xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real time rt-pcr

Chúng điều khiển các đáp ứng miễn dịch thông qua khả năng kích thích hoặc ức chế các hoạt động của tế bào thể hiện qua sự hoạt hóa, tăng sinh, biệt hóa tế bào cũng như điều hòa sự tiết c

1

PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN TÍNH KÍCH THÍCH

MIỄN DỊCH CỦA MỘT SỐ CHẤT BẰNG REAL-TIME RT-PCR

Chủ nhiệm đề tài: Trần Quốc Vũ

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng

Kinh phí được duyệt: 80 triệu

Kinh phí đã cấp: 80 triệu theo TB số : TB-SKHCN ngày / /

Mục tiêu: Xây dựng, hoàn chỉnh quy trình in vitro xác định khả năng tăng cường

miễn dịch của hợp chất tự nhiên

Nội dung:

Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện

Nội dung 1: Xây dựng và hoàn chỉnh

quy trình real-time RT-PCR đo sự thay

đổi biểu hiện mRNA của hai loại

cytokine IL-2 và TNF-α trong 2 dòng tế

bào

Tối ưu hóa một số điều kiện phản ứng, xây dựng và hoàn chỉnh được quy trình real-time RT-PCR

Nội dung 2: Áp dụng real-time RT-PCR

để phát hiện khả năng kích thích miễn

dịch của một số chất

Kết quả về tác động của một số hợp chất trên sự biểu hiện mRNA IL-2 và TNF-α

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

Hệ miễn dịch của con người có thể bảo vệ cơ thể chống lại tác hại do các vi sinh vật xâm nhiễm gây ra Hệ miễn dịch bao gồm miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đặc hiệu Trong đó, các tế bào giết tự nhiên (NK-nature killer), hệ thống bổ thể, đại thực bào, các tế bào trình diện kháng nguyên và bạch cầu trung tính tạo thành hệ miễn dịch bẩm sinh, chúng đáp ứng ngay lập tức, không đặc hiệu với tác nhân gây bệnh Nếu tác nhân gây bệnh (như vi khuẩn, virus) vượt qua hàng rào đầu tiên này,

hệ miễn dịch đặc hiệu, bao gồm miễn dịch dịch thể và trung gian tế bào sẽ bắt đầu hoạt động Các kháng nguyên (nấm, virus, vi khuẩn, độc tố…) bị xử lý và được các

tế bào trình diện kháng nguyên trình diện với tế bào T hỗ trợ (TH có mang protein

bề mặt CD4), qua đó hoạt hóa sự tiết cytokine Ngoài các cơ chế tự nhiên, có những yếu tố bổ sung có khả năng kích thích và ức chế miễn dịch của cơ thể Tính kích thích miễn dịch sẽ nâng cao khả năng miễn dịch tổng thể của cơ thể và phản ứng miễn dịch không đặc hiệu chống lại các tác nhân gây bệnh của vi sinh vật Các tác nhân kích thích miễn dịch cũng hoạt động để nâng cao đáp ứng miễn dịch dịch thể

và tế bào, bằng cách tăng cường tiết cytokine, hoặc bằng cách trực tiếp kích thích tế bào lympho T và B

Cytokine là các peptide và glycoprotein có nhiều tác động, có nhiều nguồn, nhiều mục tiêu, và nhiều chức năng Chúng điều khiển các đáp ứng miễn dịch thông qua khả năng kích thích hoặc ức chế các hoạt động của tế bào thể hiện qua sự hoạt hóa, tăng sinh, biệt hóa tế bào cũng như điều hòa sự tiết của các kháng thể hoặc các cytokine khác Trong đáp ứng miễn dịch, cytokine bám lên các thụ thể đặc hiệu trên màng của tế bào đích và khởi sự các con đường truyền tín hiệu dẫn đến thay đổi sự biểu hiện gene ở tế bào đích và các phân tử cytokine có thể tác động theo kiểu tự tiết, cận tiết hoặc nội tiết Vì vậy, cytokine rất quan trọng trong phản ứng viêm bẩm sinh và thích ứng Trong đó, các tế bào chính tiết cytokine là tế bào TH và đại thực bào Cytokine do tế bào TH tiết ra sẽ tác động trở lại làm biệt hóa các tế bào TH

thành tế bào TH1 và TH2 Hoạt động của tế bào TH1 liên quan đến sự hoạt hóa các đại

3

thực bào, đồng thời cũng liên quan đến con đường miễn dịch qua trung gian tế bào; trong khi các tế bào TH2 lại có ảnh hưởng đến sự tạo và tiết kháng thể Một loại tế bào T khác là tế bào T gây độc (có mang protein CD8 trên bề mặt) lại cảm ứng apoptosis ở các tế bào của cơ thể mang kháng nguyên lạ (Tan & cs, 2004; Oppenheim, 2001)

TNF-α là một trong các cytokine chính trong đáp ứng miễn dịch, do đại thực bào hoặc tế bào T tạo ra khi đáp ứng viêm với vi khuẩn hay các tác nhân kích thích TNF-α hoạt động như một yếu tố dẫn dụ hóa học, lôi kéo đại thực bào hay các tế bào bạch cầu đến vị trí viêm Ngoài ra, TNF-α còn cho thấy có khả năng tăng cường đáp ứng kháng ung thư Trong khi đó, IL-2 được coi như là một yếu tố tăng trưởng tế bào T, thúc đẩy sự tăng sinh, sự hoạt hóa và biệt hóa tế bào T, B IL-2 có thể kích thích tế bào NK và các tế bào gây viêm như tế bào mono/đại thực bào và các tế bào trung tính Bên cạnh đó, IL-2 còn có tác động lên sự sản xuất các cytokine khác như IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α Người ta chú ý đến ứng dụng lâm sàng của IL-2 do khả năng hoạt hóa tế bào NK và tăng cường đáp ứng kháng tế bào ung thư Các liệu pháp dựa trên IL-2 đã được FDA cho phép tiến hành trong điều trị ung thư thận suốt 2 thập niên qua (McDermott & cs, 2004)

Thảo dược đã được sử dụng để điều trị bệnh từ lâu đời Hiện nay, người ta ước tính rằng khoảng 50% các loại thuốc tổng hợp có nguồn gốc từ chất hóa học thực vật Các nghiên cứu khoa học gần đây đã chứng minh rằng nhiều loại thảo mộc có khả năng giúp tăng cường hệ thống miễn dịch bằng cách kích thích các tế bào bạch cầu và cũng như điều hòa biểu hiện các cytokine quan trọng trong hoạt động miễn dịch của cơ thể (Tan & cs, 2004) Một số nghiên cứu tiêu biểu như: Melanin, được

chiết từ Nigella sativa L cảm ứng sự biểu hiện của TNF-α, IL-6 và VEGF mRNA

của monocyte, tế bào đơn nhân ngoại vi, dòng tế bào THP-1; ở mức độ protein, melanin cảm ứng sự tạo thành TNF- α, IL-6 (El-Obeida & cs, 2006) LZ-8, một

protein từ Ganoderma lucidum có khả năng kích thích các tế bào lympho ngoại vi

tạo IL-2, đồng thời làm tăng sự biểu hiện của thụ thể của IL-2 (Hsu & cs, 2008)

4

Các cycloartane phân lập từ Astragalus melanophrurius (Fabaceae) có hoạt tính

điều hòa miễn dịch trên các tế bào lympho người được phân lập Các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng dùng astrasieversianins II, X; astragalosides I, II, IV, và VI; cyclocanthosides E, G ở các nồng độ từ 0,01 đến 10 µg/mL có thể kích thích sự tăng sinh của các tế bào lympho người Trong khi đó oleanolic acid and

echinocystic acid phân lập từ Luffa cylindrica (Cucurbitaceae) làm tăng chỉ số thực

bào, kích thích đại thực bào, làm gia tăng đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào (Ríos & cs, 2010)

Các nghiên cứu về sự biểu hiện cytokine khi bị cảm ứng bởi các tác nhân gây kích thích rất đa dạng, với nhiều kỹ thuật được áp dụng cùng với các mô hình động vật, tế bào Sau đây là những phương pháp tiêu biểu:

+ Kỹ thuật phát hiện protein cytokine:

- Phương pháp ELISA: dùng để đo hàm lượng cytokine do các tế bào thuộc

hệ thống miễn dịch (tế bào lympho, đại thực bào…) tiết ra sau khi được cảm ứng với các hợp chất Trong phương pháp này, kháng thể kháng cytokine sơ cấp gắn trên bề mặt giếng của đĩa 96 giếng sẽ bắt giữ những cytokine tương ứng hiện diện trong mẫu (dịch nuôi cấy tế bào) Những kháng thể kháng cytokine thứ cấp đã được đánh dấu biotin được bổ sung sau đó sẽ gắn vào những cytokine nói trên Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) gắn với biotin sẽ phân cắt cơ chất tạo sản phẩm hiện màu hoặc phát huỳnh quang của HRP Cường độ của những tín hiệu này phản ánh khả năng cảm ứng tạo cytokine của chất thử nghiệm Phương pháp này còn cho phép đo được lượng cytokine có trong máu của người sử dụng thuốc

- Phương pháp ELISPOT: cũng tương tự như ELISA, nhưng tế bào được gây cảm ứng sẽ phát triển trong giếng đã gắn sẵn kháng thể sơ cấp kháng cytokine Cytokine do tế bào tiết ra đều được các kháng thể sơ cấp bắt giữ Sau đó, những kháng thể kháng cytokine thứ cấp đã được đánh dấu biotin được bổ sung sau đó sẽ gắn vào những cytokine nói trên Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) gắn

5

với biotin sẽ phân cắt cơ chất tạo những đốm màu Số lượng đốm màu tạo thành sẽ được quan sát và định lượng bằng kính hiển vi và phần mềm xử lý hình ảnh (Christian & cs, 2008)

- Phương pháp flow cytometry: phát hiện ra sự thay đổi thành phần tế bào trong quần thể tế bào miễn dịch cũng như hàm lượng cytokine do chúng tiết ra Trong kỹ thuật này, các tế bào được thu nhận từ máu toàn phần hay tế bào máu đơn nhân ngoại vi sẽ được ủ với các kháng thể của các marker bề mặt đặc trưng cho từng loại tế bào (CD3, CD14, CD15, CD69…) Sau đó, các tế bào trải qua xử lý sẽ được đưa vào máy flow cytometry để phát hiện và phân tách thành các quần thể tế bào khác nhau (Christian & cs, 2008)

+ Kỹ thuật phát hiện sự biển hiện gene cytokine:

- Phương pháp RT-PCR và real-time RT-PCR: đây là phương pháp phản ánh mức độ biểu hiện của gene mã hóa cho cytokine ở mức phiên mã Những năm gần đây real-time RT-PCR ngày càng được sử dụng nhiều để định lượng mRNA của cytokine mục tiêu Điều này cho thấy tiềm năng của việc định lượng sự biểu hiện mRNA nhằm xác định sự đáp ứng của các tế bào miễn dịch trong các thử nghiệm về thuốc hay các hợp chất tự nhiên Tuy nhiên, mức độ phiên mã không phải lúc nào cũng phản ánh chính xác cytokine được tiết ra Do đó, để đánh giá chính xác ảnh hưởng của chất cảm ứng lên các tế bào miễn dịch cần có sự phối hợp của các phương pháp trên (Christoph & cs, 2001; Prescilla, 2008; Stephan & cs, 2008)

Nguồn tế bào được sử dụng để thử nghiệm chất cảm ứng kích thích miễn dịch là các tế bào thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể: tế bào mono, tế bào lympho T, Phương pháp phổ biến để phân lập các tế bào này từ máu là sử dụng ly tâm trên đệm Ficoll nhằm tách chúng khỏi hồng cầu, tiều cầu và huyết tương Theo nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau, các tế bào miễn dịch sẽ được tiếp tục xử lý

Bên cạnh đó, một số dòng tế bào của người cũng được sử dụng cho các nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc hay các hợp chất tự nhiên lên khả năng biểu hiện và sản xuất cytokine Các dòng tế bào được sử dụng gồm có: dòng tế bào Jurkat (tế bào lympho T) có khả năng biểu hiện và tiết cytokine IL-2 ; U937 (dòng tế bào mono)

có khả năng biểu hiện và tiết cytokine TNF-α, hay dòng THP1 (dòng tế bào mono)… Việc sử dụng các dòng tế bào này đã được sử dụng trong các nghiên cứu trên thế giới về cơ chế điều hòa miễn dịch, cơ chế điều hòa biểu hiện gene cytokine thông qua NF-kB (El-Obeida & cs, 2006; Grzanna & cs, 2006; Hsu & cs, 2008)

Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến tăng cường hệ miễn dịch từ cây thuốc đã được công bố trong thời gian gần đây Một số công trình sử dụng mô hình chuột được gây suy giảm miễn dịch bằng cách chiếu xạ, kết quả cho thấy một số cao chiết từ thảo dược có tác dụng làm phục hồi đáng kể tổn thương các mô lympho, tăng chức năng đại thực bào và tỷ lệ tế bào lách tạo quầng dung huyết, tăng chuyển

dạng tế bào lympho ở lách chuột Ngoài ra, thử nghiệm in vitro cho thấy làm tăng

chuyển dạng tế bào lympho của máu ngoại vi người khỏe mạnh, tăng khả năng thực bào, khả năng tiết nitric oxide của bạch cầu đa nhân trung tính người (Nguyễn Thị

7

Thư & cs, 2008) Có sản phẩm chiết xuất từ cây thuốc đã được thương mại hóa

như Phylamin chiết từ loài Azolla microphylla có tác dụng hoạt hoá các đại thực

bào và các lympho bào, do đó tăng cường khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư (Trần Công Yên & cs, 2005)

Trong khi đó, những nghiên cứu của trung tâm Sâm và dược liệu TP.HCM về tính kích thích miễn dịch của các hợp chất chiết xuất từ các cây thuốc thuộc họ Nhân sâm cho thấy cao chiết Đinh lăng có tính năng tương tự như zymosan (một chất kích thích khả năng thực bào), có khả năng làm gia tăng chỉ số thực bào của chuột bình thường và chuột đã được gây suy giảm miễn dịch Đặc biệt các nghiên cứu về sâm Ngọc Linh và hợp chất majonosid-R2 chiết xuất từ sâm Ngọc Linh cho

thấy có hoạt tính làm gia tăng chỉ số thực bào in vivo của đại thực bào ở chuột,

tương tự như chất kích thích sự thực bào điển hình zymosan – A Các thử nghiệm trên chuột gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid cho thấy bột chiết sâm vẫn duy trì được lượng bạch cầu, làm tăng trọng lượng lách và tuyến ức, gia tăng chỉ số thực bào (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007)

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để phát hiện những thay đổi ở mức độ biểu hiện gene của các cytokine quan trọng trong hoạt động miễn dịch Vì real-time RT-PCR đang được sử dụng rộng rãi để định lượng cytokine từ tế bào, dịch thể, mô và sinh thiết Đây là phương pháp mạnh và nhạy,

có thể dùng để xác định các mức độ biểu hiện mRNA của cytokine, thường biểu hiện rất thấp trong các mô nghiên cứu Phương pháp này cho phép phát hiện trực tiếp sản phẩm PCR trong pha tăng trưởng của phản ứng nhờ vào việc sử dụng các mẫu dò huỳnh quang (Taqman probe) Sự biểu hiện các cytokine được kiểm soát ở nhiều cấp độ nhưng sự phiên mã gene là bước đầu tiên, quan trọng trong quá trình tạo thành protein cytokine Do đó, chúng tôi sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR, nhằm mục đích phát hiện những thay đổi của tế bào khi cảm ứng với hợp chất tự nhiên ở mức phiên mã gene, từ đó có thể phát hiện khả năng kích thích miễn dịch của các hợp chất đó Ngoài ra, trong phạm vi đề tài này, chi phí cho việc xây dựng

8

qui trình real-time RT-PCR nhằm phát hiện sự biểu hiện cytokine thấp hơn nhiều so với việc sử dụng các bộ kit ELISA phát hiện protein cytokine (giá thành bộ kit ELISA cho từng loại cytokine với khoảng 192 phản ứng là 25-30 triệu đồng) Vì vậy, nếu dùng ELISA để nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất tự nhiên lên sự biểu hiện nhiều loại cytokine sẽ không có lợi về kinh tế Trong khi đó, chi phí đặt mua mồi và mẫu dò cho một gene mã hóa cytokine thì thấp, nên có thể phát triển cho nhiều loại cytokine với mục đích sàng lọc Những hợp chất có tiềm năng sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu chuyên sâu về sau ở mức độ biểu hiện protein hay lâm sàng

Mô hình tế bào mà chúng tôi sử dụng trong đề tài này là 2 dòng tế bào ung thư: dòng tế bào Jurkat, đại diện cho tế bào lympho T và dòng tế bào U937 đại diện cho tế bào mono/đại thực bào trong các thí nghiệm cảm ứng với các hợp chất tự nhiên Chúng tôi chọn hai dòng tế bào này vì đây là dòng tế bào của người, đặt mua

từ ATCC, có khả biểu hiện cytokine IL-2 (Jurkat), TNF-α (U937) khi được kích thích với các phytohaemagglutinin (PHA), lipopolysaccharide (LPS); ngoài ra, các thí nghiệm trên dòng tế bào cho phép chúng tôi kiểm soát được tính biến động của

tế bào so với việc dùng tế bào máu ngoại vi hay máu toàn phần thu từ nhiều người khác nhau Bên cạnh đó, thử nghiệm với 2 dòng tế bào này cũng cho phép chúng tôi đánh giá được tác động của từng hợp chất tự nhiên lên hai loại tế bào miễn dịch là

tế bào lympho T và mono/đại thực bào một cách riêng rẽ Vì vậy, đây là mô hình phù hợp để xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của các hợp chất

tự nhiên thông qua sự biểu hiện gene IL-2 và TNF-α

Sau khi xây dựng và tối ưu hóa quy trình real-time RT-PCR xong, chúng tôi

sử dụng chứng dương là phytohaemagglutinin (PHA) và lipopolysacchride (LPS)

để thử nghiệm quy trình trước tiên Hai chất này đã được chứng minh là có khả năng kích thích biểu hiện gene IL-2, TNF-α ở các tế bào lympho T và tế bào mono / đại thực bào (Dupuis & cs, 1988)

9

Ở giai đoạn thử nghiệm quy trình, chúng tôi chọn 2 hợp chất được chiết xuất

từ sâm Việt Nam là majonosid-R2 và ginsenosid-Rg1 làm chất gây cảm ứng; đây là những hợp chất đã được Trung tâm Sâm và dược liệu TP.HCM nghiên cứu, cho thấy có khả năng gây kích thích miễn dịch, làm tăng chỉ số thực bào khi thử nghiệm trên chuột (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007) Ngoài ra, nhiều công trình trên thế giới cũng cho thấy ginsenosid-Rg1 có một số ảnh hưởng nhất định đối với hoạt động miễn dịch Theo Qu và cộng sự (2011), khi tiêm chuột với hỗn hợp Rg1 và

kháng nguyên Toxoplasma gondii SAG1 tái tổ hợp làm gia tăng đáng kể đáp ứng

miễn dịch với kháng nguyên này ở chuột Trong khi đó, nghiên cứu của Sun và cộng sự (2008) cho thấy một mình Rg1 có thể nâng cao đáng kể việc sản xuất isotypes IgG chuyên biệt kháng nguyên và sự tiết IL-5 và IFN-γ (Qu & cs, 2011; Sun & cs, 2008) Trong khi đó, majonosid-R2 có khả năng ức chế đáng kể lượng TNF-α có trong huyết thanh của khi chuột được tiêm bằng DGaIN/LPS Mặt khác, majonosid-R2 cũng có khả năng bảo vệ tế bào gan chuột nuôi cấy sơ cấp bằng cách

ức chế quá trình apoptosis cảm ứng bằng D-GalN/TNF-alpha in vitro (Tran & cs,

2002)

Đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real-time RT-PCR” sẽ tạo ra một công cụ hữu ích trong việc phát hiện những hợp chất (đặc biệt là những chất có nguồn gốc từ tự nhiên) có tác dụng kích thích đối với hệ miễn dịch thông qua sự biểu hiện các cytokine quan trọng (IL-2, TNF-α) của tế bào T, monocyte; qua đó góp phần đưa những hợp chất có trong cây

cỏ vào các nghiên cứu ứng dụng về sau

10

CHƯƠNG II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real-time RT-PCR” có hai nội dung nghiên cứu chính:

- Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch

- Áp dụng quy trình với một số chất thử nghiệm

2.1 Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch

Mục tiêu: thiết lập các thông số cần thiết cho quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch

2.1.1 Nuôi cấy tế bào

- Tế bào Jurkat và U937 được nuôi cấy trong môi trường Glutamax (Gibco) có bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco) ở 37oC, 5% CO2

RPMI1640 Sau đó, ly tâm thu sinh khối ở 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

- Rửa lại bằng PBS, tiếp tục ly tâm thu sinh khối ở 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare)

- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng reverse transcriptase (Khoa Thương)

- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20oC cho các thí

nghiệm tiếp theo

2.1.2 Kiểm tra hoạt động của các cặp mồi và mẫu dò

Chúng tôi thu nhận trình tự các cặp mồi và mẫu dò cho IL-2, TNF-α và actin trên các công trình đã công bố trước đây [28] Sau đó, chúng tôi sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho việc thiết kế mồi như Annhyb 4.943 và Oligo analyzer

Các cặp mồi cùng mẫu dò được lựa chọn sẽ được tổng hợp và kiểm tra lại bằng PCR trên mẫu cDNA thu nhận từ tế bào Jurkat, U937

2.1.3.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng monoplex time PCR

real-Nhiệt độ bắt cặp được khảo sát trên gradient các nhiệt độ từ 50oC đến 65oC Các phản ứng của 3 cặp mồi được thực hiện riêng rẻ Khoảng cách giữa các nhiệt

độ khảo sát do máy tự điều chỉnh, bao gồm các nhiệt độ sau: 65oC, 62,3oC, 59,5oC,

2.1.3.2 Kiểm tra phản ứng multiplex real-time PCR với nhiệt độ đã chọn

Nhiệt độ bắt cặp tối ưu từ mục 2.1.3.1 được dùng cho thí nghiệm này Chúng tôi so sánh kết quả của 2 phản ứng monoplex và multiplex PCR để xác nhận nhiệt

độ bắt cặp phù hợp dùng cho các phản ứng multiplex PCR về sau

Phản ứng multiplex sử dụng 2 cặp mồi cho mỗi phản ứng : il2-F/R với F/R ; tnfa-F/R với bactin-F/R Trong đó bactin-F/R được dùng để phát hiện sự biểu hiện của gene chứng nội là β-actin

cytokine mục tiêu trên các dòng tế bào tương ứng

2.2 Áp dụng quy trình với một số chất thử nghiệm

Mục tiêu : kiểm tra khả năng phát hiện sự biểu hiện gene IL-2 và TNF-α bằng

kỹ thuật real-time RT-PCR vừa xây dựng

2.2.1 Sự biểu hiện gene IL-2 ở tế bào Jurkat khi cảm ứng với PHA

- Tế bào Jurkat được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax có bổ sung 10% FBS, 1% HEPES, 1% Penicillin/Streptomycin Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1 x 106 tế bào / mL

- Các tế bào được xử lý với PHA ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL, 5 µg/mL và

10 µg/mL

- Ủ ở điều kiện 5% CO2, 37oC trong 6 giờ

- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

15

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare)

- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng reverse transcriptase (Khoa Thương)

- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ bảo quản ở -20oC cho đến khi

∆Ct = Ct gene mục tiêu – Ct gene chứng nội

- Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism 5

2.2.2 Sự biểu hiện gene TNF-α ở tế bào U937 khi cảm ứng với LPS

- Tế bào U937 được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax (Gibco) có

bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco) Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1 x 106 tế bào / mL

- Các tế bào được xử lý với LPS ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL, 5 µg/mL và

10 µg/mL Ủ ở điều kiện 5% CO2, 37oC trong 6 giờ, 12 giờ

- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare)

- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng reverse transcriptase (Khoa Thương)

- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng

2.2.3 Sự biểu hiện IL-2 ở tế bào Jurkat khi cảm ứng với majonosid-R2

- Tế bào Jurkat được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax (Gibco)

có bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco) Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1 x 106 tế bào / mL

- Tế bào được xử lý với majonosid-R2 ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL, 5 µg/mL và 10 µg/mL

- Ủ ở điều kiện 5% CO2, 37oC trong 6 giờ và 12 giờ

- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare)

- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng reverse transcriptase (Khoa Thương)

- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20oC

- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR và tính toán sự tăng/giảm biểu hiện gene như mục 2.2.1

2.3.4 Sự biểu hiện TNF-α ở tế bào U937 khi cảm ứng với majonosid-R2

- Tế bào U937 được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax (Gibco) có

bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco) Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1x106 tế bào /

17

- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare)

- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng reverse transcriptase (Khoa Thương)

- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20oC

- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR và tính toán sự tăng/giảm biểu hiện gene như mục 2.2.2

2.3.5 Sự biểu hiện IL-2 ở tế bào Jurkat khi cảm ứng với ginsenosid-Rg1

- Tế bào Jurkat được nuôi trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% FBS, 1% HEPES, 1% Penicillin/Streptomycin Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1x106 tế bào / mL

- Các tế bào được xử lý với ginsenosid-Rg1 ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL,

5 µg/mL và 10 µg/mL

- Ủ ở điều kiện 5% CO2, 37oC trong 6 giờ và 12 giờ

- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare)

- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng reverse transcriptase (Khoa Thương)

- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20oC

- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR và tính toán sự tăng/giảm biểu hiện gene như mục 2.2.1

2.3.6 Sự biểu hiện TNF-α ở tế bào U937 khi cảm ứng với ginsenosid-Rg1

- Tế bào U937 được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax (Gibco) có

bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco) Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1x106 tế bào /

mL

18

- Các tế bào được xử lý với ginsenosid-Rg1 ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL,

5 µg/mL và 10 µg/mL

- Ủ ở điều kiện 5% CO2, 37oC trong 6 giờ và 12 giờ

- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare)

- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng reverse transcriptase (Khoa Thương)

- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng

- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR và tính toán sự tăng/giảm biểu hiện gene như mục 2.2.1

 Sản phẩm cần đạt : Kết quả về tác động của PHA, LPS, majonosid-R2 và ginsenosid-Rg1 trên sự biểu hiện mRNA IL-2 và TNF-α ở dòng tế bào Jurkat, U937

3.1.1 Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào Jurkat (tế bào lympho T) có khả năng biểu hiện và tiết cytokine IL-2 (Hsu & cs, 2008), trong khi U937 (dòng tế bào mono) lại có khả năng biểu hiện và tiết cytokine TNF-α (Garrelds & cs, 1999) Do đó, chúng tôi sử dụng cả hai dòng tế bào này để xây dựng quy trình phát hiện khả năng kích thích miễn dịch thông qua sự biểu hiện IL-2 và TNF-α

Các dòng tế bào được giải đông và nuôi trong môi trường Glutamax có bổ sung 10% FBS, 1% HEPES, 1% Penicillin/Streptomycin Ủ ở điều kiện 5% CO2, 37oC Sau vài thế hệ cấy chuyền, các tế bào được cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1 x 106 tế bào / mL Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin

RPMI1640-Nuôi cấy tế bào và thu nhận tế bảo Tách chiết RNA và chuyển thành cDNA

Kiểm tra hoạt động của mồi và mẫu dò