography: sắc ký lỏng cao áp

IC50 Inhibitory concentration of 50% growth: nồng độ ức chế 50% sự tăng

trưởng của tế bàoISR Integrated Stress Response:

KB tế bào ung thư biểu bì

MCF-7 tế bào ung thư vú

mRNA RNA thông tin

MTT 3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide NCCAM National Center for Complementary and Alternative Medicine:

Trung tâm Y học cổ truyền Quốc gia của Hoa Kỳ NCI National Cancer Institute: Viện Ung thư Hoa Kỳ

NCI-H460 tế bào ung thư phổi

NUPR1 nuclear protein, transcriptional regulator, 1

OD Opticcal density: Mật độ quang

PBS Phosphate buffered saline

pf Primer forward: mồi xuôi

PI propidium iodide

pr Primer reverse: mồi ngược

RD tế bào ung thư cơ

Rf Rate of flow

RNA ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction SERPINE 2 Serpine peptidase inhibitor, member 2

SRB Sulforhodamine B

STC2 Stanniocalcin 2

STD Standard deviation: độ lệch chuẩn

TRIB3 Tribbles homolog 3

WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế Thế giới YHCT Y học cổ truyền

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 - Tác dụng theo Đông y và Tây y của các vị trong 5 bài thuốc 25 

Bảng 2 - Tỉ lệ (%) ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc ở nồng độ 10% (v/v) trên 3 dòng tế bào ung thư 28 

Bảng 3 - Kết quả xác định IC50 của các bài thuốc trên dòng tế bào HeLa 28 

Bảng 4- Kết quả IC50 của các bài thuốc trên dòng tế bào MCF-7 29 

Bảng 5 - Kết quả IC50 của các bài thuốc trên dòng tế bào NCI-H460 31 

Bảng 6 - Tỉ lệ % tế bào ở các pha của chu trình phân bào khi xử lý với BT3 35 

Bảng 7 - Kết quả thử nghiệm caspase trên tế bào HeLa được cảm ứng với bài thuốc BT3 với các thời gian cảm ứng khác nhau 36 

Bảng 8- Tỉ lệ % ức chế tăng trưởng (I %) của 5 vị bài thuốc ở nồng độ 10% trên dòng tế bào HeLa 40 

Bảng 9 - Giá trị IC50 của nước sắc Hoàng liên, Hoàng cầm, Hoàng bá, Bạch thược, Chi tử trên dòng tế bào HeLa 43 

Bảng 10 - Kết quả thử nghiệm caspase-3 trên nước sắc Hoàng liên, Hoàng cầm, Hoàng bá và Bạch thược 45 

Bảng 11- Kết quả phân tích microarray một số gene tăng biểu hiện ở tế bào HeLa xử lý với bài thuốc BT3 52 

Bảng 12 - Kết quả độ ẩm của Hoàng Liên 55 

Bảng 13 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng Liên 55 

Bảng 14 - Kết quả tro không tan trong HCl của Hoàng Liên 55 

Bảng 15 - Kết quả định lượng của Hoàng Liên 57 

Bảng 16- Kết quả độ ẩm của Hoàng cầm 58 

Bảng 17 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng cầm 58 

Bảng 18 - Kết quả tro không tan trong HCl của Hoàng cầm 58 

Bảng 19 - Kết quả định lượng của hoàng cầm 59 

Bảng 20- Kết quả độ ẩm của Hoàng bá 60 

Bảng 21 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng bá 61 

Bảng 22 - Kết quả tro không tan trong HCl của Hoàng bá 61 

Bảng 23 - Kết quả định lượng của Hoàng bá 63 

Bảng 24 - Kết quả độ ẩm của Bạch thược 64 

Bảng 25 - Kết quả tro toàn phần của Bạch thược 64 

Bảng 26 - Kết quả tro không tan trong HCl của Bạch thược 64 

Bảng 27 - Kết quả định lượng của Bạch thược 65 

Bảng 28 - Kết quả độ ẩm của Chi tử 67 

Bảng 29 - Kết quả tro toàn phần của Chi tử 67 

Bảng 30 - Kết quả tro không tan trong HCl của Chi tử 67 

Bảng 31- Kết quả định lượng của Chi tử 68 

Bảng 32 - Kết quả độ ẩm cao toàn phần 69 

Bảng 33 - kết quả tro toàn phần của cao toàn phần 69 

Bảng 34- Hàm lượng berberin trong cao toàn phần 75 

Bảng 35 - Hàm lượng baicalin trong cao toàn phần 75 

Bảng 36 - Thời gian lưu và phần trăm hàm lượng/hàm lượng tổng của các mũi lặp lại trong 3 mẫu nước sắc bài thuốc ứng với 3 lần nấu khác nhau 77 

Bảng 37 - Các mồi sử dụng trong phản ứng real-time RT-PCR với các gene nghiên cứu 79 

Bảng 38 - Kết quả nhiệt độ nóng chảy sản phẩm PCR của các gene 80 

Bảng 39 - Giá trị Ct và sự thay đổi biểu hiện ở mức mRNA của một số gene được phân tích bằng kỹ thuật realtime-PCR bán định lượng 81 

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 - Các dòng tế bào sử dụng trong đề tài 13 

Hình 2: Nguyên lý của phương pháp phân tích DNA bộ gene 19 

Hình 3 - Biểu đồ histogram biểu diễn tần số giá trị FL2-H của các tế bào ở giai đoạn sub-G1, G0/sub-G1, S và G2/M 21 

Hình 4 - Nguyên lý microarray 21 

Hình 5 - Nguyên lý phương pháp realtime RT-PCR sử dụng SYBRGreen 23 

Hình 6 - Tác động ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc trên dòng tế bào HeLa 29 

Hình 7 - Tác động ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc trên dòng tế bào MCF-7 30 

Hình 8- Tác động ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc trên dòng tế bào NCI-H460 32 

Hình 9 - Tỉ lệ tế bào sống ở mẫu xử lý với BT3 phụ thuộc thời gian cảm ứng thuốc 33 

Hình 10 - Biểu đồ histogram của mẫu chứng và mẫu cảm ứng thuốc ở các thời điểm cảm ứng thuốc khác nhau 34 

Hình 11 - Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (400 X) tế bào HeLa có và không có xử lý thuốc 37 

Hình 12 - Kết quả điện di trên gel agarose của DNA bộ gene 38 

Hình 13- Hình thái tế bào HeLa sau 48 giờ nuôi cấy ở các lô chứng (400X) 41 

Hình 14 - Hình thái tế bào HeLa sau 48 giờ nuôi cấy ở các lô thử nghiệm(400X) 42 

Hình 15 - Đồ thị so sánh các giá trị IC50 của từng vị và toàn bài thuốc 44 

Hình 16 - Kết quả thử nghiệm phân mảnh DNA trên tế bào HeLa sau 40 giờ cảm ứng với nước sắc Hoàng liên và Hoàng cầm 47 

Hình 17 - Hình ảnh tế bào HeLa ở mẫu chứng (A, B) và khi xử lí với Hoàng cầm và Hoàng liên (C, D, E, F) sau 15 giờ và 24 giờ dưới KHV huỳnh quang(400X) 48 

Hình 18 - Mức độ biểu hiện một số gene xác định bằng kỹ thuật real-time RT-PCR 52 

Hình 19 - Kết quả soi bột của Hoàng Liên 54 

Hình 20 - Kết quả sắc ký đồ của Hoàng liên 56 

Hình 21 - Kết quả soi bột của Hoàng Cầm 57 

Hình 22 - Kết quả sắc ký đồ của Hoàng cầm 59 

Hình 23 - Kết quả soi bột của Hoàng bá 60 

Hình 24 - Kết quả sắc ký đồ của Hoàng bá 62 

Hình 25 - Kết quả soi bột của Bạch thược 63 

Hình 26 - Kết quả sắc ký đồ của Bạch thược 65 

Hình 27 - Kết quả soi bột của Chi tử 66 

Hình 28- Kết quả sắc ký đồ của Chi tử 68 

Hình 29 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Hoàng liên trong cao toàn phần 70 

Hình 30 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Hoàng bá trong cao toàn phần 71 

Hình 31 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Hoàng cầm trong cao toàn phần 72 

Hình 32 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Chi tử trong cao toàn phần 73 

Hình 33 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Bạch thược trong cao toàn phần 74 

Hình 34 - Kết quả HPLC ba lần lặp của bài thuốc BT3 77 

PHẦN MỞ ĐẦU

Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu khả năng kháng phân bào thực nghiệm của một số

bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở mức độ tế bào và phân tử

Chủ nhiệm đề tài/dự án:PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Tp.HCM Thời gian thực hiện: 18 tháng

Kinh phí được duyệt: 565.749.000

Kinh phí đã cấp: theo TB số: 131 TB-SKHCN ngày 27/08/2008

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 80% dân cư ở các nước đang phát triển được điều trị bằng y học cổ truyền, đặc biệt là với các phương thuốc làm từ chất chiết thực vật Khoảng 3/4 thuốc có nguồn gốc thảo mộc sử dụng trên thế giới bắt nguồn từ các phương thuốc cổ truyền và 25% số thuốc hiện đại có nguồn gốc từ các cây thuốc

đã được dân gian sử dụng từ rất lâu

Tuy nhiên, theo đánh giá của nhiều tổ chức y tế trên thế giới, YHCT có một số nhược điểm cần khắc phục Chính vì vậy mà năm 2002, WHO đã công bố kế hoạch phương hướng đầu tiên về phát triển YHCT, với những điểm chính như : (1) Phát triển chính sách quốc gia về đánh giá và kiểm định YHCT, (2) Xây dựng cơ sở vững chắc để chứng minh tính an toàn, hiệu quả và chất lượng của sản phẩm YHCT, (3) Đảm bảo nguồn cung cấp đầy đủ và ổn định nguyên liệu cho YHCT, (4) Khuyến khích việc sản xuất và tiêu thụ sản phẩm YHCT, (5) Sưu tầm và bảo quản các kiến thức và bài thuốc dân gian Các nước có nền YHCT phát triển như Trung Quốc, Ấn

Độ, đầu tư mạnh vào nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong lĩnh vực này Trong vòng 5 năm qua, Trung Quốc đã đầu tư 740 triệu nhân dân tệ (92,5 triệu đô la Mỹ) cho nghiên cứu phát triển YHCT

Trong số các bệnh có khuynh hướng tăng dần với mức độ phát triển của xã hội như tiểu đường, béo phì, tim mạch, ung thư các dạng cũng ngày càng trở thành vấn

đề lớn của lĩnh vực Sức khỏe cộng đồng Tỉ lệ mắc và tử vong do ung thư trên thế giới hiện nay tăng 22% so với năm 1990 Bên cạnh việc tìm kiếm hoạt chất mới, khả năng

sử dụng phối hợp nhiều hoạt chất đã biết nhằm tạo hiệu quả cộng hưởng là cách tiếp cận thực tế và mang tính khả thi cao Nguyên lý của YHCT phù hợp với cách nhìn hiện đại này Điều đó được chứng tỏ qua số lượng tăng dần của các công trình nghiên cứu về YHCT, đặc biệt là YHCT Trung Quốc, chỉ tính riêng trong lĩnh vực điều trị

ung thư, ở nhiều nước tiên tiến Theo đánh giá của WHO, giống như ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Triều Tiên, YHCT thực sự là một phần của hệ thống Y tế ở Việt Nam, với khoảng 30% bệnh nhân được điều trị bằng YHCT

Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố về cơ chế hoạt động của bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian mặc dù có nhiều bài thuốc đã được truyền miệng, và sử dụng khá rộng rãi Việc phát triển những công

cụ cho phép đánh giá hiệu quả tác động, chất lượng của các bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian sẽ góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc đánh giá, khai thác vốn quý của nước ta vào lĩnh vực chăm sóc sức khỏe

Trong định hướng phát triển về YHCT trên, Đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng phân bào thực nghiệm của một số bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở mức độ tế bào và phân tử” này được thực hiện nhằm hai mục tiêu chính:

(1) Góp phần ứng dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại đáng tin cậy

để cung cấp một số chứng cứ thực nghiệm ở mức độ tế bào và gene cho khả năng

sử dụng bài thuốc cổ truyền trong điểu trị ung thư

(2) Góp phần phát triển một phương pháp đánh giá tính ổn định về chất lượng và hiệu quả của bài thuốc thông qua các “chỉ thị hóa học và sinh học” bên cạnh việc chuẩn hóa nguồn nguyên liệu dựa trên các tiêu chuẩn cơ sở Việt Nam

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Thu nhận 5 bài thuốc dựa trên y văn và thông tin lưu truyền

Thu dịch chiết nước từ 5 bài thuốc

Khảo sát khả năng gây độc của 5 bài thuốc trên 3 dòng tế bào ung thư

Chọn bài có khả năng gây độc tế bào cao nhất

Nghiên cứu khả năng cảm ứng apoptosis của bài thuốc đã chọn trên

dòng tế bào HeLa

Xác định độc tính tế bào và khả năng cảm ứng apoptosis của các vị trong

bài thuốc đã chọn trên dòng tế bào HeLa

Khảo sát biểu hiện tổng thể của các gene ở tế bào HeLa xử lý với bài thuốc

Xác định các gene có đáp ứng với thuốc Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho bài thuốc và các vị

Xác định tiêu chí “dấu vân tay hóa học” và “dấu vân tay sinh học” để

kiểm tra tính ổn định và lặp lại của bài thuốc

Và những sản phẩm cần đạt được trong đề tài này, như sau:

(1) 05 bài thuốc có công dụng kháng phân bào

(2) 05 dịch chiết nước, có độ đậm đặc và trong, đủ chất lượng dùng cho các thử nghiệm

(3) 05 cao chiết methanol

(4) 02 bài thuốc có tỉ lệ % ức chế tế bào tăng trưởng cao nhất và >50% cho các nội dung tiếp theo

(5) Kết quả so sánh tính gây độc tế bào của dịch/cao chiết toàn phần của các thành phần riêng lẻ Chọn 1 trong 2 dịch chiết có số lượng chủ vị ít hơn để nghiên cứu tiếp

(6) Kết quả về khả năng và mức độ gây apoptosis của bài thuốc đã chọn và của các chủ vị trong bài thuốc đó

(7) Báo cáo kết quả giám định giữa kỳ

(8) Kết quả phân tích bằng microarray biểu hiện một số gene chủ chốt trong quá trình phân bào và gây apoptosis trên một dòng tế bào ung thư nuôi cấy Chọn khoảng 06 gene có sự thay đổi biểu hiện quan trọng nhất dùng làm “dấu ấn sinh học”

(9) 06 quy trình realtime RT-PCR để nghiên cứu biểu hiện của 06 gene đã chọn (10) Quy trình Western blot với một số kháng thể đặc hiệu cho các protein nghiên cứu

(11) Sắc ký đồ của dịch/cao chiết nước hoặc methanol

(12) Kết quả ΔCt của 06 gene nghiên cứu

(13) Kết quả về giá trị sử dụng của “dấu vân tay” hóa học và sinh học trong việc đánh giá chất lượng và độ ổn định của bài thuốc

(14) Kết quả Western blot

(15) Báo cáo toàn văn, báo cáo tóm tắt, đĩa CD

TỔNG QUAN

Ung thư các dạng ngày càng trở thành vấn đề lớn của lĩnh vực Sức khỏe cộng đồng Theo báo cáo của WHO (2003), khoảng 10 triệu ca mắc mới được ghi nhận hàng năm với trên 6 triệu ca tử vong Năm 2002, các con số này là 11 triệu và 7 triệu người chết do ung thư các loại Tỉ lệ mắc và tử vong do ung thư trên thế giới hiện nay tăng 22% so với năm 1999

Hướng nghiên cứu về dược liệu, đặc biệt là dược liệu chống ung thư, đã phát triển từ khá lâu trên thế giới và đã góp phần cung cấp một số hoạt chất kháng ung thư hữu hiệu đang được sử dụng cho điều trị như Taxol, Vinblastin, Bên cạnh hợp chất

tự nhiên chiết từ cây-con, các bài thuốc cổ truyền ngày càng được nhiều nhóm quan tâm nghiên cứu bằng nhiều công cụ hiện đại như các phương pháp sàng lọc độc tính tế bào (MTT, SRB), các phương pháp nghiên cứu cơ chế chống ung thư ở mức độ phiên

mã và dịch mã như flow cytometry, real-time RT-PCR, Western blot, (Deng & cs, 2001; Kim & cs, 2005; Lin & cs, 2006; Lin & cs, 2007; Yin & cs, 2004) Đặc biệt, DNA microarray, một công cụ nghiên cứu ở mức độ toàn thể bộ gene (geneomics) bắt đầu được sử dụng những năm gần đây trong các nghiên cứu dược động học, dược học phân tử, độc chất học, cũng như trong các công trình về kiểm định chất lượng dược liệu Công cụ này đặc biệt quan trọng trong việc tìm hiểu các tương tác thuốc-tế bào ở mức độ tổng thể (Chavan & cs, 2006; Calligaris & cs, 2009; Einbond & cs, 2007; Choi & cs, 2009)

1 Quan điểm của YHCT về ung thư – Tiềm năng – Hạn chế

Y học cổ truyền (YHCT) cũng có bệnh danh Ung thư nhưng là để gọi loại

bệnh lý chung về mụn nhọt Chữ Ung là muốn nói đến thứ nhọt đỏ – sưng – đau, nổi

gồ lên khỏi mặt da, làm mủ, khi vỡ mủ rồi thì lành miệng lại dễ dàng, còn loại nhọt chìm sâu ở trong, màu da không đổi, đau âm ỉ, khó vỡ mủ, khi vỡ ra khó lành miệng gọi là Thư Đối với các loại bệnh lý Ung thư theo Y học hiện đại, YHCT thường dùng danh từ “Thủng Lựu”, và mỗi bệnh lý lại có tên riêng như “Nhũ nham” để chỉ ung thư

vú, “Phế nham” chỉ ung thư phổi, “Thạch thư” để nói về ung thư xương, “Ế cách” chỉ ung thư thực quản,

Theo Đông y, sự sinh bệnh ung thư là do: (1) huyết ứ, (2) đàm thấp ngưng kết, (3) nhiệt (hỏa) độc, (4) tạng phủ bị tổn thương (tỳ hư, tỳ vị khí hư, tỳ thận dương hư, phế thậm âm hư, ) Do đó, các bài thuốc cổ phương hướng đến việc giải quyết các nguyên nhân sinh bệnh này Bài thuốc cổ phương thường được cấu tạo từ nhiều vị bao gồm: (1) quân dược là vị thuốc chính, (2) thần dược, làm tăng tác dụng của vị chính, (3) tá dược, điều trị các triệu chứng khác của bệnh hoặc loại bỏ tác dụng phụ không mong muốn của vị chính, (4) sứ dược, có tác dụng dẫn thuốc và điều hòa các vị trong bài thuốc Hơn 100 loại dược liệu thường được phối hợp trong các bài thuốc được phân thành 6 nhóm: thanh nhiệt giải độc (45 %), hành khí hoạt huyết (21 %), hóa đàm trừ thấp (12 %), nhuyễn kiên tán kết (7 %), dĩ độc trừ độc (8 %), bổ dưỡng (7 %) Theo báo cáo đánh giá của WHO (2008), YHCT, bao gồm ba nền y học cổ truyền lớn là YHCT Trung quốc, Ấn độ (Ayurveda) và Hy lạp/Ả rập (Unani), có vai trò quan trọng không chỉ ở khu vực kém phát triển trên thế giới mà còn có ảnh hưởng

tăng dần ở các nước phương Tây Tuy nhiên “việc tăng sử dụng các phương pháp và

sản phẩm của YHCT không đi đôi với sự tăng về số lượng cũng như chất lượng của các chứng cứ khoa học tương ứng” Ý thức về những hạn chế và nhu cầu cải thiện

tình hình hiện tại của YHCT trên thể hiện rõ ở mức quốc gia và khu vực với sự hình thành những trung tâm nghiên cứu lớn về YHCT trên toàn thế giới Ở châu Á, cái nôi của hai nền YHCT lớn, nhiều trung tâm nghiên cứu quốc gia về YHCT hoạt động mạnh ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ Châu Phi thống nhất xây dựng Bản Tuyên bố Abuja 2000 về vai trò YHCT trong phòng chống và điều trị sốt rét (Abuja Declaration

on Roll back Malaria) với sự tham gia của 53 quốc gia của Lục địa Đen Nghị viện châu Âu ra tuyên bố “Cách tiếp cận của châu Âu đối với các nền y học không truyền thống” (A European Approach to Non-conventional Medicines) năm 1999 nhằm thúc đẩy sự thừa nhận chính thức YHCT trong các trường đại học y và khuyến khích việc

sử dụng YHCT trong các bệnh viện Song song đó, cơ quan châu Âu về đánh giá sản phẩm từ dược liệu (European Agenecy for the Evaluation of Medicinal Products) cũng bắt đầu phát triển việc xác lập các tiêu chuẩn về an toàn, hiệu quả và chất lượng của thảo dược từ 1997 Hoa Kỳ có nền nghiên cứu về YHCT phát triển với nhiều trung tâm nghiên cứu YHCT đặt tại các trường đại học lớn như Maryland, Harvard, Columbia, và Trung tâm Quốc gia Hoa Kỳ về YHCT (US National Center for

Complementary and Alternative Medicine) Mức đầu tư cho các nghiên cứu YHCT ở Hoa Kỳ tăng từ 2 triệu USD năm 1992 lên 68, 3 triệu USD năm 2000

Tuy nhiên cũng theo WHO, YHCT có một số mặt hạn chế khiến khó có thể phát triển một cách căn cơ Các hạn chế của YHCT tập trung vào 4 nội dung: (1) các chính sách quốc gia và hệ thống pháp lý nhằm thúc đẩy sự phát triển của YHCT, (2)

các chứng cứ về tính an toàn, hiệu quả và chất lượng của phương pháp và sản phẩm YHCT, (3) sự phổ biến YHCT trong nhân dân và khả năng đảm bảo nguồn

nguyên liệu cho phát triển bền vững đi kèm với sự đảm bảo quyền sở hữu trí tuệ của người dân địa phương đối với kho tàng YHCT, (4) Sự phổ biến thông tin và hình thành các mối liên kết hợp tác trong nghiên cứu, thực hành YHCT Riêng đối với hạn chế thứ hai, sự thiếu các phương pháp nghiên cứu, thiếu chứng cứ khoa học, thiếu các tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế về tính an toàn, hiệu quả và chất lượng của sản phẩm, thiếu hệ thống luật lệ rõ ràng, thiếu sự quản lý chặt chẽ các nhà phân phối nguyên liệu

và thiếu sự đầu tư cho nghiên cứu là những nguyên nhân chính Như vậy, việc kiểm soát chất lượng các bài thuốc cổ truyền là một trong những vấn đề cốt lõi cho việc triển khai ứng dụng các bài thuốc này vào thực tiễn Khâu đầu tiên trong việc kiểm soát chất lượng là khâu định danh chính xác nguyên liệu Trong khâu này, bên cạnh các phương pháp nhận dạng hình thái cổ điển, các “chỉ thị DNA” (DNA marker) dựa trên những biến động trình tự gene đặc trưng cho loài ngày càng được sử dụng rộng rãi, giúp định danh chính xác và phân biệt giữa các loài có hình thái tương tự nhưng tính chất dược lý khác biệt Tuy nhiên, điểm mấu chốt vẫn là tính ổn định và hiệu quả trong tác động cuối cùng của bài thuốc Theo WHO, đối với những bài thuốc không thể xác định được hoạt chất chính thì có thể dùng “dấu vân tay hóa học” (sắc ký) để đảm bảo chất lượng ổn định của sản phẩm cuối cùng (WHO, 1996) Phương pháp sắc

ký lỏng cao áp (HPLC) đã được nhiều nhóm nghiên cứu ưu tiên sử dụng hơn so với các phương pháp sắc ký khác như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, và điện di mao quản,

để xác định “dấu vân tay” hóa học của các bài thuốc (Liang & cs, 2004; Chavan & cs, 2006) Trong phương pháp này, người ta dựa vào một số chất chuẩn có hiện diện trong hợp chất/bài thuốc để kiểm tra sự lặp lại của phổ sắc ký của hợp chất/bài thuốc cho mỗi lần tách chiết Từ đó đánh giá được độ ổn định về thành phần hóa học của sản phẩm khi sử dụng những nguyên liệu và quy trình thu nhận xác định

Để đánh giá tính ổn định về mặt sinh học của hợp chất tự nhiên/bài thuốc thì gần đây, phương pháp “dấu vân tay đáp ứng sinh học” (biological response fingerprinting) được đề xuất dựa trên sự biểu hiện của một tập hợp các gene chỉ thị cho đáp ứng của

tế bào chủ đối với một hợp chất xác định Một số công trình cho thấy có thể sử dụng

“dấu ấn đáp ứng sinh học ở mức độ bộ gene” để kiểm soát chất lượng của hợp chất có hoạt tính sinh học, và cả những bài thuốc cổ truyền có thành phần phức tạp (Liang &

cs, 2004; Chavan & cs, 2006) Trước tiên, người ta so sánh biểu hiện các gene trong toàn bộ bộ gene ở tế bào có xử lý “thuốc” với biểu hiện tương tự ở tế bào không xử lý dựa trên phương pháp microarray Từ kết quả phân tích trên microarray, người ta chọn

ra một tập hợp gene có liên quan đến hoạt tính sinh học mong muốn và có biểu hiện tăng/giảm rõ rệt khi xử lý “thuốc” Biểu hiện của tập hợp gene này được xem là “dấu

ấn đáp ứng sinh học ở mức độ bộ gene” của một hợp chất hay bài thuốc xác định và sẽ được định lượng bằng kỹ thuật realtime RT-PCR (để xác định mức độ tăng/giảm biểu hiện) Mức độ tăng/giảm biểu hiện của các gene “chỉ thị” xác định được chính là chỉ

số dùng để kiểm soát chất lượng của hợp chất/bài thuốc cho những lần thử nghiệm hay sản xuất sau đó Do bản chất về mặt hóa học của bài thuốc là vô cùng phức tạp nên việc sử dụng “dấu vân tay hóa học” không thể hiện hết các biến động về thành phần các hoạt chất hiện diện trong bài thuốc mà chỉ cho thấy vài hoạt chất có hàm lượng cao (mặc dù chưa chắc có hoạt tính sinh học chủ chốt) Do đó, phương pháp

“dấu vân tay đáp ứng sinh học” là một phương pháp bổ sung hiệu quả, cho phép đánh giá kết quả thực sự cuối cùng, tức là tác động sinh học, của bài thuốc và được xem là

có tiềm năng ứng dụng vào quá trình kiểm soát chất lượng bên cạnh các tiêu chí về định danh nguyên liệu và thành phần hóa học của bài thuốc (Liang & cs, 2004; Chavan & cs, 2006; Rong & cs, 2007)

2 Tình hình nghiên cứu YHCT

Nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến các bài thuốc với tác dụng trị liệu

đa dạng, riêng đối với điều trị ung thư, một số công trình nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng cho thấy có triển vọng ứng dụng tốt

Chế phẩm PC-SPES bao gồm 8 loại thực vật là Cúc hoa trắng (Chrysanthemum

morifolium R.), nấm Linh chi (Ganoderma lucidum K.), Cam thảo (Glycyrrhiza

glabra L.), Thanh đại (Isatis indigotica L.), Tam thất (Panax pseudoginseng W.),

Đông lăng thảo (Rabdosia rubescens H.), Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis G.), Cọ lùn Nam Mỹ (Serenoa repens B.) Hàng loạt các nghiên cứu về cơ chế phân tử của

PC-SPES được tiến hành cho thấy chế phẩm này hoạt hoá con đường tín hiệu Jun/AP-1 dẫn đến sự ngừng phân bào và cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt người (Bonham & cs, 2002) PC–SPES còn ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt khác như PC-3, DU-145, dòng ung thư vú MCF-7, dòng T47-D, và ung thư bạch cầu ở người HL-60 LNCaP (Ikezoe & cs,

JNK/c-2003) Về mặt lâm sàng, PC-SPES ức chế sự tăng trưởng của khối u, giảm thời gian

tái phát và kéo dài thời gian sống của các bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt PC-SPES còn làm giảm triệu chứng trên các bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn cuối (de Lemos, 2002) PC-SPES được phát triển thành thuốc dạng viên nén và đã được FDA chấp nhận cho phép bán rộng rãi trên thế giới từ năm 1998 Tuy nhiên, từ 2001, có nhiều phản hồi về việc trong chế phẩm có chứa các thành phần tạp nhiễm nguy hiểm như estrogene diethylstilbestrol (DES – là một dạng thuốc tránh thai, có nguy cơ gây ung thư tử cung và ung thư vú), warfarin và indomethacin (một dạng thuốc kháng viêm không thuộc họ steroid) Điều này đã khiến Trung tâm YHCT Quốc gia của Hoa

Kỳ (National Center for Complementary and Alternative Medicine –NCCAM) ngừng cung cấp kinh phí cho các nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng của PC–SPES FDA cũng đã thu hồi toàn bộ sản phẩm PC-SPES có trên thị trường và khuyến cáo người dân ngừng sử dụng chế phẩm này vào cuối năm 2002 cho đến khi thành phần của bài

thuốc được chuẩn hóa chặt chẽ (Ruan & cs, 2006)

Bài thuốc “Hoàng liên giải độc thang” gồm 4 vị: Hoàng liên (Coptis sinensis Franch), Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr), Hoàng cầm (Scutellaria

baicalensic Georg), và Chi tử (Gardenia fzorida L) cho thấy khả năng ức chế tăng

sinh dòng tế bào u tủy và cảm ứng apoptosis theo con đường trung gian ti thể (Ma &

cs, 2005) Bài thuốc làm giảm hàm lượng cyclin A, cyclin B1, Cdc2 và Cdc25C, làm ngừng chu trình tế bào Nó cũng làm tăng sự biểu hiện của Bax và Bak, giảm sự biểu hiện của Bcl-2 và Bcl-XL, khởi động con đường apoptosis qua ti thể trên dòng tế bào HepG2 và PLC/PRF/5 Hiệu quả ức chế của bài thuốc lên sự tăng trưởng khối u cũng

đã được chứng minh trong mô hình chuột nude với khối u dị ghép tế bào ung thư gan (Hsu & cs, 2008)

Bài thuốc Wikyungtang gồm 4 loại thảo dược là Phragmitis rhizome (từ rễ cây

Pragmites cimmunis T.), Coicis semen (hạt cây Ý dĩ -Coix lachryma-jobi var), Benincasae semen (hạt cây Benincasa hispida), Persicae semen (hạt cây Đào –Prunus persica B.) có nguồn gốc từ Trung Quốc Các nghiên cứu in vitro trên bài thuốc cho

thấy bài thuốc có tính kháng viêm thông qua sự ức chế biểu hiện cyclooxygenease-2 (COX-2) và ức chế sự tăng sinh và cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư phổi người A549 (Park & cs, 2004)

Bài thuốc ISF-1, với thành phần Radix Astragali, Radix Angelicae Sinensis,

Radix Paeoniae Rubra, Rhizoma Chuanxiong, Flos Carthami, Semen Persicae, Pheretima, ức chế sự tăng trưởng dòng tế bào ung thư gan HepG2 (Rong & cs, 2008)

Bài thuốc Je-Chun-Jun bao gồm Radix Angeneliace gegantis, Rhizoma

rehmanniae, Radix achyranthis, Radix linderae, Cortex cinnamomi, Semen Persicae

cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào HeLa (Chae & cs, 2004)

Bài thuốc cổ truyền Hàn Quốc, Gagam-whanglyun-haedoktang, có khả năng cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư máu người HL-60 thông qua sự hoạt hóa caspase-3 (Kim & cs, 2005)

Một số bài thuốc cổ truyền Trung quốc bao gồm Huang-Lian-Tang, Ling-Wan đã được nghiên cứu về tác động kháng phân bào và gây apoptosis trên dòng tế bào ung thư máu bằng các phương pháp Western blot, flow cytometry và RT-PCR (Ma & cs, 2009) Bài thuốc có tên là Yigan ức chế sự tăng trưởng và cảm ứng apoptosis ở tế bào gan, có tác dụng chống lại sự xơ hóa gan (Yao & cs, 2002)

Zhi-Fu-Một nghiên cứu khác trên 242 bệnh nhân bị ung thư tại Trung Quốc được cho

sử dụng bài thuốc Sheng Xue Tang, gồm các vị Astragalus membranaceus, Angelica

sinensis, Equus asinus, Spatholobi spp., Pyrrosia lingua, Ziziphus jujube, Hordeum vulgare, Citrus reticulate, Glycyrrhiza uralensis Các xét nghiệm lâm sàng sau đó trên

các bệnh nhân này cho thấy hoạt động của đại thực bào tăng 16%, số lượng tế bào lympho T “giúp đỡ” (helper) tăng 50%, đặc biệt, chức năng của các tế bào giết tự nhiên tăng đến 81% (Rao & cs, 1991)

Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều hợp chất tự nhiên và bài thuốc cổ truyền đã được đánh giá một cách khoa học, thuyết phục và là một kho tàng cần khai thác cho trị liệu các dạng ung thư

Công trình trong nước liên quan đến các nghiên cứu về dược liệu từ cây thuốc bắt đầu được công bố nhiều trong thời gian gần đây Hoạt tính sinh học được quan tâm khá phong phú và được chiết xuất từ một phổ thực vật rộng bằng các phương pháp hóa học phù hợp Các hoạt tính sinh học này bao gồm tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư, chống oxy hóa và nhiều tính năng điều trị khác (Ninh Khắc Bản

& cs, 2004; Nguyễn Quốc Khang & cs, 2004) Riêng đối với hoạt tính kháng ung thư, các nhóm nghiên cứu chủ yếu sử dụng một số dòng tế bào ung thư người như MCF-7 (ung thư vú), HepG-2 (ung thư gan), RD (ung thư cơ), KB (ung thư biểu bì), Hep-2 (ung thư thanh quản), để thử tính gây độc tế bào của hợp chất tự nhiên bằng phương pháp MTT (cytotoxic assay) (Đỗ Khắc Hiếu & cs, 2004; Lê Mai Hương & cs, 2005;

Lê Minh Hà & cs, 2007; Đỗ Thị Thảo & cs, 2007) Một số ít công trình sử dụng mô

hình chuột gây ung thư in vivo để thử hoạt tính kháng ung thư của hợp chất tổng hợp

hay tự nhiên (Trần Công Yên & cs, 2005) Kết quả cho thấy nhiều cây, và cả nhiều chi cây bản địa có tác dụng gây độc tế bào rất cao, cần được nghiên cứu sâu hơn, hướng đến khả năng sử dụng làm thuốc trị ung thư Trong nước hiện chưa có công trình nào công bố về việc nghiên cứu bài thuốc chống ung thư bằng các phương pháp hiện đại

3 Cơ sở thực hiện hướng nghiên cứu của đề tài

Trong điều trị ung thư, một trong những mục tiêu quan trọng là nhắm đến việc khởi phát con đường chết theo chương trình (apoptosis) ở tế bào khối u

Đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng phân bào thực nghiệm của một số bài

thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở mức độ tế bào và phân tử” là sự tiếp nối các đề tài

của nhóm nghiên cứu từ trước đến nay Trong giai đoạn 2002-2005, nhóm nghiên cứu

đã xây dựng các phương pháp và quy trình thực nghiệm để: (1) nuôi cấy các dòng tế bào ung thư người, (2) sàng lọc tính gây độc tế bào (các phương pháp MTT, SRB, Trypan blue, clonogeneic), (3) khảo sát hiện tượng apoptosis (chết theo chương trình)

ở mức độ tế bào và gene và thời điểm tác động trên chu trình phân bào (các phương pháp “thang DNA” (DNA laddering), kính hiển vi huỳnh quang, flow cytometry, thử

nghiệm caspase, Western blot) Các phương pháp và quy trình đã xây dựng trên đã được sử dụng để sàng lọc và đánh giá tác động kháng phân bào của các chất chiết từ cây thuốc Ở giai đoạn kế tiếp (2006-2008), chúng tôi đã chuẩn hóa các quy trình đi từ quy trình thu hái và chế biến cây thuốc, tách chiết hoạt chất cho đến các thử nghiệm sinh học Các kết quả về xây dựng và chuẩn hóa phương pháp, quy trình thực nghiệm của các đề tài trước đều được áp dụng cho nghiên cứu này

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU SINH HỌC

2.1.1 Các dòng tế bào sử dụng trong đề tài bao gồm: dòng tế bào ung thư vú MCF-7,

dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, và dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 Các

dòng tế bào này do Viện Ung thư Hoa Kỳ (NCI) cung cấp

2.1.2 Các bài thuốc sử dụng trong đề tài:

- Song sâm địa thược thang (BT1) gồm: Đảng sâm (Codonopsis pilosula) 15 g,

Sinh địa (Rehmannia glutinosa ) 30 g, Huyền sâm (Scrophularia bucrgeriana ) 30 g,

Bạch hoa xà (Hedyotis diffusa ) 30 g, Bán chi liên (Scutellaria barbata ) 30 g

- Nhị trần thang gia vị (BT2) gồm: Trần bì (Citrus reticulata) 20 g, sử dụng

phần vỏ (pericarpium citri reticulatae), Bán hạ chế (Typhonium divaricatum) 30 g,

Bạch linh (Poria cocos) 30 g, Cam thảo (Glycyrrhiza spp.) 10 g, Bán chi liên

(Scutellaria barbata) 30 g

- Hoàng liên giải độc thang (BT3) gồm: Hoàng liên (Coptis chinensis) 30 g,

Hoàng bá (Phellodendron chinense) 30 g, Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) 30 g,

Bạch thược (Paeonia lactiflora) 20 g, Chi tử (Gardenia jasminoides) 20 g

- Tiểu tích nhuyễn kiên phương (BT4): Bán chi liên (Scutellaria barbata) 30 g,

Bạch hoa xà (Hedyotis diffusae) 30 g, Bạch thược (Paeonia lactiflora) 30 g, Mẫu lệ

(Ostrea gigas) 30 g

Bốn bài thuốc trên do PGS TS Nguyễn Thị Bay, khoa Y học cổ truyền, Đại học

Y Dược Tp HCM cung cấp

- Nam địa long (BT5) gồm: Giun đất (Pheretima aspergillum) 10 g, Đậu xanh

(Vigna radiata) 20 g, Đậu đen (Vigna unguiculata) 20 g, Bù ngót (Sauropus

androgynus L Merr.) 40 g

Hình 1 - Các dòng tế bào sử dụng trong đề tài

Bài thuốc do Lương y Nguyễn An Định cung cấp công thức Dược liệu khô sử dụng trong đề tài đến từ Công ty cổ phần Dược Trung Ương Mediplantex –Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp thu nhận cao nước từ bài thuốc

- Dược liệu cân theo tỉ lệ khối lượng quy định cho mỗi bài thuốc

- Ngâm ngập dược liệu trong nước cất 2 lần, 15 phút Chắt bỏ nước ngâm

- Thêm nước cất 2 lần sao cho mực nước ngập dược liệu (khoảng 200ml)

- Đun sôi trong 5 phút, đảo đều Sau đó, nấu thuốc ở 70 – 800C trong 1,5 giờ

- Thu nước sắc thuốc lần 1

- Thêm nước cất 2 lần sao cho mực nước ngập dược liệu (khoảng 150ml)

- Đun sôi trong 5 phút, đảo đều Sau đó, nấu thuốc ở 70 – 800C trong 1,5 giờ

- Thu nước sắc thuốc lần 2

- Trộn dịch nước sắc của 2 lần nấu Ly tâm ở 4.000 vòng/phút trong 15 phút để loại cặn Nước sắc thuốc sau khi loại cặn được cô qua đêm ở bể ổn nhiệt, nhiệt độ 60 – 700C cho đến khi đạt được thể tích tương ứng với trọng lượng nguyên liệu theo tỉ lệ

1 g : 1 ml

- Li tâm dịch chiết thuốc ở 4.000 vòng/phút trong 15 phút, loại cặn

- Dịch chiết thuốc được sử dụng trong các thử nghiệm được pha loãng đến nồng độ nhất định trong môi trường nuôi cấy tế bào, sau đó, được lọc loại khuẩn bằng màng lọc vô trùng 0.22 µm Nước sắc thuốc được pha loãng sử dụng trong ngày

2.2.2 Phương pháp nuôi tế bào

- Giải đông các dòng tế bào ung thư cần sử dụng, kiểm tra tình trạng nhiễm

dưới kính hiển vi soi ngược

- Tế bào được cấy chuyền khi đã đạt độ phủ 70-80% diện tích bình nuôi cấy:

loại bỏ môi trường cũ, cho 2 ml dung dịch PBS (-)1X để rửa một cách nhẹ nhàng (lặp lại 3 lần)

- Cho 2 ml dung dịch Trypsin/EDTA vào để tách tế bào (khoảng 3 phút)

- Loại bỏ nhanh Trypsin/EDTA, vỗ nhẹ hai thành bình Thêm 1 ml môi trường nuôi cấy Dùng pipette huyền phù nhẹ tế bào Chuyển dịch tế bào vào bình Roux Bổ sung 5 ml môi trường nuôi cấy vào bình

- Ủ trong tủ ấm 5% CO2, 370C

- Thay môi trường mới sau 2 ngày nuôi cấy

2.2.3 Phương pháp SRB (Sulforhodamin B)

Chúng tôi sử dụng có biến đổi quy trình do Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ

(NCI) công bố (In Vitro Cancer Cell Line Screen – Manual of Operations (08/2005))

Nguyên lý của phương pháp dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm màu SRB với protein hiện diện trong mẫu nhờ liên kết tĩnh điện, từ đó đo lượng protein tổng Lượng SRB đo được sẽ tỉ lệ thuận với lượng protein và phản ánh tình trạng sống/chết của tế bào

Thiết kế thí nghiệm: mỗi đĩa bao gồm 1 mẫu chứng dương (Camptothecin 0.01 µg/ml), 1 mẫu chứng âm (môi trường) và 1 mẫu chứng dung môi pha thuốc Mỗi mẫu thử gồm một giếng trắng (blank) và 3 giếng tế bào lặp lại

Quy trình như sau:

- Các dòng tế bào ung thư (từ thế hệ 4 đến 20) được nuôi trong môi trường E’MEM có bổ sung 10 % FBS (Fetal Bovine Serum) ở 370 C và 5 % CO2 đạt độ phủ khoảng 70-80 %

- Tách tế bào bằng trypsin/EDTA: loại môi trường; rửa lớp đơn tế bào bằng 2 ml PBS (-) (NaCl 10 g, KCl 0.25 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4 0.25 g, nước cất đủ 1l); loại PBS và thêm 1 ml trypsin/EDTA vào bình cho ngập lớp đơn tế bào trong 1-2 phút; loại trypsin/EDTA và thêm 1 ml môi trường vào bình; nhẹ nhàng huyền phù tế bào bằng pipette và chuyển 1 ml dịch huyền phù tế bào vào eppendorf 1,5 ml

- Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu với phương pháp Trypan blue: chuyển dịch tế bào đã huyền phù trong Trypan blue 0,4 % vào cạnh buồng đếm đã phủ lamelle; để tế bào cố định vài phút trước khi đếm dưới kính hiển vi, vật kính 10X Các

tế bào sống sẽ sáng rõ, tế bào chết sẽ bị nhuộm xanh Xác định tổng số tế bào trong một ml:

(Tổng số tế bào đếm được/5) x 2 x 10 4 = số tế bào/ml

Lưu ý: 10 4 là thể tích buồng đếm (mỗi ô là 1x1 mm và dày 0.1 mm)

Từ đó suy ra thể tích dịch huyền phù tế bào cần để có mật độ tế bào cần đạt:

(Mật độ cần x 10 x thể tích (ml) dịch tế bào cần)/số tế bào/ml (ở bước trên)

- Tạo dịch tế bào đồng nhất có mật độ mong muốn bằng cách trộn dịch huyền phù tế bào ban đầu với môi trường theo tính toán ở trên

- Đưa 100µl dịch tế bào đồng nhất vào mỗi giếng Dán nhãn đĩa (giờ, ngày, người thực hiện, dòng tế bào) Kiểm tra đĩa dưới kính hiển vi để xem mức độ trải đều của dịch tế bào trong giếng Đặt đĩa vào tủ ấm ủ trong 24 giờ

- Pha loãng cao trong tủ vô trùng

- Xử lý tế bào với cao nước: Ủ trong tủ ấm 48 giờ

- Cố định tế bào: lấy đĩa khỏi tủ ấm và thêm 50 µl TCA (trichloroacetic acid) 50% lạnh (tế bào dính) hoặc 50 µl TCA 80% lạnh (huyền phù tế bào) vào mỗi giếng; đặt đĩa trong tủ lạnh từ 1-3 giờ; lấy đĩa khỏi tủ lạnh và loại dịch trong các giếng bằng cách lật ngược đĩa; rửa đĩa 5 lần bằng nước (200 µl/giếng), thấm đĩa trên giấy sau khi rửa Đặt đĩa trên khay, để khô ở nhiệt độ phòng trong 12-24 giờ

- Nhuộm protein nội bào với SRB: thêm 100 µl SRB vào mỗi giếng, để ở nhiệt

độ phòng trong 20 phút; rửa đĩa 4 lần với acetic acid 1% (200 µl/giếng); thấm đĩa trên giấy sau khi rửa để loại acetic acid còn lại; đặt đĩa trên khay, để khô 12-24 giờ

- Đọc kết quả: thêm 200 µl 10 mM Tris vào mỗi giếng; lắc đĩa trên máy lắc đến khi SRB cố định được hòa tan hết (10 phút); ghi nhận giá trị OD tại bước sóng 492 và

620 nm bằng máy đọc ELISA reader

- Tính toán tỉ lệ ức chế tăng trưởng tế bào theo công thức:

I(%) = (1- (OD (492-620)TN / OD (492-620)C )) x 100%

Tính toán thống kê bằng phần mềm SPSS 13.0

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính caspase

Caspase là họ cysteine protease đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát quá trình apoptosis Do vậy, các thử nghiệm dùng để phát hiện sự hiện diện của caspase là công cụ hữu hiệu để khẳng định sự tồn tại của quá trình apoptosis Ở động vật có vú,

có khoảng 14 loại caspase, phân thành hai nhóm là caspase khởi sự (caspase8, 9, 12) và caspase thực hiện (-3, -6, -7) Trong đó, hai caspase thường được tập trung khảo sát là: (1) caspase-9, khởi sự apoptosis theo con đường thông qua ti thể - con đường thường bị tác động bởi các hợp chất tự nhiên; và (2) caspase-3 là caspase thực hiện cuối, chịu trách nhiệm phân cắt các cơ chất quan trọng trong đó có DNA bộ gene

-Ở công trình này, chúng tôi sử dụng kit Caspase-3 (EnzChek®Caspase-3Assay Kit 2, Invitrogene) để phát hiện hiện tượng apoptosis thông qua việc xác định hoạt tính protease đặc hiệu cơ chất DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) của caspase 3 Cơ chất

chính của bộ kit là Rhodamine 110

bis-(N-CBZ-L-aspartyl-Lglutamyl-L-valyl-L-aspartic acid amide) (Z-DEVD–R110) Khi có sự hiện diện của caspase-3, cơ chất không phát huỳnh quang bị phân cắt thành sản phẩm phát huỳnh quang (bước sóng kích thích 496 nm, bước sóng phát ra 520 nm) Như vậy hoạt tính caspase tỉ lệ thuận với lượng huỳnh quang đo được ở 520 nm

Thử nghiệm được tiến hành như sau:

- Tế bào HeLa được nuôi cấy trong bình Roux 25 cm2 với mật độ ban đầu 7,5.105 tế bào/ bình; kiểm tra độ phủ và hình thái tế bào sau hai ngày nuôi cấy

- Cảm ứng tế bào với bài thuốc ở nồng độ IC50, với chứng âm tế bào không được cảm ứng BT3, chứng dương tế bào được cảm ứng Camptothecin ở nồng độ 0,01 µg/ml

- Sau các khoảng thời gian 12, 24, 36, 48 giờ cảm ứng với thuốc, xác định tỉ lệ sống chết của tế bào bằng phương pháp Trypan Blue

- Tiến hành thử nghiệm caspase: ly giải tế bào bằng dịch ly giải lạnh (EnzChek®Caspase-3Assay Kit 2, Invitrogene), đặt trên đá trong 3 phút, sau đó chuyển sang bồn nước ổn nhiệt 370 C trong 3 phút, lặp lại 4 lần; thu nhận dịch ly giải

tế bào và dùng 5 µl dịch ly giải tế bào để định lượng protein bằng thử nghiệm Bradford

- Định lượng protein bằng thử nghiệm Bradford: dựng đường chuẩn BSA cho định lượng protein:từ dung dịch mẹ BSA 2mg/ml pha loãng trong PBS (-) thành các nồng độ theo bảng sau:

Nồng độ (µg/ml) 0 25 50 75 100 125 150 BSA 2mg/ml (µl) 0 12,5 25 37,5 50 62,5 75

PBS (µl) 1000 987,5 975 962,5 950 937,5 925 Pha loãng mẫu cần xác định lượng protein tổng (thường pha loãng 100 lần)

Cho 160 µl dung dịch Bradford 1X vào giếng, cho 40 µl mẫu/giếng Lắc 3 phút, đo mật độ quang ở 595 nm Tính nồng độ protein dựa trên đường chuẩn BSA

Pha loãng để có được 50 µl dịch ly giải chứa 200µg protein tổng rồi chuyển vào

mỗi giếng/đĩa 96 giếng chuẩn bị cho phản ứng đo hoạt tính caspase-3

- Thiết kế những phản ứng đo hoạt tính caspase-3 gồm: 1 chứng âm - ức chế caspase-3 (bổ sung 1µl “inhibitor” 1mM vào 50 µl dịch ly giải); 1 chứng dương hoạt tính caspase-3 (mẫu ly giải protein của tế bào cảm ứng với camptothecin); các mẫu ly giải (từ tế bào) và các mẫu blank

- Chuẩn bị dung dịch cơ chất cho phản ứng 2X: 10µl Z-DEVD-R110 5mM + 990µl 2X Buffer phản ứng

- Phản ứng: thêm 50µl dung dịch cơ chất 2X vào các mẫu (đã chuẩn bị sẵn ở phần trên), sau đó ủ mẫu ở 370 C Đo tín hiệu huỳnh quang ở bước sóng kích thích 496nm, bước sóng phát ra 520nm trong 30, 90 phút

Công thức tính tỉ lệ thay đổi hoạt động của caspase-3:

Tỉ lệ thay đổi hoạt tính caspase-3 (lần) = OD TN /OD C

Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần Số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS version 13, độ tin cậy 95%

2.2.5 Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang

Nguyên lý của phương pháp sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện hiện tượng apoptosis dựa trên tính thấm qua màng tế bào của một số chất nhuộm phát huỳnh quang như acridine orange (AO) và ethidium bromide (EB) AO thấm qua cả màng tế bào sống và chết còn EB chỉ thấm qua màng tế bào đã mất tính thấm chọn lọc Như vậy, tế bào sống chỉ phát huỳnh quang màu xanh của AO còn tế bào chết, mất tính thấm chọn lọc sẽ phát huỳnh quang màu đỏ cam, là sự kết hợp giữa màu huỳnh quang của AO và EB

Quy trình như sau :

- Tế bào được cho vào các đĩa nhựa nuôi cấy đường kính 35 mm đạt mật độ 105

tế bào/đĩa

- Ủ tế bào ở 37oC, 5% CO2, 24 giờ

- Cảm ứng tế bào với thuốc ở nồng độ IC50

- Sau các khoảng thời gian cảm ứng thuốc, hút cẩn thận hết dịch nổi trong đĩa

Sau đó thêm 25µl dung dịch nhuộm AO/EB (100µg/ml AO: 100µg/ml EB) vào

- Đặt lamelle lên và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với độ phóng đại

1000X Chụp hình 3 thị trường

2.2.6 Phương pháp phân tích DNA bộ gene (“thang DNA”)

Trong quá trình apoptosis ở tế bào động vật có vú, các endonuclease (enzyme thủy phân) được hoạt hoá sẽ phân cắt cấu trúc nhiễm sắc chất tại liên kết giữa các nucleosome tạo thành những đoạn có kích thước là bội số của 180 - 200 bp (hình 2) Phương pháp phân tích DNA bộ gene dựa trên việc thu hồi qua tách chiết các đoạn DNA phân mảnh này và phân tích chúng bằng điện di trên gel agarose

Quy trình như sau :

- Cảm ứng tế bào: chọn những bình tế bào có độ phủ 70- 80%, cảm ứngtế bào với cao chiết tại nồng độ IC50 trong 36 và 48 giờ

- Quan sát các biến đổi hình thái của tế bào dưới kính hiển vi soi ngược, xác định mật độ tế bào và tỉ lệ tế bào sống/chết bằng thử nghiệm Trypan blue

- Ly giải tế bào: thu cặn tế bào qua ly tâm và huyền phù cặn trong 500-600 µl dung dịch ly giải, để trong đá khoảng 45 phút

- Loại bỏ RNA: ly tâm thu dịch nổi sau ly giải, thêm RNase A (10mg/ml) để đạt nồng độ 100 µg/ml, ủ 37o C, trong 1 giờ

- Tinh sạch DNA: xử lý phenol:chloroform/mẫu (1v/1v), rồi chloroform/mẫu (1v/1v), tủa trong ethanol tuyệt đối lạnh (2v ethanol/1v mẫu) với NaCl (300 mM), ủ ở -20o C qua đêm

Các vị trí bị endonuclease cắt tạo thành các đoạn 180 bp và bội số của 180 bp

Hình 2: Nguyên lý của phương pháp phân tích DNA bộ gene

Ly tâm thu tủa 12000 vòng/phút trong 20 phút (4o C), rửa tủa bằng ethanol 70%; ly tâm thu tủa 12000 vòng/phút trong 5 phút, để khô Hòa cặn trong 20 µl TE

- Phân tích sự phân mảnh của DNA bộ gene bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 2% (60V, 30 phút)

2.2.7 Phương pháp flow cytometry

Trong phương pháp này, PI (propidium iodide) được sử dụng để nhuộm DNA của tế bào đã cố định trong ethanol 70% Các phân tử PI thấm vào tế bào, đi vào nhân

và gắn xen vào phân tử DNA mạch đôi Khi tế bào này đi qua đầu dò của máy flow cytometer, dưới tác động của ánh sáng kích thích phát ra từ nguồn laser, các phân tử

PI gắn xen vào DNA của tế bào sẽ phát huỳnh quang Cường độ huỳnh quang phát ra

từ mỗi tế bào tỉ lệ thuận với hàm lượng DNA của tế bào đó Biểu đồ histogram biểu diễn tần số của cường độ huỳnh quang được sử dụng để phân tích hàm lượng DNA của các tế bào trong mẫu

PI là thuốc nhuộm có màu đỏ cam Khi gắn xen vào các nucleic acid mạch đôi, dưới tác động của ánh sáng kích thích có bước sóng 480-580 nm, PI sẽ phát huỳnh quang ở bước sóng 623 nm [14]

Quy trình như sau:

- Cố định tế bào: chuẩn bị huyền phù tế bào với mật độ 106-107 tế bào/ml, trộn 1

ml huyền phù tế bào với 10 ml ethanol 70% lạnh, giữ ở –200C ít nhất 2 giờ

- Nhuộm tế bào với dung dịch PI (20µg/ml): thu hồi cặn tế bào qua ly tâm và huyền phù trong 1 ml dung dịch PBS (-), điều chỉnh mật độ tế bào đạt 5.105 tế bào/ml

Ly tâm thu cặn và huyền phù hóa trong 1 ml dung dịch PI (20µg/ml), ủ ở nhiệt

độ phòng trong 30 phút

- Đo tín hiệu huỳnh quang của tế bào bằng flow cytometry: tín hiệu huỳnh quang hấp thu được ghi nhận thông qua giá trị FL2-H và số tế bào phân tích cho 1 mẫu là 10.000 tế bào Kết quả được biểu thị dưới dạng biểu đồ histogram biểu diễn tần số của giá trị FL2-H (hình 3) cũng là tần số của hàm lượng DNA của các tế bào phân tích

Sử dụng phần mềm CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA) thiết lập các vùng tế bào thuộc các giai đoạn sub-G1, G0/G1, S và G2/M dựa trên hàm lượng DNA tương ứng trên biểu đồ histogram Xác định phần trăm tế bào ở các giai đoạn đó

2.2.8 Phương pháp microarray

Đây là một phương pháp lai phân tử trên giá thể rắn Giá thể rắn có thể là phiến kính, silicon, vật liệu composite có gắn các trình tự DNA tương ứng với số lượng lớn các gene trong bộ gene (khoảng 20.000 gene) được gọi là microarray Các trình tự gene là đối tượng nghiên cứu được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang và đem lai với microarray Kết quả lai giữa trình tự đối tượng với một/nhiều trình tự gene cố định

sẽ được phát hiện thông qua cường độ huỳnh quang ở vị trí xác định trên array Phương pháp này có nhiều ứng dụng, trong đó ứng dụng nổi bật nhất là nghiên cứu biểu hiện của các gene ở mức độ bộ gene cũng như tương tác giữa chúng khi tế bào ở trong một tình trạng xác định, ví dụ như khi có hay không có xử lý “thuốc” (hình 4)

Trong đề tài này, chúng tôi nuôi cấy tế bào HeLa trong bình Roux 25 cm2 với mật độ ban đầu 7,5.105 tế bào/ bình; kiểm tra độ phủ và hình thái tế bào sau hai ngày nuôi cấy Sau đó xử lý tế bào bằng cách ủ với bài thuốc ở nồng độ IC50 trong 24 và 36 giờ

Chúng tôi tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ tế bào có và không có xử lý bài thuốc bằng kit “RNeasy Mini Kit” (Qiagene)

RNA tổng sau đó được gửi đi phân tích bằng phương pháp microarray tại thuộc Đại học Sunkuynkwan (Hàn Quốc)

Hình 3 - Biểu đồ histogram biểu diễn tần số giá trị FL2-H của các tế bào ở giai đoạn sub-G1, G0/G1, S

và G2/M.

Hinh 4: Nguyên tắc microarray

2.2.9 Phương pháp real-time RT-PCR

Đây là phương pháp định lượng RNA dựa trên kỹ thuật phiên mã ngược (reverse transcription) phối hợp với kỹ thuật PCR có sử dụng các chất phát huỳnh quang Chất phát huỳnh quang có hai dạng: dạng dùng để đánh dấu mẫu dò (probe) và dạng gắn xen vào mạch đôi DNA như SYBRGreen Các phân tử SYBRGreen không phát huỳnh quang ở dạng tự do trong môi trường, chỉ phát huỳnh quang khi gắn chèn vào mạch đôi DNA Cường độ huỳnh quang đo được tương ứng với số lượng bản sao DNA được nhân bản tại thời điểm đo

Trong phương pháp định lượng tuyệt đối, người ta sử dụng một đường chuẩn dựng được từ những nồng độ đã biết của trình tự DNA mục tiêu để suy ra nồng độ trình tự mục tiêu có trong một mẫu xác định, tương ứng với cường độ huỳnh quang đo được trên mẫu đó

Tế bào xử lý “thuốc” Tế bào không xử lý

Tách chiết RNA

Phiên mã ngược và đánh

dấu huỳnh quang

Lai cDNA đánh dấu

huỳnh quang với microarray

Đọc tín hiệu huỳnh quang

Đỏ : gene biểu hiện ở tế bào xử lý “thuốc Xanh: gene biểu hiện ở tế bào không xử lý “thuốc”

Vàng : gene biểu hiện ở cả hai trình trạng

Cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với mức độ biểu hiện

Còn trong phương pháp định lượng tương đối, người ta xác định số lần tăng/giảm biểu hiện của một gene ở mẫu thực nghiệm và mẫu chứng, ví dụ mẫu có và không có xử lý thuốc, bằng cách so sánh giá trị Ct của hai mẫu này Giá trị Ct phản ánh số bản sao DNA hiện diện trong mẫu ở thời điểm đo Và để đảm bảo sự khác biệt giá trị Ct là do tăng/giảm biểu hiện gene chứ không phải bắt nguồn từ sự khác biệt hàm lượng RNA ban đầu cho vào phản ứng, người ta đo thêm giá trị Ct của những gene “giữ nhà” (house-keeping gene) vốn có biểu hiện ổn định trong mọi tình huống

Sự tăng/giảm biểu hiện được suy từ công thức sau:

Mức độ tăng tương đối biểu hiện gene = 2 -ΔΔCt

Trong đó: ΔΔCt = ΔCtcảm ứng - ΔCtkhông cảm ứng

ΔCt = Ct gene mục tiêu – Ct gene chứng nội

Quy trình như sau :

- Chọn các gene dùng làm “chỉ thị sinh học” - từ kết quả microarray chọn 5 gene đạt hai tiêu chí: có liên quan đến quá trình apoptosis và có sự tăng/giảm biểu hiện từ hai lần trở lên giữa mẫu tế bào có và mẫu tế bào không có xử lý bài thuốc

- Xây dựng quy trình PCR: thiết kế các cặp primer đặc hiệu cho các gene đã chọn và cho gene “giữ nhà” là GAPDH, thiết lập chương trình real-time PCR tương ứng

- Tách chiết RNA tổng số của mẫu tế bào HeLa được cảm ứng thuốc và mẫu chứng (không được cảm ứng) với mật độ tế bào đạt tế bào 5-6.106tế bào/ml giống nhau giữa các lô bằng RNeasy Mini Kit (Qiagene)

- Tiến hành phản ứng RT-PCR: phiên mã ngược RNA thành cDNA bằng hỗn hợp mồi oligodT và hexamer từ kit Bio-rad, thực hiện phản ứng real-time PCR với mạch khuôn cDNA, cặp mồi đặc hiệu và chất phát huỳnh quang EVAGreen (với

đôi DNA

Cường độ huỳnh quang tương ứng với số bản sao DNA

Hình 5 - Nguyên lý phương pháp realtime RT-PCR sử dụng SYBRGreen

nguyên tắc hoạt động tương tự SYBRGreen) Giá trị ghi nhận là giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) đặc trưng cho một gene và cho gene “giữ nhà”

- Tính mức độ tăng biểu hiện của gene dựa trên công thức nêu trên

Giá trị tính được cho phép định lượng tương đối mRNA của gene đặc hiệu giữa mẫu có và không có xử lý thuốc

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Đề tài gồm 5 nội dung chính:

1 TUYỂN CHỌN CÁC BÀI THUỐC CÓ TÁC ĐỘNG KHÁNG PHÂN BÀO

Đề tài được tiến hành trên 5 bài thuốc, trong đó 4 bài được tuyển chọn dựa trên kiến thức, kinh nghiệm về y học cổ truyền của khoa Y học cổ truyền – ĐH Y Dược Tp HCM, bài thứ năm được dựa trên kinh nghiệm điều trị của Lương y Nguyễn An Định Ngoài tác dụng chữa trị dựa trên kinh nghiệm các bài thuốc này có đặc điểm là không bao gồm quá 5 vị cho mỗi bài Điều này cho phép giảm độ phức tạp trong nghiên cứu tương tác giữa các vị và tương tác giữa thuốc/tế bào

Các bài thuốc được thu thập đồng thời với các thông tin đi kèm liên quan đến tên khoa học, thành phần hóa học, công dụng theo Đông y và tác dụng dược lý theo Tây y cùng một số công trình nghiên cứu trước đây (Phụ lục 7.1)

Tác dụng tóm tắt của các vị trong 5 bài thuốc được trình bày trong bảng 1

Bảng 1 - Tác dụng theo Đông y và Tây y của các vị trong 5 bài thuốc

Bài thuốc Dược liệu Tác dụng theo Đông y Tác dụng theo Tây y

hoạt huyết

Cảm ứng apoptosis dòng tế bào ung thư máu người, bảo vệ và phục hồi tế bào gan Bán chi liên Thanh nhiệt giải độc Cảm ứng apoptosis ở nhiều dòng tế bào

ung thư người và chuột Cao chiết được thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân ung thư phổi, gan, vú

Nhị trần

thang gia

vị (BT2)

Trần bì Lý khí hóa đờm Cảm ứng apoptosis, ức chế tăng sinh một

số tế bào ung thư người, long đờm Bán hạ chế Hóa đờm tiêu tích Cảm ứng apoptosis và ức chế tăng sinh

một số dòng tế bào ung thư người

Bạch linh Kiện tỳ trừ thấp Dừng phân bào và cảm ứng apoptosis trên

một số dòng tế bào ung thư người Cam thảo Ôn trung kiện tỳ Kháng viêm, kháng ung thư, kháng virus,

bảo vệ gan, chống ho Bán chi liên Thanh nhiệt giải độc Như trên

Hoàng liên

giải độc

thang

(BT3)

Hoàng liên Thanh nhiệt giải độc Ức chế tăng sinh tế bào ung thư, giảm

đường máu, chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn

Hoàng bá Thanh nhiệt giải độc Kháng khuẩn/nấm, kháng viêm, chống

sốt, chống ho, hạ mỡ máu, giảm huyết áp Hoàng cầm Thanh nhiệt giải độc Ức chế tăng sinh một số dòng tế bào ung

thư người, kháng khuẩn, điều hòa phản ứng viêm

Bạch thược Thanh nhiệt dưỡng

Bán chi liên Thanh nhiệt giải độc Như trên

Bạch hoa xà Thanh nhiệt giải độc,

Mẫu lệ Nhuyễn kiên cố sáp Giải độc gan, ức chế tăng sinh và di căn tế

bào ung thư, ức chế sinh mạch máu mới

Nam địa

long (BT5)

Giun đất Thanh nhiệt an thần Cảm ứng apoptosis ở nhiều dòng tế bào

ung thư gan, kháng khuẩn, chống đông máu và làm tan máu đông

Đậu xanh Thanh nhiệt giải độc Chống oxy hóa

Đậu đen Thanh nhiệt bổ thận Cung cấp hàm lượng amino acid cao

Bù ngót Thanh nhiệt, hoạt

huyết, giải độc

Cảm ứng apoptosis ở nguyên bào sợi, cung cấp thành phần dinh dưỡng cao Nhìn ở góc độ Tây y, nhiều thành phần trong các bài thuốc đã chọn đều cho thấy ít nhiều có khả năng ức chế sự tăng sinh và cảm ứng apoptosis trên các dòng tế

bào ung thư người, trong đó có hoạt chất được nghiên cứu nhiều như resveratrol có trong Bạch thược Một số thành phần khác có thêm tác động chống oxy hóa, kháng viêm (chống lở loét), ức chế sinh mạch máu mới, tăng cường dinh dưỡng cho cơ thể, tăng cường miễn dịch Qua sự kết hợp các thành phần với hoạt tính sinh học bổ sung như trên, ta có thể thấy được cơ sở khoa học và tính hợp lý của cách dụng dược trong Đông y

2 THU NHẬN DỊCH CHIẾT TỪ BÀI THUỐC

Chúng tôi thu được 5 dịch chiết nước từ 5 bài thuốc khảo sát Các dịch chiết này đáp ứng được yêu cầu của các phương pháp sàng lọc sử dụng trong đề tài là SRB

và Trypan blue, cụ thể là sau khi lọc vô trùng, dịch chiết không còn chứa cặn thuốc có thể ảnh hưởng đến kết quả đọc và không chứa các thành phần vi sinh gây nhiễm tế bào trong quá trình ủ với thuốc Lượng chất có trong dịch chiết cho mỗi lần thử tương đương với lượng chất thu nạp vào cơ thể nếu tính rằng lượng thuốc vào cơ thể sẽ được hấp thu và hòa loãng ra trong tổng thể tích máu trung bình là khoảng 5l

3 SÀNG LỌC CÁC CAO CHIẾT DỰA VÀO TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO TRÊN

BA DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ NUÔI CẤY IN VITRO

Đầu tiên, để đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các bài thuốc, chúng tôi tiến hành thử nghiệm SRB với các dịch chiết thu được ở nồng độ 10% (v/v) (tương đương với nồng độ BT được hòa tan trong cơ thể) trên 3 dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7 và NCI-H460 Tỉ lệ phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào sẽ được sử dụng để chọn bài thuốc có triển vọng tốt nhất cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo Bài thuốc

có tỉ lệ ức chế tăng trưởng cao nhất sẽ được chọn

Kết quả cho thấy sau 48 giờ ủ, cả 5 bài thuốc đều ức chế mạnh sự tăng trưởng của cả 3 dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7 và NCI-H460 với tỉ lệ (%) được thể hiện trong bảng 2, đi từ 73,9 ± 1,5 (%) đến 91,2 ± 1,6 (%)

Các thử nghiệm được lặp lại 3 lần và kết quả cuối cùng là giá trị trung bình cộng của 3 lần lặp lại

Bảng 2 - Tỉ lệ (%) ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc ở nồng độ 10% (v/v) trên 3

dòng tế bào ung thư

BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 HeLa 79,9 ± 0,8 83,0 ± 0,5 78,6 ± 1,0 82,6 ± 3,1 84,1 ± 2,2

NCI-H460 82,1 ± 1,3 73,9 ± 1,5 79,3 ± 1,6 86,9 ± 0,6 91,2 ± 1,6

MCF-7 85,1± 0,7 89,0 ± 0,5 88,3 ± 0,7 88,2± 1,9 78,3 ± 3,2

Chúng tôi tiếp tục khảo sát sự tăng trưởng của 3 dòng tế bào ung thư sau 48 giờ dưới tác động của dịch chiết ở các nồng độ khác nhau để xác định giá trị IC50

Kết quả được trình bày trong các bảng 3, 4 và 5 và các hình 6, 7, 8

Bảng 3 - Kết quả xác định IC50 của các bài thuốc trên dòng tế bào HeLa

Bài thuốc

Nồng độ thử nghiệm (% v/v) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD

IC 50 (% v/v)

BT1

10,00 78,38 81,01 80,20 79,86 ± 1,35

3,01 (1) ± 0,17

5,00 80,79 84,35 85,20 83,45 ± 2,34 2,50 38,13 42,17 43,80 41,37 ± 2,92 1,67 24,23 25,65 31,80 27,23 ± 4,02 1,25 28,96 25,94 29,60 28,17 ± 1,95 1,00 19,98 27,97 26,20 24,72 ± 4,20

BT2

10,00 82,82 83,91 82,23 82,99 ± 0,86

4,38 (3) ± 0,50

5,00 50,58 66,23 58,59 58,47 ± 7,83 2,50 20,08 24,93 33,00 26,00 ± 6,53 1,67 12,93 15,51 21,80 16,75 ± 4,56 1,25 15,44 14,20 14,40 14,68 ± 0,67 1,00 12,55 12,90 15,80 13,75 ± 1,78

BT3

10,00 80,10 76,86 78,92 78,63 ± 1,64

1,47 (1) ± 0,04

5,00 82,85 84,98 83,39 83,74 ± 1,11 2,50 84,65 84,57 83,05 84,09 ± 0,91 1,67 70,26 64,82 60,71 65,26 ± 4,79 1,25 29,50 37,62 30,47 32,53 ± 4,44 1,00 29,38 35,86 34,25 33,16 ± 3,38

BT4

10,00 85,95 76,32 85,45 82,58 ± 5,42

3,06 (2) ± 0,46

5,00 87,37 77,13 83,85 82,78 ± 5,20 2,50 47,94 30,72 41,58 40,08 ± 8,71 1,67 19,59 21,38 24,86 21,94 ± 2,68 1,25 4,25 13,26 20,85 12,79 ± 8,31

Các số liệu trên được thể hiện trên đồ thị sau (hình 6)

0 20 40 60 80 100

Hình 6 - Tác động ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc trên dòng tế bào HeLa Bảng 4- Kết quả IC50 của các bài thuốc trên dòng tế bào MCF-7

Bài thuốc

Nồng độ thử nghiệm (% v/v) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± SD

IC 50 (% v/v)

BT1

10,00 83,76 85,44 86,11 85,10 ± 1,21

1,43 (4) ± 0,04

5,00 85,85 88,51 88,47 87,61 ± 1,52 2,50 89,55 89,64 89,31 89,50 ± 0,17 1,67 72,83 86,41 87,22 82,15 ± 8,08 1,25 23,47 26,21 26,94 25,54 ± 1,83 1,00 16,40 17,80 25,69 19,96 ± 5,01

BT2

10,00 88,73 88,33 89,86 88,97 ± 0,79

2,77 (5) ± 0,23

5,00 91,63 90,60 90,97 91,07 ± 0,52 2,50 47,83 38,90 47,50 44,74 ± 5,06 1,67 19,65 13,13 28,06 20,28 ± 7,48

1,25 -16,56 -8,74 1,94 -7,78 ± 9,29 1,00 -11,90 -8,90 -1,53 -7,44 ± 5,34

BT3

1,00 92,68 91,82 92,62 92,38 ± 0,48

0,36 (1) ± 0,01

0,50 92,68 86,88 91,90 90,49 ± 3,15 0,33 41,30 43,95 44,86 43,37 ± 1,85 0,25 38,00 37,62 41,51 39,04 ± 2,14 0,20 42,51 34,50 35,67 37,56 ± 4,33 0,17 29,62 28,57 31,20 29,80 ± 1,32

BT4

1,67 90,19 91,51 93,39 91,70 ± 1,61

0,93 (3) ± 0,02

1,25 82,04 72,37 86,43 80,28 ± 7,19 1,00 69,48 61,05 69,46 66,66 ± 4,86 0,83 29,41 21,12 32,92 27,82 ± 6,06 0,71 21,21 14,38 17,39 17,66 ± 3,42 0,63 24,15 6,87 6,83 12,62 ± 9,99

BT5

1,00 93,97 91,17 88,40 91,18 ± 2,79

0,64 (2) ± 0,04

0,83 81,64 76,49 83,81 80,65 ± 3,76 0,71 58,82 52,04 73,65 61,50 ± 11,05 0,63 54,38 42,39 53,65 50,14 ± 6,72 0,56 12,48 9,37 2,43 8,10 ± 5,14 0,50 4,30 2,52 2,58 3,14 ± 1,01 (1) (2) (3) (4) (5) thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê

Các số liệu trên được thể hiện trên đồ thị sau (hình 7)

-20 0 20 40 60 80 100

Hình 7 - Tác động ức chế tăng trưởng của 5 bài thuốc trên dòng tế bào MCF-7