nghiên cứu bệnh tay chân miệng ở trẻ em bằng áp dụng kỹ thuật real - time rt-pcr

Xác định yếu tố tiên lượng biến chứng lâm sàng, cận lâm sàng Phương pháp nghiên cứu: áp dụng thiết kế mô tả tiến cứu, chọn mẫu ngẫu nhiên hệ thống với đối tượng nghiên cứu là tất cả các

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

(NGHIÊN CỨU BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM BẰNG ÁP DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR)

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

(Ký tên)

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 7/ 2010

PHIẾU THU THẬP DỮ LIỆU NGHIÊN CỨU

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Quốc gia Đài Loan - Trung Quốc)

đại chuỗi gen với men sao chép ngược)

iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ LIỆU

chuẩn trong 3 lần chạy liên tiếp của phản ứng Realtime-PCR

Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng

vi

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đặt vấn đề: Với tình hình diễn tiến phức tạp của Bệnh tay chân miệng (BTCM) trong

những năm gần đây cả về mặt dịch tễ cũng như lâm sàng, nhu cầu áp dụng một kỹ thuật giúp chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh nhanh hơn, giúp xử trí sớm hơn, đồng thời dự báo sớm khuynh hướng của dịch BTCM nhằm có biện pháp khống chế thích hợp là rất cấp thiết Do đó, nhóm nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR để nghiên cứu sâu về BTCM ở trẻ em

Mục tiêu nghiên cứu:

Mục tiêu tổng quát: Xác định tác nhân gây bệnh (Enterovius 71 và Enterovirus

non-71) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR, tiên lượng độ nặng và ứng dụng để dự báo dịch trong BTCM ở trẻ em

Mục tiêu chuyên biệt:

1 Xác định tác nhân gây bệnh tay chân miệng do Enterovirus 71 và Enterovirus non-71 bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR;

2 Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM do enterovirus;

3 Xác định yếu tố tiên lượng biến chứng (lâm sàng, cận lâm sàng)

Phương pháp nghiên cứu: áp dụng thiết kế mô tả tiến cứu, chọn mẫu ngẫu nhiên hệ

thống với đối tượng nghiên cứu là tất cả các bệnh nhi đến khám hay nhập viện tại Bệnh Viện Nhi Đồng 1 có chẩn đoán BTCM trên lâm sàng Quy trình thực hiện xét nghiệm 3 bước kết hợp kỹ thuật RT- PCR và Realtime RT- PCR được áp dụng để định danh tác nhân gây BTCM và định lượng nồng độ vi rút trong các bệnh phẩm phết họng, phết trực tràng, dịch não tủy và bóng nước Các đặc điểm dân số, triệu chứng lâm sàng và đặc điểm cận lâm sàng, kết quả phân tích sinh học phân tử được thu thập

để tìm hiểu đặc điểm lâm sàng của BTCM và các yếu tố tiên lượng biến chứng

Kết quả: Từ 449 bệnh nhi BTCM đưa vào nhóm nghiên cứu chúng tôi có được 419

(93,3%) trường hợp chẩn đoán dương tính với EV qua thử nghiệm PCR Trong đó, mẫu bệnh phẩm phết họng cho kết quả dương tính cao nhất với 84,5% các trường hợp BTCM là một bệnh lưu hành ở khu vực phía Nam, thường gặp ở trẻ dưới 36 tháng Đây là một bệnh cấp tính; biểu hiện lâm sàng điển hình với các triệu chứng sốt, phát ban dạng sẩn hay bóng nước ở các vị trí đặc hiệu, loét miệng và giật mình; giúp chẩn đoán chính xác trên 90% Biến chứng có thể xuất hiện rất sớm ngay từ ngày đầu tiên,

vii

mức độ biến chứng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng nhưng tỉ lệ biến chứng rất cao đến 47,7% Những biến chứng thường gặp là viêm màng não vô trùng (36,8%), viêm não (9,1%), yếu liệt chi (8,4%), co giật (6%) Các trường hợp biến chứng nặng như viêm não, phù phổi, viêm cơ tim chiếm 10% Tử vong chung chiếm 1,4% trong toàn lô nghiên cứu; 3% trong các ca có biến chứng và 10,9 % trong các ca có biến chứng nặng

Dựa trên các đặc điểm dân số học, các trẻ tử vong đều dưới 24 tháng Tuổi của trẻ

ban ít, giật mình, nôn ói, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, bạch cầu tăng >

nhịp tim nhanh > 150 lần / phút, bạch cầu tăng > 16.000 /mm3 có giá trị trong tiên lượng biến chứng nặng (viêm não, phù phổi cấp, viêm cơ tim) Các yếu tố: nhịp tim nhanh > 150 lần / phút, lactate trong DNT > 2,5 mmol/L, hôn mê, sốc, phù phổi hoặc biến chứng viêm não có giá trị trong tiên lượng tử vong Phân tích về sinh học phân tử, nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm phết họng, phết trực tràng, DNT được lấy ở từ ngày 2-4 của bệnh chưa thấy có mối tương quan rõ ràng với khả năng gây biến chứng của EV71 Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo thời gian tương ứng với những cao điểm của BTCM, nhưng chưa thấy tương quan rõ rệt với biến chứng

Kết luận: Nghiên cứu cho thấy kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp

Realtime-PCR Taqman Probes trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm có có tính đồng nhất, ổn định cao Dựa vào kết quả vi sinh được xác định bằng phương pháp RT-PCR và Realtime RT-PCR, nhóm nghiên cứu đã nhận định được đặc điểm lâm sàng – cận lâm sàng của các bệnh nhi BTCM do EV71 và do nhóm EV khác EV71 Nhóm nghiên cứu

cũng đã đưa ra được những yếu tố tiên lượng về dân số học, lâm sàng và cận lâm sàng

trong BTCM ở trẻ em

viii

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Background: Because of the complicated progress of the epidemic of hand foot

mouth disease (HFMD) in recent years, in both clinical and epidemiological area, it is vital to find a technology which can help identify accurately the etiology of the disease and based on that the patients may have timing effective treatment as well as the potential outbreak may be detected and controlled at the early stage For this reason, the study group has focused on applying Real-time RT-PCR to study in-depth the hand foot mouth disease in children

Research objectives:

Overall objective: Identify the etiology of the disease (Enterovius 71 versus

Enterovirus non-71) with the application of Real-time RT-PCR; study risk factors

of the disease for prognosis purposes; and learn the factors which can anticipate the outbreak of the disease

3 Study the risk factors for prognosis of complications

Study methods: the study applied prospective case-series design and systematically

random sampling method upon the study objects including all children clinically diagnosed with HFMD in both outpatient and inpatient of Children’s Hospital 1 Three – step RT-PCR process, including both conventional PCR and real-time PCR, was employed to identify the presence of EV, EV71 and its viral concentration in collected specimens such as throat swab, rectal swab, cerebrospinal fluid (CSF), and vesicles Demographic characters, clinical signs and symptoms, investigational signs, and molecular analysis results were collected to learn the complications in HFMD in children

Results: Among 449 children will HFMD enrolled in the study, 419 (93.3%) were

positive on RT-PCR with EV presence in at least one specimen (throat swab, rectal swab, CSF, or vesicle) Among them, throat swab was most sensitive (84.5%) HFMD

ix

is endemic in the South of Vietnam, mostly among children less than 36 months of age It is an acute disease, typically manifesting with fever, site-specific rashes, mouth ulcers, sleep disturbance and myoclonic jerks These typical signs and symptoms help diagnose accurately HFMD in 90% of the cases Complications may appear very early since the first day of the disease course Complications vary from mild to very severe with the overall prevalence of 47.7% Common complications include aseptic meningitis (36.8%), encephalitis (9.1%), acute paralysis (8.4%) and convulsion (6%) Severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis are present in 10% of the cases The overall mortality rate is 1.4% in total, 3% among the cases with complications and 10.9 % among the cases with severe complications

In the study, all deaths were under 24 months of age The average age among deaths is less than that among children with complications The factors such as fever,

blood count above 13,000 per cubic milimetre, neutrophile above 7,000 per cubic milimetre, EV71 infection are significantly associated with the presence of

tachycardia, tachypnea, white blood count above 16,000 per cubic milimetre among the cases with severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis; while factors including coma, shock, tachycardia, tachypnea, encephalitis, acute pulmonary oedema and lactate in CSF above 2.5 mmol/l are significantly associated with death In biomolecular analysis, there is no evidence that show the association between the viral concentration in study specimens such as throat swab, rectal swab, CSF and vesicle, which were collected from day 2 to day 4 of the disease course, and EV71-induced complications The rate of EV71/EV was increased

in accordance with the peak of the diseases during the years but not significantly associated with the increase of complication rate

Conclusion: The study had shown the application of Realtime-PCR Taqman Probes

directly on collecyed specimens to indentify EV71 and quantify its concentration was sensitive and stable Based on the microbiological analysis from RT-PCR and Realtime RT-PCR, the study had determined the clinical manifestations of EV71 and non-EV71 – induced HFMD in children The study had also indentified the potential risk factors asssocitaed with the presence of complications in HFMD in children

1

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tên đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu bệnh tay chân miệng ở trẻ em bằng áp

dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR”

Chủ nhiệm đề tài: Ths BS Tăng Chí Thượng

Cơ quan chủ trì: Bệnh viện Nhi Đồng 1

Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2007 đến tháng 4/2009 (đã được chấp thuận gia

hạn đến tháng 12/2009)

Kinh phí được duyệt: 450.000.000 đồng

Kinh phí đã cấp: 280 triệu theo TB 158/TB-SKHCN ngày 25/9/2007 và 125 triệu

theo TB 182/TB-SKHCN ngày 12/10/2009

2 Mục tiêu nghiên cứu:

Mục tiêu tổng quát: Xác định tác nhân gây bệnh (Enterovius 71 và Enterovirus

non-71) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR, tiên lượng độ nặng và ứng dụng để dự báo dịch trong BTCM ở trẻ em

Mục tiêu chuyên biệt:

Xác định tác nhân gây BTCM do Enterovirus 71 và Enterovirus non-71 bằng

kỹ thuật Real-time RT-PCR;

Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM do enterovirus; Xác định yếu tố tiên lượng biến chứng (lâm sàng, cận lâm sàng)

3 Nội dung nghiên cứu:

Chẩn đoán xác định nhiễm Enterovirus bằng qui trình kỹ thuật PCR qua 3 bước: Xác định Enterovirus, xác định EV71 (bằng RT-PCR), định lượng nồng

độ siêu vi EV71 bằng Real-time RT-PCR với đoạn mồi (primer) EV

Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng của BTCM ở trẻ em

So sánh giữa nhóm có và không có biến chứng để tìm yếu tố tiên lượng lâm sàng – cận lâm sàng về khả năng gây biến chứng, nhờ đó có thể chẩn đoán và điều trị đặc hiệu sớm

Phân tích tỉ lệ dương tính đối với từng loại mẫu bệnh phẩm nhằm đưa ra các khuyến cáo phục vụ công tác chẩn đoán bệnh và điều trị

Báo cáo tổng kết (toàn văn và tóm tắt)

Quy trình chẩn đoán nhiễm Enterovirus bằng quy trình kỹ thuật PCR

Báo cáo chuyên đề: Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Bệnh tay chân miệng do vi rút đường ruột (Enterovirus) gây ra, bệnh có khả năng lây lan rất cao qua đường tiêu hóa Enteroviruses (EVs), một giống thuộc họ Picornaviridae, là những vi rút có một chuỗi đơn RNA chia thành 71 nhóm huyết thanh, gồm các nhóm echoviruses, coxsackie virus, polioviruses và các enterovirus (EV) Riêng EV bao gồm các nhóm huyết thanh 68 đến 71 Trong đó coxsackie A16 (CA16) và enterovirus 71 (EV71) là hai tác nhân chính gây bệnh tay chân miệng

Bệnh có biểu hiện bằng loét miệng, phát ban dạng sẩn hoặc bóng nước vùng lòng bàn tay, bàn chân, mông, gối Hai tác nhân quan trọng là CA16 và EV71 có thể gây thành dịch EV71 còn gây ra những biến chứng nguy hiểm như viêm não, viêm cơ tim, phù phổi cấp gây tử vong cao và rất nhanh Trên thế giới từ năm 1974 BTCM do tác nhân EV71 đã xuất hiện ở hầu hết các nước, và gây ra khoảng 13 trận dịch lớn nhỏ Trong đó đáng lưu ý là các trận dịch năm 1973 và năm 1978 tại Nhật Bản, tại Bungary

và Hungary vào những năm cuối của thập kỷ 70 với 4 trận dịch gây nhiều ca tử vong

do biến chứng viêm thân não, tại Malaysia và Đài Loan (Trung Quốc) năm 1997 -

1998 Trong thời gian xảy ra dịch tại Đài Loan (Trung Quốc) năm 1998 đã có trên

Hiện nay bệnh còn xuất hiện thường xuyên theo mùa trong năm tại các nước Đông nam Á và Đài Loan (Trung Quốc) Tại Đài Loan (Trung Quốc) đã có chiến lược kiểm soát bệnh bằng cách xác định tác nhân gây bệnh từ đầu năm nhằm dự đoán có xảy ra dịch hay không để có kế hoạch phòng ngừa Các nghiên cứu cho thấy khi số ca BTCM tăng, nếu tác nhân là EV71 thì số ca viêm não và biến chứng nặng cũng sẽ tăng theo Tại Đài Loan (Trung Quốc) và Singapore đã thiết lập hệ thống giám sát cảnh báo dịch

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

BTCM hiện nay đã trở thành một trong những bệnh phổ biến trong nhi khoa ở phía Nam Theo số liệu thống kê tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 (BVNĐ1), tổng số lượt khám và nhập viện do BTCM hàng năm tương đương với sốt xuất huyết Dengue Bệnh lây qua

4

đường tiêu hóa và có nguy cơ phát triển thành dịch, đặc biệt là trong các môi trường trẻ sống tập trung như nhà trẻ, mẫu giáo

Từ năm 2002 – 2003, tại BVNĐ1 đã xuất hiện nhiều ca viêm não tối cấp, gây tử

sàng điển hình của BTCM Qua nghiên cứu tại BVNĐ1 phối hợp với Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh (TPHCM), lần đầu tiên đã phân lập được EV71 trong phân

Từ đó đến nay, số ca mắc BTCM gia tăng nhanh hàng năm Năm 2006 đã có trên 2000 trường hợp mắc mới được chẩn đoán với trên 400 ca có biến chứng thần kinh, trong đó 63% trẻ bệnh thuộc địa bàn TPHCM Nghiên cứu về tác nhân BTCM phối hợp giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TP.HCM năm 2005 bằng phương pháp nuôi cấy đã xác định

Trong những năm qua, nhờ công tác chủng ngừa, số trường hợp viêm não Nhật Bản nhập viện đã giảm đáng kể so với những năm 90 của thế kỷ trước Từ khi phát hiện và chẩn đoán xác định BTCM, tỉ lệ viêm não liên quan đến BTCM gia tăng và đến nay đã chiếm trên 50% tổng số trường hợp viêm não nhập viện tại BVNĐ1

Những cải tiến về qui trình sàng lọc phát hiện ca bệnh nặng và xử trí tích cực, bước đầu đã giúp giảm tỉ lệ tử vong từ 3,27% (năm 2005) xuống còn 1,23% (năm 2006) Việc điều trị bằng gamma globuline cần phải thực hiện ở giai đoạn sớm khi chưa diễn tiến đến giai đoạn cuối thì mới đảm bảo hiệu quả điều trị Tuy nhiên, phương pháp chẩn đoán cổ điển BTCM bằng phân lập vi rút là một phương pháp tốn kém, thời gian

có kết quả chậm nên ít có giá trị trong công tác điều trị do bệnh diễn tiến rất cấp tính

và tử vong từ 1-7 ngày

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng chẩn đoán với độ chính xác cao của phương pháp khuếch đại chuỗi gen (Polymerase Chain Reation - PCR) trực tiếp từ

RT-PCR được thực hiện trực tiếp từ bệnh phẩm nên tránh được trường hợp khó xác định nhóm huyết thanh do dễ phản ứng chéo

Sự phát triển của kỹ thuật Real-time RT-PCR có thể rút ngắn thời gian trả kết quả nhanh hơn nữa so với RT-PCR cổ điển (2 giờ so với 10 giờ) Các nghiên cứu tại Đài

Nghiên cứu này nhằm giải đáp 2 giả thuyết chính :

- Sự gia tăng tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 có liên quan với cao điểm dịch BTCM, nhờ đó có thể ứng dụng tỉ lệ này để dự báo dịch và can thiệp sớm

- Nồng độ vi rút EV71 từ bệnh phẩm có liên quan đến mức độ biến chứng của BTCM, nhờ đó có thể tiên lượng bệnh và điều trị sớm nhằm giảm biến chứng

và tử vong, đồng thời việc điều trị có chọn lọc cũng làm giảm đáng kể chi phí điều trị do chi phí điều trị bằng gamma globuline rất cao

6

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1:

Bệnh phẩm: Các mẫu bệnh phẩm dịch não tủy (DNT), phết họng, phết trực tràng

ứng

Hệ thống chuẩn và chứng dương: Hệ thống chuẩn dựa vào chuẩn gốc do Viện

Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan-Trung Quốc (National Health Research

copies/ml Dùng chuẩn này pha loãng thành các nồng độ chuẩn cho phép định lượng EVs-RNA và làm chứng dương cho phản ứng Revere transcriptase PCR (RT-PCR) định tính Để có mẫu chuẩn, chúng tôi dùng bệnh phẩm có phản ứng PCR dương tính mạnh với EV (băng điện di sáng và rõ nét) trộn lẫn với nhau (khoảng 5ml) và bảo quản

(QIAmpMinElute Virus Kit), phân chia RNA đã ly trích được thành nhiều ống thử 30

tìm được nồng độ của mẫu chuẩn Pha loãng các mẫu chuẩn và chọn các độ pha loãng

gam chuẩn và chứng dương cho phản ứng Realtime-PCR

Ly trích EVs-RNA: Dựa trên nguyên tắc trong điều kiện biến tính cao khi nhiệt độ

được nâng lên, dưới tác động của QIAGEN Protease và dung dịch đệm AL cùng với

sự bất hoạt của men RNAse sẽ làm màng tế bào vi rút bị phá vỡ để phóng thích RNA Các RNA sẽ gắn kết tối đa vào màng silica khi cho thêm ethanol vào phản ứng Các protein và các chất khác (làm ức chế các phản ứng men trong chuỗi phản ứng PCR) không bám được trên màng silica và sẽ bị loại bỏ sau khi rửa và ly tâm hai lần Cuối cùng RNA tinh sạch sẽ được thu giữ bằng dung dịch đệm thích hợp

Cách thực hiện: Cho vào 1 ống thử Eppendorf nắp khóa 1,5ml: 200 l bệnh phẩm, 25

l Protease, 200 l dung dịch đệm AL (chứa RNA carrier) Vortex kỹ trong 15 giây,

96-100% Vortex kỹ trong 15 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút

Ly tâm nhẹ, chuyển tất cả dung dịch vào MinElute Column (QIAgen), ly tâm 8.000

7

vòng trong 1 phút Chuyển qua ống thử thứ 2, cho thêm vào 500 l AW1, ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút Chuyển qua ống thử thứ 3, cho thêm vào 500 l AW2, ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút Chuyển qua ống thử thứ 4, cho thêm vào 500 l ethanol (96-100%),

ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút Chuyển qua ống thử thứ 5, ly tâm 14.000 vòng / phút trong 3 phút Sau đó chuyển MinElute Column qua một ống thử Eppendorf 1.5ml mới,

mở nắp và ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút Thêm 30 l AE (nước cất không có RNAse), ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 10 phút Sau đó ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút, cẩn thận hút 30 l vào ống thử Eppendorf 1.5ml mới Dùng 10 l dung dịch nổi này cho phản ứng Realtime-PCR

Chứng âm: sử dụng môi trường vận chuyển làm chứng âm ly trích và dung dịch

TE1X làm chứng âm cho phản ứng Realtime-PCR

Thực hiện chẩn đoán bằng phản ứng khuếch đại chuỗi gien có sao chép ngƣợc:

Đối với mỗi mẫu bệnh phẩm, để xác định chẩn đoán chúng tôi áp dụng Qui trình chẩn đoán 3 bước do Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan chuyên giao (đính kèm qui trình thực hiện), gồm 3 bước: xác định EV bằng RT-PCR với đoạn mồi EV (bước 1), nếu dương tính sẽ thực hiện tiếp bước 2 bằng phản ứng RT-PCR với đoạn mồi EV71, trường hợp bước 2 có phản ứng dương tính sẽ thực hiện phản ứng Real-time RT-PCR với đoạn mồi EV để xác định nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm

Định tính EV-RNA và EV71-RNA bằng kỹ thuật RT-PCR: Hai cặp mồi đặc hiệu

cho EV (EV-F và EV-R) và EV71 (F-primer1705 và R-primer 2036) được thiết kế nằm trong vùng VP1 của EV và EV71 genome cho sản phẩm khuếch đại theo thứ tự lần lượt là 148bp và 331bp do NHRI cung cấp Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong các phản ứng PCR như sau:

8

được thực hiện trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước

C / 10 phút trong một chu kỳ Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE Các mẫu dương tính sẽ được thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR với cặp mồi F-primer 1705 và R-primer 2036 trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước như

phút trong một chu kỳ Tương tự như trên, sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE Mỗi lần thực hiện phản ứng RT-PCR đều chạy kèm theo một chứng dương

và hai chứng âm (một chứng âm ly trích và một chứng âm phản ứng PCR)

Định lƣợng EV71-RNA bằng kỹ thuật REAL-TIME PCR với đoạn dò TAQMAN:

Thử nghiệm Realtime-PCR được phân tích trên máy LightCyler (Roche Diagnostics) Bộ thuốc thử LightCycler RNA Amplification Kit Hybprobe (Roche Diagnostics) đã được sử dụng trong phản ứng này Đây là bộ thuốc thử cho phép sử

EV-F, 0.5µl EV-R, 0.1µl TaqMan Hybprobe, 0.2 µl enzymes, 2 µl RNA ly trích Phản

hóa phản ứng, mỗi lần thực hiện Realtime-PCR EV71 đều kèm theo bốn nồng độ

cùng một chứng âm là TBX Phân tích dữ liệu nhờ vào phần mềm của hệ thống máy LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics) Dữ liệu được

(threshold cycle: Ct) của các mẫu thử được xác định tại điểm mà ánh sáng huỳnh quang phát ra vượt quá giới hạn nền Đường cong chuẩn được vẽ tự động dựa vào các giá trị Ct của mỗi một nồng độ chuẩn đã biết Hệ số tương quan của mỗi lần chạy Realtime-PCR phải đạt trên 0.98 và hiệu suất PCR từ 90 đến 100% Số bản copies của RNA trong mẫu thử được tính dựa vào phép nội suy từ đường cong chuẩn

9

Tóm tắt qui trình thực hiện xét nghiệm PCR:

- Bệnh phẩm: phết họng, phết trực tràng, phết bóng nước, dịch não tủy

- Môi trường chuyên chở: Môi trường EMEM-Earle + Gelatin + Antibiotics + Amphotericin B

- Xử lý bệnh phẩm và ly trích RNA từ bệnh phẩm: Sử dụng QIAamp MinElute Virus Spin kit (QIAGEN 57704) để ly trích RNA từ bệnh phẩm theo qui trình chuẩn của NHRI (Đài Loan - Trung Quốc)

- Qui trình thử nghiệm One-Step RT-PCR đối với Enterovirus (NHRI, Đài Loan - Trung Quốc)

10

- Qui trình thử nghiệm One-Step TaqMan probe for Real-time RT-PCR đối với

EV (NHRI, Đài Loan - Trung Quốc)

o Máy RealTime PCR : Light Cycler 1.5 (Roche Diagnostics)

2.2 Nội dung thứ 2 đến nội dung 6:

Đối tƣợng nghiên cứu:

- Tất cả bệnh đến khám hay nhập viện tại bệnh viện nhi đồng 1 có chẩn đoán lâm sàng BTCM

Định nghĩa ca bệnh:

- BTCM: có một trong các dấu hiệu sau

2-3 mm ở vòm khẩu cái, niêm mạc má, nướu, lưỡi

có tính chất: hình bầu dục, nổi cộm hay ẩn dưới da, trên nền hồng ban, không đau, khi bóng nước khô để lại vết thâm, không loét

- BTCM có biến chứng: đủ tiêu chuẩn chẩn đoán BTCM kèm theo một trong các biểu hiện sau:

o Run chi hay giật mình

- Tiêu chuẩn loại trừ:

Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả tiến cứu

Điểm nghiên cứu: tại BVNĐ1 - TP HCM

Thời gian chọn ca bệnh vào nhóm nghiên cứu: tháng 4/2007 đến tháng 3/2008 Ƣớc tính cỡ mẫu:

- Dựa trên kết quả nghiên cứu thử nghiệm tại BVNĐ1, tỉ lệ phát hiện EV bằng RT-PCR là 67%

- Kết quả nghiên cứu hợp tác giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TPHCM, tỉ lệ EV71/EV là 50%

- Tổng số bệnh nhân tay chân miệng đến khám trong năm 2006 tại BVNĐ1 là

2225 bệnh nhân

- Ước tính cỡ mẫu nghiên cứu mô tả dựa vào chương trình Epi Info 2002:

Ước tính tổng số ca nhiễm EV71 được phát hiện: 740 = 67% x 50% x 2225

Tỉ lệ biến chứng của BTCM do EV71: 50%

Sai số xa nhất chấp nhận được: 5% (10% x 50%)

Alpha: 95%

Đưa tất cả thông số trên vào chương trình tính cỡ mẫu trong EPI INFO 2002:

n (EV71) = 125 x n (bệnh tay chân miệng) = 400

Các bệnh phẩm đƣợc thu thập trong nghiên cứu để thực hiện xét nghiệm PCR:

- Phết trực tràng : bằng 1-2 que và cho ngay vào môi trường chuyên chở vi rút

- Phết họng : 1- 2 que rồi cho vào môi trường chuyên chở vi rút

- Phết bóng nước còn tươi và cho vào môi trường chuyên chở vi rút

- DNT: 1-2 ml DNT được cho vào môi trường chuyên chở vi rút

12

Tất cả bệnh nhân được lấy mẫu phết họng, phết trực tràng và phết bóng nước (nếu bóng nước chưa khô) Bệnh nhân nghi ngờ có biến chứng thần kinh sẽ được chọc dò tủy sống để lấy bệnh phẩm dịch não tủy

Bệnh phẩm thực hiện xét nghiệm PCR được cho ngay vào môi trường chuyên chở: EMEM-Earle + Gelatin + Antibiotics + Amphotericin B

Thực hiện xét nghiệm chẩn đoán và điều trị:

- Thực hiện tất cả các xét nghiệm chẩn đoán theo phân loại độ nặng và điều trị theo phác đồ điều trị BTCM tại bệnh viện hiện nay

- Trường hợp có biểu hiện thần kinh, thực hiện xét nghiệm ion đồ, đường huyết, xét nghiệm sinh hoá - tế bào dịch não tuỷ, nuôi cấy dịch não tuỷ và cấy máu

- Trường hợp có suy hô hấp hay biến chứng tim mạch thực hiện thêm xét nghiệm Xquang phổi, ECG, siêu âm tim

- Xét nghiệm PCR được thực hiện theo qui trình sau :

phẩm (đoạn mồi EV)

EV71 (đoạn mồi EV71)

dụng đoạn mồi Enterovirus chung, không sử dụng đoạn mồi đặc hiệu EV

71 để có độ nhạy cảm cao hơn)

13

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nội dung 1: Xác định tác nhân gây BTCM do EV71 bằng kỹ thuật time RT-PCR

Real-Định chuẩn xét nghiệm Real-time RT-PCR

Qui trình chẩn đoán EV71 ba bước gồm 2 phản ứng RT-PCR kết hợp với 1 phản ứng Real-time PCR đã được nghiên cứu chứng minh về độ nhạy cảm và độ đặc hiệu Chúng tôi chỉ áp dụng qui trình được chuyển gia từ NHRI nên không cần thiết lập lại các bước xác định độ nhạy cảm và độ đặc hiệu của phản ứng, mà chỉ thực hiện chuẩn hóa xét nghiệm trong điều kiện cụ thể của phòng xét nghiệm BVNĐ1 thông qua việc xác định độ lập lại của kết quả xét nghiệm và mức độ biến thiên

chuẩn gốc, chúng tôi thực hiện phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes với hệ thống

Từ kết quả phản ứng Real-time PCR dựa trên chuẩn gốc, chúng tôi thiết lập đường cong chuẩn cho phản ứng Kết quả (hình 2) cho thấy đường cong chuẩn của phản ứng

có tương quan tuyến tính khi nồng độ EV71-RNA của mẫu chuẩn nằm trong giới hạn

Để đánh giá mức độ tin cậy của phản ứng Real-time PCR thực hiện tại phòng thí nghiệm BVNĐ1, chúng tôi nghiên cứu về độ lập lại của kết quả phản ứng cho một mẫu chuẩn được thực hiện phản ứng trên nhiều ống nghiệm khác nhau trong cùng một lần chạy phản ứng, cũng như những lần thực hiện phản ứng khác nhau

Hình 1: Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu

chuẩn pha loãng có nồng độ từ 10 2

copies cho tới 10 5 copies/phản ứng trong phản ứng

Realtime-PCR với Taqman probes trong định

lượng EV-RNA

Hình 2: Đường cong chuẩn của Real-Time

PCR với Taqman Probes định lượng EV-RNA

14

Bảng 1 và 2 trình bày độ lập lại của kết quả xét nghiệm trên gam chuẩn có nồng độ

bình

Độ lệch chuẩn

CV (%)

(Ct: Threshold Cycle – Chu kỳ ngưỡng) (CV = coefficient of variation - hệ số biến thiên)

Độ lập lại của phản ứng là khả năng lập lại kết quả xét nghiệm của cùng một mẫu thử, khi phản ứng được thực hiện nhiều lần khác nhau

Để khảo sát độ lập lại của các mẫu thử lâm sàng, chúng tôi sử dụng 3 mẫu ly trích

có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 trên xét nghiệm PCR định tính, mỗi mẫu

lần khác nhau Kết quả trong bảng 3 và 4 cho các giá trị về nồng độ của mẫu mỗi lần lập lại trong một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau

Mẫu

số EV71-RNA

(Copies/ml)

Trung bình

Độ lệch chuẩn

CV (%)

Mẫu

số EV71-RNA (copies/ml)

/ngày

Trung bình

Độ lệch chuẩn

CV (%)

10 5

Lần 3: 2,8 x

10 5Ống 4: 2,3 x

10 3

Lần 3: 8, 1

x 10 3Ống 4: 8,4 x

10 3

Bảng 1: Độ lập lại của chu kỳ ngưỡng (Ct) ứng

với các nồng độ chuẩn trong 3 lần chạy liên tiếp

của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát

hiện và định lượng EV71

Bảng 2: Dữ liệu của đường cong chuẩn

với FAM-490 (Ct)

Bảng 3: Sự biến thiên trong một lần phản

ứng của phản ứng Realtime-PCR Taqman

Probes phát hiện và định lượng EV71

Bảng 4: Sự biến thiên giữa các lần khác

nhau của phản ứng Real-Time PCR Taqman phát hiện và định lượng EV71

15

Hình 3: Độ lập lại của 4 lần chạy của

cùng một mẫu trong cùng một đĩa

Độ lệch chuẩn

CV (%)

Mẫu

số

EV71-RNA (copies/ml) /ngày

Trung bình

Độ lệch chuẩn

CV (%)

10 7

Lần 3: 7,5 x

10 7Ống 4: 8,4 x

10 7

Phản ứng Real-time RT-PCR được xem là

chính xác khi có sự tương đồng với kết quả của

phản ứng RT-PCR định tính đối với EV71 Phản

ứng Real-time RT-PCR sử dụng đoạn mồi EV có

độ chính xác tốt bắt buột phải dương tính nếu

phản ứng RT-PCR trên mẫu thử trước đó dương

tính với EV71 và ngược lại Để nghiên cứu độ

chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman

Probes phát hiện EV71, chúng tôi thực hiện phản ứng định lượng này trên 100 mẫu bệnh phẩm phết họng gồm 90 mẫu dương tính và 10 mẫu âm tính với EV/EV71 bằng

của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes định lượng EV71 phù hợp với phản ứng RT-PCR Các mẫu dương lặp lại đều có chu kỳ ngưỡng gần giống nhau với hệ số biến thiên < 5% và mẫu âm thì đường biểu diễn nằm dưới ngưỡng phát hiện

Hình 4: Hình ảnh khuếch đại của EV71-RNA

trong các mẫu thử khi thực hiện

Realtime-PCR Taqman Probes

Hình 5: Đường cong chuẩn của Realtime-PCR

Taqman Probe định lượng EV71-RNA