xây dựng quy trình để kiểm nghiệm enterobacter sakazaki trong sữa bột bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (pcr)

Sản phẩm của đề tài: Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR và một bài báo đăng trên Tạp Chí Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp... vi MỤC LỤC Trang Chương

ii

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài: Xây dựng qui trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng kỹ

thuật polymerase chain reaction (PCR)

Chủ nhiệm đề tài: TS Vũ Thị Lâm An

Cơ quan chủ trì: Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện đề tài: từ 5/2011 tới 7/2013

Kinh phí được duyệt: 300 triệu đồng

Kinh phí đã cấp: 200 triệu theo TB số: 28/TB-SKHCN ngày 5/5/2011

70 triệu theo TB số: 151/TB-SKHCN ngày 22/11/2012

Mục tiêu: Xây dựng qui trình phát hiện E sakazakii trong sữa bột bằng kỹ thuật PCR

Nội dung:

1 Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E sakazakii bằng PCR

1.1 Kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của Enterobacter sakazakii, với 2 cặp mồi để

nhân bản 2 gen ompA (outer membrane protein A) và MMS (macromolecular

synthesis)

1.2 Khảo sát các điều kiện phản ứng: nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2, hàm lượng mồi

1.3 Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi

1.4 Khảo sát độ nhạy của phương pháp PCR và thời gian tăng sinh cần thiết

1.5 PCR sử dụng chứng nội chung mồi ESSF và ESSR

1.6 Giải trình tự sản phẩm PCR

1.7 Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR

2 Đánh giá hiệu lực sơ cấp qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii bằng PCR

dựa vào nhân bản gen (tên gen đã chọn từ 2 qui trình PCR kể trên)

2.1 Xác định giới hạn phát hiện Enterobacter sakazakii trong mẫu sữa bột

iii

2.2 Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy

2.3 Thử nghiệm qui trình ở hai phòng thí nghiệm độc lập

3 Kết quả của đề tài

- Qui trình PCR1 để nhân bản gen ompA là qui trình được chọn để kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR Điều kiện tối ưu tiến hành qui trình

PCR này bao gồm: nồng độ mồi 10 pm, nhiệt độ bắt cặp 57 oC và nồng độ MgCl23

mM Thời gian tăng sinh cần thiết đối với mẫu sữa bột là 24 giờ trong nước peptone (BPW) ủ ở nhiệt độ 37 oC Với thời gian tăng sinh 24 giờ, qui trình PCR1 có thể phát

hiện E sakazakii ngay cả ở mức 1 CFU/25g mẫu sữa bột Việc sử dụng chứng nội

chung mồi và UNG trong quá trình thực hiện PCR không làm ảnh hưởng tới kết quả của kiểm nghiệm mà còn cho phép loại trừ kết quả âm và dương tính giả Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đã khẳng định có sự tương đồng rất cao của đoạn gen đích với

đa số chủng E sakazakii trong ngân hàng gen

- Giới hạn phát hiện (LOD) của qui trình PCR đề xuất là 1 CFU/25 g sữa bột Các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR đề xuất đã đảm bảo các chuẩn mực thẩm định một phương pháp thay thế với: Độ chính xác (AC) 95%, Độ đặc hiệu (SP) 100%, Độ nhạy (SE) 90%, Độ lệch dương (PD) 0%, Độ lệch âm (ND) 10%

4 Sản phẩm của đề tài: Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột

bằng PCR và một bài báo đăng trên Tạp Chí Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp

iv

Project title: Development of an Enterobacter sakazakii detection procedure in milk

powder using polymerase chain reaction (PCR)

Executive institution: the University of Agriculture and Forestry, Ho Chi Minh City (or Nong Lam University)

Duration: from May 2011 to July 2013

Objective: to develop Enterobacter sakazakii detection procedure in milk powder using

PCR technique

Research contents:

1 Development of E sakazakii detection procedure in milk powder using PCR

1.1 Examination of amplification of E sakazakii genes using two pairs of primers that amplify gene fragments of ompA gene (outer membrane protein A) as PCR 1 and MMS

gene (macromolecular synthesis) as PCR 2

1.2 Investigation of PCR conditions of the chosen PCR: annealing temperature, concentration of MgCl2 and primers

1.3 Examination of specificity of the primers

1.4 Examination of sensitivity of the chosen PCR and the enrichment time

1.5 PCR using exogenous positive control EPC with primers ESSF và ESSR

1.6 Sequencing of PCR products

1.7 PCR procedure for detection of E sakazakii in powdered milk

2 Primary validation of the achieved procedure using PCR for detection of E sakazakii in powdered milk

2.1 Determination of detection limit (LOD) of the PCR for detection of E sakazakii in

v

- The PCR 1, the ompA-targeted one, was chosen for detection of E sakazakii in

powdered milk Optimal conditions for the chosen PCR were: the concentration of primer of 10 pm, anealing temperature of 57 oC and concentration of MgCl2of 3 mM Enrichment time was 24 h in buffered peptone water at 37 oC After 24 h of

enrichment, the PCR could detect E sakazakii at level of 1 CFU/25 g The presence

of the EPC with the adjusted amount of EPC and the UNG did not affect the target sensitivity, but did avoid PCR false negative and false positive results Comparison of the nucleotide sequences of the PCR products with other sequences available in the

GenBank database revealed a high degree of homology with ompA genes of other strains of E sakazakii

- The limit of detection (LOD) of the PCR method was 1 CFU/25 g The technical parameters of PCR method were calculated: relative accuracy (AC) 95%, relative specificity (SP) 100%, relative sensitivity (SE) 90%, positive deviation (PD) 0% and negative deviation (ND) 10%

4 Research products: PCR procedure for detection of E sakazakii in powdered milk

and an article on the Journal of Agricultural Sciences and Technology

vi

MỤC LỤC

Trang

Chương I: Tổng quan

1.1 Giới thiệu sơ lược về Enterobacter sakazakii và các phương pháp

xác định vi khuẩn này trong thực phẩm

1.2 Một số nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài

2.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E sakazakii bằng

PCR

2.1.1 Kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của E sakazakii

2.1.2 Khảo sát các điều kiện phản ứng: nhiệt độ bắt cặp, nồng độ

2.2.1 Xác định giới hạn phát hiện Enterobacter sakazakii trong mẫu sữa

bột bằng PCR so với phương pháp truyền thống

2.2.2 Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so với

phương pháp nuôi cấy

2.2.3 Thử nghiệm qui trình ở hai phòng thí nghiệm độc lập

3.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E sakazakii bằng

3.1.3 Kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình PCR

3.1.4 Khảo sát độ nhạy của phương pháp PCR và thời gian tăng sinh

cần thiết

3.1.4.1 Kết quả khảo sát sau thời gian tăng sinh 8 giờ

3.1.4.2 Kết quả khảo sát sau thời gian tăng sinh 24 giờ

3.1.5 Kết quả sử dụng chứng nội chung mồi ESSF và ESSR

viii

3.1.6 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR

3.1.7 Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng

PCR

3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu lực sơ cấp Enterobacter sakazakii bằng

PCR dựa vào nhân bản gen

3.2.1 Xác định giới hạn phát hiện Enterobacter sakazakii trong mẫu sữa

bột bằng PCR so với phương pháp truyền thống

3.2.2 Kết quả khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so

với phương pháp nuôi cấy

3.2.3 Kết quả thử nghiệm qui trình ở hai phòng thí nghiệm độc lập

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection

BPW Môi trường Buffered peptone water

CFU Colony forming unit

DNA Deoxyribonucleic acid

DW Distilled water, nước cất

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase chain reaction

WHO World Health Organization

x

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Primer và trình tự các nucleotide của primer 13

3.1 Kết quả kiểm nghiệm E sakazakii bằng phương pháp PCR và

3.9 Sản phẩm PCR trên bản điện di – Có và không sử dụng chứng

nội chung mồi

31

3.10 Sản phẩm PCR trên bản điện di có sử dụng chứng nội chung mồi

với DNA được pha loãng

32

1

MỞ ĐẦU

Enterobacter sakazakii (hiện nay được gọi là Cronobacter sakazakii) là vi

khuẩn gây bệnh trên người ở nhiều độ tuổi khác nhau (Drudy và ctv, 2006), đặc biệt ở trẻ em có trọng lượng sơ sinh thấp, sinh thiếu tháng hoặc có hệ miễn dịch kém (Himelright và ctv, 2002) và trên người trưởng thành có đáp ứng miễn dịch

bị suy giảm, chủ yếu trên người già (Tsai et al., 2013) E sakazakii còn được

xem là nguyên nhân gây ra các cơn bộc phát bệnh nguy hiểm như viêm màng não, nhiễm trùng máu, hoại tử ruột non… ở trẻ em Đầu tiên là cơn bộc phát bệnh do viêm màng não ở Anh vào năm 1958, làm chết hai trẻ được Urmenyi và Franklin báo cáo vào năm 1961 Kể từ đó cho đến năm 2005 đã có hơn 80

trường hợp nhiễm E sakazakii xảy ra ở nhiều nước trên thế giới (Drudy và ctv,

2006; Iversen và Forsythe, 2003; Grutler và ctv, 2005 và FAO/WHO, 2006) Bệnh hiếm gây lây nhiễm lan tràn nhưng tỉ lệ chết do bệnh đã được ghi nhận rất cao ở trẻ em là 44% (FAO/WHO, 2006) và có thể tới 40-80% ở trẻ sơ sinh (Iversen và Forsythe, 2003) Ở người trưởng thành - nhóm được xem là ít bị nguy hiểm nhất – thì tỷ lệ tử vong là 50% (Muytjens và ctv, 1983; Kleimen và ctv, 1981; Burdette và Santos, 2000) với biểu hiện thường là nhiễm trùng máu, viêm xương tủy, viêm phổi… (Lai, 2001)

Sự lây nhiễm E sakazakii thường liên quan tới các sản phẩm sữa bột và

bột trẻ em từ sữa ngay cả sản phẩm sau hai năm được bảo quản vì sữa bột không

được khử trùng trong giai đoạn cuối của quá trình chế biến nên khả năng có vi

trùng trong hộp và túi đựng rất cao mà nhiệt độ của nước pha chế sữa bột cho trẻ

sử dụng nằm trong khoảng điều kiện phát triển tốt cho Enterobacter sakazakii

2

Đặc biệt là khả năng hình thành màng sinh học của E sakazakii trên bề mặt dụng

cụ chứa và chế biến sữa cũng như trên các bề mặt trong xưởng sản xuất sữa giúp cho vi khuẩn này có thể tồn tại lâu ở đó ngay cả khi những bề mặt này được xử

lý với chất tẩy rửa nên khả năng nhiễm và tồn tại trong sản phẩm là khá cao (Lehner và ctv, 2005)

Năm 2002 ICMSF (International Commission on Microbiological

Specifications for Food) đã đánh giá E sakazakii như ‘‘một mối nguy nghiêm

trọng cho các cộng đồng dân cư, đe dọa tính mạng hoặc để lại di chứng mãn tính

quan trọng kéo dài’’ (ICMSF, 2002) Qua đó, E sakazakii đã được xếp vào cùng bậc (mối nguy bậc A- bậc cao nhất) với Salmonella (FAO/WHO, 2004 và 2006)

Trong rất nhiều các nguyên nhân gây nhiễm E sakazakii và khả năng gây

bệnh của nó như đã kể trên thì nguyên nhân từ nguồn nguyên liệu (bột sữa) bị nhiễm là khó phòng ngừa nhất đối với người tiêu dùng Cách duy nhất có thể là

nguyên liệu đảm bảo không bị vấy nhiễm, do vậy cần có sự kiểm nghiệm E

sakazakii trong các sản phẩm này để ngăn chặn nguồn lây nhiễm bệnh do E sakazakii cho người tiêu dùng nói chung đặc biệt là trẻ em nói riêng

Hiện nay ở các nước thuộc cộng đồng châu Âu EU, Mỹ và một số nước

khác E sakazakii đã được đưa vào danh mục những vi khuẩn gây bệnh cần được

kiểm nghiệm bắt buộc và đã có tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho vi khuẩn này

Theo qui định của Bộ Y tế Việt Nam, E sakazakii không được phép có trong các

sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng hay trong các sản phẩm dinh dưỡng công thức với mục đích y tế đặc biệt cho trẻ đến 12 tháng (QCVN 8-3: 2012/Bộ Y tế) Trong khi đó tại Việt Nam hiện nay chưa có thông

tin về tình hình nhiễm bệnh hay tỉ lệ tử vong do E sakazakii và vi khuẩn này vẫn

chưa được chú ý kiểm nghiệm dù mặt hàng sữa bột và thực phẩm bột trẻ em từ

3

sữa đã và đang chiếm lĩnh thị phần rất lớn trên thị trường Trong khi kết quả kiểm nghiệm các mẫu sữa bột theo các phương pháp truyền thống do chúng tôi thực hiện trước đây cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn này trong các mẫu sữa bột được kiểm

Một số qui trình kiểm nghiệm E sakazakii truyền thống đã được công

nhận trên thế giới và đang được áp dụng, nhưng thời gian kiểm nghiệm kéo dài (7 ngày) lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm và kĩ thuật của người thực hiện Quan trọng hơn cả là tính chuyên biệt còn thấp vì các môi trường phân lập được

sử dụng trong các qui trình này vẫn chưa thật sự chuyên biệt, cần phải áp dụng thêm các phản ứng sinh hóa mất rất nhiều thời gian Các kĩ thuật hiện đại như kĩ thuật sinh học phân tử có tính chuyên biệt, độ chính xác cao và thời gian thực hiện ngắn hơn nhiều so với qui trình truyền thống

Vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng qui trình kiểm nghiệm E sakazakii

trong sữa bột và thực phẩm bột từ sữa có thời gian thực hiện ngắn và chi phí thấp, phù hợp điều kiện và yêu cầu tại Việt Nam là rất cần thiết

4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu sơ lược về Enterobacter sakazakii và các phương pháp xác định vi

khuẩn này trong thực phẩm

Enterobacter sakazakii (E sakazakii) là vi khuẩn gram (-), hình trực, thuộc

giống Enterobacter, họ Enterobacteriaceae (Farmer và ctv, 1980) Vi khuẩn này có mặt

ở khắp nơi trong đất, nước, không khí, vật nuôi… (Iversen và Forsythe, 2003) và trong thực phẩm, đặc biệt là sữa bột hiện được sử dụng ngày càng nhiều cho trẻ em để thay thế cho sữa mẹ

E sakazakii là vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt nhất so với các vi khuẩn khác

trong họ Enterobacteriaceae (Nazarowec - White và ctv, 1997) Theo nghiên cứu của

Iversen và ctv (2004), hầu hết các chủng E sakazakii đều có khả năng phát triển ở một

khoảng rộng của nhiệt độ từ 6 đến 45 oC và nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là từ 37 đến 43 oC

Ngoài ra, một số chủng E sakazakii có thể phát triển ở nhiệt độ thấp 5,5 oC (Nazarowec - White và Farber, 1997) Theo nghiên cứu của Iversen và ctv (2004),

cũng tồn tại một số chủng E sakazakii phát triển ở nhiệt độ cao hơn (47 oC) trong sản phẩm sữa bột dành cho trẻ em Khả năng chống chịu sự sấy khô giúp cho vi khuẩn này tồn tại lâu dài trong sữa bột công thức trẻ em và các thành phần có độ ẩm thấp của thực phẩm này (Walsh et al., 2011; Beuchat et al., 2013) Khả năng này có thể do vài nhân

tố phản ứng với stress trước đây đã được xác định trên E sakazakii bao gồm khả năng

sống sót qua shock nhiệt, stress do lạnh, môi trường khô hạn, hoạt độ nước và pH (Arku et al., 2011)

5

E sakazakii không có khả năng sống sót qua quá trình thanh trùng Pasteur ở 72

o

C trong 15 phút (Iversen và ctv, 2004a) Nhưng cũng có một vài nghiên cứu cho rằng

E sakazakii có thể tồn tại trong điều kiện sống khắc nghiệt như môi trường khô hạn có

hoạt độ nước aw = 0,2 (Breeuwer và ctv, 2003) và sống sót qua quá trình sấy phun (Arku và ctv, 2008)

E sakazakii có khả năng chống lại các chất tẩy rửa được sử dụng trong quá trình

vệ sinh dụng cụ và thiết bị Điều này có được là do E sakazakii có khả năng sinh

polysaccharide bên ngoài tế bào, giúp cho quá trình tạo màng sinh học (biofilm) trên silic, nhựa, polycarbonat, thuỷ tinh… làm tăng khả năng kết dính của vi khuẩn này với

bề mặt dụng cụ và thiết bị (Lehner và ctv., 2005) Từ đó làm tăng nguy cơ nhiễm E sakazakii vào thực phẩm, đặc biệt là sữa bột dành cho trẻ em

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy sữa bột bị nhiễm E sakazakii là nguồn gây bệnh cho trẻ em (Mullane và ctv, 2006; Sharker và ctv, 2007) và E sakazakii đã được

phát hiện trong các mẫu sản phẩm sữa và các mẫu khác thu thập trong nhà máy sản xuất sữa bột: sàn đóng gói, nền nơi bao gói, các bước sấy… (Mullane và ctv, 2007)

E sakazakii được xem là nguyên nhân gây bệnh ở nhiều độ tuổi khác nhau, từ

trẻ em đến người trưởng thành và kể cả người già (Drudy và ctv, 2006) Đặc biệt là những trẻ có hệ miễn dịch chưa hoàn thiện, trẻ sinh thiếu tháng hay trẻ có trọng lượng

thấp sau khi sinh, có nguy cơ nhiễm E sakazakii cao hơn so với những trẻ khác

(Himelright và ctv, 2002)

Tỷ lệ nhiễm E sakazakii là 1/100.000 đối với trẻ em dưới 12 tháng tuổi

(FAO/WHO, 2004) Trong khi đó, tỷ lệ này đối với trẻ có cân nặng dưới 2500 g là 8,7/100.000 và trẻ có cân nặng dưới 1500 g là 9,4/100.000 (Stoll và ctv, 2004) Trẻ em

trên 12 tháng tuổi và người trưởng thành có nguy cơ mắc bệnh thấp hơn khi nhiễm E sakazakii (FAO/WHO, 2006)

6

E sakazakii là một mầm bệnh cơ hội, thường gây ra hậu quả và triệu chứng

nghiêm trọng như viêm màng não, chết hoại ruột non (Van Acker và ctv, 2001) và nhiễm trùng máu (Bar - Oz và ctv, 2001)… đặc biệt là ở trẻ sơ sinh với tỉ lệ tử vong rất cao từ 40- 80% (Muytjens và ctv, 1988) Những trường hợp mắc phải bệnh xâm nhiễm

do E sakazakii thường có khả năng sống sót thấp và để lại di chứng rất nghiêm trọng

như tai biến mạch máu não, tràn dịch não, u nang não, tứ chi bất toại… (Drudy và ctv,

2006) Đối với người trưởng thành, sự nhiễm E sakazakii được xem là ít nguy hiểm

hơn, triệu chứng thường gặp như viêm phổi, nhiễm khuẩn máu… với tỉ lệ tử vong là 50% (Lai, 2001)

Phương pháp định tính E sakazakii được sử dụng phổ biến hiện nay tại châu Âu

và Mỹ là phương pháp theo CLF (Central Laboratories Friedrichsdorf, Đức), phương pháp theo FDA (Food and Drug Administration, Mỹ), phương pháp theo ISO/TS

22964 (Sanjaq, 2007) Những phương pháp này đều qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa Do đó các phương pháp này có nhược điểm là thời gian phát hiện dài, đòi hỏi nhiều môi trường nuôi cấy

và hiệu quả kiểm nghiệm tùy thuộc nhiều vào kỹ năng của người xét nghiệm Quy trình tóm tắt ba phương pháp này được thể hiện trong Hình 1.1

Kiểm tra bằng API 20E/API 32E Chọn khuẩn điển hình

Xác định sự hiện hiện E sakazakii trong mẫu Hình 1.1: Quy trình phân lập E sakazakii theo CLF, FDA, ISO

8

Phương pháp của CLF: mẫu sau khi được tiền tăng sinh trong môi trường BPW

và tăng sinh chọn lọc trong môi trường EE (Enterobacteriaceae enrichment broth), sẽ

được phân lập trên môi trường MacConkey Sau đó, chọn các khuẩn lạc điển hình để thử sinh hoá với Simmon’s citrat, sorbitol Khuẩn lạc nghi ngờ hình thành trên môi trường MacConkey sẽ được trải lại trên môi trường TSA (Tryptic (Trypticase) Soy Agar) để tìm ra khuẩn lạc mang sắc tố vàng và dùng hệ thống API 20E (API 32E…) để khẳng định kết quả (Sanjaq, 2007)

Phương pháp của FDA: mẫu sau khi trải qua bước tiền tăng sinh trong môi trường BPW và tăng sinh chọn lọc trong môi trường EE, sẽ được phân lập trên môi trường VRBGA (violet red bile glucose agar) Sau khi phân lập, năm khuẩn lạc màu đỏ hồng được chọn và cấy chuyển qua môi trường phân lập TSA để phát hiện ra khuẩn lạc đặc trưng mang sắc tố vàng Cuối cùng, sử dụng hệ thống sinh hoá API 20E (API 32E…) để khẳng định kết quả (FDA, 2002a)

Phương pháp ISO/TS 22964: mẫu cũng trải qua các bước tiền tăng sinh trong dung dịch pepton đệm, tăng sinh chọn lọc trong môi trường mLST (môi trường LST, modified lauryl sulfate broth, có bổ sung 0,5 M NaCl và 10 mg/l vancomycin) và phân

lập trên môi trường TSA để tìm ra khuẩn lạc đặc trưng mang sắc tố vàng của E sakazakii Sau đó, hệ thống sinh hoá API 20E (API 32E…) được sử dụng để khẳng

9

được sản xuất như DFI (Druggan-Forsythe-Iversen), ESPM (E sakazakii chromogenic

plating medium), TSA (Tryptic Soy Agar) bổ sung 4-α-MUG D-glucopyranosid), nhằm mục đích phát hiện dễ dàng vi khuẩn E sakazakii nhờ màu

(4-methylumbelliferyl-α-sắc rất đặc trưng của khuẩn lạc (Hình 1.2) trên môi trường nhưng vẫn cần phải qua bước khẳng định bằng phương pháp sinh học phân tử.

Trên OK (Oh và Kang, 2004)

Trên DFI (Iversen và ctv, 2004)

Trên ESPM (Restaino,

2005)

Hình 1.2: Khuẩn lạc của E sakazakii trên ESPM, DFI và OK

10

Môi trường phân lập DFI có bổ sung chất chỉ thị D-glucopyranoside (X-α-Glc) Trên môi trường này, enzym α-glucosidase sẽ kết hợp với X-α-Glc ở vị trí 5-bromo-4-chloro-3-indolol trong điều kiện có oxy không khí, tạo

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-nên bromo chloroindigo sẽ nhuộm xanh các khuẩn lạc của E sakazakii (Iversen và ctv,

2004) Môi trường phân lập OK có bổ sung chất 4-methyl-umbelliferyl-α-D-glucoside

Trên môi trường này, khuẩn lạc của E sakazakii sẽ phát quang dưới tia UV có bước

sóng 365 nm (Oh và Kang, 2004) Môi trường phân lập ESPM có chứa chất huỳnh

quang X-α-Glucoside và D-cellobioside Trên môi trường này, khuẩn lạc của E sakazakii sẽ mang sắc tố màu đen (Restaino, 2005)

Một số phương pháp sinh học phân tử đã khắc phục được những nhược điểm trên của các phương pháp truyền thống Trong đó PCR được sử dụng rất phổ biến với nhiều cặp mồi khác nhau của các nhà nghiên cứu khác nhau (Hassan và ctv, 2007; Liu

và ctv, 2006; Lehner và ctv, 2004) Với việc sử dụng MMS (macromolecular synthesis operon) Seo and Brackett (2005) đã phát triển một qui trình real-time PCR để định

lượng E sakazakii Vài kỹ thuật real-time PCR khác cũng đã được Malorny và Wagner

(2005) và Derzelle và Dilasser (2006) mô tả

Trong đề tài này chúng tôi áp dụng 2 qui trình PCR đã được thử nghiệm trên các

chủng chuẩn E sakazakii và một số các vi khuẩn khác (Seo and Brackett, 2005) và trên chủng E sakazakii (ATCC 51329) (Nair và Venkitanarayanan, 2006) với sự cải tiến là

sự thử nghiệm quá trình tăng sinh trên môi trường nước peptone trong thời gian 8 và 24 giờ và sự hiệu chỉnh qui trình cho phù hợp với đối tượng mẫu sữa bột Các qui trình này đã cho kết quả rất cao về tính chính xác (100%) và độ nhạy (100%) Trong các qui trình PCR này, các cặp mồi ESSF và ESSR đã được thiết kế để xác định các gen đích,

ompA (outer membrane protein A) (Nair và Venkitanarayanan, 2006) và MM1 và

MM2 để xác định gene đích MMS (Seo và Brackett, 2005, Sanjaq, 2007), đặc hiệu cho

E sakazakii mà không có sự bắt cặp chéo với các giống vi khuẩn khác

11

1.2 Một số nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài

Chủ nhiệm đề tài đã chủ trì hướng dẫn các nghiên cứu xác định E sakazakii

trong sữa bột:

- “Kiểm nghiệm E sakazakii trong sữa bột dành cho trẻ em”, tiến hành theo phương pháp ISO/TS 22964, đã phát hiện trong E sakazakii 7/20 mẫu sữa (Trần Thị

Viết Hiếu và Vũ Thị Lâm An, 2008)

- “Phát hiện vi khuẩn Enterobacter sakazakii từ sữa bột tại thành phố Hồ Chí Minh”, 2/22 mẫu sữa bột trẻ em được phát hiện có E sakazakii nhờ phương pháp FDA

(Dương Ngọc Phương và Vũ Thị Lâm An, 2008)

- “Kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột trẻ em theo phương pháp ISO/TS 22964” đã phát hiện E sakazakii trong 7 mẫu sữa trên tổng số 40 mẫu (Trần

Thị Mộng Dung, Vũ Thị Lâm An và Võ Minh Châu, 2009)

- “Kiểm nghiệm E sakazakii trong sữa bột trẻ em theo phương pháp FDA” và đã

phát hiện 25% số mẫu có sự hiện diện của vi khuẩn này (Nguyễn Phương Thảo, Vũ Thị Lâm An và Võ Minh Châu, 2009)

Chi Đoàn Trung tâm Dịch vụ Phân tích và Thí nghiệm Tp HCM đã thực hiện

nghiên cứu: “Cải tiến phương pháp phát hiện E sakazakii trong sữa và sản phẩm sữa”

qua việc sử dụng môi trường Chromocult Agar và đã rút ngắn việc phát hiện còn 3 ngày so với 7 ngày của phương pháp ISO/TS 22964:2006 (Chi Đoàn Trung tâm Dịch

vụ Phân tích và Thí nghiệm TP HCM, 2009)

1.3 Ý nghĩa khoa học

Kết quả đề tài sẽ là dữ liệu khoa học cho việc định hướng sử dụng rộng rãi kỹ

thuật PCR trong kiểm nghiệm E sakazakii

12

Kết quả của nghiên cứu sẽ mở ra một hướng đi mới trong việc áp dụng kỹ thuật PCR trong thực tế kiểm nghiệm tại các đơn vị kiểm nghiệm thực phẩm cũng như tại các công ty chế biến thực phẩm

13

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đề tài đã được tiến hành từ 5/2011 tới 7/2013 tại Trung Tâm Chẩn Đoán Xét Nghiệm Bệnh Động Vật, 521/1 Hoàng Văn Thụ Tân Bình, TP HCM

2.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E sakazakii bằng PCR

2.1.1 Kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của E sakazakii

Mục đích: kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của E sakazakii

Vật liệu: chủng gốc Enterobacter sakazakii ATCC 4869 từ microbank (Pro-Lab

Diagnostics, Mỹ) được cấy trên môi trường thạch máu, ủ ở 37 °C trong 24 giờ Khuẩn lạc được thu bằng que cấy và pha vào nước tinh khiết (không có DNA) để đạt được nồng độ

vi khuẩn 105 tế bào/ml (bằng phương pháp so màu với bộ Mc Farland)

Môi trường và hoá chất: môi trường BPW (Buffered Peptone Water, Merck, Germany),

thang DNA chuẩn, 2 cặp mồi để nhân bản gen ompA (outer membrane protein A gene) và

operon MMS (macromolecular synthesis) với trình tự các nucleotide được trình bày qua Bảng 2.1 và điều kiện thực hiện PCR được trình bày qua Bảng 2.2

Bảng 2.1: Primer và trình tự các nucleotide của primer

- Thực hiện 2 qui trình PCR 1 và PCR 2 Lặp lại 5 mẫu

- Đánh giá sản phẩm PCR trên bản điện di

- Chọn 1 qui trình PCR cho sản phẩm PCR trên bản điện di rõ nét, không có vết (hay vạch khác lạ) để tiến hành các nội dung tiếp theo

Các trang thiết bị sử dụng cho các thí nghiệm được trình bày ở phần Phụ lục 3

2.1.2 Khảo sát các điều kiện phản ứng: nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2, hàm lượng mồi

Mục đích: Hiệu chỉnh các điều kiện phản ứng để cho kết quả PCR tốt nhất cho qui trình được chọn từ nội dung 1.1

Tiến hành:

15

- DNA của vi khuẩn chuẩn được chuẩn bị giống như nội dung 1.1 ở trên

- Thực hiện qui trình PCR trong các điều kiện thay đổi: nhiệt độ bắt cặp (từ 51 tới 68 oC), nồng độ MgCl2(1; 1,5; 2,0; 3; 4 và 5 mM), hàm lượng mồi (1, 2, 5, 10, 15, 20 và 25 pm mỗi primer) cho mỗi 20 µl PCR mix Lặp lại 5 lần

- So sánh kết quả PCR

- Hiệu chỉnh qui trình PCR qua việc lựa chọn các điều kiện thực hiện PCR (nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2, hàm lượng mồi)

2.1.3 Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi

Vật liệu: ngoài giống vi khuẩn chuẩn Enterobacter sakazakii (như đã trình bày ở các nội

dung trên, các giống vi khuẩn Salmonella enterica ATCC 13036, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, E coli ATCC 8739, Shigella flexneri (serotype 2b) ATCC 12022, Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 6538 và Proteus mirabilis ATCC

12453 cũng được sử dụng cho thí nghiệm này

Sữa bột được mua trên thị trường, phân thành các mẫu 25 g được chiếu xạ với liều 20,3 kGy để diệt khuẩn và chứa trong các túi vô trùng (tại Trung Tâm Nghiên Cứu Triển

Khai Công Nghệ Bức Xạ - Quận 9)

Tiến hành:

- Sử dụng dịch vi khuẩn trong môi trường BPW (môi trường nước peptone) của E sakazakii chuẩn với mật độ 105 tế bào/ml và các vi khuẩn khác như E coli, S aureus, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Bacillus cereus, Proteus mirabilis và Salmonella enterica cũng ở mật độ 105 tế bào/ml Đây là những vi khuẩn gây bệnh thường

có khả năng phát hiện trong sữa bột Các mẫu sữa bột đã được chiếu xạ sẽ được cấy 1 ml

canh khuẩn của E sakazakii chuẩn, hoặc 1 ml canh khuẩn của các vi khuẩn khác hoặc hỗn hợp của E sakazakii và các vi khuẩn khác Đồng thời mẫu sữa bột không được gây

nhiễm với vi khuẩn nào được sử dụng làm mẫu đối chứng âm

16

- Các mẫu sữa được gây nhiễm và không được gây nhiễm được bổ sung thêm 225

ml nước pepton, ủ 24 h ở 37 oC Hút 1 ml dịch tăng sinh và chiết tách để có DNA

- Li trích DNA

- Mẫu âm tính gồm có mẫu sữa bột không được gây nhiễm vi khuẩn nào và mẫu PCR mix

- Thực hiện qui trình PCR Lặp lại 3 lần với mỗi giống vi khuẩn

- Tính tỉ lệ mẫu dương tính và âm tính

- Đánh giá tính đặc hiệu qui trình PCR

2.1.4 Khảo sát độ nhạy của phương pháp PCR và thời gian tăng sinh cần thiết

Vật liệu: chủng gốc E sakazakii ATCC 4869 Sữa bột được mua trên thị trường và được

khử trùng bằng phương pháp chiếu xạ, thang DNA chuẩn, các cặp mồi cho qui trình PCR, các dung dịch đệm cho các phản ứng PCR, các hóa chất cho quá trình điện di Vi khuẩn

E sakazakii chuẩn được giữ ở nhiệt độ đông lạnh -20 oC trước khi gây nhiễm để tạo stress cho vi khuẩn như là stress khi sữa bột qua các giai đoạn chế biến (AOAC, 2002)

Tiến hành:

- Cấy gốc vi khuẩn E sakazakii chuẩn từ microbank vào thạch máu (BA), ủ 37oC trong 24 giờ Chọn khuẩn lạc, pha loãng vào nước muối sinh lý để có ống ban đầu (N), pha loãng tiếp 10 lần để có các nồng độ 10-1 tới 10-9 Cấy trang 0,1 ml dịch pha loãng ở các nồng độ 10-6 tới 10-8 vào chromocult (mỗi nồng độ 3 đĩa), ủ 37oC trong 24 giờ Số lượng vi khuẩn được xác định qua số lượng khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch Vi khuẩn

E sakazakii chuẩn sau đó được pha loãng các nồng độ từ 106 -101 CFU/ml

- Gây nhiễm sữa bột bằng vi khuẩn E sakazakii chuẩn sao cho mật độ vi khuẩn

(CFU/25g) trong các mẫu sữa bột 25 g mẫu lần lượt là 105, 104, 103, 102, 10, 5, 1 và 1 mẫu sữa không gây nhiễm Các mẫu này sau đó được cấy tăng sinh trên môi trường nước peptone BPW (tỉ lệ mẫu/nước peptone là 1/9) ở 37 oC trong 8 và 24 giờ

17

- Li trích DNA từ dịch tăng sinh Các mẫu sau tăng sinh 8 và 24 giờ được pipet (1 ml) cho vào các ống tube 1,5 ml và được đánh theo số thứ tự của mẫu

- Thực hiện qui trình PCR Lặp lại 3 lần cho mỗi độ pha loãng

- Đánh giá độ nhạy của qui trình, thời gian tăng sinh cần thiết (tối ưu)

Kết quả cần đạt được: đánh giá khả năng phát hiện E sakazakii trong các mẫu sữa bột của

qui trình PCR, thời gian tăng sinh mẫu thích hợp và các mức mật độ của vi khuẩn mà qui

trình có thể phát hiện được Từ đó đưa ra 1 qui trình kiểm nghiệm E sakazakii trong sữa

bột bằng PCR

2.1.5 PCR sử dụng chứng nội chung mồi ESSF và ESSR

Mục đích: khảo sát PCR khi sử dụng chứng nội chung mồi để loại bỏ khả năng kết quả

âm tính giả (đảm bảo 1 kết quả âm là do trong mẫu không có gene đích chứ không phải

do PCR bị ức chế) PCR mastermix cũng được thêm uracil N-glycosylase (UNG) (để loại trừ kết quả dương tính giả do ngoại nhiễm)

Vật liệu: chủng gốc E sakazakii ATCC 4869 chuẩn từ microbank được cấy vào thạch

máu (BA), ủ 37 oC trong 24 giờ sau đó DNA của nó được tách chiết Chứng nội (EPC) sử dụng chung mồi ESSF và ESSR được thiết kế bằng kỹ thuật tái tổ hợp nhờ plasmid pGEM T-Easy tại Công Ty Nam Khoa (địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, Phường Tân Hưng Quận 7, TP HCM) Chứng nội được thiết kế từ một trình tự DNA dài 599 bp có 2 đầu mang trình tự của ESSF và ESSR được chèn vào plasmid pGEM T-Easy Plasmid này

sau đó được tải nạp vào E coli để có được vi khuẩn E coli mang chứng nội Trình tự

primer để thiết kế chứng nội và chu trình nhiệt được trình bày qua Bảng 2.1 và Bảng 2.3 Trình tự chứng nội dùng chung mồi ESSF và ESSR được trình bày ở Phục lục 6 UNG Invitrogen, cat no 18054-015; QIAGEN® Multiplex PCR Kit Catalog no 206143 hay

206145

Công thức pha PCR mastermix có chứng nội sử dụng chung mồi và UNG như sau:

Qiagen Multiplex Mastermix 2X 10 µl

- PCR được tiến hành trên DNA của vi khuẩn E sakazakii chuẩn và chứng nội được thêm

vào PCR mastermix sau đó sản phẩm PCR được chạy điện di Thực hiện PCR 3 lần lặp lại cho mẫu có và không sử dụng chứng nội chung mồi

- Bên cạnh đó PCR cũng được tiến hành với các mẫu DNA của vi khuẩn E sakazakii

chuẩn được pha loãng từ 10-2 tới 10-7 với chứng nội EPC

Kết quả PCR đối với gene đích của E sakazakii là dương nếu xuất hiện cả 2 vạch

khuếch đại 469 và 599 bp trên bản điện di Trường hợp kết quả chỉ là 1 vạch 469 bp làm

19

lại PCR với mẫu DNA được pha loãng thành 10-1 và 10-2 để loại trừ khả năng chứng nội

bị ức chế hàm lượng DNA trong mẫu cao

2.1.6 Giải trình tự sản phẩm PCR

Mục đích: đánh giá sự tương đồng về kiểu gen của sản phẩm PCR thu được với các

chủng E sakazakii chuẩn trong ngân hàng gen

Vật liệu: sản phẩm PCR được chọn từ các kết quả có vạch DNA trên bản điện di rõ nét từ các thí nghiệm trên Các mẫu này (3 mẫu) được gởi tới Công Ty Nam Khoa để giải trình tự

Kết quả giải trình tự sau đó sẽ được tra cứu (NCBI blast search) để so sánh với ngân hàng gene và đánh giá sự tương đồng về kiểu gen của sản phẩm PCR thu được với

các chủng E sakazakii chuẩn trong ngân hàng gen

2.1.7 Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR

- Trích 25 g mẫu sữa bột từ mẫu cần kiểm nghiệm, bên cạnh đó trích 75 g mẫu lưu (mẫu này được trữ lạnh ở -20 oC để kiểm tra lại khi cần thiết)

- Tăng sinh: 25 g mẫu sữa bột cần kiểm nghiệm sẽ được thêm vào 225 ml BPW và ủ ở 37 o

C trong thời gian dựa vào kết quả của phần 1.4

- Mẫu sau tăng sinh sẽ được hút 1 ml vào tube 1,5 ml để thu nhận DNA (Phụ lục 1)

- Phản ứng PCR: thực hiện qui trình được chọn từ kết quả của nội dung trên đối với các

mẫu DNA, trong đó có cả chứng dương (DNA vi khuẩn E sakazakii chuẩn ở mật độ 105

tế bào/ml)

- Điện di và đọc kết quả

20

2.2 Đánh giá hiệu lực sơ cấp Enterobacter sakazakii bằng PCR dựa vào nhân bản gen

2.2.1 Xác định giới hạn phát hiện Enterobacter sakazakii trong mẫu sữa bột bằng PCR so

với phương pháp truyền thống

Mục đích: Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp PCR so với phương pháp truyền thống

và 10 CFU/250 g Các mẫu sữa này được trộn đều rồi phân thành các mẫu sữa bột gây nhiễm (25 g/mẫu) theo 3 mức: 50 tế bào (cao), 5 tế bào (trung bình) và 1 (thấp) CFU/25 g

và nhóm không gây nhiễm (AOAC international, 2002) Cách pha trộn vi khuẩn được trình bày ở Phụ Lục (3) Kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn trong các mẫu gây nhiễm bằng cách cấy mẫu sữa bột vào môi trường nước pepton và ủ ở 37 oC trong 24 h và sau đó cấy ria trên môi trường chromocult agar và ủ ở 37 oC trong 24 h

- Tiến hành phát hiện vi khuẩn trong các mẫu sữa bột bằng 2 phương pháp song song PCR và nuôi cấy truyền thống (ở đây chúng tôi dùng phương pháp TCVN 7850:2008

(ISO/TS 22964:2006), là phương pháp đang được sử dụng để kiểm nghiệm E sakazakii

trong thực phẩm tại Việt Nam), với 6 lần lặp lại cho mỗi phương pháp

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp PCR so với nuôi cấy dựa vào 2 mức gây nhiễm: mức 1 với kết quả <50% số mẫu dương tính và mức 2 với kết quả >50%

số mẫu dương tính LOD được xác định ở giữa 2 mức gây nhiễm này (ISO, 2003; Lombard và Leclereq, 2010) Phần mềm SAS 9.1.3 được sử dụng để tính LOD 50, khoảng tin cậy 95% theo Spearman-Karber

21

2.2.2 Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy

Hai mươi mẫu sữa bột và 20 mẫu bột sữa tập ăn được thu mua tại các cửa hàng bán sữa lẻ

và một số siêu thị trên địa bàn TP.HCM Kiểm nghiệm E sakazakii bằng qui trình đề

xuất Sau đó, trong mỗi chủng loại mẫu chia làm 2 đơn vị: 1 đơn vị gây nhiễm và 1 đơn vị không gây nhiễm Mức gây nhiễm 10 lần LOD (LOD có được từ kết quả của nội dung 2.1) Các mẫu được phân tích đồng thời bằng 2 phương pháp PCR và nuôi cấy truyền thống theo ISO/TS 22964:2006 Mỗi mẫu (25 g) được cấy vào 225 ml môi trường tăng sinh và sau khi tăng sinh ở 37 oC trong 24 h mới tách ra để tiến hành PCR và nuôi cấy truyền thống

Mẫu gây nhiễm Mẫu không gây nhiễm Phương pháp

* vì chung môi trường tăng sinh nên chỉ tách ra sau khi đã tăng sinh

- Đánh giá tỉ lệ nhiễm tự nhiên E sakazakii trong các mẫu sữa và bột sữa tập ăn (các mẫu

không được gây nhiễm)

- Đánh giá kết quả nhiễm E sakazakii trong các mẫu bằng 2 phương pháp phân tích

- Tính toán các thông số: độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, tỉ lệ dương tính giả và âm tính giả

Độ chính xác tương đối AC = (PA+NA)/Nx100

Độ đặc hiệu tương đối SP = NA/(NA+PD)x100

Độ nhạy tương đối SE = PA/(PA+ND)x100

Tỷ lệ dương tính giả DTS = PD/PAx100

Tỷ lệ âm tính giả ATS = ND/NAx100

22

Với:

PA: số kết quả dương ở cả 2 phương pháp (PP)

NA: số kết quả âm ở cả 2 PP

ND: số kết quả âm ở PCR trong khi là dương ở PP truyền thống

PD: số kết quả dương ở PCR trong khi là âm ở PP truyền thống

2.2.3 Thử nghiệm qui trình ở hai phòng thí nghiệm độc lập

- Chuẩn bị 20 mẫu sữa bột gây nhiễm vi khuẩn E sakazakii chuẩn: 5 CFU/25 g và 20 mẫu

sữa không có VK này Cách chuẩn bị các mẫu này được tiến hành tương tự như đã mô tả

ở phần 2.1.1 Mã hóa ký hiệu mẫu

Các mẫu sẽ được kiểm tra sự có mặt của E sakazakii theo cả phương pháp PCR và nuôi

cấy bởi 2 phòng thí nghiệm (PTN): Viện Vệ Sinh Y Tế Công Cộng TP HCM, số 159 Hưng Phú, Quận 8, TP HCM (7 mẫu dương và 3 mẫu âm) và Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích TP HCM, số 2 Nguyễn Văn Thủ, Phường Đakao, Quận 1, TP HCM (5 mẫu dương

và 5 mẫu âm) Tiến hành đồng thời tại phòng thí nghiệm tại chỗ (8 mẫu dương và 12 mẫu âm)

23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E sakazakii bằng PCR

3.1.1 Chọn lựa qui trình PCR

Kết quả chạy PCR với 2 nồng độ primer 10 µM và 1 µM cho cả PCR1 và PCR2 cho thấy sản phẩm 469 bp (PCR1) trên gel điện di rõ, đẹp, không phát hiện sản phẩm khác, nhưng chỉ khi sử dụng 10 µM primer đối với PCR2 Sản phẩm 78 bp (PCR2) mờ, khó phát hiện khi sử dụng 1 µM primer Trong khi không phát hiện primer dư khi sử dụng 1 µM đối với cả PCR1 và PCR2, có phát hiện primer dư đối với cả 2 qui trình PCR khi sử dụng hàm lượng 10 µM primer Kết quả kiểm tra được trình bày qua Hình 3.1 Qua cả 5 lần lặp lại, kết quả đều tương tự

Qua kết quả thử nghiệm 2 qui trình PCR, qui trinh PCR1 được chọn cho các thí

Hình 3.1: Hình ảnh sản phẩm PCR trên bản điện di của PCR1 và PCR2

Sản phẩm 469 bp, 10 µM primer (cột 2-6) và 1 µM primer (cột 8-12); sản phẩm 78 bp, 10

µM primer (cột 15-19) và 1 µM primer (cột 20-24); cột 7 và 14: ĐC âm, cột 13: thang

DNA chuẩn 100 bp

24

nghiệm tiếp theo vì sản phẩm PCR rõ nét, đẹp, không nhầm lẫn với primer thừa, đồng thời với việc dùng thang DNA phổ biến 100 bp dễ phát hiện sản phẩm PCR hơn

3.1.2 Khảo sát các điều kiện phản ứng: nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2, hàm lượng mồi

Nhằm đạt được phản ứng PCR tốt với tính đặc hiệu cao, chúng tôi đã tiến hành khảo sát và hiệu chỉnh các điều kiện phản ứng Để cho kết quả PCR tốt nhất cho qui trình được chọn từ nội dung 2.1.1, qui trình PCR1, các thí nghiệm khảo sát hàm lượng mồi, hàm lượng MgCl2 và nhiệt độ bắt cặp đã được tiến hành

3.1.2.1 Tối ưu hàm lượng mồi

Qui trình PCR1 được chọn tiến hành với hàm lượng mồi được thay đổi ở các mức

1, 2, 5, 10, 15, 20 và 25 pm Kết quả qua 5 lần lặp lại đều cho kết quả tương tự, hàm lượng ở mức 10 pm cho vạch DNA rõ nét nhất (Hình 3.2)

Hình 3.2: Hình ảnh sản phẩm PCR trên bản điện di khi thay đổi hàm lượng mồi Sản phẩm 469 bp; 1, 2, 5, 10, 15, 20 và 25 pm (cột 7-1); cột 8: thang DNA chuẩn 100 bp

10 pm