xác định nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được khi sử dụng phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích clenbuterol trong thức ăn gia súc

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH đOÀN CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ *  BÁO CÁO NGHIỆM THU đã ựược chỉnh sửa theo góp ý của Hội ựồng nghiệm thu ngày 29/01/20

Trang 1

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH đOÀN

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

* 

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(đã ựược chỉnh sửa theo góp ý của Hội ựồng nghiệm thu ngày 29/01/2010)

XÁC đỊNH NỒNG đỘ THẤP NHẤT CÓ THỂ PHÁT HIỆN KHI SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM

đỂ PHÂN TÍCH CLENBUTEROL TRONG THỨC ĂN GIA SÚC

Chủ nhiệm ựề tài: CN NGUYỄN THỊ VÂN

CNCđ NGÔ HỮU THẮNG

Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

Trang 2

TÓM TẮT ðỀ TÀI

Clenbuterol là một chất thuộc nhóm β - agonist ñược sử dụng bất hợp pháp trong các sản phẩm thịt ñộng vật Clenbuterol ñược bổ sung vào thức ăn gia súc nhằm tạo ra những con thú có tỷ lệ nạc hơn, tăng trọng nhanh hơn Ngoài ra clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, ñây là một dược phẩm ñược ñiều chế ñể

ñiều trị giãn phế quản trên người Vì vậy, clenbuterol có trong sản phẩm thịt ñộng

vật có thể gây ngộ ñộc cho người sử dụng Clenbuterol bị cấm sử dụng trong thực phẩm, theo tổ chức FDA và WHO hàm lượng Clenbuterol tối ña cho phép là 0,2 ppb có trong bắp thịt và béo, 0,6 ppb trong gan và cật Clenbuterol ñược xác ñịnh hàm lượng bằng các phương pháp HPLC, GC – MS, ELISA, Các phương pháp phân tích truyền thống thường chi phí phân tích mẫu cao Phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm bước ñầu nghiên cứu cho thấy có khả năng phân tích nhanh, ñơn giản, giá thành thấp, thiết bị do Việt Nam sản xuất Trong ñiều kiện phân tích tốt nhất với dung dịch nền là Natri Borat 0.1M, pH 9,5 ðường chuẩn xây dựng trên mẫu có giới hạn phát hiện từ 28,2 ppb – 32,6 ppb

Trang 3

SUMMARY

Clenbuterol is one of major β - agonist illegally used in livestock production

It can improve the meat/fat ratio in fattened animals and accelarate livestock growth It also has relaxing effect on non – striated musculature and can be used as

an antiasthmatic and a tocolytic agent in human beings Therefore, excess clenbuterol residues in livestock products may lead to health risks for consumers This has led to a prohibition of clenbuterol use in food production According to the

US FDA and WHO, a maximum residue limit clenbuterol is 0.2 ppb (ppb) in muscle and fat, and 0.6 ppb (ppb) in liver and kidney The amount of clenbuterol can be determined by methods such as HPLC or GC – MS, ELISA, etc However, these traditional methods usually require very expensive preparation procedures Alternatively, a square wave fast scanning polarography method (SQF) was primarily developed and validated to quantify these clenbuterol, which is simple, rapid, low – cost reagent, equipment made in Vietnam Under optimum conditions, Clenbuterol could be baseline separated within a running natri borat buffer 0.1M,

pH 9.5 Highly linear response was obtained for above compound over three oders

of magnitude with detection limits ranging from 28.2 ppb to 32.6 ppb

Trang 4

MỤC LỤC

Trang TÓM TẮT ðỀ TÀI I SUMMARY II MỤC LỤC III DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT V DANH SÁCH BẢNG VI DANH SÁCH ðỒ THỊ VII DANH SÁCH HÌNH VIII

PHẦN MỞ ðẦU 1

ðẶT VẤN ðỀ 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về CLENBUTEROL 5

1.1.1 Cấu trúc khung của các β 2 – agonist: 5

1.1.2 Công thức cấu tạo Clenbuterol: 6

1.1.3 Tính chất lý hoá: 6

1.1.4 Công dụng: 6

1.1.5 Dược ñộng học: 7

1.1.6 Ảnh hưởng của sự tồn dư Clenbuterol trong thịt gia súc, gia cầm lên người sử dụng 10

1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 10

1.3 Các phương pháp xác ñịnh Clenbuterol 11

1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) 11

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS) 12

1.3.3 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC – MS) 13

1.3.4 Phương pháp cực phổ sóng vuông 13

1.4 Tính cấp thiết của ñề tài 14

1.5 Giới thiệu máy phân tích Analyzer SQF – 505 16

1.5.1 Giới thiệu máy phân tích Analyzer SQF – 505 16

1.5.2 Cấu tạo máy 16

1.5.3 Nguyên tắc hoạt ñộng 17

1.5.4 Cách cài ñặt các thông số chạy máy 17

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu, hoá chất thí nghiệm 19

2.2.1 ðối tượng nghiên cứu 19

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 19

2.2.3 Hóa chất và thuốc thử 20

2.2.4 Chuẩn bị các dung dịch và mẫu giả ñịnh 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu ñịnh lượng Clenbuterol 21

2.3.1 Nguyên tắc 21

2.3.2 Khảo sát ñiều kiện ñịnh lượng Clenbuterol bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh 21

2.4 Xây dựng quy trình xử lý mẫu thức ăn chăn nuôi 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 Kết quả thực nghiệm 30

3.1.1 ðịnh lượng CLEN bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh 30

3.1.2 Xây dựng quy trình ñịnh lượng CLEN trong mẫu thức ăn gia súc 43

3.1.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi CLEN trong 3 mẫu thức ăn gia súc 54

Trang 5

3.2 Nghiên cứu phân tích CLEN trên máy ANALYZER SQF – 505 với Mode PSA – F: 56

3.2.1 Khảo sát trên Mode PSA – F: 56

3.2.2 Kết quả khảo sát trên Mode PSA – F: 56

3.3 Bàn luận 56

CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 58

4.1 KẾT LUẬN 58

4.2 ðỀ NGHỊ 59

PHỤ LỤC 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

Trang 6

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

CLEN: Clenbuterol

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high perfomance liquid chromatography) LC/MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ

LOD: Giới hạn phát hiện (limit of detection )

LOQ: Giới hạn ñịnh lượng (limit of quantization)

SQW – F: Sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

Tdrop: Thời ñiểm bắt ñầu quét thế trong ñời sống một giọt

Vstar: Thế bắt ñầu ghi phổ

Vstep: Bước thế quét một chiều

Vpulse: Biên ñộ xung

Vstop: Thế kết thúc quá trình ghi phổ

Trang 7

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Họ β 2 – agonist 5

Bảng 1.2: Thời gian ñào thải CLEN trong nước tiểu và phân ñộng vật 9

Bảng 1.3: ðộ phản ứng chéo của các chất trong họ β 2 – agonist 12

Bảng 3.1: Khảo sát dung dịch nền Na 2 B 4 O 7 – H 3 BO 3 0,2M 30

Bảng 3.2: Khảo sát dung dịch nền Natriacetat 0,2 M 30

Bảng 3.3: Khảo sát dung dịch nền Amoni acetat 0,2 M 30

Bảng 3.4: Khảo sát dung dịch nền Natrihydrophosphat 0,2 M 31

Bảng 3.5: Sự phụ thuộc cường ñộ dòng vào nồng ñộ ñệm Natriborat của CLEN 300 ppb 32 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát chế ñộ quét xuôi và quét ngược 32

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát V star 34

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát Vstep: 34

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát Vpulse 35

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát Time drop 35

Bảng 3.11: Cường ñộ dòng I (nA) của CLEN ñể xây dựng ñường chuẩn trong dung dich nước 41

Bảng 3.12 : Kết quả khảo sát ñộ lặp lại của phép ño 42

Bảng 3.13 : Hiệu suất chiết của các quy trình 48

Bảng 3.14: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) ño ñược khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 1 48

Bảng 3.15: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 2 50

Bảng 3.16: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) ño ñược khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 3 51

Bảng 3.17: Kết quả cường ñộ dòng I (nA) khi dựng ñường chuẩn trên mẫu 4 53

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi 3 mẫu thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm 55

Trang 8

DANH SÁCH ðỒ THỊ

Trang ðồ thị 3.1: So sánh cường ñộ dòng CLEN của 4 dung dịch nền khác nhau 31

ðồ thị 3.2: Cực phổ ñồ của CLEN 300 ppb khi tiến hành quét xuôi trong dung dịch nền Natriborat 0,1 M; pH = 9,5 33

ðồ thị 3.3: Phổ sóng Cl trong dung dịch nền KNO 3 0.1M 37

ðồ thị 3.4: Phổ sóng Fe3+ 4ppb trong dung dịch nền Pyrophosphat 38

ðồ thị 3.5: Phổ sóng Cu 2+ nồng ñộ 4ppb trong dung dịch nền Natri borat 39

ðồ thị 3.6: Phổ sóng Vitamin C nồng ñộ 4ppb trong dung dịch nền Amoni acetat 40

ðồ thị 3.7: Xây dựng ñường chuẩn CLEN trong dung dịch nước 41

ðồ thị 3.8: Cực phổ ñồ sóng vuông của CLEN xây dựng trên mẫu 1 49

ðồ thị 3.9: ðường chuẩn của CLEN xây dựng trên mẫu 1 49

Trang 9

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của CLENBUTEROL 6

Hình 1.2: Quá trình chuyển hóa CLEN trong cơ thể 7

Hình 1.3: Quá trình chuyển hóa Clenbuterol trong nước tiểu chó 8

Trang 10

DANH SÁCH PHỤ LỤC HÌNH

Hình 1.1: Phổ khảo sát dung dịch nền amoni acetat pH 9.5 60

Hình 1.5: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri hydrophosphat pH 10.5 62

Hình 1.9: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri acetat pH 10.5 64

Hình 1.13: Phổ khảo sát dung dịch nền Natri borat pH 9.5 66

Hình 1.18: Phổ khảo sát VStart trong dung dịch nền Natri borat, VStart = 0 mV 68

Hình 1.19: Phổ khảo sát VStart trong dung dịch nền Natri borat, VStart = -100mV

69

70

Hình 1.22: Phổ khảo sát Vstep trong dung dịch nền Natri borat với VStep = 4 mV

70

71

72

Hình 1.26: Phổ khảo sát VPulse trong dung dịch nền Natri borat với VPulse = 10mV

72

73

74

Hình 1.30: Phổ kết quả khảo sát Vstop = - 2000mV 74

Hình 1.31: Phổ khảo sát nồng ñộ dung dịch nền Natri borat 0.05M, pH 9.5 75

Trang 11

Hình 1.34: Phổ kết quả so sánh dung dịch nền Natri borat ở các nồng ñộ khác nhau

76

Hình 1.35: Phổ khảo sát ñộ lặp trong dung dịch nền Natri borat 0.1M, pH 9.5 nồng ñộ CLEN trong dung dịch 100ppb 77

Hình 1.38: Phổ thu ñược khi chiết CLEN bằng dung môi ethanol 78

Hình 1.39: Phổ ño dung dịch chiết 4 mẫu trắng 79

Hình 1.40: Phổ thu ñược khi chiết CLEN bằng dung môi methanol 79

Hình 1.41: Phổ thu ñược khi chiết CLEN bằng dung môi hỗn hợp methanol và isopropanol .80

Hình 1.42: Phổ thu ñược khi phân tích Mẫu 1 80

Hình 1.45: Phổ thu ñược khi phân tích mẫu 4 82

Trang 12

PHẦN MỞ ðẦU

1 Tên ñề tài: “Xác ñịnh nồng ñộ thấp nhất có thể phát hiện khi sử dụng phương

pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ñể phân tích Clenbuterol trong thức ăn gia súc”

Chủ nhiệm ñề tài:

Cơ quan công tác: Chi nhánh phía Nam - Trung tâm Nhiệt ñới Việt - Nga

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện ñề tài: 01/2008 – 12/2008

Kinh phí ñược duyệt: 80.000.000ñ (Tám mươi triệu ñồng)

Kinh phí ñã cấp: 59.000.000ñ (Năm mươi chín triệu ñồng)

2 Mục tiêu của ñề tài: Xác ñịnh nồng ñộ thấp nhất có thể phát hiện khi sử dụng

phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ñể phân tích Clenbuterol trong thức ăn gia súc

3 Nội dung (Theo ñề cương ñã duyệt)

Trang 13

4 Những nội dung ựã thực hiện

chọn dung dịch nền

- đã nghiên cứu 04 dung dịch nền là: dung dịch nền là

Na2B4O7 Ờ H3BO3 nồng ựộ 0,2M; dung dịch nền Natriacetat 0,2M; dung dịch nền Amoni acetat 0,2M; dung dịch nền Natri hydrophosphat 0,2M

- Chọn ựược dung dịch nền thắch hợp ựể phân tắch Clenbuterol trong thức ăn gia súc là natri borat 0,1M, pH = 9,5

Nghiên cứu chọn

chế ựộ chạy máy

thắch hợp

đã chọn ựược chế ựộ chạy máy thắch hợp Mode SQF, Vtart =

-200 mV; VStop = -1800mV ;VStep = 8 mV; VPulse = 30; TDrop = 4000

Nghiên cứu phương

pháp phân tắch

ựịnh tắnh

Phát hiện ựược Clenbuterol trong mẫu ựo

Nghiên cứu phương

pháp phân tắch ựịnh

lượng

đã xây dựng ựường chuẩn và ựường thêm chuẩn, xác ựịnh

ngưỡng phát hiện, sai số và ựộ thu hồi

So sánh kết quả với

phương pháp khác

đã gửi mẫu 04 nền mẫu thức ăn gia súc ựể phân tắch bằng

phương pháp sắc ký tại Công ty CP DV KHCN Hải đăng Tổng hợp, phân

tắch, so sánh các số

liệu thực nghiệm và

viết báo cáo

Báo cáo nghiệm thu

Trang 14

đẶT VẤN đỀ

Gần ựây, trong chăn nuôi heo cũng như gia cầm ở Việt Nam có những thông tin về việc phát hiện chất Clenbuterol trong thịt và thức ăn chăn nuôi của một số công ty trong nước Năm 2006, một ựợt khảo sát trên diện rộng tại ựịa bàn thành phố Hồ Chắ Minh do Chi cục Thú y thực hiện, kết quả kiểm tra 500 mẫu thịt heo

ựang bày bán tại các chợ, thịt ở một số lò vừa giết mổ xong, có gần 30% mẫu dương

tắnh với Clenbuterol đồng thời, khảo sát các doanh nghiệp kinh doanh chế biến thức ăn gia súc trong cả nước phát hiện trên 02 doanh nghiệp có kết quả mẫu thức

ăn gia súc dương tắnh với Clenbuterol

Clenbuterol là một chất thuộc nhóm beta Ờ agonist có tác dụng làm giãn phế quản, ựây là một dược phẩm ựược ựiều chế ựể ựiều trị giãn phế quản trên người, các trường hợp viêm phổi dị ứng trên ngựa và viêm ựường hô hấp trên bò Vào giữa thập kỷ 1980, người ta khám phá rằng khi dùng liều cao các chất beta Ờ agonist theo

ựường miệng, thuốc có thể tạo ra sự gia tăng nhanh chóng và rõ rệt sự tăng khối cơ ựồng thời làm giảm khối lượng mỡ Các nhà chăn nuôi phát hiện tác dụng kỳ diệu

này của Clenbuterol cũng như các chất thuộc họ beta Ờ agonist nên ựã bổ sung vào thức ăn gia súc nhằm tạo ra những con thú có tỷ lệ nạc hơn, tăng trọng nhanh hơn nhằm thu lợi nhuận cao

Tuy nhiên, ngừơi ta phát hiện sự tồn dư của Clenbuterol trong thịt và phủ tạng,

ựặc biệt là gan của những thú ựược nuôi bằng thực phẩm có chứa Clenbuterol ảnh

hưởng ựến sức khỏe người tiêu dùng, ựôi khi gây ngộ ựộc cấp tắnh đã có nhiều báo cáo về các trường hợp ngộ ựộc trên người sau khi tiêu thụ thịt, gan tồn dư Clenbuterol tại các nước Châu Âu và Châu Á Dù vậy, chất này vẫn sử dụng bất hợp pháp trên thị trường thức ăn chăn nuôi

Hiện nay Mỹ, Canada và và các nước thuộc Liên minh Châu Âu cấm sử dụng Clenbuterol và các chất thuộc nhóm beta Ờ agonist Tại Việt Nam, ngày 20/06/2002

Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn chắnh thức cấm sử dụng hoá chất này trong sản xuất, nhập khẩu, lưu thông tại quyết ựịnh số 54/2002/Qđ Ờ BNN

Do ựó ựể bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, vấn ựề vệ sinh an toàn thực phẩm phải ựặt lên hàng ựầu Phải ựảm bảo cung cấp cho người dân những sản phẩm không bị nhiễm bẩn vi sinh vật mà còn không tồn dư những chất có hại cho sức

Trang 15

khỏe bao gồm kháng sinh và các chất kích thích tăng trưởng trong ñó có Clenbuterol

ðể có ñược những sản phẩm an tòan, không chỉ có biện pháp quản lý ở khâu

chuyên chở, giết mổ, chế biến mà cần có biện pháp quản lý từ khâu chăn nuôi, nguyên liệu chế biến thức ăn cũng như thành phẩm tại các cơ sở chế biến thức ăn trước khi xuất bán ñến người chăn nuôi Việc phân tích phát hiện ra dư lượng các chất tồn dư này ở tất cả các công ñoạn từ nguồn nguyên liệu ñến chế biến thì vấn ñề xét nghiệm nhanh là rất cần thiết ñối với các cơ quan quản lý và kiểm soát an tòan thực phẩm, mặt khác xu hướng toàn cầu hoá kinh tế và gia nhập vào Tổ chức Thương mại thế giới (WTO) của nước ta thì việc tồn dư lượng thuốc trong thực phẩm sẽ là rào cản ñối với các doanh nghiệp xuất khẩu thịt và sản phẩm ñộng vật

Vì vậy, chúng tôi ñề xuất ñề tài nghiên cứu: “Xác ñịnh giới hạn thấp nhất có thể phát hiện Clenbuterol trong thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm” [5, 6, 11, 18, 28]

Trang 16

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về CLENBUTEROL

1.1.1 Cấu trúc khung của các ββββ2 – agonist:

Họ β2 – agonist gồm 15 chất dùng làm thuốc ñiều trị bệnh ñường hô hấp ở người, ñộng vật

Trang 17

1.1.2 Công thức cấu tạo Clenbuterol:

Công thức phân tử: C12H18Cl2N2O

Tên quốc tế: 4 – amino – 3,5 dichloro - α [[(1,1 – dimethylethyl) amino] methyl] benzenethanol

Một số tên khác: 4 – amino - α [tert – terbutylamino) methyl] - 3 – 5 dichlorobenzylalcol

Trang 18

CLEN là một chất thuộc nhóm β2 – agonist ñược sử dụng ñể ñiều trị các chứng bệnh liên quan ñến hô hấp như hen, suyễn ở người và ñộng vật Do CLEN gây giãn mạch, kích thích tim, giãn phế quản, không phân giải ñường, không tiêu thụ năng lượng, ái lực với các các thụ thể có mạch hydrocacbon… nên dược sử dụng trong chăn nuôi với mục ñích tăng tỷ lệ nạc trên gia súc, gia cầm thương phẩm Clen còn làm tăng tỷ lệ ñẻ trứng trên gà Tuy nhiên, CLEN cũng gây ngộ ñộc cho ñộng vật nuôi như gà sẽ chết nếu sử dụng thức ăn có chứa CLEN với hàm lượng khoảng 137,05 ppb [1, 2]

1.1.5 Dược ñộng học:

Trong mạch máu CLEN kết hợp với Gs _ protein làm tăng hoạt ñộng cAMP, cAMP làm hoạt ñộng cAMP – dependent protein kinase (PK – A) dẫn ñến lượng

Ca++ ñi vào tế bào tăng lên ảnh hưởng ñến màng cơ tim, làm tăng nhịp tim

Trong phổi: CLEN ñược hoạt hóa ở dạng phế nang, CLEN làm tăng sự hoạt hóa glycogen ở gan và tụy, ảnh hưởng tới glucose trong huyết tương

Trong thận: CLEN kích thích tạo ra aldosterone ở vỏ thượng thận

Hình 1.2: Quá trình chuyển hóa CLEN trong cơ thể

Trang 19

Nghiên cứu sự chuyển hóa của Clenbuterol trong mẫu nước tiểu của chó, tác giả Schmid & Prox kết luận quá trình chuyển hóa xảy ra chậm do không có các liên kết có khả năng phản ứng với enzym, monoamine oxidase và cotechol – O – methyl transferdase, diễn tiến của quá trình chuyển hóa xảy ra như sau:

Hình 1.3: Quá trình chuyển hóa Clenbuterol trong nước tiểu chó

(A) Clenbuterol; (B) 2.3%; (C) 2.2%; (D) 0.5%; (E) 4.5%;

(F) 20% 4 – amino - 3,5dichloromandelic acid; (G)1.6%; (H ) 6.5%; (I) 2.2% (J) 9% 4 – amino - 3,5 dichlorobenzoic acid

Trang 20

Trong một thí nghiệm trên gia súc, khi ñược cho uống, tiêm bắp và tiêm ven bằng 14C – Clenbuterol thì có sự ñào thải qua nước tiểu (50 – 80% của liều sử dụng); qua phân (5 – 30% của liều sử dụng) Có sự ñào thải qua sữa (0,9 – 3% liều

sử dụng) một cách ñều ñặn sau khi qua sử dụng từ 4 – 15 ngày

Bảng 1.2: Thời gian ñào thải CLEN trong nước tiểu và phân ñộng vật

Loài Thời gian sau

khi sử dụng (h)

% trong nước tiểu

mỡ Có tác dụng phân phối lượng năng lượng (repartitioning) nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn Vì vậy, CLEN thường bị lợi dụng dùng làm chất tăng trưởng làm tăng

tỷ lệ nạc so với mỡ

Ngoài ra, CLEN còn ñược dùng làm thuốc giảm béo cho người mập và dùng làm chất kích thích cho các vận ñộng viên thể thao, năm 2001 Uy ban thể thao Olympic quốc tế ñã ra lệnh cấm sử dụng CLEN và các β2 – agonist khác [ 8, 9, 10, 12,13; 14; 15; 16; 17;19; 20; 21; 22; 23]

Trang 21

1.1.6 Ảnh hưởng của sự tồn dư Clenbuterol trong thịt gia súc, gia cầm lên người sử dụng

Clenbuterol có những tác động không mong muốn một cách mạnh mẽ lên người nếu ăn phải sản phẩm động vật cĩ tồn đọng chất này Các hội chứng ngộ độc cấp cho con người gồm các triệu chứng như: run cơ, tim đập nhanh, tăng huyết áp, choáng váng, đau đầu, đau cơ, buồn nôn, sốt ói, gây tổn thương hệ thần kinh

và hệ tuần hồn của con người

Theo báo cáo của một bác sĩ thuộc Trung Tâm Phân Tích ðộc Chất Thú Y Lyons ở miền Nam nước Pháp, những người ăn phải thực phẩm cĩ chứa CLEN thường xuất hiện triệu chứng ngộ độc trong thời gian từ 30 – 360 phút, trung bình khoảng 100 phút, thời gian xuất hiện triệu chứng khơng phụ thuộc tuổi tác và giới tính Sau 72 giờ thì đa số các bệnh nhân khơng cịn triệu chứng trên

Ở Mỹ cơ quan thuốc và thực phẩm FDA cho rằng CLEN hồn tồn cĩ thể gây

chết nếu người ăn phải thịt ngộ độc vốn nhạy cảm hay đang điều trị một loại thuốc

cĩ tác dụng tương tự Năm 2006, cơ quan thuốc và thực phẩm Mỹ cấm sử dụng kể

cả trong điều trị cho người [11, 12, 18 ]

1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước

Để kiểm tra phát hiện Clenbuterol trong thức ăn gia súc, sản phẩm thịt gia súc, các nước EU đang sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng (HPLC) hoặc sắc ký khí khối phổ (GC-MS) với giới hạn phát hiện 1,02 ppb, định lượng được 85% Clenbuterol, độ lệch chuẩn tương đối tương ứng 6,2% Các phương pháp này có ngưỡng phát hiện thấp nhưng quy trình xử lý mẫu phức tạp, thời gian dài

Clenbuterol có chứa nhóm chức amino vì vậy phương pháp sắc ký lỏng sử dụng đầu dò điện hoá cũng tỏ ra hiệu quả với điện cực glassy cacbon, điện cực

so sánh Ag/AgCl hoặc Calomel với độ phát hiện mẫu thấp nhưng có nhược điểm là điện cực phải được làm sạch mài nhẵn sau mỗi lần phân tích

Để tiện dụng, người ta đã chế tạo ra các kit thử còn gọi là Test kits Sử

Trang 22

lỏôỉng maãu lôùn, ựaỉt hieảu quaũ phaùt hieản, ựaỉt toác ựoả traũ lôụi keát quaũ raát nhanh, toán ắt hoùa chaát Tuy nhieân ôũ moảt soá trỏôụng hôỉp coù theă gaẻp dỏông tắnh giaũ neáu nhaân vieân phaân tắch khoâng coù kinh nghieảm,Ầ vaụ coù theă phaũi kieăm tra laỉi baèng phỏông phaùp phaân tắch khaùc [8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 19, 21, 22, 23]

1.3 Các phương pháp xác ựịnh Clenbuterol

Dựa vào tắnh chất và cấu trúc của Clen có rất nhiều phương pháp xác ựịnh trong thức ăn gia súc, thịt, gan, dùng các phương pháp dụng cụ như: phát quang hóa học, sắc ký lỏng, sắc ký khắ, ựiện hóa, phương pháp miễn dịch enzym

1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA)

1.3.1.1 Nguyên tắc

Cơ sở ựịnh lượng dựa trên phản ứng miễn dịch giữa chất kháng nguyên ựặc hiệu và chất kháng thể đó là sự cạnh tranh của enzym cộng hợp và dư lượng CLEN trong mẫu ựể gắn vào kháng thể ựặc biệt CLEN cố ựịnh trên giếng microtiter Trong quá trình thử nghiệm, mẫu và enzym cộng hợp cho vào giếng ựã có sẵn kháng thể Thuốc trong mẫu sẽ cạnh tranh với enzym cộng hợp ựể gắn vào lượng giới hạn của kháng thể ựã có sẵn trong giếng Khi có ựủ lượng thuốc hiện diện trong mẫu, thuốc

sẽ làm bão hòa lượng kháng thể có sẵn Do vậy, phản ứng của enzym sẽ không xảy

ra và chỉ nhận màu nhạt thể hiện kết quả dương tắnh Nếu mẫu âm tắnh, nó sẽ tạo màu ựậm do phản ứng giữa enzym với chất nền [23]

1.3.1.2 độ nhạy và tắnh chọn lọc

Phép thử nghiệm miễn dịch enzym CLEN dùng một kháng thể ựặc trưng chống lại CLEN liên hợp protein, khả năng phản ứng chéo của kháng thể này so với các chất trong họ β2 Ờ agonist

Trang 23

Bảng 1.3: ðộ phản ứng chéo của các chất trong họ ββββ2 – agonist

ðường chuẩn tuyến tính từ 0,05 – 4,5 ppb Phương pháp có thể phát hiện trực

tiếp tổng không cần qua bước thủy giải vì khả năng phản ứng chéo của CLEN miễn dịch enzym với các chất còn lại trong họ β2 – agonist giảm dần

Giới hạn phát hiện nằm ở mức ppb phù hợp với phát hiện dư lượng CLEN trong mẫu thức ăn gia súc (LoD = 0,2 ppb) theo quyết ñịnh cấm của Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Việt Nam

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS)

Dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha ñảo hoặc pha nghịch) thường là chất rắn và pha ñộng (lỏng) mà mỗi cấu tử sẽ ñược rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự khác nhau Cấu tử ra khỏi cột ñược ñưa vào ñầu dò MS và ở ñây cấu tử

ñược ion hóa, phân mảnh và ñược phát hiện dựa vào ñộ giàu m/z Trên cở sở này

nên ñầu dò có thể nhận danh và ñịnh lượng một cách rõ ràng, khẳng ñịnh về hợp chất nào ñó

1.3.2.2 ðộ nhạy và tính chọn lọc

Phương pháp có tính chọn lọc rất cao và rất nhạy Giới hạn phát hiện cỡ 0.01 ppb ðường chuẩn tuyến tính rất dài 0.1 – 100 ppb rất tốt khi ñịnh lượng Phương pháp này phù hợp ñể phân tích và khẳng ñịnh dư lượng CLEN trong thức ăn gia

Trang 24

1.3.3 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC – MS)

Dựa vào sự khác nhau về nhiệt ñộ sôi và ái lực của các cấu tử với pha tĩnh, mỗi cấu tử sẽ ra khỏi cột theo thứ tự khác nhau nhờ sự vận chuyển liên tục của pha

ñộng (khí mang) trên pha tĩnh và ñược phân biệt bởi thời gian lưu giữ khác nhau

Khi phân tích dùng ñầu dò khối phổ, mẫu phải ñược tạo dẫn xuất ñể giảm ñộ phân cực, tăng khả năng bay hơi, nâng cao tính chọn lọc và ñộ hoàn hảo về mặt sắc

ký khí và mặt phổ Khi phân tích ở mức dư lượng trong các loại nền mẫu khác nhau thì mẫu cần phải ñược làm sạch và làm giàu ñảm bảo tính chọn lọc và ñộ ñúng [22, 23]

1.3.3.2 ðộ nhạy và tính chọn lọc

GC – MS là một phương pháp khá nhạy và có tính chọn lọc khá cao vì cho thêm thông tin về mặt cấu trúc ðộ nhạy của GC – MS phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật ion hóa ñược sử dụng Ngoài ra, khi phân tích dùng ñầu dò khối phổ ta có thể nâng cao ñộ nhạy (hạ thấp giới hạn phát hiện) bằng cách dùng kỹ thuật SIM ñồng thời thỏa mãn các yêu cầu cho phương pháp khẳng ñịnh dư lượng CLEN mẫu thức

ăn gia súc (LoD = 0,75 ppb) ðường chuẩn tuyến tính từ 0,4 – 5000 ppb tốt cho ñịnh lượng

Theo chỉ thị cộng ñồng Châu Âu 2002/657/EC bắt buộc phải dùng phương pháp phổ ñể khẳng ñịnh các chất bị cấm tuyệt ñối, nghĩa là phải nhận danh rõ ràng theo quy tắc 4 ñiểm nhận danh (identification point, ký hiệu IP) ñối với các hợp chất cấm thuộc nhóm A theo chỉ thị 96/23/EC và chỉ ñược quyền kết hợp tối ña ba kỹ thuật (ví dụ: HPLC, GC – ECD và TCL) [15]

1.3.4 Phương pháp cực phổ sóng vuông

Kỹ thuật cực phổ sóng vuông là kỹ thuật vi phân biên ñộ lớn, trong ñó hình dạng xung ñược sắp xếp cân xứng, hình dạng thế là hình cầu thang, ñược áp dụng cho ñiện cực làm việc Theo phương pháp này, ñiện cực giọt Hg ñược phân cực bởi một ñiện áp một chiều Estep biến thiên theo thời gian có dạng hình bậc thang và

ñược cộng thêm một xung ñiện áp xoay chiều dạng hình vuông Esw có góc biên ñộ

nhỏ và giữ không ñổi trong suốt quá trình ño.Chiều dài mỗi bước bậc thang có ñiện

áp và chu kỳ của xung phải ñồng nhất (khoảng 5 ms), bước thế của thang ñiện áp

Trang 25

Estep thường cĩ giá trị 10 mV, cường độ xung Esw thường là 10 – 60 mV Các điều kiện này tương ứng với tần số xung là 200 Hz, tốc độ quét thế là 200 mV/s

Với các phản ứng thuận nghịch, kích thước của một xung đủ lớn để quá trình oxy hĩa sản phẩm hình thành ở trong xung thuận ban đầu sẽ diễn ra trong suốt quá trình xung ngược Do đĩ, xung ban đầu sinh ra dịng i1 sau đĩ sẽ sinh ra dịng i2 Tương ứng như vậy sẽ ghi dịng Faraday 2 lần: lần thứ nhất là cuối ban đầu và lần thứ 2 là cuối xung ngược, tại thời điểm này diện tích bề mặt giọt Hg khơng đổi để dịng tụ điện gần như triệt tiêu Sự khác biệt giữa 2 dịng ∆ i = [i(t2)-i(t1)] được vẽ Hình theo bước thế, ta thu được cực phổ ở dạng sĩng, trong đĩ chiều cao của sĩng phổ và diện tích sĩng phổ tương ứng với thế bán sĩng trong cực phổ DC

Thời gian phân tích nhanh nên cĩ thể lặp lại phép phân tích nhiều lần Theo tính tốn, với xung sĩng vuơng cĩ chu kỳ 5ms và bước thế 10 mV, để thu được cực phổ hồn chỉnh trong phạm vi thế quét là 0 – 1V chỉ trong 0.5s Trong cùng điều kiện trên với cực phổ xung vi phân phải cần 50 s Loại trừ ảnh hưởng của dịng tụ

điện, giảm LOD đến mức 10-7

– 10-8M

1.4 Tính cấp thiết của đề tài

Trong thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về tình hình ngộ độc Clenbuterol xảy ra trên người Đầu năm 1990, tại Tây Ban Nha người ta nghi ngờ vì ăn gan bò bị nhiễm độc làm 135 người phải nhập viện Đây là bằng chứng đầu tiên cho việc quản lý thuốc dùng trong chăn nuôi đã gây nên triệu chứng ngộ độc cấp tính đối với người tiêu thụ Ngày 24/09/1990 tại Pháp có 22 người đã bị ngộ độc

do dùng thịt còn tồn dư Clenbuterol Chính vì những tác động không mong muốn này mà hiện nay Clenbuterol đã bị cấm sử dụng trong chăn nuôi tại Mỹ (năm1991), tại Châu Aâu (năm1998) và tại Canada (năm 2004) Tại Việt Nam, ngày 20/06/2002 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn chính thức cấm sử dụng hoá chất này trong sản xuất, nhập khẩu, lưu thông tại quyết định số 54/2002/QĐ – BNN Tuy nhiên hoạt động kiểm soát dư lượng hóa chất có hại đến sức khỏe người tiêu dùng vẫn chưa được thực hiện nghiêm túc ở tất cả các công đoạn từ

Trang 26

nguồn nguyên liệu đến chế biến, số lô hàng trên thị trường phát hiện Clenbuterol vẫn còn

Năm 2004, tại Cần Thơ xảy ra một vụ ngộ độc cũng phát hiện thấy Clenbuterol trong mẫu thức ăn Năm 2006, một đợt khảo sát rộng tại 06 quận huyện trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh do Chi cục Thú y thực hiện, kết quả kiểm tra 500 mẫu thịt heo đang bày bán tại các chợ, thịt ở một số lò vừa giết mổ xong, có gần 30% mẫu dương tính với Clenbuterol điều đáng lo ngại là khi có kết quả xét nghiệm thì toàn bộ số thịt heo trên đã được tiêu thụ hết

Ngày 17/01/2007 Bộ Nông nghiệp – Phát triển Nông thôn ra thông báo 198 công bố tên 06 doanh nghiệp có mẫu thức ăn chăn nuôi phân tích bằng phương pháp ELISA cùng kết quả dương tính ở hai nơi Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, Trung tâm Dịch vụ Phân tích thí nghiệm và gửi mẫu đi Singapore phân tích theo phương pháp sắc ký để so sánh kết quả, đã công bố 2 doanh nghiệp sản xuất thức ăn gia súc sử dụng Clenbuterol bổ sung trong thức ăn gia súc

Trước thực trạng các hoá chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi được sử dụng ở tất cả các công đoạn từ nguồn nguyên liệu đến chế biến, nhu cầu xét nghiệm nhanh rất cần thiết đối với các cơ quan quản lý và kiểm soát an tòan thực phẩm như đã trình bày trên, mặt khác xu hướng toàn cầu hoá kinh tế và gia nhập vào Tổ chức Thương mại thế giới (WTO) của nước ta thì việc tồn dư lượng thuốc trong thực phẩm sẽ là rào cản đối với các doanh nghiệp xuất khẩu thịt và sản phẩm động vật Vì vậy, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích Clenbuterol trong thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm”

Trang 27

1.5 Giới thiệu máy phân tích Analyzer SQF – 505

1.5.1 Giới thiệu máy phân tích Analyzer SQF – 505

Máy phân tích ANALYZER là sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu thiết kế, chế tạo máy phân tích điện hóa hiện đại phục vụ sản xuất nông nghiệp, nuôi trồng thủy sản” do TS Nguyễn Trọng Giao và nhóm các nhà khoa học củaTrung tâm nhiệt đới Việt – Nga nghiên cứu chế tạo, đã được nghiệm thu trước Hội đồng Khoa học Công nghệ – Sở khoa học Công nghệ Tp.HCM ngày 13/01/2005 Máy phân tích ANALYZER đã được Bộ trưởng Bộ Khoa học Công nghệ tặng bằng khen tại Hội chợ Công nghệ và Thiết bị Việt Nam (Techmark 2005, 2007) Đây là một thiết bị phân tích điện hóa hiện đại được hoạt động theo nguyên lý sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm, cực tĩnh, cực rắn, … với phần mềm chuyên dụng tương thích với hệ điều hành Windows XP, có thể phân tích nhiều chất hữu cơ và vô cơ trong các lĩnh vực khác nhau: dư lượng kháng sinh trong thủy sản, vitamin, nguyên tố vi lượng trong sản xuất dược phẩm và thuốc thú y, phân tích các kim loại nặng trong nước thải, thuốc trừ sâu, để kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm và kiểm sóat nguồn nước

1.5.2 Cấu tạo máy

Máy phân tích Analyzer SQF – 505 bao gồm:

- Hệ thống điện cực

- Máy phân tích ANALYZER SQF - 505

- Máy tính để bàn FPT Elead chạy phần mềm phân tích ANALYZER SQF-505

Hệ thống điện cực bao gồm:

- Cực làm việc (Working Electrode): là một cực giọt thủy ngân cĩ tốc độ chảy

ổn định khoảng 13 giây một giọt

- Cực so sánh (Reference Electrode): cực Ag/AgCl/KCl bão hịa cĩ thế khơng

Trang 28

- Cực hỗ trợ (Auxiliary Electrode): là một thanh Platin tinh khiết có tác dụng

hỗ trợ trong suốt quá trình ño

1.5.3 Nguyên tắc hoạt ñộng

Máy phân tích Analyzer SQF – 505 là thiết bị phân tích ñiện hóa hiện ñại hoạt

ñộng theo nguyên lý sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm, cực tĩnh hay cực

rắn; ñược chạy với phần mềm chuyên dụng tương thích với hệ ñiều hành Window

XP Khi hoạt ñộng, ta nhúng vào dung dịch phân tích 3 ñiện cực:

ñộ từ 10mV ñến 40 mV Tiến hành ño dòng Faraday xoay chiều ở ñầu và cuối các

xung vuông trong khoảng thời gian một hai giây của ñời sống một giọt thủy ngân Xây dựng quan hệ giữa dòng Faraday xoay chiều ño ñược và thế một chiều ñặt trên cực làm việc ta thu ñược một phổ sóng vuông quét nhanh Phổ có dạng các ñỉnh khác nhau, mỗi ñỉnh ñặc trưng cho một chất hay hay một giai ñoạn phản ứng ñiện hóa Vị trí ñỉnh ñặc trưng cho từng chất và ñược dùng cho phân tích ñịnh tính, chiều cao ñỉnh (cường ñộ dòng Faraday xoay chiều) hay diện tích ñỉnh (công suất tạo sóng) tỷ lệ thuận với nồng ñộ nên ñược dùng cho phân tích ñịnh lượng

1.5.4 Cách cài ñặt các thông số chạy máy

Cách cài ñặt thông số chạy máy cho Mode ño “SQW-F” (Sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm)

Trang 29

- V start (thế bắt ñầu ghi phổ): giá trị thế bắt ñầu tiến hành phép ño, thường ta

ñặt V start trước giá trị thế ñỉnh khoảng 300 mV ñể chân sóng ñủ rõ

- V stop (thế kết thúc quá trình ghi phổ): ñây là giá trị thế khi phép ño kết

thúc, người ta thường ñặt V stop sau thế ñỉnh khoảng 300 mV ñể chân sóng ñủ rõ

V stop hầu như không ảnh hưởng tới chiều cao sóng và dạng sóng

Việc phối hợp giữa V start, V stop hợp lý tạo ra sự quét thuận (tăng thế dần theo chiều âm) hay quét ngược (tăng thế dần theo chiều dương) Thay ñổi chiều quét ảnh hưởng rất nhiều tới dạng sóng, ñặc biệt là với các chất hữu cơ Với nhiều chất hữu cơ khi ñổi chiều quét có thể làm sóng ñẹp hơn, nhạy hơn hay ngược lại Sự thay ñổi chiều quét, thay ñổi dung dịch nền là một kỹ thuật rất ñơn giản và hiệu quả trong phân tích ñịnh tính và ñịnh lượng

- V step (bước quét thế một chiều): ta có thể lựa chọn các giá trị 2 – 4 – 6 – 8

– 10 mV Giá trị càng cao tốc ñộ quét càng nhanh Khi quét khảo sát sơ bộ, quét toàn thang, nên chọn chế ñộ 8 hay 10 mV Nếu chúng ta chọn giá trị nhỏ (2 – 4 mV) thì trong quá trình ghi phổ, giọt sẽ rơi trước ñiểm kết thúc và không thu ñược phổ mong muốn Trong nhiều trường hợp tốc ñộ quét cũng ảnh hưởng ít nhiều tới chiều cao sóng, nhất là khi có hiện tượng hấp thụ xảy ra trong quá trình quét thế

- V pulse (biên ñộ xung vuông): Ta có thể chọn các giá trị 10, 20, 30, 40 mV

Biên ñộ xung càng lớn sóng càng cao nhưng ñộ phân giải lại giảm xuống Chọn xung quá lớn sóng có thể tù, ñộ phân giải sẽ kém ñi Thông thường hay chạy chế ñộ

20, 30 mV

- Time – drop (thời ñiểm bắt ñầu quét thế trong ñời sống một giọt thuỷ ngân):

Ta có thể cài ñặt các giá trị 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 ms Giá trị này thể hiện thời ñiểm bắt ñầu ghi sóng kể từ thời ñiểm hình thành một giọt thuỷ ngân mới ðể ghi toàn phổ ta nên chọn giá trị 1000 hay 4000 ms, ñể trong quá trình ghi giọt không bị rơi Giá trị Timedrop càng lớn sóng càng lớn vì ñược ghi ở vùng giọt lớn, cường ñộ dòng qua cực làm việc càng cao Khi ñịnh lượng ta thường chọn các giá trị 3000, 4000 hay 5000 ms ñể ñộ nhạy ñược nâng cao

Trang 30

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 01/2008 – 12/2008

- ðịa ñiểm: Phòng nghiên cứu Phân tích Môi trường, Chi nhánh phía Nam, Trung tâm Nhiệt ñới Việt – Nga

2.2 Vật liệu, hoá chất thí nghiệm

2.2.1 ðối tượng nghiên cứu

* Dung dịch chuẩn Clenbuterol Hydrocloride (0,1g/lọ) – ðức

Bảo quản kín, tránh ánh sáng

* Bốn nền mẫu thức ăn trên thị trường:

Mẫu 1: Thức ăn hỗn hợp heo con 7 ngày tuổi – 30 kg

Mẫu 2: Thức ăn hỗn hợp heo thịt 15 – 30 kg

Mẫu 3: Thức ăn hỗn hợp heo thịt 30 – 60 kg

Mẫu 4: Thức ăn hỗn hợp heo siêu nạc 80 kg – xuất chuồng

* Mẫu trắng: là mẫu ñã ñược kiểm tra hàm lượng CLEN tại Công ty Cổ phần dịch

vụ Công nghệ Sắc ký Hải ðăng bằng phương pháp LC/MS/MS, giới hạn phát hiện 0,2ppb Kết quả: không phát hiện (phụ lục)

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Máy phân tích Analyzer SQF – 505

Cân phân tích Precisa XT 220A có ñộ chính xác 0,0001g

Máy ño pH Lavibond pH 200, ñộ chính xác ñến 0,05 ñơn vị

Máy ly tâm lạnh Hettich – ðức tốc ñộ 6000 vòng/phút

Các loại bình ñịnh mức 10ml, 25ml, 50ml, 100ml, 250ml, 500ml và 1000ml Các loại cốc thuỷ tinh 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000ml

Pipet các loại 1ml, 2ml, 5ml, 10ml

Micropipet dung tích từ 20µl, 100µl

Trang 31

2.2.3 Hóa chất và thuốc thử

Nước cất hai lần

2.2.4 Chuẩn bị các dung dịch và mẫu giả ñịnh

Dung dịch chuẩn Clenbuterol Hydrocloride (0.1g/lọ) – ðức Pha dung dịch chuẩn trong nước cất hai lần, ñược bảo quản trong tủ lạnh Các nồng ñộ nhỏ hơn của CLEN ñược pha từ dung dịch chuẩn gốc trong nước cất hai lần

Dung dịch NaOH 0,2M: dùng một cốc thuỷ tinh sạch khô, cân chính xác 0,8g NaOH Dùng nước cất hai lần hoà tan, chuyển sang bình ñịnh mức 100ml và ñịnh mức ñến vạch

Dung dịch ñệm amoni axetat – axetic 0,1M: cân 7,7 g muối CH3COONH4 cho vào một cốc thủy tinh sạch và khô Dùng nước cất hai lần hoà tan, dùng axit axetic hoặc NaOH ñể chỉnh về pH thích hợp, cho vào bình ñịnh mức 1000ml và ñịnh mức

Trang 32

Dung dịch đệm đa năng Briston – Robinson 0,04M: là hỗn hợp các axit phosphoric H3PO4 (0,12M), axit axetic CH3COOH (0,12M), axit boric H3BO3(0,12M) được trộn đồng thể tích với nhau Dùng NaOH (0,2M) để chỉnh hỗn hợp dung dịch axit trên tạo thành dung dịch đệm cĩ pH thích hợp

Dung dịch đệm natri axetat – axetic 0,1M: cân 8,2 g muối CH3COONa cho vào một cốc thủy tinh sạch và khơ Dùng nước cất hai lần hồ tan, dùng axit axetic hoặc NaOH để chỉnh về pH thích hợp, cho vào bình định mức 1000ml và định mức

đến vạch

Dung dịch đệm Natri borat 0,2M: cân 19.08g Na2B4O7.10H2O cho vào một cốc thủy tinh sạch khơ Dùng nước cất hai lần hịa tan, dùng acid clohydric hoặc NaOH để điều chỉnh về pH thích hợp, cho vào bình định mức 1000ml định mức đến vạch

Dung dịch đệm Natrihydrophosphat 0,2M: cân 29,8g Na2HPO4 cho vào một cốc thủy tinh sạch khơ Dùng nước cất hai lần hịa tan, dùng NaOH để điều chỉnh về

pH thích hợp, cho vào bình định mức 1000ml định mức đến vạch

Mẫu giả định (mẫu tự tạo): cho chất chuẩn vào mẫu trắng thức ăn chăn nuơi gia súc (được xác định khơng cĩ Clenbuterol) làm mẫu giả để xây dựng phương pháp định lượng: chiết và định lượng bằng kỹ thuật sĩng vuơng quét nhanh

2.3 Phương pháp nghiên cứu định lượng Clenbuterol

2.3.1 Nguyên tắc:

Dựa vào cơng thức cấu tạo của Clenbuterol cĩ thể dự đốn cơ chế phản ứng

điện hĩa của CLEN như sau:

H2N

Cl

OH N H C(CH3)3

OH

H2N

N HC(CH3)3

2.3.2 Khảo sát điều kiện định lượng Clenbuterol bằng kỹ thuật cực phổ sĩng vuơng quét nhanh

+2e + 2H+ 2HCl +

Trang 33

2.3.2.1 Khảo sát dung dịch nền

Ảnh hưởng của bản chất nền và nồng ñộ nền: Việc chọn dung dịch nền và

nồng ñộ nền thích hợp có ảnh hưởng rất lớn ñến kết quả phân tích Nều sử dụng các nền khác nhau có thể cho sóng có cường ñộ và thế bán sóng khác nhau Khi lựa chọn nền thích hợp, không những làm tăng ñộ nhạy, ñộ ổn ñịnh của cường ñộ dòng

và có tính chọn lọc của phương pháp

Trong kỹ thuật sóng vuông cùng với kỹ thuật chạy máy, ñiều kiện nền ñóng vai trò quyết ñịnh khả năng xác ñịnh các chất Vì thế dựa vào các tài liệu nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam, lần lượt khảo sát các dung dịch nền sau:

* Khảo sát pH nền:

Dung dịch nền Na2B4O7 – H3BO3 0,2M ở các pH 5,5; 6,5; 7,5; 8,5; 9,5; 10,5 Dung dịch nền Natriacetat 0,2 M ở các pH 5,5; 6,5; 7,5; 8,5; 9,5; 10,5

Dung dịch nền Amoni acetat 0,2 M ở các pH 5,5; 6,5; 7,5; 8,5; 9,5; 10,5

Nền Natrihydrophosphat 0,2 M ở các pH 7,5; 8,5; 9,5; 10,5

* Khảo sát nồng ñộ nền:

Muối Natri borat 0,01M; 0,05M; 0,1M; 0,2M ở pH 9,5

ðo trực tiếp Clenbuterol trong từng dung dịch ñệm ở các pH khác nhau Dựa

vào sự xuất hiện và ñặc ñiểm sóng ñể tìm dung dịch nền tối ưu

Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch gốc CLEN và dung dịch làm việc CLEN với từng dung dịch nền (các dung dịch ño có cùng nồng ñộ với nhau) lần lượt ở các pH

tử nhỏ ñến lớn, ở từng dung dịch chọn ra pH tối ưu Tiến hành so sánh giữa các dung dịch nền và chọn ra dung dịch nền tối ưu nhất

2.3.2.2 Khảo sát chế ñộ chạy máy

Khảo sát chế ñộ quét xuôi, quét ngược

Vsart: thế bắt ñầu quét 0 mV ñến – 350 mV

Vstop: thế kết thúc quá trình quét: - 1800 mV

Vstep: bước thế 4, 6, 8, 10

Vpulse: biên ñộ xung 10, 20, 30, 40

Time drop: thời ñiểm bắt ñầu ghi 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 ms

Trang 34

Tiến hành pha dung dịch chuẩn gốc CLEN và dung dịch làm việc CLEN trong dung dịch nền tối ưu Chọn các thông số cho peak cao, E1/2 ổn ñịnh làm thông

số chạy máy trong ñịnh lượng

2.3.2.3 Xây dựng ñường chuẩn CLEN trong dung dịch nước

Tiến hành pha các giải mẫu của dung dịch chuẩn gốc CLEN trong dung dịch nền tối ưu khảo sát ñược ðo phổ sóng vuông của các giải mẫu Sử dụng phần mềm Ms-Excell ñể xử lý số liệu, dựng ñường chuẩn và tính hệ số tương quan R2 ñể có

ñược khoảng nồng ñộ tuyến tính có R2 ≈0,99

2.4 Xây dựng quy trình xử lý mẫu thức ăn chăn nuôi

5g mẫu trắng thức ăn ñã ñược nghiền nát ñồng nhất

Giai ñoạn 1

Thêm chuẩn làm việc, thêm 1 ml NaOH 0,1 N.Chiết bằng 10 ml dung môi/ lần x 05 lần Lắc bằng máy lắc trong 10 phút

Dịch chiết

(6000 vòng/ phút) Dịch ly tâm

Trang 35

* Hiệu suất chiết

Tiến hành tách chiết theo quy trình với mẫu giả ñịnh tương ứng với 03 nồng

ñộ nằm trong khoảng tuyến tính, mỗi nồng ñộ làm 03 lần

Chuẩn bị mẫu ño như sau: thêm dung dịch ñệm vào dịch trong, cho vào bình

ñịnh mức 25 ml cho ñến vạch Ghi phổ sóng vuông

It Tính hiệu suất chiết như sau: H =

Ic x 100%

Trong ñó It : cường ñộ dòng của mẫu giả ñịnh ñược xử lý theo quy trình

Ic : cường ñộ dòng của chuẩn làm việc CLEN trong dung dịch chiết

của mẫu trắng

2.5 Phương pháp tính LOD, LOQ:

2.5.1 Xử lý kết quả phân tích theo phương pháp ñường chuẩn:

ðường chuẩn là một Hình thực nghiệm, khảo sát phụ thuộc tín hiệu phân tích ych

vào hàm lượng xch của chất chuẩn gồm N ñiểm (xch,i ; ych,i) Hàm lượng xch là biến

x A

y D

y E

1

N

i i

x

1 ,

1

2 ,

1 ,

N

i

ch i ch

1

2 ,

1 ,

N

i

ch i ch

N y

Trang 36

} {

i

ch i ch

N

i

ch i ch ch i ch

y y x

x

y y x x r

1

2 ,

1

2 ,

1

, ,

) (

(

) (

(

r hệ số tương quan

1 , 1 , 2

2

2 , 2

,

2 , 2

,

, 1

, ,

,

) 1 ( ) )(

( ) (

ch ch

N

i

N

i i ch i

ch N

i

N

i i ch i

ch i ch

s s N

y x N F E

ND B N

BE NF y

y N x

x

N

y x

y x N

r

r2 (hệ số tương quan bình) = R

) 1 ( 3

1

2 ,

1

, ,

) 1 ( )

(

) )(

( )

(

ch w N

i

ch i ch

N

i

ch i ch ch i ch

s N N

BE NF B

N

BE NF x

x

y y x x slope

) ˆ

1

, 2

y y

s

i ch N

i

i ch

residue

2

1 ,

2 , 2

N

i

i ch residue

r

N r

t

−

Trang 37

Bước 3: phương trình hồi quy là phù hợp thực nghiệm khi tTN > t0.99,f = N - π

s x

- đánh giá ựộ chắnh xác của kết quả phân tắch

Tắnh tắnh hiệu phân tắch trung bình:

m

y y

m

i ij sp

j sp

∑

=

, ,

2.5.2.Xử lý kết quả theo phương pháp thêm chuẩn:

Lập dãy thêm chuẩn: ựánh số thứ tự cho seri các mẫu thử cần phân

tắch j = 1, 2 Ầ.k

Ta lấy mẫu cần phân tắch, dùng pipet hút ra các thể tắch bằng nhau của mẫu thử này cho vào các bình ựịnh mức giống nhau, trừ bình số 1 không thêm chuẩn, còn tất cả các bình còn lại lần lượt cho thêm các lượng khác nhau dung dịch chuẩn

ựã biết nồng ựộ Sau ựó ta thêm các thuốc thử theo quy trình phân tắch ựã thiết lập,

Trang 38

ñịnh mức bằng dung dịch nền ñến vạch ñịnh mức, trộn ñều Ta ño các tín hiệu phân

tích ya,i (i = 1 → N) của mẫu thử không thêm chuẩn và của các mẫu có thêm chuẩn Tính toán phương trình hồi quy bậc nhất: y = a + bx

Trường hợp phổ biến mỗi ñiểm (ai , ysp,a i )N

a A

y D

y E

1

2

1 ,

N

i

N i

1

2 ,

1 ,

N

i

N i a

N yi

} {

i

N i

N

i

N i a N i

y y a

a

y y a a

r

1

2 ,

1

2 1

,

) (

(

) (

(

r hệ số tương quan

1 , 1 , 2

2

2 , 2

,

2 2

,

, 1

,

) 1 ( ) )(

( ) ( )

N N

N

i

N

i i a i

a N

i

N

i i i

a i

i

a N

y a N F E

ND B N

BE NF y

y N a

a

N

y a

y a N

r

Hệ số tương quan có giá trị trong khoảng: -1 ≤ r ≤ +1

r2 (hệ số tương quan bình) = R

) 1 ( 3

1

2 1

,

) 1 ( )

(

) )(

( )

(

ch w N

i

N i

N

i

N i a N i

s N N

BE NF B

N

BE NF a

a

y y a a slope

Trang 39

2 2

) Ẽ

1

, 2

y y

s

i a i

i a

residue

2

1 ,

2 , 2

N

i

i ch residue

đánh giá sự phù hợp của phương trình hồi quy với thực nghiệm dựa vào việc

kiểm ựịnh theo chuẩn Student, chọn tLT = t0.99, f

r

N r

Tắnh kết quả phân tắch của tất cả các mẫu thử trong seri

đối với mẫu thử không thêm chuẩn tắn hiệu phân tắch của mẫu không thêm chuẩn

là ya,1 ứng với nồng ựộ chưa biết là a1 Việc tắnh theo phương pháp thêm căn cứ vào

giá trị ya,1 và hệ số hồi quy b Ta có:

Hàm lượng mẫu:

b

y

đối với mẫu thử không thêm chuẩn còn lại trong seri

đối với các mẫu này ta xử lý theo quy trình như ựã làm ựối với mẫu không thêm

chuẩn, sau khi ựịnh mức, trộn ựều ta tiến hành ựo tắn hiệu phân tắch

ysp,j ; j = 1, 2, k Ờ 1 (không kể mẫu không thêm chuẩn)

Trang 40

2.6 Quy ñổi tương ñương ra ppm, ppb:

Loại ñơn vị ppm, ppb, ppt thuộc loại ñơn vị không thứ nguyên rất thông dụng trong phân tích Khi cần thiết có thể chuyển về loại ñơn vị này:

Mẫu rắn & mẫu lỏng:

ppm = mg/kg ≈ mg/L

ppb = µg/kg ≈ µL

ppt = ng/kg ≈ ng/L

Định dạng
Số trang	97
Dung lượng	3,56 MB