Nghiên cứu tạo và ứng dụng kháng thể đơn dòng nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung

Đề tài nghiên cứu các nội dung sau: Tạo protein tái tổ hợp và xây dựng quy trình tạo protein tái tổ hợp. Tạo KTĐD và xây dựng quy trình tạo KTĐD. Quy trình và kit immunoPCR. Quy trình và kit hóa tế bào miễn dịch. Quy trình và kit ELISA.

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM CÔNG TY TNHH CNSH KHOA THƯƠNG

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

PGS.TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2013

MỤC LỤC

CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI i

TÓM TẮT TIẾNG VIỆT iv

ABSTRACT v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Các protein virus HPV và protein tế bào liên quan đến ung thư cổ tử cung (UTCTC) 2

1.1.1 Các protein virus, oncoprotein E7 và protein cấu trúc L1 2

1.1.2 Các protein tế bào 3

1.2 Tổng quan về kháng thể đơn dòng 3

1.2.1 Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật tạo tế bào lai (hybridoma) 3

1.2.2 Kỹ thuật sản xuất KTĐD từ người bằng cách bất tử hóa lympho bào 4

1.2.3 Dung hợp tế bào lympho người với tế bào u tủy chuột 4

1.2.4 Tạo kháng thể khảm và kháng thể “người hóa” 4

1.2.5 Phương pháp trình diện phage 5

1.2.6 Phương pháp tạo chuột chuyển gene biểu hiện Ig người 5

1.2.7 Sản xuất kháng thể đơn dòng 5

1.3 Các phương pháp phát hiện E7 và p16INK4A 9

PHẦN 2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 9

PHẦN 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 10

3.1 VẬT LIỆU 10

3.1.1 Tế bào 10

3.1.2 Chủng vi sinh vật 10

3.1.3 Vector 10

3.1.4 Chuột thí nghiệm 11

3.1.5 Bệnh phẩm 11

3.1.6 Hóa chất-Môi trường 11

3.1.6.1 Hóa chất 11

3.1.6.2 Môi trường 15

3.2 PHƯƠNG PHÁP 15

3.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 15

3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA, RNA 16

3.2.2.1 Tách chiết DNA bộ gene 16

3.2.2.2 Tách chiết DNA plasmid 16

3.2.2.3 Tách chiết RNA 17

3.2.3 Phương pháp PCR và RT-PCR 17

3.2.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 17

3.2.5 Phương pháp giải trình tự 17

3.2.6 Phương pháp tạo dòng biểu hiện 18

3.2.6.1 Tạo vector tái tổ hợp mang gene mong muốn 18

3.2.6.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli DH5α và BL21 (DE3) 19

3.2.6.3 Chọn lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp có mang gene mong muốn 19

3.2.7 Phương pháp thu nhận – tinh sạch protein tái tổ hợp 20

3.2.8 Phương pháp điện di SDS-PAGE 20

3.2.9 Phương pháp Western blot 21

3.2.10 Phương pháp Bradford 21

3.2.11 Phương pháp tạo KTĐD 21

3.2.11.1 Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột 18

3.2.11.2 Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) 22

3.2.11.3 Sản xuất và tinh sạch KTĐD 23

3.2.12 Phương pháp ELISA 24

3.2.12.1 ELISA trực tiếp 24

3.2.12.2 ELISA “sandwich” 25

3.2.12.3 Phương pháp checkerboard 25

3.2.13 Phương pháp chuyển gene vào tế bào động vật 25

3.2.14 Phương pháp hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry) 26

3.2.14.1.Phương pháp lai hóa miễn dịch tế bào trên lamelle 26

3.2.14.2 Phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch trên lame kính 27

3.2.15 Phương pháp immunoPCR 27

3.2.15.1 Biotin hóa kháng thể 27

3.2.15.2 Tạo đoạn DNA chỉ thị đánh dấu biotin (DNA-biotin) 28

3.2.15.3 ImmunoPCR 28

PHẦN 4 KẾT QUẢ 30

4.1 TẠO PROTEIN TÁI TỔ HỢP E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 VÀ p16INK4A 30

4.1.1 CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU CHO TẠO DÒNG 30

4.1.1.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR nhân bản các gene E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 và p16INK4A 30

4.1.1.2 Thu nhận các gene cần tạo dòng 31

4.1.2 DÒNG HÓA CÁC GENE TƯƠNG ỨNG VÀO VECTOR pET28a(+), pE-SUMO3, pETM-44, pGATVÀ KIỂM TRA VECTOR TÁI TỔ HỢP BẰNG PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 33 4.1.3 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM TRA CHÚNG BẰNG SDS -PAGE VÀ WESTERN BLOT 36

4.1.3.1 Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 16 38

4.1.3.2 Kết quả biểu hiện protein p16INK4A 38

4.1.3.3 Kết quả biểu hiện protein E7 HPV 6 và E7 HPV 11 39

4.1.3.4 Kết quả biểu hiện protein L1 HPV 16 và L1 HPV 18 40

4.1.4 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 40

4.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH 41

4.2.1 BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP 41

4.2.1.1 Hệ vector biểu hiện 41

4.2.1.2 Nhiệt độ cảm ứng 42

4.2.1.3 Nồng độ IPTG cảm ứng 43

4.2.1.4 Thời gian cảm ứng 44

4.2.2 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 46

4.2.2.1 Nồng độ imidazole dùng trong dung dịch rửa cột 47

4.2.2.2 Dung dịch đệm của phản ứng cắt loại bỏ đuôi SUMO 48

4.2.2.3 Ảnh hưởng của một số chất biến tính lên phản ứng cắt 50

4.2.2.4 Kết quả tinh sạch protein p16INK4A từ vector pE-SUMO3 tái tổ hợp 51

4.3 TẠO KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV 16 VÀ p16INK4A 52

4.3.1 GÂY ĐÁP ỨNG MIỂN DỊCH CHUỘT VỚI KHÁNG NGUYÊN MỤC TIÊU 52

4.3.1.1 Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên E7 HPV 16 tái tổ hợp 52

4.3.1.2 Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên p16INK4A tái tổ hợp 53

4.3.2 CHỌN LỌC DÒNG HYBRIDOMA SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV 16 VÀ p16 INK4A 54

4.3.2.1 KTĐD kháng protein E7 HPV16 54

4.3.2.2 KTĐD kháng protein p16INK4A 55

4.3.3 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KTĐD KHÁNG E7 HPV 16 VÀ p16 INK4A 55

4.3.3.1 Kết quả xác định isotype KTĐD kháng E7 HPV 16 và p16INK4A 55

4.3.3.2 Kết quả tinh sạch KTĐD kháng protein E7 HPV 16 và p16INK4A 57

4.3.4 KIỂM TRA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KTĐD 58

4.3.4.1 Kết quả xác định ái lực của KTĐD với kháng nguyên tái tổ hợp 58

4.3.4.2 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 59

4.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ CHO QUY TRÌNH TẠO KTĐD 62

4.4.1 SẢN XUÂT KTĐD QUA NUÔI CẤY TĨNH 62

4.4.1.1 Thu nhận tối đa sinh khối tế bào 4H5 dùng để cấy (seeding) 62

4.4.1.2 Xác định một số điều kiện nuôi tế bào 4H5 để sản xuất KTĐD 63

4.4.2 QUY TRÌNH SẢN XUÂT KTĐD QUA NUÔI CẤY BIOREACTOR 66

4.4.2.1 Mật độ tế bào cấy 66

4.4.2.2 Nồng độ FBS trong môi trường nuôi tế bào 67

4.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH IMMUNOPCR 68

4.5.1 TẠO KTĐD 4H5 ĐÁNH DẤU BIOTIN 69

4.5.2 TẠO ĐOẠN DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN 71

4.5.3 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 1D5 PHỦ GIẾNG 71

4.5.4 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 4H5-BIOTIN VÀ STREPTAVIDIN-ALKALINE PHOSPHATASE (STV-AP) 71

4.5.5 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN 73

4.5.6 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ STREPTAVIDIN (STV) 73

4.5.7 TÁC NHÂN “KHÓA” GIẾNG VÀ SỐ CHU KÌ PCR 74

4.6 XÂY DỰNG QUY TRÌNH HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH 75

4.6.1 NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TỐI ƯU CHO QUY TRÌNH LAI TRÊN LAMELLE 75

4.6.2 TÁC NHÂN CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 79

4.6.3 NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 80

4.6.4 CÁC ĐIỀU KIỆN BỘC LỘ KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 81

4.6.5 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 83

4.6.6 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH KTĐD 1C10 85

4.7 QUY TRÌNH ELISA 87

4.7.1 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “BẮT GIỮ” (PHỦ GIẾNG) TỐT NHẤT 89

4.7.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “PHÁT HIỆN” TỐT NHẤT 90

4.7.3 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “CỘNG HỢP HRP” TỐT NHẤT 90

4.7.4 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TÁC NHÂN KHÓA GIẾNG TỐT NHẤT 91

4.8 KIT IMMUNOPCR - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 95

4.8.1 ĐỘ ĐÚNG 95

4.8.2 ĐỘ CHÍNH XÁC 96

4.8.3 ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH 98

4.8.4 ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH 99

4.8.5 KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CÁC CƠ SỞ Y TẾ 99

4.9 KIT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (HTBMD) - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 101

4.9.1 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-16ICC 101

4.9.1.1.Độ đúng 101

4.9.1.2 Độ chính xác 103

4.9.1.3 Độ đặc hiệu phân tích 104

4.9.1.4 Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 108

4.9.2 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-18ICC 108

4.9.2.1 Độ đúng 108

4.9.2.2 Độ chính xác 110

4.9.2.3 Độ đặc hiệu phân tích 111

4.9.2.4 Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 113

4.9.3 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTp16ICC 113

4.9.3.1 Độ đúng 113

4.9.3.2 Độ chính xác 115

4.9.3.3 Độ đặc hiệu phân tích 118

4.9.3.4 Độ ổn định 119

4.9.3.5 Khả năng triển khai đại trà kit tại cơ sở y tế 121

4.10 KIT ELISA – XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 121

4.10.1 XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ “NGƯỠNG” (CUT-OFF) CỦA KIT 121

4.10.2 ĐỘ ĐÚNG 123

4.10.3 ĐỘ CHÍNH XÁC 124

4.10.4 ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH 126

4.10.5 ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH 126

4.10.6 KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CƠ SỞ Y TẾ 127

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128

TÀI LIỆU THAM KHẢO 130

CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài : NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Chủ nhiệm : PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

Cơ quan chủ trì : Công ty TNHH CNSH Khoa Thương

Thời gian thực hiện : 36 tháng,

Báo cáo tiến độ : 6/2011

Thời gian được gia hạn : 6 tháng

Kinh phí được duyệt : 3.050.000.000 đồng

Kinh phí đã cấp :

2 Mục tiêu : Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển một công nghệ mới ở Việt Nam, công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD) phục vụ cho chẩn đoán và điều trị Đối tượng nghiên cứu của đề tài là HPV (Human Papillomavirus), một loại virus có liên quan chặt chẽ với ung thư cổ tử cung Mục tiêu cụ thể bao gồm : (1) Hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD ở quy mô nhỏ và vừa, áp dụng để tạo KTĐD kháng một số protein liên quan đến ung thư cổ tử cung như E7 HPV16/18, p16INK4A ; (2) Ứng dụng các KTĐD đã tạo được

để phát triển các phương pháp chẩn đoán dựa trên kỹ thuật immuno PCR và miễn dịch mô/ tế bào ; (3) Xây dựng một số kit nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung dựa trên kỹ thuật immuno-PCR và hóa miễn dịch mô, tế bào

3 Nội dung

1 Báo cáo tổng kết với đầy đủ nội

dung và đúng quy định của Sở

mg cho mỗi loại protein Gene L1 HPV 16 và L1 HPV 18 tạo dòng biểu hiện không thành công

3 Quy trình tạo protein tái tổ hợp Quy trình tạo protein tái tổ hợp vời các vector

Bộ vector cùng với quy trình tạo

dòng tương ứng có thể sử dụng để

tạo dòng nhiều loại protein

pET28(a+), pETM-44, pGAT và pSUMO3 có thể dùng để tạo dòng các protein có tính tan khác nhau

4 Quy trình tạo KTĐD – thực hiện

được tại Việt Nam, xác định được

các thông số về loại môi trường,

tốc độ lắc, thời gian nuôi cấy

trước khi thu kháng thể

Quy trình tạo KTĐD – thực hiện được tại Việt Nam

Quy trình thu nhận KTĐD 4H5 gồm các thông

số cụ thể : (1) thu sinh khối làm nguyên liệu cấy : môi trường RPMI 1640 chứa FBS 10 %, mật độ 2.106 tế bào/ml môi trường, nuôi 48 giờ

; (2) thu nhận KTĐD bằng nuôi cấy bình Roux: môi trường RPMI 1640 chứa FBS 5 %, mật độ 2.106 tế bào/ml môi trường, thu mẫu sau 96 giờ

; thu nhận KTĐD với bioreactor : môi trường RPMI 1640 chứa FBS 10 %, mật độ 5.105 tế bào/ml môi trường, thu mẫu sau 168 giờ

5 Kháng thể đơn dòng – 2 loại

KTĐD kháng E7 HPV 16 và

p16INK4A, độ tinh sạch  90 %,

hàm lượng 10 mg/l môi trường

nuôi cấy hybridoma

2 loại KTĐD : 2C1 kháng E7 HPV 16, hàm lượng 7,6 mg/ml độ tinh sạch 95 %, và 1C10 kháng p16INK4A, hàm lượng 7,3 mg/ml, độ tinh sạch 92 %

2 KTĐD 4H5 và 1D5 kháng E7 HPV 18 tạo từ

đề tài trước được sản xuất với hàm lượng lần lượt là 8,8 mg/ml và 6,7 mg/ml và độ tinh sạch lần lượt là 90 % và 98 %

6 Quy trình immunoPCR – 3 quy

mẫu bệnh với độ đặc hiệu là 95 %

so với kit OncoTect (Invirion

01 kit immunoPCR phát hiện protein E7 HPV

18 trong mẫu bệnh, độ nhạy phân tích 1 ng/ml, không có so sánh với kit đối chứng ; 50 phản ứng/kit x 6 kit

Diagnostics), độ nhạy cao hơn

10-100 lần ; 50 phản ứng /kit x 3 loại

kit x 6 kit/loại

8 Quy trình hóa miễn dịch tế

bào/mô – 2 quy trình hóa miễn

dịch tế bào hoặc hóa miễn dịch

mô để phát hiện p16INK4A và E7

HPV 16

Quy trình hóa miễn dịch tế bào – 3 quy trình phát hiện p16INK4A, E7 HPV 16, và E7 HPV 18 được xậy dựng dựa trên các dòng tế bào chứng dương và âm phù hợp

9 Kit hóa miễn dịch tế bào/mô – 02

kit phát hiện p16INK4A và E7 HPV

16 với độ đặc hiệu và độ nhạy

tương đương (90-100%) với các

kit thương mại tương ứng ; 50

phản ứng /kit x 2 loại kit x 6

kit/loại

Kit hóa miễn dịch tế bào – 03 kit phát hiện p16INK4A, E7 HPV 16 và E7 HPV 18 Kit E7 HPV 16 phù hợp 80 % với kit chứng ; kit E7 HPV 18 phù hợp 53 % với kit chứng ; kit p16INK4A phù hợp 85 – 85,7 % với kit chứng ;

50 phản ứng /kit x 2 loại kit x 6 kit/loại

10 Bài báo quốc tế và trong nước –

02 bài đăng tại tạp chí khoa học

và công nghệ chuyên ngành

03 bài báo đăng tại tạp chí chuyên ngành trong nước

11 Báo cáo khoa học tại hội thảo

quốc tế và trong nước chuyên

ngành – 2 bài

01 báo cáo poster tại hội nghị quốc tế

dựng dựa trên các dòng tế bào chứng dương và

âm phù hợp

tế bào cổ tử cung, độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng lần lượt là 91,6 % và 88,89 % tại gía trị

“ngưỡng” là 0,250

14 Luận văn Thạc sĩ 03 luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền

TÓM TẮT TIẾNG VIỆT

Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD)

phục vụ chẩn đoán và điều trị bệnh Mục tiêu cụ thể là hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD

kháng một số protein liên quan chặt chẽ đến ung thư cổ tử cung như E7 HPV 16, 18, p16INK4A ; ứng dụng các KTĐD tạo được để phát triển các quy trình immunoPCR và hóa

tế bào miễn dịch ; và dựa trên các quy trình này để xây dựng các kit chẩn đoán nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung

Các nội dung chủ yếu của đề tài bao gồm :

1 Tạo protein tái tổ hợp và xây dựng quy trình tạo protein tái tổ hợp Chúng tôi đã tạo

được các protein E7 HPV 6, 11, 16, p16INK4A Các protein này được kiểm tra bằng kỹ thuật Western blot và có độ tinh sạch 92-95 % Các protein này được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột cho nội dung tạo KTĐD Quy trình tạo protein tái tổ hợp với vector pET28a(+) và pSUMO-3 có thể áp dụng để tạo dòng biểu hiện nhiều loại protein

2 Tạo KTĐD và xây dựng quy trình tạo KTĐD Chúng tôi đã tạo được các hybridoma

sản xuất KTĐD kháng protein E7 HPV 16 và p16INK4A Các KTĐD này và KTĐD kháng E7 HPV 18 được thu nhận theo hai cách : nuôi cấy tĩnh và nuôi trong bioreactor Các KTĐD tạo được có ái lực mạnh với kháng nguyên mục tiêu, độ tinh sạch  90 % Quy trình thu nhận KTĐD, gồm các thông số về môi trường, mật độ tế bào cấy, thời gian nuôi trước khi thu kháng thể, có thể thực hiện được trong điều kiện phòng thí nghiệm trong nước

Từ các KTĐD đã tạo được, chúng tôi xây dựng các quy trình và các kit immunoPCR, hóa tế bào miễn dịch và ELISA

3 Quy trình và kit immunoPCR Chúng tôi xây dựng quy trình immunoPCR phát hiện

protein E7 HPV 18 ; và dựa trên quy trình để xây dựng kit immunoPCR nhằm phát hiện kháng nguyên mục tiêu trong dịch ly giải tế bào cổ tử cung Kit immunoPCR được so sánh với kit Amplisense HPV Typing Độ đúng và độ đặc hiệu phân tích cũng như khả năng triển khai rộng rãicủa kit immunoPCR không cao

4 Quy trình và kit hóa tế bào miễn dịch Chúng tôi đã xây dựng được 03 quy trình phát

hiện các protein E7 HPV 16, E7 HPV 18 và p16INK4A Từ các quy trình, chúng tôi tạo 03 kit tương ứng Các kit E7 HPV 16 và E7 HPV 18 được so sánh với kit Amplisense HPV Typing, kit p16INK4A được so sánh với kit CINtec Kit E7 HPV 18 có độ đúng và độ đặc hiệu phân tích thấp Kit E7 HPV 16 phù hợp 80 % với kit định týp HPV và độ đặc hiệu phân tích tốt Kit p16INK4A phù hợp 85-85.7 % với kit CINtec, độ đặc hiệu phân tích tốt và khả năng triển khai thực tế cao

5 Quy trình và kit ELISA Chúng tôi xây dựng quytrình ELISA phát hiện p16INK4A tái tổ hợp và áp dụng quy trình để xây dựng kit ELISA phát hiện p16INK4A trong dịch ly giả tế bào cổ tử cung Với giá trị “ngưỡng” là OD450 = 0,250, độ nhạycủa kit ELISA là 91,6 %

và độ đặc hiệu là 88,89 %, giá trị AUC đạt 93 % Kit ELISA phát hiện p16INK4A trong dịch ly giải tế bào cổ tử cung có khả năng triển khai thực tế cao nếu tiếp tục được nghiên cứu ở quy mô lớn hơn

6 Các sản phẩm khác của đề tài gồm : 2 bài báo đăng trong tạp chí chuyên ngành trong

nước, 01 báo cáo tại hội nghị quốc tế, 03 luận văn Thạc sĩ

ABSTRACT

Long-term purpose of our study is the development of monoclonal antibody

technology for diagnostic and therapeutic applications Short-term purposes include :

optimization of production protocols for monoclonal antibodies (Mabs) directed against some viral and cellular proteins closely related to cervical cancer such as E7 HPV 16/18, p16INK4A ; use of the Mabs generated to develop protocols and diagnostic kits for early detection of cervical cancer, based on immunoPCR and immunocytochemistry methods

The main contents include :

1 Generation of some recombinant proteins and setting up protocol for recombinant protein obtention We generated E7 HPV 6/11/16 and p16INK4A recombinant proteins

with purity in the range of 92 to 95 % and whose specificity was confirmed by Western blotting These proteins were used to induce immune responses in mice for Mab generation Protocol for recombinant proteins generation based on pET28a(+) and pSUMO-3 vectors can be used to generate recombinant proteins

2 Generation of Mabs and setting up protocol for Mab generation We generated

hybridomas producing Mabs directed against E7 HPV 16 and p16INK4A Those Mabs, along with the Mab against E7 HPV 18, were obtained by flask- and bioreactor-cultures These Mabs exhibited high affinity with their target antigens, and a purity superior to 90

% The protocols for Mab generation and production, including parameters on medium composition, seeding density, time before collection, are applicable in local conditions Using the Mabs generated, we established immunoPCR, immunocytochemistry and ELISA-based protocols and diagnostic kits

3 ImmunoPCR-based protocol and kit We established immunoPCR-based protocol to

detecting E7 HPV 18 and furtherly developed kit (named KTimmunoPCR E7/18) for antigen detection in cervical cell lysates Results obtained with our immunoPCR kit was compared to those obtained with the Amplisense HPV Typing kit Accuracy and analytical specificity as well as applicability of the kit are low

4 Immunocytochemistry-based protocols and kits We established three protocols to

detecting E7 HPV 16/18 and p16INK4A Based on these protocols, we fabricated three kits (KTE7-16ICC, KTE7-18ICC, KTp16ICC) KTE7-16ICC and KTE7-18ICC kits were compared, in term of accuracy, to the Amplisense HPC Typing kit, whereas KTp16ICC was compared to the CINtec cytology kit KTE7-18ICC kit has low accuracy and low analytical specificity Results obtained with KTE7-16ICC kit was of 80 % in concordance with those obtained with Amplisense HPV Typing kit In the same way, KTp16ICC kit was of 85-85.7 % in agreement with CINtec cytology kit The two latter kits have good analytical specificity and KTp16ICC has good perspective for application

as a complementary test to cytology methods

5 ELISA protocol and kit We established ELISA protocol and developed kit

(KTp16ELISA) to detecting p16INK4A in cervical cell lysates With a cut-off value of 0.250 at OD450, kit sensitivity and specificity were 91.6 % and 88.89 %, respectively AUC value reached 93 % KTp16ELISA kit would have good applicability with larger sample size for more accurate cut-off value determination

6 Other achievements include : 02 publications in local scientific journals, 01 poster

presentation at international conference and 03 Master theses

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

KÝ HIỆU VÀ

ASC-US Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance

NCBI National Center for Biotechnology Information

ROC Receiver operating characteristics

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel

electrophoresis

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Các plasmid sử dụng và enzyme cắt giới hạn tương ứng 18

Bảng 2 Kích thước sản phẩm PCR dự đoán trên các vector tái tổ hợp 19

Bảng 3 Quy trình gây đáp ứng miễn dịch chuột 22

Bảng 4 Các cặp mồi sử dụng để nhân bản các gene mục tiêu 30

Bảng 5 Ký hiệu các vector tái tổ hợp 33

Bảng 6 Đặc điểm của các hệ vector sử dụng dòng hóa gene E7 HPV16 và p16INK4A 34

Bảng 7 Phân tử lượng dự đoán của protein E7 HPV16 dung hợp với các đuôi khác nhau 36

Bảng 8 Kích thước dự đoán của protein p16INK4A ở dạng dung hợp với các đuôi khác nhau 36

Bảng 9 Mức độ biểu hiện protein ở pha tan của các hệ vector 39

Bảng 10 Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant mức độ biểu hiện protein pha tan với các protein khác của tế bào trong các hệ vector ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau 42

Bảng 11 Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant mức độ biểu hiện protein pha tan với protein khác của tế bào trong các hệ vector ở các nồng độ IPTG khác nhau 43

Bảng 12 Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant mức độ biểu hiện protein pha tan với protein khác của tế bào trong các hệ vector ở các thời gian cảm ứng khác nhau 44

Bảng 13 Các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein p16INK4A tối ưu cho từng hệ vector 45

Bảng 14 Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant ảnh hưởng của nồng độ imidazole lên sự dung ly của protein mục tiêu 46

Bảng 15 Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant ảnh hưởng của dung dịch đệm, thời gian và nhiệt độ cắt lên phần trăm protein mục tiêu thu được 46

Bảng 16 Kết quả phân tích bằng phần mềm Total Lab Quant hiệu suất của phản ứng cắt 49

Bảng 17 Tổng kết kết quả immunoPCR E7/HPV 18 dựa trên kết quả định týp HPV 51

Bảng 18 Độ lặp lại nội phản ứng của kit immunoPCR E7/18 trên dich tế bào HeLa và

protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 96

Bảng 19 Độ lặp lại liên phản ứng của kit KTE7-18 immunoPCR trên dich tế bào HeLa và protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 97

Bảng 20 Kết quả ImmunoPCR E7/18 trên dịch tế bào HeLa và MCF-7 98

Bảng 21 Giá trị Ct của các nồng độ protein tái tổ hợp E7 HPV 18 98

Bảng 22 Kết quả hóa miễn dịch tế bào E7 HPV 16 so với kết quả định týp HPV 99

Bảng 23 Kết quả hóa miễn dịch tế bào E7 HPV 18 so với kết quả định týp HPV 102

Bảng 24 Kết quả nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC và CINtec đợt I 109

Bảng 25 Kết quả nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC và kit CINtec đợt II 114

Bảng 26 Kết quả ELISA trên mẫu dịch tế bào cổ tử cung với kit KTp16ELISA và JC8 115

Bảng 27 Độ lặp lại nội phản ứng của kit ELISA p16INK4A trên dich tế bào HeLa và protein p16INK4A tái tổ hợp 124

Bảng 28 Độ lặp lại liên phản ứng của kit KTp16ELISA trên dich tế bào HeLa và protein p16INK4A tái tổ hợp 124

Bảng 29 Độ lặp lại liên phản ứng của kit KTp16ELISA trên dich tế bào HeLa và protein p16INK4Atái tổ hợp 125

Bảng 30 Kết quả ELISA p16INK4A trên dịch tế bào HeLa và MCF-7 126

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 ELISA và immuno PCR 9

Hình 2 Các kiểu ELISA 25

Hình 3 Sơ đồ phương pháp checkerboard 26

Hình 4 Sơ đồ phương pháp immunoPCR 28

Hình 5 Sản phẩm PCR từ các gene E7/HPV 1, E7/HPV 6 32

Hình 6 Sản phẩm PCR từ gene E7 HPV16 với các cặp mồi E7-Nde/E7-Sal; E7-Bsa/E7-Sal, E7-Nco/E7-Sal 32

Hình 7 Sản phẩm PCR từ gene p16 INK4A với cặp mồi p16-Nde/p16-Sal; cặp mồi p16-Bsa/p16-Sal; p16-Nco/p16-Sal 32

Hình 8 Sản phẩm PCR từ gene L1 HPV 16 và L1 HPV 18 với cặp mồi L1/16f-Nhe/ L1/16r-Hind và L1/18f-Eco/ L1/18r-Xho 33

Hình 9 Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene E7 HPV11 và E7 HPV6 35

Hình 10 Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene E7 HPV16 34

Hình 11 Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene p16INK4A 35

Hình 12.Sản phẩm PCR từ các plasmid tái tổ hợp mang gene L1 HPV16 và L1 HPV18 35

Hình 13 Kết quả SDS-PAGE và Western blot từ các vector pET-E7, pETM-E7, pSUMO-E7, pGAT-E7 37

Hình 14 Kết quả SDS-PAGE và Western blot từ các vector pET-p16, pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 38

Hình 15 Kết quả SDS-PAGE và Western blot từ các vector pET-E7/6, pET-E7/11 39

Hình 16 Kết quả SDS-PAGE và Western blot từ các vector pET-L1/16 và pET-L1/18 40

Hình 17 Kết quả SDS-PAGE với protein p16 INK4A, E7 HPV 16, E7 HPV 6, E7 HPV 11 trước và sau tinh sạch 41

Hình 18 Kết quả SDS-PAGE với các vector pET-p16, pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau 43 Hình 19 Kết quả SDS-PAGE từ dịch protein thu nhận với các vector pET-p16, pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 ở các nồng độ IPTG khác nhau 44 Hình 20 Kết quả SDS-PAGE từ dịch protein thu nhận với các vector pET-p16, pETM-p16, pSUMO-p16, pGAT-p16 ở các thời gian cảm ứng khác nhau 45 Hình 21 Kết quả khảo sát nồng độ imidazole cho vector pE-SUMO, pET-28a 48 Hình 22 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 3 dung dịch 1, dung dịch 2, dung dịch 3 49 Hình 23 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2 chất biến tính protein 50 Hình 24 Kết quả tinh sạch protein p16INK4A từ vector pE-SUMO3 tái tổ hợp 51 Hình 25 Kết quả ELISA trên huyết thanh của 2 chuột trước và sau khi gây đáp ứng miễn dịch với protein E7 HPV16 53 Hình 26 Kết quả ELISA trên huyết thanh của 4 chuột trước và sau khi gây đáp ứng miễn dịch với protein p16INK4A 53 Hình 27 Biểu đồ thể hiện kết quả sàng lọc các dòng hydridoma có khả năng tạo kháng thể kháng E7 HPV 16 trên 102 giếng tế bào lai ở10 đĩa 96 giếng 54 Hình 28 Biểu đồ thể hiện kết quả sàng lọc các dòng hydridoma có khả năng tạo kháng thể kháng p16INK4A trên 49 giếng tế bào lai ở 10 đĩa 96 giếng 55 Hình 29 Kết quả xác định isotype của các KTĐD kháng protein E7 HPV 16 sản xuất bởi dòng tế bào lai 2C1 và 6B10 bằng bộ Isotyping ELISA Kit (BD) 56 Hình 30 Kết quả xác định isotype của các KTĐD kháng protein p16INK4A sản xuất bởi dòng tế bào lai 1C10 và 5A1 bằng bộ Isotyping ELISA Kit (BD) 56 Hình 31 Kết quả điện di SDS-PAGE KTĐD 2C1 57 Hình 32 Kết quả điện di SDS-PAGE KTĐD 1C10 57 Hình 33 Đồ thị xác định hằng số ái lực của KTĐD 2C1 với kháng nguyên E7 HPV16 58 Hình 34 Đồ thị xá định hằng số ái lực của KTĐD 1C10 với kháng nguyên p16INK4A 58 Hình 35 Kết quả SDS-PAGE và Western blot trên KTĐD kháng E7 HPV 6, E7 HPV 11, E7 HPV 16, E7 HPV 18 với các protein tái tổ hợp tương ứng 59

Hình 36 Kết quả Western blot giữa KTĐD 2C1 với dịch ly giải tế bào CaSki, C-33 A và

protein E7 HPV-16 tái tổ hợp 60

Hình 37 Kết quả SDS-PAGE và Western blot trên KTĐD 1C10 với protein p16INK4A tái tổ hợp 61

Hình 38 Kết quả Western blot của các KTĐD 1C10 và thương mại với dịch ly giải tế bào HeLa, MCF7 và protein p16INK4A tái tổ hợp 58

Hình 39 Đồ thị xác định điều kiện nuôi cấy tế bào 4H5 để đạt mật độ tối đa 63

Hình 40 Tăng trưởng tế bào và nồng độ KTĐD thu được với mật độ cấy thấp và cao 64

Hình 41 Sự thay đổi mật độ tế bào, tỉ lệ tế bào sống, nồng độ kháng thể 64

Hình 42 Sự thay đổi mật độ tế bào và nồng độ kháng thể theo thời gian trong các môi trường có nồng độ huyết thanh khác nhau và môi trường SFM, với mật độ cấy thấp (2 x 105 tế bào/ml) và cao (2 x 106 tế bào/ml) 65

Hình 43 Sự thay đổi mật độ tế bào, nồng độ kháng thể trong môi trường bổ sung 5 % FBS khi nuôi bằng bioreactor với mật độ cấy 5 x 105 tế bào/ml và 1 x 106 tế bào/ml 64

Hình 44 Sự thay đổi mật độ tế bào, nồng độ kháng thể trong môi trường có bổ sung 5 % FBS và 10 % FBS khi nuôi bằng bioreactor với mật độ cấy 5 x 105 tếbào/ml 67

Hình 45 Các dạng immunoPCR và ELISA 68

Hình 46 Đồ thị hằng số ái lực của KTĐD 4H5-biotin với E7 HPV 18 tái tổ hợp 70

Hình 47 PCR tạo DNA đánh dấu biotin 70

Hình 48 Kết quả kiểm tra sự biotin hóa DNA bằng streptavidin cộng hợp alkaline phosphatase 70

Hình 49 Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể 1D5 phủ giếng 71

Hình 50 Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể 4H5-biotin 72

Hình 51 Đồ thị khảo sát nồng độ STV-AP 72

Hình 52 Kết quả khảo sát nồng độ DNA đánh dấu biotin 73

Hình 53 Sản phẩm PCR với các nồng độ streptavidin 73

Hình 54 Sản phẩm PCR với các tác nhân khóa giếng và số chu kì PCR khác nhau 74

Hình 55 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng E7 HPV 18 – 1D5 trên dòng tế bào HeLa và C-33 A với các nồng độ kháng thể 10µg/ml, 5 µg/ml và 2,5 µg/ml 76

Hình 56 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng E7 HPV 16 – 2C1 trên dòng tế bào CaSki và C-33 A với các nồng độ kháng thể 20µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5µg/ml 76 Hình 57 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD kháng p16INK4A – 1C10 trên dòng

tế bào HeLa và MCF-7 với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5µg/ml 77 Hình 58 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch với KTĐD 1D5 (10 µg/ml) trên tế bào HeLa, C-

33 A, CHO-K1 chuyển vector pEGFP-E7 HPV 18, CHO-K1 chuyển vector pEGFP-C2, CaSki 77 Hình 59 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 2C1 (5 µg/ml) trên các dòng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A, MCF-7 78 Hình 60 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 1C10 (10 µg/ml) trên các dòng

tế bào HeLa, CaSki, C-33 A, MCF-7 78 Hình 61 Các tác nhân sử dụng trong cố định và bảo quản tế bào : PFA 1%, ethanol 30%, methanol 30% và acetone 10% 79 Hình 62 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính sử dụng KTĐD 1D5 trên dòng tế bào HeLa và C-33 A với các nồng độ kháng thể 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml và 2,5µg/ml 80 Hình 63 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính sử dụng KTĐD 2C1 trên dòng tế bào CaSki và C-33 A với các nồng độ kháng thể 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml và 10µg/ml 80 Hình 64 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên lame kính sử dụng KTĐD 1C10 trên dòng tế bào HeLa và MCF-7 với các nồng độ kháng thể 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml và 10µg/ml 81 Hình 65 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng HeLa và C-33 A với kháng thể 1D5 (10 µg/ml), tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10mM/EDTA 1mM pH 6, Tris 10mM/EDTA 1mM pH 9 và citrate 10mM pH 6 81 Hình 66 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng CaSki và C-33 A với kháng thể 2C1 (20 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10mM/EDTA 1mM pH 6, Tris 10mM/EDTA 1mM pH 9 và citrate 10mM pH 6 82

Hình 67 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng HeLa và MCF-7 với kháng thể 1C10 (80 µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate 10mM/EDTA 1mM pH 6, Tris 10mM/EDTA 1mM pH 9 và citrate 10mM pH 6 82 Hình 68 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng HeLa với kháng thể 1C10 (80 µg/ml),

sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là Tris 10mM/EDTA 1mM pH 9 theo 2 phương pháp là đun trong bể ổn nhiệt và microwave, ở 2 thời gian xử lý là 10 phút và 20 phút 83 Hình 69 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7 với KTĐD 1D5 (10 µg/ml) 83 Hình 70 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7 với KTĐD 2C1 (20 µg/ml) 84 Hình 71 Nhuộm hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa, CaSki, C-33 A và MCF-7 với KTĐD 1C10 (80 µg/ml) 84 Hình 72 Kết quả nhuộm miễn dịch với KTĐD 1C10 tế bào HeLa và tế bào MCF-7 (chứng âm) trong các dung dịch bảo quản (1-11) và ở các mốc thời gian từ 0 đến 150 ngày 87 Hình 73 Sơ đồ phương pháp ELISA “sandwich” gián tiếp 88 Hình 74 Giá trị OD450 ở các nồng độ kháng thể phủ giếng của 1C10 và JC8 89 Hình 75 Giá trị OD450 ở các nồng độ kháng thể “phát hiện” với kháng thể bắt giữ là 1C10 và JC8 90 Hình 76 Giá trị OD450 ở các nồng độ kháng thể “cộng hợp HRP” với kháng thể “bắt giữ” là 1C10 và JC8 91 Hình 77.Giá trị OD450 ở các nồng độ tác nhân khoá giếng BSA và FBS khác nhau 92 Hình 78 Tế bào CaSki và C-33A nhuộm miễn dịch ở các lần thử nghiệm khác nhau tại PTN Công ty Khoa Thương 103 Hình 79 Tế bào CaSki và C-33A nhuộm miễn dịch ở hai đơn vị: Khoa Thương và BV Hùng Vương 104 Hình 80 Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CHO-K1/EGFP-E7-16, CHO-K1/EGFP-C2 với KTĐD 2C1 quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng

541 nm và 488 nm 106 Hình 81 Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CaSki, C-33 A với KTĐD 2C1 quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng 541 nm và 488 nm 107

Hình 82 Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch ở các lần thử nghiệm khác tại Công

ty Khoa Thương 110 Hình 83 Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch ở hai đơn vị: Khoa Thương và BV Hùng Vương 111 Hình 84 Tế bào CHO-K1/EGFP và CHO-K1/EGFP-E7 nhuộm miễn dịch huỳnh quang với KTĐD 1D5 quan sát ở bước sóng 488 và 541 nm (100X) 113 Hình 85 Tế bào HeLa và Beas-2B nhuộm miễn dịch huỳnh quang với 1D5 (40 X) 112 Hình 86 Tế bào cổ tử cung nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC và kit CINtec 115 Hình 87 Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC với các lần lặp lại 116 Hình 88 Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC ở các đơn vị: BV Bình Dương, BV Thủ Đức, Khoa Thương, BV Hùng Vương 117 Hình 89 Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CHO-K1 EGFP-p16INK4A và CHO-K1 pEGFP-C2 bằng KTĐD 1C10 (20X) 118 Hình 90 Kết quả lai miễn dịch huỳnh quang trên tế bào HeLa và MCF7 với KTĐD 1C10 (20X) 116 Hình 91 Tế bào HeLa và MCF-7 nhuộm miễn dịch với kit KTp16ICC bảo quản ở các thời gian khác nhau 120 Hình 92 Kết quả nhuộm miễn dịch tế bào HeLa (A) và tế bào MCF-7 (B) với kit KTp16ICC ở các lô sản xuất khác nhau 120 Hình 93 Biểu đồ phân bố giá trị mật độ quang của các mẫu từ người có kết quả Pap bình thường (control) và người có kết quả Pap bất thường (patient) với hệ thống ELISA trên kháng thể 1C10 (A), JC8 (B) 122 Hình 94 Đồ thị đường cong R.O.C của kit KTp16ELISA với KTĐD 1C10 (A) và JC8 (B) 123 Hình 95 Kết quả xác định độ nhạy của kit KTp16ELISA 126

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở Việt Nam theo công bố của WHO (2010) thì UTCTC được xếp thứ 5 trong số các dạng ung thư ở phụ nữ và xếp thứ nhất trong nhóm tuổi từ 15 đến 44 với tỷ lệ mắc là 11.7/100.000 người/năm Tỷ lệ tử vong do UTCTC là 5.6/100.000 người và xếp thứ tư trong số các dạng ung thư ở phụ nữ mọi lứa tuổi Dự đoán đến 2025, số ca mắc mới tăng

40 % cho lứa tuổi dưới 65 và 80 % cho lứa tuổi trên 65 ; trong khi tỷ lệ tử vong tăng lần lượt là 62 % và 75 % cho lứa tuổi dưới và trên 65

UTCTC có liên quan chặt chẽ với sự nhiễm HPV (Human Papillomavirus) Virus này gồm nhiều týp trong đó nhóm các týp “nguy cơ cao” là nguyên nhân gậy UTCTC và một số dạng ung thư khác như ung thư hậu môn, âm đạo, đầu và cổ Do UTCTC diễn tiến rất chậm, có thể đến vài chục năm nên việc phát hiện sớm các tổn thương tiền ung thư có

ý nghĩa lớn cho việc phòng và điều trị bệnh

Xét nghiệm tế bào học, Pap test, là công cụ tầm soát UTCTC được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới Tuy nhiên, Pap test vẫn có một số hạn chế, với tỷ lệ âm tính giả có thể lên đến 20-30 % và phụ thuộc nhiều vào chủ quan của người đọc Xét nghiệm HPV DNA týp “nguy cơ cao” cũng được khuyến cáo cho tầm soát lại có nhược điểm khác do

tỷ lệ người nhiễm HPV týp “nguy cơ cao” diễn tiến thành UTCTC chỉ vào khoảng 1 % Như vậy việc phát hiện chính xác những trường hợp sẽ thật sự diễn tiến thành ung thư sẽ giúp can thiệp kịp thời nhưng hạn chế những can thiệp quá mức cần thiết

Đó là lý do ngày càng nhiều “chỉ thị sinh học” (biomarker) được đề xuất trong tầm soát, tiên lượng và chẩn đoán UTCTC Có hai nhóm “chỉ thị sinh học”, nhóm từ virus như DNA HPV, E6/E7 HPV “nguy cơ cao”, …, và nhóm từ tế bào như protein p16INK4A, ki-

67, TERC, MCM, … Trong đó, protein E6/E7 các týp HPV “nguy cơ cao” và p16INK4A

thu hút nhiểu sự chú ý do sự tăng hàm lượng của chúng phản ánh được quá trình diễn tiến

từ tế bào bình thường đến tình trạng ung thư

Đề tài này tạo các kháng thể đơn dòng (KTĐD) kháng E7 HPV 16 và 18, và p16INK4A và sử dụng các KTĐD này để phát triển các quy trình và kit nhằm phát hiện sớm các trường hợp có khả năng diễn tiến thành UTCTC

và sự biệt hóa của tế bào chủ bị phá vỡ thì HPV sẽ nhân bản được trong các tế bào biểu

mô mầm chưa biệt hóa cao và sẽ tương tác với quá trình phân chia bình thường của tế bào biểu mô dẫn đến sự xuất hiện khối u Diễn tiến UTCTC do các týp HPV "nguy cơ cao" khởi đầu chủ yếu với tác động của hai oncoprotein của virus, E6 và E7 Protein E7 gây mất ổn định pRb vốn là một protein quan trọng trong sự điều hòa phân bào, làm rối loạn quá trình phân bào và dẫn đến những bất thường về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể ở

tế bào chủ, là những tiền đề cho sự phát triển khối u (zur Hausen, 2002)

Như vậy, hai thành phần chủ chốt trong diễn tiến UTCTC là các oncoprotein virus

và các protein điều hòa ở tế bào chủ

1.1.1 Các protein virus, oncoprotein E7 và protein cấu trúc L1

 E7 là protein nhỏgồm 100 amino acid, có tính acid E7 là một protein có khả năng tương tác với rất nhiều protein đóng vai trò quan trọng trong điều hòa sự phân chia tế bào như pRb, p107, p130, các cyclin như cyclin A hay cyclin E, hay các phân tử ức chế các CDK (Cyclin Dependent Kinase - cyclin phụ thuộc kinase) như p27Kip1… E7 gây bất hoạt chức năng của chúng trong tế bào, khiến các tế bào bị HPV xâm nhiễm vốn ở trạng thái không phân bào chuyển sang trạng thái phân bào liên tục không kiểm soát và hình thành khối u(zur Hausen, 2002)

 L1 là protein vỏ capsid chính của HPV, có cấu trúc pentamervà có khối lượng phân tử khoảng 55.000 dalton Protein này cùng với protein vỏ capsid phụ là L2 chỉ được tạo ra trong các tế bào đã biệt hóa nằm ở lớp ngoài cùng của biểu mô Sau khi được tổng hợp ở

tế bào chất, L1 và L2 được chuyển vào nhân để đóng gói thành các phần tử virus mới L1

có tính bảo tồn rất cao giữa các týp HPV đồng thời có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh Ngoài ra, L1 còn có khả năng tự lắp ghép thành các phần tử giống virus (virus like particle - VLP) có cấu trúc và khả năng gây miễn dịch tương tự như virus thật Khả năng

này thuận lợi cho việc tạo ra các VLP in vitro dùng trong chẩn đoán và tạo vaccine Một

số công bố phát hiện HPV thông qua kháng thể kháng L1 như công trình của Sehr và

cộng sự (2002) Đặc biệt, hai loại vaccine được FDA công nhận là Gardasil (HPV 16, 18, 6,11) và Cervarix (HPV 16, 18) được hình thành dựa trên protein L1 này

1.1.2 Các protein tế bào

Các công trình nghiên cứu biomarker (dấu ấn sinh học) để phát hiện sớm UTCTC

đã đề xuất nhiều ứng viên như các protein MCM5 (minichromosome maintenance), CDC6 (cell division cycle), p16INK4A, Ki-67, topoisomerase 2A (Wentzensen & von Knebel Doeberitz, 2007) Trong số đó, hầu hết các công trình đều thống nhất xem p16INK4A, do gene CDKN2Amã hóa, như một dấu ấn sinh học nhạy và đặc hiệu cho các tế bào loạn sản cổ tử cung, dạng vảy và dạng tuyến Đây là một protein ức chế khối u (tumor suppressor protein) mà nếu mất đi hay giảm biểu hiện có thể dẫn đến nhiều dạng ung thư

ở người (tụy, thực quản, dạ dày, …) Protein này lại có biểu hiện vượt mức trong tế bào UTCTC Cơ chế này liên quan đến sự bất hoạt pRb bởi oncoprotein E7 của các týpHPV

“nguy cơ cao” Protein pRb bất hoạt sẽ giải phóng E2F, nhân tố phiên mã hoạt hóa biểu hiện của gene CDKN2A, dẫn đến sự tăng hàm lượng p16INK4A trong tế bào loạn sản Biểu hiện của p16INK4A liên kết chặt chẽ với sự nhiễm các týp HPV “nguy cơ cao” (Klaes & cs,

2001 ; Murphy & cs, 2005)

1.2 Tổng quan về kháng thể đơn dòng (KTĐD)

1.2.1 Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật tạo tế bào lai (hybridoma)

Kỹ thuật sản xuất KTĐD được đề xuất bởi hai nhà khoa học Cesar Milstein và Georges Köhler năm 1975 Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai tế bào u tủy (myeloma) với tế bào lympho B đã hoạt hóa Tế bào u tủy là tế bào có khả năng phân chia vô hạn

trong điều kiện nuôi cấy in vitro nhưng không tạo được kháng thể Ngược lại, tế bào

lympho B có khả năng tổng hợp kháng thể nhưng sẽ chết sau một thời gian nuôi cấy vì là những tế bào tận cùng của quá trình biệt hóa Do đó, tế bào lai (hybridoma) sẽ kết hợp được ưu điểm phân chia vô hạn của tế bào u tủy và sản xuất kháng thể của tế bào B KTDĐ là kháng thể thu nhận được từ một dòng tế bào lai đã được phân lập và tạo dòng (Ausubel, 2001)

KTĐD sản xuất từ kỹ thuật tạo tế bào lai đã được ứng dụng rộng rãi cho nghiên cứu và trở thành những công cụ chẩn đoán hiệu quả Ngày nay, nhiều kỹ thuật mới đã ra đời nhằm tạo ra các KTĐD có khả năng dùng trong điều trị bệnh ở người

1.2.2 Kỹ thuật sản xuất KTĐD từ người bằng cách bất tử hóa lympho bào

Khi xâm nhiễm vào lympho bào B, virus Epstein-Barr (EBV) sẽ làm bất tử hóa tế bào và tạo những dòng tế bào sản xuất kháng thể liên tục EBV có thể làm bất tử cả những tế bào

B ở trạng thái nghỉ do đó ưu điểm của phương pháp này là không cần gây đáp ứng miễn dịch tăng cường Tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế như hiệu suất của quá trình gây bất tử hóa rất thấp, các tế bào T được bất tử sẽ ức chế quá trình bất tử của tế bào

B Một số tác giả sử dụng phương pháp làm giàu số lượng các tế bào B đặc hiệu với kháng nguyên trước khi cho EBV xâm nhiễm nhằm tăng hiệu quả bất tử hoá Một số tác giả khác dung hợp tế bào B đã bất tử với tế bào u tủy chuột hoặc tế bào u tủy lai giữa người và chuột nhằm tăng khả năng tăng trưởng và sản xuất kháng thể (Lanzavecchia &

cs, 2007; Sugimoto & cs, 2004)

1.2.3 Dung hợp tế bào lympho người với tế bào u tủy chuột

Tế bào lympho người được thu nhận từ máu ngoại vi hoặc hạch lympho được dung hợp với tế bào u tủy chuột để tạo tế bào lai người-chuột Tuy nhiên, phương pháp này gặp một số khó khăn về kỹ thuật như: hiệu quả dung hợp rất thấp và một số nhiễm sắc người

bị mất ngẫu nhiên sau khi dung hợp (Karpas & cs, 2001)

1.2.4 Tạo kháng thể khảm và kháng thể “người hóa”

Bằng kỹ thuật di truyền người ta đã tạo ra DNA tái tổ hợp biểu hiện phân tử kháng thể khảm (chimeric antibody) và kháng thể “người hóa” (humanised antibody) Kháng thể khảm là kháng thể người có vùng biến đổi (Fv) của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ KTĐD chuột đặc hiệu với kháng nguyên và có vùng hằng định (Fc) cuả kháng thể người Kháng thể “người hóa” là kháng thể chỉ có 3 trình tự siêu biến đổi (CDR) trên phân tử kháng thể người có nguồn gốc từ chuột DNA tái tổ hợp mã hóa cho các kháng thể khảm và kháng thể “người hóa” được chuyển vào tế bào động vật như tế bào u tủy không sản sinh các Ig

và được cảm ứng biểu hiện vượt mức Những dòng tế bào sản xuất kháng thể mục tiêu được chọn lọc và phân lập để thu nhận KTĐD Kỹ thuật này có thể ứng dụng tạo kháng thể cho những kháng nguyên có tính sinh miễn dịch thấp (Little & cs, 2009; Wu & cs, 2005)

Để làm giảm khả năng gây đáp ứng miễn dịch từ các kháng thể đơn dòng khảm và

“người hóa”, các nhà nghiên cứu đã cố gắng xây dựng vài phương pháp tạo các KTĐD có nguồn gốc từ người, ví dụ như: phương pháp trình diện phage và phương pháp tạo chuột chuyển gene biểu hiện Ig người

1.2.5 Phương pháp trình diện phage

Đối với phương pháp trình diện phage, một thư viện tổng hợp ngẫu nhiên các gene

mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của Ig người được biểu hiện trên bề mặt cuả phage Hỗn hợp phage này được cho tiếp xúc với phân tử kháng nguyên đích nhằm sàng lọc dòng phage có ái lực gắn tốt nhất với kháng nguyên Phage mang gene mã hóa cho phân

tử kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được phân lập và làm giàu Phương pháp này cho phép tạo KTĐD người phản ứng đặc hiệu với bất kỳ kháng nguyên nào Sau nhiều lần sàng lọc sẽ thu được dòng phage mang gene mã hoá cho kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên (Carmen & cs 2002)

1.2.6 Phương pháp tạo chuột chuyển gene biểu hiện Ig người

Trong phương pháp tạo chuột chuyển gene mã hóa Ig người, gene mã hóa cho chuỗi nặng và nhẹ cuả phân tử Ig chuột được làm bất hoạt hoàn toàn Những chuột mang đột biến Ig–/– này được chuyển gene mã hóa cho IgH and Igκ của người Như vậy, chuột chuyển gene khi được gây đáp ứng miễn dịch sẽ tạo kháng thể có chuỗi nặng và chuỗi nhẹ bắt nguồn từ người Thực hiện phương pháp tạo bào lai cho phép thu nhận được KTĐD có nguồn gốc từ người (Davis & cs, 1999)

1.2.7 Sản xuất kháng thể đơn dòng

Phương pháp in vitro là phương pháp dựa vào khả năng sản xuất KTĐD của tế bào

lai trong môi trường nuôi cấy Phương pháp này sử dụng các hệ thống nuôi cấy tế bào như các bình nuôi cấy và bioreactor cho phép tế bào phát triển và đạt mật độ cao

Cách đơn giản nhất để sản xuất KTĐD in vitro là nuôi cấy hybridoma trong các

bình flask và tinh sạch kháng thể từ dịch nuôi cấy Với phương pháp này, nồng độ kháng thể thấp chỉ khoảng 20 µg/ml Một số phương pháp nuôi cấy dùng bình lắc (spinner flask

và roller bottle) cho phép chất dinh dưỡng và khí hòa tan phân bố đều [Tarleton & cs, 1991]; ngoài ra còn phương pháp nuôi trong các túi thấm khí giúp làm tăng nồng độ khí hòa tan, do đó làm gia tăng lượng kháng thể tạo thành Tuy nhiên, phương pháp trên bị hạn chế khi nuôi các thể tích lớn hơn 1 lít vì các hệ thống không cung cấp đủ oxy cho tế bào [Singh, 1999]

Các hệ thống nuôi cấy được sử dụng trong việc sản xuất lượng lớn kháng thể bao gồm nuôi cấy mẻ (fed-batch) và nuôi cấy liên tục (perfusion) Các hệ thống nuôi cấy mẻ

đã trở nên rất thông dụng, quy mô nuôi cấy có thể mở rộng lên tới 20000 lít Trong nuôi cấy mẻ, các chất dinh dưỡng thiết yếu cho tế bào được bổ sung để duy trì nguồn dinh

dưỡng và các sản phẩm tạo ra trong quá trình nuôi cấy sẽ được thu hoạch ở giai đoạn cuối của mẻ Nhằm mục đích cải thiện sự tăng trưởng và sản xuất của tế bào, các hệ thống nuôi cấy liên tục làm tăng mật độ tế bào bằng cách bổ sung liên tục môi trường mới và loại bỏ nhanh các chất độc tích lũy trong môi trường nuôi, giúp tăng sản lượng và cải thiện chất lượng sản phẩm [Voisard & cv, 2003] Theo Deo & cs (1996) một hệ thống như vậy với thể tích 500 lít có thể nuôi cấy kéo dài tới 15 hay 35 ngày, sản xuất kháng thể lên đến hàng kilogram Lượng kháng thể tạo ra trong hệ thống nuôi cấy liên tục cao hơn

hệ thống nuôi cấy mẻ tới 10 lần, tuy nhiên bất tiện là cần thời gian kéo dài và máy móc phức tạp

Ở quy mô nhỏ hơn, hệ thống nuôi cấy liên tục sử dụng túi dùng một lần ngày càng nhiều Hệ thống nuôi cấy như vậy, gọi là hệ thống Wave bioreactor, lượng oxy có thể lưu thông tốt do hoạt động “wave” độc đáo, thể tích nuôi cấy có thể lên tới 100 lít trong khi mật độ tế bào hơn 5 x 106 tế bào/mL Đây là hệ thống lý tưởng để nuôi vài lít môi trường cho nhu cầu của phòng thí nghiệm Như trước đây, cách duy nhất để sản xuất 5-100 lít tế bào nuôi cấy là sử dụng các bioreactor tốn kém Wave bioreactor chỉ bằng 1/10 giá so với một bioreactor, dễ sử dụng, làm giảm nguy cơ nhiễm do không cần rửa túi hoặc khử trùng túi Chỉ cần với một hệ thống kiểm soát CO2 và nhiệt độ theo mong muốn, các Wave bioreactor có thể sử dụng dễ dàng trong phòng thí nghiệm nhỏ, bệnh viện và các trường đại học [Singh, 1999]

Tuy các phương pháp in vitro cho phép sản xuất một lượng lớn kháng thể nhưng một số dòng tế bào hybridoma không thích ứng tốt đối với các điều kiện nuôi cấy in vitro Do đó, phương pháp in vivo được lựa chọn cho các trường hợp này Phương pháp in vivo được

thực hiện bằng cách cấy ghép tế bào lai vào màng bụng của chuột sống và thu nhận dịch báng có chứa kháng thể từ khối u Dịch báng này có nồng độ kháng thể lên đến 10 mg/ml, tuy nhiên phương pháp này bị hạn chế bởi những quy định về việc sử dụng động vật cho mục đích thí nghiệm [Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies, 1999] 1.3 Các phương pháp phát hiện E7 và p16INK4A

Các công trình nghiên cứu về tạo và ứng dụng KTĐD và đa dòng kháng E6, E7 HPV 16 và 18 còn khá hạn chế Sớm nhất có thể kể đến công trình tạo KTĐD trên chuột kháng protein E7 của HPV 16 của Tindle và cộng sự (1990) Công trình nghiên cứu

“Combination of anti-HPV 16 and 18 antibodies and uses thereof” của Zwerschke và

cộng sự (2005) đã được Amynon Biotech ứng dụng sản xuất kháng thể kháng HPV

thương mại Fiedler và cộng sự (2004) sử dụng kháng thể đa dòng thỏ kháng protein E7 HPV 16 đã được kiểm tra bằng Western blot và miễn dịch huỳnh quang trên các dòng CaSki, HeLa, U2-OS chuyển gene E7 HPV 16 để nghiên cứu mối liên quan giữa sự biểu hiện vượt mức protein E7 HPV 16 với sự giảm biểu hiện pRb trong sinh thiết cổ tử cung bằng phương pháp hóa mô miễn dịch Peck và cộng sự (2006) trong một thông báo tóm tắt cho biết là đã phát triển được một strip test phát hiện protein E6 của HPV 16 dựa trên tương tác đặc hiệu của E6 với PDZ, phát hiện được 2,6 ng protein E6 tái tổ hợp Một hướng phát triển khác tương tự nhưng ở dạng ELISA cũng trong thông báo trên cho biết

có thể giảm mức phát hiện tới 30 pg E6/thử nghiệm Nhiều công trình phát triển KTĐD kháng E6 và E7 HPV 16, 18 và sử dụng chúng để phát hiện protein E6, E7 tái tổ hợp và trong dịch tế bào tử cung (Ehehalt & cs, 2011)

Trong chẩn đoán HPV, có rất nhiều kit phát hiện các type HPV “nguy cơ cao/thấp”nhưng chỉ kit Hybrid Capture II là đã được FDA (Food and Drug Administration) công nhận cho sử dụng vào chẩn đoán thường quy Một kit khác đang được thử nghiệm rộng rãi tại Hoa kỳ, Canada, Nam Phi và được chính thức cho lưu hành tại Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha là kit HPV OncoTect (Invirion Diagnostics) Kit này định lượng mRNA E6 và E7 trong tế bào biểu mô cổ tử cung dựa trên nguyên lý flow cytometry Trong lĩnh vực miễn dịch học HPV, có nhiều kháng thể kháng protein E6 và E7 của HPV 16, 18 đã được thương mại hóa (Santa Cruz Biotechnology, Abcam, HyTest, Genway, AbD Serotec, Novus Biologicals, Lifespan Biosciences, Amynon Biotech), nhưng chủ yếu được ứng dụng trong nghiên cứu, chưa dùng cho chẩn đoán

Nhiều công trình cho thấy việc sử dụng p16INK4A cho phép tăng hiệu quả của chẩn đoán tế bào học cho các trường hợp tiền UTCTC Protein p16INK4A trong chẩn đoán

“cervical intraepithelial neoplasia” có độ nhạy là 33%, độ đặc hiệu là 93%, giá trị tiên đoán dương là 93% và giá trị tiên đoán âm là 58% trong một công trình nghiên cứu trên

136 bệnh phẩm (Walts & cs, 2009) Một công trình khác tiến hành trên 232 mẫu prep cho thấy trên nhóm ASCUS, độ đặc hiệu của chẩn đoán p16INK4A và HR-HPV DNA PCR lần lượt là 42 % và 27 % Điều này có nghĩa là 18 người (42 %) sẽ tránh được việc theo dõi không cần thiết nếu sử dụng p16INK4A so với 6 người (27%) nếu sử dụng HR-HPV DNA test (Schledermann & cs, 2008) Trong một công trình nghiên cứu diễn tiến bệnh ở các trường hợp LSIL đi kèm với tăng cường biểu hiện p16INK4A cho thấy các bệnh nhân dương tính với p16INK4A, sau 4 đến 8 tháng theo dõi, đều có diễn tiến xấu đi Như

Thin-vậy việc can thiệp tức thì sẽ có ích lợi lớn cho các bệnh nhân này (Di Stefano & cs, 2010) Nhiều công trình cho thấy có mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của p16INK4

và mức độ bất thường tế bào học (Norman & cs, 2007 ; Lee & cs, 2012) Một công trình tiến hành với sự tham gia của 12 nhà bệnh học đánh giá độc lập 500 mẫu mô cổ tử cung

và so sánh với “chuẩn vàng” do 3 chuyên gia về bệnh học phụ khoa thiết lập Kết quả cho thấy việc bổ sung thêm xét nghiệm miễn dịch p16INK4A làm tăng khả năng phát hiện chính xác và lặp lại các trường hợp CIN “high-grade” một cách có ý nghĩa thống kê, làm tăng

độ nhạy lên 13%, giảm phân nửa các trường hợp âm tính giả (Klaes & cs, 2003 ; Bergeron & cs, 2010) Nhìn chung, p16INK4A được xem là một chỉ thị hữu ích, bổ sung cho xét nghiệm tế bào học, đặc biệt trong các trường hợp Pap không rõ ràng, giúp phát hiện các trường hợp CIN (Cervical Intraepithelial Neoplasia “high grade” từ các ca ASC-

US (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) và LSIL (Low Grade of Squamous Intraepithelial Lesion)(Schledermann & cs, 2008 ; Kurshumliu & cs, 2009) Kit CINtec p16INK4A Cytology (mtm) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn thử nghiệm Papillomavirus-nguy cơ cao (HR-HPV) trong việc phát hiện CIN “high-grade” trên những mẫu Pap thuộc nhóm ASC-US hay LSIL (Reuschenbach & cs, 2010 ; Denton &

cs, 2010)

Phương pháp Immuno-PCR:

Đây là phương pháp tận dụng độ nhạy cao của PCR và tính linh hoạt của phương pháp ELISA để phát hiện một protein xác định, do Sano và cộng sự đề xuất năm 1992 Trong phương pháp này, kháng thể nhận biết đặc hiệu kháng nguyên được cộng hợp với một trình tự DNA dùng làm chỉ thị (marker) Trình tự DNA này được nhân bản bằng PCR

và sản phẩm nhân bản sẽ được phát hiện bằng nhiều phương pháp Kết quả là ngưỡng phát hiện của immuno PCR tăng lên 100 – 10.000 lần so với ELISA (Niemeyer, 2005 ; Malou &cs, 2011) (hình 1) ImmunoPCR được ứng dụng để phát hiện kháng nguyên với

độ nhạy cao (Niemeyer &cs, 2007)

Phương pháp này bao gồm nhiều cách tiếp cận : (1) Kháng thể bắt giữ đặc hiệu kháng nguyên được cố định lên hạt nano hay lên giếng ELISA, kháng nguyên hiện diện trong mẫu sau khi được bắt giữ sẽ được phát hiện bằng kháng thể cộng hợp với một trình tự DNA ; (2) Cố định kháng nguyên trực tiếp lên giếng ELISA và phát hiện bằng kháng thể

đặc hiệu cộng hợp với một trình tự DNA ; (3) in situ immuno PCR : kháng thể đặc hiệu

cộng hợp với một trình tự DNA dùng để phát hiện trực tiếp kháng nguyên hiện diện trong lát cắt mô, tế bào (Adler& cs, 2008)

Hình 1 ELISA và immuno PCR Nguyên lý (A) và độ nhạy (B) của hai phương pháp

Một số công trình trong nước về KTĐD có thể kể là : công trình tạo KTĐD INNNV ở tôm (Bùi Thị Bích Hằng & cs, 2008), đề tài “Nghiên cứu tạo bộ kit ELISA định lượng Alpha-fetoprotein (AFP) trong huyết thanh để hỗ trợ chẩn đoán bệnh ung thư tế bào gan (HCC) ở người” (Đỗ Thị Thảo, 2010-2011); đề tài “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán và điều trị bệnh ở người” (Lê Quang Huấn, 2012)

PHẦN 2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Mục tiêu dài hạn của đề tài là phát triển một công nghệ mới ở Việt Nam, công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD) phục vụ cho chẩn đoán và điều trị Đối tượng nghiên cứu của đề tài là HPV (Human Papillomavirus), một loại virus có liên quan chặt chẽ với ung thư cổ tử cung

 Tế bào CaSki (ATCC), dòng tế bảo ung thư cổ tử cung có chứa bộ gene của HPV 16

 Tế bào C-33 A (ATCC), dòng tế bào ung thư cổ tử cung không chứa bộ gene HPV

 Tế bào MCF-7 (ATCC), dòng tế bào không biểu hiện protein p16INK4A

 Tế bào u tủy P3X63Ag8.653 (ATCC) không sản sinh các chuỗi immunoglobin và mất khả năng tổng hợp enzyme HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)

 Dòng tế bào lai 1D5 và 4H5 sản xuất KTĐD kháng protein E7 HPV18 được tạo ra trong hợp tác giữaPTN SHPT–ĐH KHTN–ĐHQGTpHCM với Trung tâm Nghiên cứu Y sinh học Cordeliers - Đơn vị INSERM 255 (Pháp) năm 2006

 Tế bào CHO–K1 được nhận từ Phòng thí nghiệm Tế bào gốc – ĐHQG HCM, nuôi cấy

và bảo quản tại PTN SHPT – ĐHKHTN – ĐHQG HCM

Các dòng tế bào được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử (PTN SHPT) - bộ môn Di Truyền – khoa Sinh Học – trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên (ĐHKHTN) – ĐHQG HCM

3.1.2 Chủng vi sinh vật

 Chủng vi khuẩn dùng để dòng hoá : E coli (Escherichia coli) DH5 F–, ø80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK–, mK+), phoA,

supE44, λ–, thi-1, gyrA96, relA1 (Promega)

 Chủng vi khuẩn biểu hiện protein tái tổ hợp: E coli BL21(DE3): F– ompT gal dcm

lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) (Promega)

3.1.3 Vector

 Các vector biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli bao gồm: pET28a(+)

(Novagen), pE-SUMO3 (Life Sensor), pETM44 và pGAT (EMBL) Các vector này có

mang vùng T7 promoter để biểu hiện protein mục tiêu trong tế bào chất của E.coli Các

vector này mang các đuôi dung hợp khác nhau: 6xHis (pET28(a)), 6xHis-protein MBP (pETM44), 6xHis-protein SUMO (pSUMO), 6xHis-protein GST (pGAT)

 Vector pEGFP-C2 (BD) biểu hiện gene E7 HPV 16 và p16INK4A ở tế bào CHO-K1

 Vector pEGFP-E7: có mang toàn bộ gene E7 HPV 18 được chèn vào vị trí BglII và

SalI trong vùng MCS của vector pEGFP-C2, được tạo ra và bảo quản ở Phòng thí nghiệm

Sinh học phân tử - Đại học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQGTPHCM

3.1.4 Chuột thí nghiệm

 Chuột BALB/C (Viện Pasteur Nha Trang): chuột cái 6-8 tuần tuổi

 Chuột BALB/CBYJ (Charles River Laboratories France): chuột cái 6-8 tuần tuổi 3.1.5 Bệnh phẩm

Bệnh phẩm là mẫu dịch phết cổ tử cung lấy bằng que phết và cytobrush hay thu nhận trong dung dịch ThinPrep của bệnh nhân hoặc người đến khám ở các bệnh viện : Bệnh viện Ung bướu - Thành phố Hồ Chí Minh (4/2011 - 5/2011) ; Bệnh viện Phụ sản Bán công Bình Dương (10/2012 – 12/2012) ; Bệnh viện Thủ Đức (09/2012 – 10/2012) ; Bệnh viện Hùng Vương (02/2013 – 05/2013) Các mẫu thu nhận ở BV Hùng Vươngđược cung cấp với kết quả Pap test

3.1.6 Hóa chất-Môi trường

3.1.6.1 Hóa chất

 Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR (Polymerase chain reaction)

- GoTaq Flexi DNA polymerase (Promega), Pfu polymerase (Promega)

- Mồi (primer) gồm hai loại : (1) mồi chung (universal) dùng trong phương pháp giải trình tự là T7 promoter 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’ và T7 terminator 5’ GCTAGTTATTGCTCAGCGG 3’ có trình tự đã công bố ; (2) các mồi đặc hiệu cho các gene nghiên cứu dùng trong tạo dòng biểu hiện do chúng tôi thiết kế sẽ được trình bày trong phần Kết Quả tương ứng Mồi được tổng hợp bởi công ty IDT (Hoa Kỳ) và công ty Sigma

 Thang phân tử DNA và thang protein (Fermentas)

 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn

Dung dịch I (glucose 50 mM, Tris-HCl (pH 8,0) 25 mM, EDTA (pH 8,0) 10 mM), dung dịch II (sodium dodecyl sulfate (SDS) 1 %, NaOH 0,2 M), dung dịch III (potassium acetate 3 M pH 5), RNase 10 mg/ml

 Hóa chất dùng cho phản ứng tạo dòng

Dung dịch CaCl2 100 mM lạnh, NdeI (New England Biolab), BsaI (Fermentas),

NheI, NcoI, SalI, T4 DNA ligase (Promega)

 Hóa chất dùng cho cảm ứng biểu hiện protein

Dung dịch IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) 100 mM(Fermentas)

 Hóa chất dùng cho điện di protein

- Dung dịch ly giải protein: NaCl 50 mM, EDTA 1 mM

- Gel phân tách (separating gel) acrylamide 12 %: 3,3 ml dH2O, 4 ml acrylamide 30 %, 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 0,1 ml SDS 10 %, 0,1 ml APS 10 %, 30 µl TEMED

- Gel gom (stacking gel): 2,8 ml dH2O; 0,66 ml acrylamide 30 %, 0,5 ml Tris-HCl 1M (pH 6,8), 0,04 ml SDS 10 %, 0,04 ml APS 10 %, 16 µl TEMED

- Dung dịch nạp mẫu 5X (giữ ở 4oC): SDS 10 % (w/v), DTT 10 mM, Tris-HCl (pH 6,8) 0,2 M, glycerol 20 % (v/v), bromophenol blue 0,05 %

- Dung dịch điện di 5X (giữ ở nhiệt độ phòng): 15,1 g Tris-base; 94 g glycine; 5 g SDS; thêm dH2O cho đủ 1l

- Dung dịch nhuộm gel (giữ ở nhiệt độ phòng): 0,625 g coomassie brilliant blue, 112,5 ml ethanol tuyệt đối, 25 ml glacial acetic acid ; thêm dH2O (nước cất) cho đủ 250 ml

- Dung dịch giải nhuộm (giữ ở nhiệt độ phòng): 100 ml glacial acetic acid, 100 ml ethanol tuyệt đối, 800 ml dH2O

 Hóa chất dùng cho Western blot

- Dung dịch điện chuyển 1X (giữ ở 4oC): 3,03 g Tris-base, 14,41 g glycine, 200 ml methanol, thêm dH2O cho đủ 1 l

- Dung dịch TBS 1X: 0,605 g Tris-base, 4,39 g NaCl, thêm dH2O đủ 500 ml

- Dung dịch TBST (dung dịch rửa): TBS + Tween 20 (1 %)

- Dung dịch khóa màng (membrane blocking): TBST + sữa gầy (5 %)

- KTĐD kháng protein p16INK4A, KTĐD kháng protein E7 HPV16 (Santa Cruz Biotechnology), KT kháng đuôi 6xHis (Abcam)

- Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu horseradish peroxidase (Dako)

- Dung dịch ly giải tế bào : M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent

 Hóa chất dùng cho tinh sạch protein tái tổ hợp

- Lysozyme 10 mg/ml

- Dung dịch gắn cột (20 mM sodium phosphate, 50 mM NaCl, 40 mM imidazole, pH 7,4)

- Dung dịch rửa cột (20 mM sodium phosphate, 50 mM NaCl, 100 mM imidazole pH 7,4)

- Dung dịch dung ly (20 mM sodium phosphate, 50 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH7,4)

 Hóa chất dùng để gây đáp ứng miễn dịch trên động vật và thu nhận huyết thanh

- Tá dược Freund complete adjuvant, Freund incomplete adjuvant (Sigma)

- Dung dịch PBS (-) 1X, KH2PO4 (1,47 mM), Na2HPO4.2H2O (10 mM), KCl (2,7 mM), NaCl (137 mM), dung dịch PBS – BSA 1 % (PBS 1X + bovine serum albumin (BSA) (Sigma) 1 %), dung dịch PBS – Tween 0,05 % (PBS 1X + Tween 20 (Merck) 0,05 % )

 Hóa chất dùng trong ELISA kiểm tra đáp ứng miễn dịch của động vật

- Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu alkaline phosphatase (Southern Biotech)

- Cơ chất của enzyme alkaline phosphatase được pha trong dung dịch pha cơ chất (pH

9,8) có thành phần : Diethanolamine (Merck) 48,5 ml, MgCl2 4M 62,5 μl, ddH2O 500 ml Cách pha cơ chất (phosphatase substrate) (Sigma) : cho một viên cơ chất vào 5 ml dung

dịch pha cơ chất Lắc đến tan Bảo quản ở -20C, tránh sáng

 Hóa chất dùng cho dung hợp tạo tế bào hydridoma:

PEG 1500 (Sigma), dung dịch NH4Cl 0,17 M (Merck), HAT 50X (Sigma), HT 50X (Sigma), trypan blue (Sigma)

 Hóa chất dùng trong tinh sạch kháng thể đơn dòng

Bộ kit xác định isotype Isotrip (Santa Cruz Biotechnology), cột sepharose gắn protein A (GE Health Care), dung dịch gắn cột (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5 , NaCl 0,15 M),

dung dịch dung giải (glycine 0,1 M pH 2,8), dung dịch trung hòa (Tris-HCl 1 M pH 9)

 Hóa chất chuyển gene vào tế bào CHO-K1 và lai hóa miễn dịch tế bào trên lamelle

Lipofectamine 2000 (Invitrogen), poly-L-lysine (Sigma), PBS – PFA 3 % , PBS – triton X100 0,5 %, PBS – saponin (Sigma) 0,05 %, sữa gầy (Merck) 5 %, PBS – Tween (Merck) 0,1 %, H2O2 3%, DAB (2,4-diaminobutyric acid (Sigma), glycerol

 Hóa chất lai hóa miễn dịch tế bào trên lame kính

Lame kính có phủ silane (Dako), ethanol 95 %, ethanol 50 %, citrate pH6 10 mM,

H2O2 3 %, PBS – Tween 0,1 %, DAB (2,4-diaminobutyric acid (Sigma), hematoxylin (Merck), glycerol

 Hóa chất biotin hóa kháng thể

NaHCO3 (Merck) 0.1M pH 9,5, NHS-D-biotin (Sigma), DMSO (Merck), PBS, túi thẩm tách, HABA/avidin (Sigma)

 Hóa chất tạo đoạn DNA đánh dấu biotin

- Gotaq Master Mix (Promega)

- Đoạn amplicon khuôn:

5’CTTTCGGTCGTGTCGGCCATCCTCGCCATCACTGCTGTGATTGCTGTATTTATTGTGATTTTTAGGTATCACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCCACACAGGCAATATCGAGACAAACATGGATGAAAACCTCCGCATTCCTGTGACTGCTGAGGTTGTTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAACAC3’và

5’GTGTTGGAGCTACCGACAAAGGCCTTTGATGGGTTAACAACCTC

AGCAGTCACAGGAATGCGGAGGTTTTCATCCATGTTTGTCTCGATATTGCCTGTGTGGTTTCGATGGTCTTGGTCACAGTGTTGTGATACCTAAAAATCACAATAAATACAGCAATCACAGCAGTGATGGCGAGGATGGCCGACACGACCGAAAG3’ ; mồi xuôi 5’ biotin-GGTCGTGTCGGCCATCCTC 3’ và mồi ngược 5’ GGAGCTACCG ACAAAGGCCT 3’

 Hóa chất cho immunoPCR

PBS, sữa gầy 5 % có bổ sung 0,1 mg/ml DNA tinh trùng cá hồi (Promega), sữa gầy 0,5 %, PBS-Tween 0,1 %, streptavidin (Sigma), Gotaq Green Master mix (Promega), PCR master mix (Promega), gel agarose (Biorad)

 Hóa chất cho lai reverse dot blot (RDB) định type HPV

- Hóa chất xử lý mẫu: que lấy mẫu, dung dịch TE (Tris EDTA)

- Hóa chất tách chiết DNA: Dung dịch A (phenol pH 8, guanidinium isothiocyanate, glycerol, sodium acetate 3M pH 5,4), Dung dịch B (chloroform), Dung dịch C (isopropanol, coprecipitant), Dung dịch D (ethanol 70%), Dung dịch E (Tris, EDTA)

- Hóa chất PCR-RDB: PCR-RDB Master mix

- Gel agarose (1,8 %), dung dịch nạp mẫu, thang “181 cặp base”

- Dung dịch TAE 1X

3.1.6.2 Môi trường

 Môi trường Luria-Bertani (LB): 10 g NaCl, 10 g bacto tryptone, 5 g cao nấm men, hòa tan trong H2O, chỉnh pH 7, thêm nước cho đủ 1 l Hấp khử trùng ở 121°C - 30 phút

 Môi trường thạch LB: môi trường LB thêm agar 15 g/l

 Môi trường LB-kanamycin: môi trường LB bổ sung kanamycin để đạt nồng độ cuối là

 Môi trường chọn lọc : môi trường HAT dùng chọn lọc tế bào lai là môi trường RPMI1640 (Gibco) bổ sung các thành phần dung dịch HAT 1X (hypoxanthine 1 x 10-4M, aminopterin 4 x 10-7 M, thymidine 1,6 x 10-5 M (Sigma), huyết thanh (FBS – fetal bovine serum (Gibco) 20 %, penicillin-streptomycin (Gibco) 1 %, HEPES (Gibco) 1 %, NCTC

109 (Sigma) 10 %, amino acid không thiết yếu (Sigma) 1 %

 Môi trường EX-CELL Hybridoma : là môi trường thương mại có chứa các thành phần thay thế huyết thanh tăng cường khả năng sản xuất kháng thể của tế bào lai

 Môi trường E’MEM nuôi cấy tế bào HeLa và tế bào Beas-2b: bột môi trường E’MEM (Sigma) 8,12 g/l, phenol đỏ 0,4 %, L-glutamine 2 mM, NaHCO3 0,1125 %, HEPES 20

mM, amphotericin-B 0,025 μg/ml, penicillin G 100 UI/ml, streptomycin 100 μg/ml, huyết thanh (FBS – fetal bovine serum) 10 %, chỉnh pH 7,2

 Môi trường Opti-MEM (Invitrogen): thành phần giống với môi trường E’MEM nhưng lượng huyết thanh giảm một nửa

 Môi trường Ham’s Nutrient Mixture F12 nuôi tế bào CHO-K1: môi trường Ham’s Nutrient Mixture F12 (Sigma), amphotericin-B 0,025 μg/ml, penicillin G 100 UI/ml, streptomycin 100 μg/ml, FBS 10 %, pH 7,2 – 7,4

3.2 PHƯƠNG PHÁP

3.2.1 Phương pháp thiết kế mồi

Trình tự gene mục tiêu được thu nhận từ cơ sở dữ liệu NCBI Các mồi và mẫu dò được thiết kế bằng phần mềm Beacon Designer 7.9 (PREMIER Biosoft International)

Thông số vật lý của mồi và mẫu dò được đánh giá bằng phần mềm OligoAnalyzer 3.1 (Integrated DNA Technologies) Phần mềm Clustal được sử dụng để kiểm tra các tính bảo tồn ở hai đầu của gene Độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò được kiểm tra bằng phần mềm BLAST (NCBI)

Các mồi được thiết kế để mang trình tự nhận biết của một loại enzyme cắt giới hạn

để tạo thuận lợi cho quá trình tạo dòng trong một vector xác định

3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA, RNA

3.2.2.1 Tách chiết DNA bộ gene

Tế bào (từ dịch nuôi cấy tế bào HeLa/Caski hay từ dịch phết cổ tử cung) được thu nhận bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút DNA được tách chiết dựa theo phương pháp TriZol (Chomczynski & Sacchi, 1987) Bổ sung 900 l dung dịch TriZol (guanidinium thiocyanate, phenol pH8, sodium acetate) vào 100 l dịch tế bào sau ly tâm Lắc mạnh 5 giây rồi để yên 10 phút Thêm 200 l dung dịch chloroform, trộn kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển 600 l dịch nổi sang eppendorf 1,5 ml mới Thêm 600 l dung dịch isopropanol Trộn kỹ và để yên 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Cẩn thận hút bỏ dịch nổi Thêm 900 l dung dịch ethanol 70% Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Cẩn thận hút bỏ dịch nổi Làm khô cặn trong 10 phút ở 60C Hòa cặn trong 50 l dung dịch

TE 1Xvà bảo quản DNA tách chiết ở 2-8C trong vòng 2-3 ngày hoặc ở -20C trong vòng

6 tháng

3.2.2.2 Tách chiết DNA plasmid

Hoạt hóa tế bào E coli DH5α có mang plasmid cần tách chiết bằng cách cấy

chuyền từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 2 ml môi trường LB có bổ sung kanamycin 30 µg/ml (đối với các chủng mang vector pET-28a(+), pE-SUMO3, pETM44, pEGFP-C2) hoặc bổ sung ampicillin 100 µg/ml (đối với chủng mang vector pGAT) Nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 37°C Ly tâm thu sinh khối (13.000vòng/phút, 5 phút) Bổ sung 100 µl dung dịch I (3.1.6.1) vào eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn, vortex kỹ Bổ sung 200 µl dung dịch II (3.1.6.1), đảo nhanh eppendorf nhẹ nhàng Ủ trên nước đá 5 phút Thêm 150 µl dung dịch III (3.1.6.1), đảo eppendorf thật kỹ cho đến khi thấy tủa trắng xuất hiện Ủ 5 phút trong đá Ly tâm với vận tốc 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C Chuyển dịch nổi từ eppendorf trên vào một eppendorf 1,5 ml mới Bổ sung hai thể

tích ethanol tuyệt đối lạnh Hòa tủa trong 20 µl TE 1X + 2 µl RNase 10 mg/ml, bảo quản

ở -20°C

3.2.2.3 Tách chiết RNA

Sinh khối tương đương 2x106 tế bào HeLa được dùng để tách chiết RNA với quy trình tương tự nội dung 3.2.2.1, trong đó phenol pH 8 được thay bằng phenol pH 4 trong dung dịch TriZol.Cặn RNA được hòa lại trong 10µl H2O-DEPC (đã xử lý với diethylpyrocarbonate), giữ ở - 20oC

3.2.3 Phương pháp PCR và RT-PCR

Phương pháp PCR được sử dụng cho nhiều mục tiêu : nhân bản gene để tạo dòng

và giải trình tự, chọn lọc các dòng có mang gene mong muốn, định týp HPV, thực hiện phản ứng immunoPCR Đối với mỗi ứng dụng, các cặp mồi đặc hiệu và chương trình PCR phù hợp sẽ được trình bày trong nội dung tương ứng

Phương pháp RT-PCR được sử dụng để nhân bản cDNA p16INK4A từ RNA của tế bào HeLa Phản ứng RT gồm : 10 µl dịch RNA, 1 µl reverse transcriptase (Agilent), H2O –DEPC cho đủ 15 µl Chương trình nhiệt RT : 20oC – 10 phút, 42oC - 1 giờ,72oC - 15 phút

3.2.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Để tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose, chúng tôi sử dụng DNA extraction kit (Fermentas), với hướng dẫn sử dụng tóm tắt như sau : Vạch sản phẩm PCR có kích thước mong muốn được trích từ gel agarose sau điện di và làm tan ; mẫu được cho vào cột ly tâm (spin column) và sản phẩm tinh sạch được thu lại sau ly tâm

Để tinh sạch sản phẩm PCR và sản phẩm cắt giới hạn : Cho 260 µl TE1X vào 40

µl sản phẩm PCR ; thêm 300 µl dung dịch phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), vortex 5 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút - 10 phút, ở 4oC, thu dịch nổi Thêm 1 thể tích chloroform, vortex 5 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút - 10 phút, ở 4oC, thu dịch nổi Bổ sung 1/10 thể tích dung dịch CH3COONa 3M pH 5,2, 1/20 thể tích glycogen 20 mg/ml và

2 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh, đảo ống Tủa trong -20oC - 2 giờ Ly tâm 13.000 vòng/ phút - 20 phút để thu tủa Rửa tủa bằng 1ml ethanol 70 % và ly tâm 13.000 vòng/ phút -

10 phút Để tủa khô ở 65oC, hoà vào 20 l TE 1X

3.2.5 Phương pháp giải trình tự

Mẫu cần giải trình tự, sau khi tinh sạch, được gửi cho hãng Macrogen (Hàn quốc) Kết quả giải trình tự được xử lý theo hai bước: (1) so sánh với các dữ liệu trên ngân hàng

gene bằng phần mềm BLAST (NCBI) ; (2) sắp gióng cột và kiểm tra sự đồng khung giữa gene mục tiêu và plasmidbằng phần mềm Clustal X (SFI)

3.2.6 Phương pháp tạo dòng biểu hiện

Phương pháp tạo dòng biểu hiện dùng để tạo các vector tái tổ hợp mang các gene E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 18 và p16INK4A Có 4 hệ vector được sử dụng là plasmid pET28a(+), pE-SUMO3, pETM44 và pGAT nhưng cách tiến hành không có khác biệt, và

bao gồm ba bước : (1) tạo vector tái tổ hợp, (2) biến nạp vector tái tổ hợp vào E

coliDH5α và E.coli BL21 (DE3), (3) chọn lọc dòng có mang gene mong muốn

3.2.6.1 Tạo vector tái tổ hợp mang gene mong muốn

 Thủy giải plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzyme phù hợp (bảng1) theo hai bước : bước 1, sản phẩm PCR và plasmid được cắt bằng enzyme cắt giới hạn I ; bước

2, plasmid và sản phẩm cắt giới hạn ở bước 1 được tiếp tục cắt bằng enzyme II

Mỗi phản ứng thủy giải được tiến hành trong thể tích 40 µl : 2 µl plasmid /sản phẩm PCR (hoặc sản phẩm cắt giới hạn) với lượng khoảng 0,4-2 µg/phản ứng, 4 µl buffer

10 X, 4 µl BSA 10 X, 1 µl enzyme cắt giới hạn phù hợp (10 unit/ul) (bảng 1), 29 µl H2O

đã loại bỏ nuclease (nuclease free), ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 4 giờ Sau đó, thu nhận sản phẩm cắt giới hạn bằng 2 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh để tủa ở -20oC trong 2 giờ Tủa này sẽ được hòa trong 31 µl nước đã loại bỏ nuclease và bổ sung các thành phần buffer

10 X, BSA 10 X và emzyme cắt thứ 2, ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 4 giờ

Sản phẩm cắt giới hạn cuối cùng được tinh sạch bằng phương pháp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (mục 2.4)

Bảng 1 Các plasmid sử dụng và enzyme cắt giới hạn tương ứng

 Thiết lập phản ứng nối trong thể tích 10 µl : 1 µl buffer T4 DNA ligase 10X, 1µl plasmid đã xử lý enzyme cắt giới hạn với lượng khoảng 100-200 ng/phản ứng, một thể tích sản phẩm PCR đã xử lý enzyme sao cho đáp ứng tỉ lệ khối lượng giữa sản phẩm