xác định tình trạng bội nhiễm streptococcus suis trên heo nhiễm virus gây hội chứng hô hấp và sinh sản

Xác định sự hiện diện của vi-rút PRRS trong mẫu bệnh phẩm được thu nhận từ heo bằng qui trình revervse transcriptase real time PCR RT-rtPCR đang được sử dụng tại Cơ quan thú y vùng 6..

Trang 1

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

XÁC ĐỊNH TÌNH TRẠNG BỘI NHIỄM

STREPTOCOCCUS SUIS TRÊN HEO NHIỄM VI-RÚT

GÂY HỘI CHỨNG HÔ HẤP VÀ SINH SẢN

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS NGÔ THỊ HOA ThS PHẠM PHONG VŨ

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG _3_/ 2013

Trang 2

1

NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Streptococcus suis serotype 2 (Streptococcus suis serotype 2 – SS2) là tác nhân gây

bệnh phổ biến trên người bệnh viêm màng não mủ (VMNM) tại Việt Nam Heo là

ký chủ tự nhiên của vi khuẩn này và là nguồn lây nhiễm trực tiếp cho người thông qua tiếp xúc và tiêu thụ sản phẩm thịt heo nhiễm khuẩn Kể từ năm 2007, Việt Nam trở thành nước trong vùng dịch của bệnh tai xanh do vi-rút gây hội chứng rối

loạn rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) Đồng nhiễm của vi-rút này và S suis là

nguyên nhân gây bệnh nặng cho heo trong mùa dịch PRRS Do vậy khảo sát bội

nhiễm S suis trên heo nhiễm PRRS là cần thiết, để hiểu hơn nguy cơ nhiễm S suis

cho người và lây lan cho heo trong đàn trong các đợt dịch tai xanh Chúng tôi đã

khảo sát sự hiện diện của S suis trong máu của heo bệnh tai xanh và heo không có

biểu hiện lâm sàng của bệnh

Chúng tôi đã thu nhận 563 mẫu máu và 14 bộ mẫu mô của 573 heo thuộc 107 hộ chăn nuôi Mẫu máu đại diện của từng hộ chăn nuôi được ly trích RNA và tiến hành phản ứng reverse transcriptase real time PCR (RT-rtPCR) khuếch đại gen

nsp2 nhằm khẳng định heo nhiễm vi-rút PRRS Các mẫu máu không đông và mẫu

mô được tiến hành nuôi cấy tìm tác nhân vi khuẩn Các mẫu vi sinh đã phân lập được tiến hành định danh và thực hiện kháng sinh đồ Phản ứng real time PCR

khuếch đại gen cps2J và PCR khuếch đại 16SrDNA được tiến hành nhằm xác định heo nhiễm S suis serotype 2 hay S suis Đồng thời, độ nhạy của các phản ứng

được sử dụng ở trên cũng được xác định nhằm tìm ngưỡng phát hiện

Tổng cộng 493 heo bệnh có biểu hiện lâm sàng điển hình của PRRS thuộc 91 hộ được xác định nhiễm vi-rút PRRS Kết quả nuôi cấy vi sinh xác định 17 (3,9 %) heo bệnh tai xanh bị nhiễm vi khuẩn với 9 (2,1%) heo bị nhiễm với SS2 trong máu

và/ hoặc các cơ quan khác nhau Phản ứng khuếch đại cps2J của SS2 từ mẫu máu

của 487 heo xác định được 26 (5,3%) heo thuộc 21 (23%) hộ nhiễm SS2 Kết quả

Trang 3

khuếch đại 16SrDNA của S suis giúp xác định thêm 34 (7%) heo thuộc 24 (26,4%)

hộ nhiễm S suis khác serotype 2 Tổng cộng có 60 (12.3%) heo nhiễm S suis được

xác định Kết quả kiểm tra mẫu máu của từng heo của 52 heo đối chứng (heo không biểu hiện bệnh) cho thấy tất cả heo không nhiễm vi-rút PRRS Chỉ một heo

cho kết quả cấy máu dương tính với S suis khác SS2 và không có heo nhiễm SS2

Độ nhạy với độ lập lại 100% của phản ứng nsp2/RT-rtPCR (PRRS) được xác định

là 25 bản sao của gen ; của phản ứng cps2J/rtPCR là 5 tế bào SS2 và của

16SrDNA/PCR là 25 tế bào S suis

Kết quả nghiên cứu đã cung cấp bằng chứng cụ thể về sự đồng nhiễm của SS2 trong heo nhiễm PRRSV, với sự khác biệt thống kê (p<0.05), so với heo không có triệu chứng lâm sàng Điều này cho thấy nguy cơ nhiễm SS2 cho người tiếp xúc trực tiếp với heo bệnh tai xanh (như người nuôi, chăm sóc heo bệnh, người tham gia tiêu hủy hay người giết mổ) và tiêu thụ sản phẩm chưa chín của heo bệnh tai

xanh nhiễm SS2 Ngoài ra kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, tỉ lệ nhiễm S suis trong đàn heo bệnh cũng cao hơn đàn heo khỏe Như vậy S suis có thể lây lan

nhanh trong đàn heo bệnh dẫn đến tình trạng bệnh nặng và diễn biến phức tạp của dịch bệnh tai xanh Vì vậy, việc trang bị và nhất thiết sử dụng các biện pháp và dụng cụ bảo hộ lao động trong công việc chăm sóc, giết mổ, tiêu hủy heo bệnh tai xanh là rất cần thiết và cần được thực hiện nghiêm ngặt để giảm thiểu tối đa nguy

cơ nhiễm S suis cho người

Trang 4

3

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Streptococcus suis serotype 2 (SS2) is one of the main cause of bacterial

mennigitis in adult patients in Vietnam Pig is the natural host of this pathogen and/or the source of transmission to human via direct contact and consumption of contaminated pork product Since 2007, Vietnam has become an endemic country for blue ear disease with causative agent is Porcine Reproductive and Respiratory Syndromes virus (PRRSV) (co called blue ear disease) Co- infection of PRRSV

and Streptococcus suis was shown to cause complication and increase of severity

in blue ear outbreak Therefore investigating the co-infection of S suis in PRRS pigs should be carried out to understand risk of S suis infection in human and

transmission among sick and healthy pigs in pens/ herds during PRRS ourbreaks

We investigated the presence of S suis in clinical sick pigs infected with PRRSV

and in clinical healthy pigs

We collected 563 blood samples và 14 sets of tissue samples of 573 pigs reared in

107 backyard farms or farms RNA of representative blood samples of 107 farms

were extracted to use in RT-rtPCR, which amplify nsp2 gene of PRRSV, to

confirm the infection of PRRSV in those farms The unclotted blood samples and tissue samples were cultured to isolate bacteria pathogen Susceptibility tests of all

isolates were identified using disk diffusion tests PCR to amplify cps2J and/

16SrDNA gen were performed to confirm the infection of S suis serotype 2 or S suis in these blood samples The threshold of detection of these above reactions

were also identified

In total, 493 sick pigs with typical PRRS from the 91 family holders, which were confirmed to infect with PRRSV, were included in this study The samples of these

493 sick pigs were 487 unclotted blood samples and 13 tissue samples The latter included tissue samples of 6 sudden dead pigs (with no blood samples collected)

Trang 5

Bacterial culture results showed that 17 (3.9%) pigs were bacterial coinfected, amongst those 9 (2.1%) pigs were coinfected with SS2 in blood or/ and tissue samples Specific DNA amplification methods for SS2 using 487 unclotted blood samples of sick pigs confirmed that 26 (5.3%) pigs from 21 (23%) family holders

were coinfected with SS2 Amplication of 16SrDNA from blood samples of sick

pigs confirmed another 34 (7%) PRRS sick pigs originated from 24 (26.4%) farms

were co infected with non- serotype 2 S.suis Oveall, 60 (12.3%) PRRS sick pigs co-infected with S suis were confirmed RT-rtPCR reactions with individual 52

blood samples collected from clinical healthy pigs were all negativ with PRRS

Only one pig was positive with S suis non serotype 2 by culture The threshold of detections of the above test were 100% reproducible at 25 bản sao for nsp2/ RT- rtPCR and 5 S suis serotype 2 cells for cps2J/rtPCR and 25 S suis cells for

16SrDNA PCR

The result of this research provided the evidence of the co-infection of S suis in

PRRS pigs, with significant difference (p<0.05) in comparison to asymptomatic pigs This indicated a potential risk of SS2 infection for direct contact or exposure personnels, who take care, treat, directly involve in culling, slaughter sick pigs and consume undercook pork dishes Therefore encouraging a habit of frequent usage

of personal protective equipment should be enforced to prevent or minimize the risk of human infection

Trang 6

5

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Cơ quan chủ trì: Văn phòng đại diện Tổ chức Centre for Tropical Medicine -

Oxford University Clinical Research Unit – Vietnam

Thời gian thực hiện đề tài: 12/2010- 12/2012

Kinh phí được duyệt: 550.000.000 Đồng

Kinh phí đã cấp: 500.000.000 Đồng, theo TB số: 226/HĐ-SKHCN ngày 2/12/2010

Mục tiêu:

Xác định tỉ lệ bội nhiễm Streptococcus suis serotype 2 (Streptococcus suis serotype

2 – SS2) trong mẫu bệnh phẩm của heo nhiễm vi-rút PRRS nhằm đưa ra khuyến

cáo về nguy cơ nhiễm bệnh cho người

Nội dung:

1 Xác định sự hiện diện của vi-rút PRRS trong mẫu bệnh phẩm được thu nhận

từ heo bằng qui trình revervse transcriptase real time PCR (RT-rtPCR ) đang được sử dụng tại Cơ quan thú y vùng 6 Đồng thời xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp

2 Xác định vi khuẩn bội nhiễm bằng phương pháp cấy phân lập, thực hiện

kháng sinh đồ cho các chủng S suis

3 Khảo sát sự hiện diện của SS2 trong máu heo bệnh tai xanh bằng qui trình

Trang 7

real time PCR (rtPCR)

4 Ứng dụng qui trình PCR phát hiện sự hiện diện của liên cầu khuẩn heo trong máu heo bệnh hay không bệnh tai xanh

Những nội dung thực hiện ở giai đoạn 1 (đối chiếu với hợp đồng đã ký):

Công việc dự kiến

Công việc

đã thực hiện ST

T

Các nội dung, công việc

chủ yếu cần được thực hiện

(các mốc đánh giá chủ yếu)

Kết quả phải đạt

Kết quả trên mẫu heo bệnh (bốn nội dung đăng ký)

1 Nội dung 1:

Xác định sự hiện diện của vi-rút PRRS trong mẫu bệnh phẩm được thu nhận từ heo bằng qui trình revervse transcriptase real time PCR (RT-rtPCR ) đang được sử dụng tại Cơ quan thú y vùng 6 Đồng thời xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp

1.1 Nhận mẫu máu và mẫu mô của

heo bệnh tai xanh xác định dựa

trên lâm sàng tại cơ sở chăn

nuôi

- Thu nhận mẫu máu: trung bình

5 mẫu/ hộ chăn nuôi và thu nhận mẫu trên

100 hộ

Hoàn tất:

- Đã thu nhận mẫu từ 573 heo bệnh thuộc 107 hộ chăn nuôi Bao gồm 563 mẫu máu và 14 bộ mẫu mô

1.2 Từ qui trình thường được dùng

với mẫu huyết thanh và không

có hiện diện của mẫu chứng

nội, tiến hành ứng dụng phản

ứng RT-rtPCR khuếch đại

RNA của vi-rút gây PRRS

trong mẫu huyết tương

Qui trình phản ứng RT-rtPCR ,

có hiện diện của chứng nội, trong

tương

Hoàn tất:

qui trình đính kèm

Trang 8

7

1.3 Tách chiết RNA (một mẫu

chọn ngẫu nhiên/ hộ chăn nuôi)

487 mẫu máu và 13 bộ mẫu mô

1.4 Nuôi cấy phân lập vi-rút gây

Thực hiện với các mẫu máu

hoàn toàn không đông

Danh sách các chủng vi sinh phân lập đƣợc từ mẫu máu và mô

Hoàn tất:

- Đã thực hiện nuôi cấy với 435 mẫu máu không đông thu nhận từ heo bệnh thuộc 91 hộ chăn nuôi

đã đƣợc xác định nhiễm PRRSV

-phân lập đƣợc 17 chủng vi sinh

Trang 9

2.2 Tiến hành thực hiện kháng sinh

đồ của các chủng vi sinh phân

lập được

Kháng sinh đồ của các chủng vi sinh đó

Danh sách 17 chủng vi sinh với

rtPCR khuếch đại DNA của

SS2 hiện diện trong mẫu máu

heo

Qui trình rtPCR

có chứng nội sử dụng với mẫu máu

DNA của SS2 trong tất cả 487

mẫu máu của heo nhiễm

PRRSV

Tỉ lệ heo bệnh tai xanh nhiễm SS2

Hoàn tất:

- Thực hiện xong 487 mẫu máu

- Tỉ lệ dương tính được xác định là: 26 heo (5,3%)

Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng

Trang 10

9

4.2 Ứng dụng phản ứng PCR

khuếch đại 16SrDNA của SS

trong mẫu máu

Tỉ lệ nhiễm SS của heo bệnh tai xanh

5.1 Thu nhận mẫu máu heo không

có biểu hiện lâm sàng của bệnh

tai xanh

Mẫu máu heo có biểu hiện lâm sàng khỏe, Cấy phân lập vi sinh

Hoàn tất:

Thu nhận mẫu máu của 52 heo không có biểu hiện của bệnh tai xanh

1/52 (1,9%) heo khỏe dương tính

với SS không phải serotype 2

5.2 Thực hiện

a RT-rtPCR khuếch đại

RNA của PRRSV trên tất cả

các mẫu huyết tương của 52

Tỉ lệ heo khoẻ nhiễm SS2

Tỉ lệ heo khoẻ nhiễm SS

Trang 11

6.2

Viết bài báo khoa học

- 2 bài báo khoa học

1 Đã xuất bản: 2 bài

1 Tạp chí CNSH 4989), volume 9, 4B, 2011

(ISSN1811-1 bài trên tạp chí Emerging Infectious Diseases, CDC USA (ISSN1080-6059)

2 Đã nộp lại sau khi chình sửa theo nhận xét của phản biện:1 bài nộp cho tạp chí CNSH

7 Nghiệm thu đề tài

7.2 Báo cáo nghiệm thu cấp Thành

phố

Đạt chất lƣợng

1/2013

Trang 12

11

Mục lục

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT 3

I Tổng quan 20

I.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo 20

I.2 Khác biệt di truyền giữa các chủng vi-rút PRRS 20

I.3 Nhiễm trùng Streptocccus suis trên heo 23

I.4 Nhiễm trùng SS2 trên người, tác nhân gây bệnh lây nhiễm từ heo 24

I.5 Bội nhiễm của Streptococcus suis trên heo nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trong nghiên cứu 25

I.6 Điều trị heo nhiễm PRRSV bị bội nhiễm S suis 27

I.7 Các gen mục tiêu đặc hiệu của S suis dùng trong phản ứng khuếch đại 27

I.8 Nghiên cứu trong nước 28

II Thiết kế và nội dung nghiên cứu 32

II.1 Thiết kế nghiên cứu 32

II.2 Nội dung nghiên cứu 34

II.2.1 Nội dung 1: Xác định heo bệnh nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (heo bệnh PRRS) và ngưỡng phát hiện của phản ứng RT-rtPCR 34

II.2.2 Nội dung 2: Xác định tác nhân bội nhiễm vi khuẩn trên heo nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 46

II.2.3 Nội dung 3: Xác định tỉ lệ heo bệnh PRRS nhiễm vi khuẩn liên cầu khuẩn heo tuýp huyết thanh 2 49

Trang 13

II.2.4 Nội dung 4: Xác định tỉ lệ heo bệnh PRRS nhiễm vi khuẩn liên

cầu khuẩn heo 50

III Kết quả và thảo luận 53

III.1 Nội dung 1: Xác định sự hiện diện của vi-rút PRRS trong mẫu máu heo bệnh và nguỡng phát hiện của phương pháp 53

III.1.1 Thu nhận mẫu máu heo tại hai tỉnh Tiền Giang và Sóc Trăng 53

III.1.2 Xác định heo nhiễm hay không nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 55

III.1.3 Phân lập vi-rút 58

III.1.4 Xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp phát hiện PRRSV 59

III.2 Nội dung 2: Xác định tác nhân bội nhiễm vi khuẩn trên heo nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 68

III.3 Nội dung 3: Xác định tỉ lệ heo bệnh PRRS nhiễm vi khuẩn SS2 74

III.4 Xác định tỉ lệ heo bệnh PRRS nhiễm vi khuẩn S suis 78

III.4.1 Tính đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen 16SrDNA của S suis 78

III.4.2 Ngưỡng phát hiện của phản ứng khuếch đại 16SrDNA phát hiện S suis 80

III.4.3 Tỉ lệ nhiễm S suis trong máu heo nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 81

III.5 Nhiễm S suis trong heo khỏe 82

III.6 Thảo luận chung 83

IV Kết luận và đề nghị 89

V Tài liệu tham khảo 93

VI Phụ lục 99

VI.1 Phụ lục 1A: Tổng hợp cDNA 100

Trang 14

13

VI.2 Phụ lục 1B: Qui trình rtPCR phát hiện PRRSV trong mẫu huyết

tương của heo 103 VI.3 Phụ lục 2: Qui trình rtPCR phát hiện SS2 trong mẫu máu toàn phần

của heo 107 VI.4 Phụ lục 3: Qui trình PCR phát hiện S suis trong mẫu máu toàn phần

của heo 111 VI.5 Phụ lục 4: thông tin của 117 hộ nuôi heo thu nhận mẫu (bao gồm 107

hộ heo bệnh và 10 hộ heo khỏe) 114

Trang 15

Danh sách hình

Hình I-1: So sánh trình tự ORF5 của chủng PRRSV phân lập 22

Hình I-2: Mất đoạn trên protein nsp2 22

Hình II-1: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 34

Hình II-2: Sơ đồ thực hiện plaque assay 40

Hình II-3: Sơ đồ cấy phân lập và định danh vi khuẩn bội nhiễm trên heo bệnh tai xanh 47

Hình II-4: Hình minh họa thực hiện kháng sinh đồ của S suis sử dụng E test hay đĩa khuếch tán 48

Hình III-1: Sơ đồ tóm tắt thu nhận và phân tích mẫu máu heo bệnh 54

Hình III-2 Tế bào MARC 145 trên đĩa đối chứng (A) và đĩa có ủ với dịch mô của heo bệnh được xác định nhiễm PRRSV (B) 58

Hình III-3: Tế bào Marc-145 được chụp từ kính hiển vi ngược 59

Hình III-4: Khả năng tạo plaque của vi-rút PRRS gần như không thể quan sát được 60

Hình III-5: Kết quả khuếch đại đoạn gen nsp2 (hình trái) và EAV (hình phải) từ genome của vi-rút PRRS và EAV 61

Hình III-6: Kết quả biến nạp vào tế bào DH5 α 62

Hình III-7: Sản phẩm khuếch đại của các đoạn chèn nsp2 và gen của EAV 63

Hình III-8: Trình tự đoạn chèn gen nsp2 trong plasmid tái tổ hợp với gen nsp2 của PRRSV kiểu gen Trung Quốc 64

Hình III-9: Sản phẩm khuếch đại của các gen nsp2 và của EAV với các primer đặc hiệu 65

Hình III-10: Đường cong khuếch đại của phản ứng real time với plasmid mang gen EAV với các nồng độ khác nhau 66

Trang 16

15

Hình III-11: Sản phẩm khuếch đại gen 16SrDNA của các chủng S suis thuộc các

serotype khác nhau 79

Hình III-12: Sản phẩm khuếch đại gen 16SrNDA đặc hiệu cho Streptococcus suis

từ các mẫu DNA của vi khuẩn Gram dương và âm không có chứa (A) và có chứa

DNA của S suis (B) 79 Hình III-13 Sản phẩm khuếch đại PCR (318 bp) cuả gen 16S rDNA của S suis với

DNA ly trích từ dịch nuôi cấy (A) hoặc từ mẫu máu (B) 81

Trang 17

Danh sách bảng

Bảng I-1: So sánh độ tương đồng amino axit giữa chủng Bắc Mỹ (VR-2332) và

chủng Châu Âu (Lelystad) [8] 21

Bảng II-1: Các môi truờng sử dụng cho thí nghiệm tạo plaque của vi-rút PRRS 41

Bảng II-2: Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng phiên mã ngược khuếch đại RNA của vi-rút PRRS 44

Bảng II-3: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA của vi-rút PRRS trong qui trình tạo dòng 45

Bảng III-1: Phân bố của các mẫu lâm sàng thu nhận từ heo bệnh 54

Bảng III-2: Kiểm tra ảnh hưởng của RNA của vi-rút Equine arteritis đến phản ứng khuếch đại cDNA của PRRSV 55

Bảng III-3: Tổng số hộ và mẫu thuộc hộ được xác định nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp, và phân bố của chúng 57

Bảng III-4: Giá trị ngưỡng trung bình của phản ứng với nồng độ khác nhau của plasmid mang gen của EAV 65

Bảng III-5: Tỉ lệ dương tính trong các phản ứng xác định giới hạn phát hiện của phương pháp rtPCR phát hiện PRRSV 67

Bảng III-6: Số liệu giá trị ngưỡng của phản ứng RT-rtPCR phát hiện PRRSV nhằm xác định giới hạn phát hiện của phản ứng 67

Bảng III-7: Tổng số mẫu được thực hiện nuôi cấy và kết quả phân lập vi sinh và S suis 68

Bảng III-8: Vi khuẩn phân lập từ mẫu máu và mô của heo bệnh tai do nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 71

Bảng III-9: Kháng sinh đồ của các chủng SS2 72

Bảng III-10: Kháng sinh đồ của các chủng E coli 72

Bảng III-11: Kháng sinh đồ của chủng Enterococcus faecalis 73

Trang 18

17

Bảng III-12: So sánh kết quả giá trị Ct của phản ứng khuếch đại cps2J từ mẫu dịch

nuôi cấy và mẫu máu 75 Bảng III-13: Kết quả so sánh giá trị Ct của các cặp phản ứng rtPCR khuếch đại gen

cps2J của SS2, có và không có chứng nội 76

Bảng III-14: Ngƣỡng phát hiện của phản ứng rtPCR khuếch đại gen cps2J với

DNA phân lập từ mẫu máu 76 Bảng III-15: Kết quả khảo sát sự hiện diện của SS2 trong mẫu máu của heo nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 78

Bảng III-16: Kết quả khuếch đại đoạn DNA của gen 16S của Streptococcus suis

nhằm xác định ngƣỡng phát hiện của phản ứng 80

Bảng III-17: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus suis trong heo nhiễm vi-rút gây hội chứng

rối loạn sinh sản và hô hấp theo kết quả khuếch đại DNA 82

Trang 19

Danh mục chữ viết tắt

BVBNĐ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới

cDNA copied deoxyribo nucelic acid

cps2 capsular polysaccharide serotype 2

EAV Equine arteritis vi-rút

Epf Extra cellular factor (gen)

HP-PRRS High pathogenic- PRRS

Gdh Glutamate dehydrogenase (gen)

Nsp2 Non-structure protein 2

PCR Polymerase Chain Reaction

PHFS Porcine High Fever Syndrome

phHV Phocine Herpes Vi-rút

PRRS Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Pocine reproductive

and respiratory syndrome) PRRSV Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Pocine

reproductive and respiratory syndrome virus)

RT-rtPCR Reverse transcriptase real time PCR

Streptococcus suis Liên cầu khuẩn heo

Trang 20

19

TỔNG QUAN

Trang 21

TỔNG QUAN

I Tổng quan

I.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo, (Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome, PRRS) còn được gọi là bệnh tai xanh, là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm ở heo mọi lứa tuổi, bệnh lây lan nhanh Bệnh do vi-rút PRRS được chẩn đoán lần đầu tại Mỹ năm 1987 [1], sau đó được phát hiện tại Châu Âu

và nhanh chóng lan rộng ra nhiểu nước trên thế giới bao gồm cả Việt nam [2] Hiện nay, tác nhân gây bệnh này đã hiện diện trên heo của hầu hết các nước trên thế giới [3] Dịch heo tai xanh do vi-rút PRRS đã và đang là nguyên nhân dẫn đến thiệt hại kinh tế và ảnh hưởng đến an sinh xã hội cho người chăn nuôi heo trên thế giới [4] Biểu hiện bệnh thường thấy là suy hô hấp trên heo con mới sinh và sẩy thai trên heo nái mang thai, cho nên tác nhân gây bệnh này được đặt tên theo triệu chứng lâm sàng [1] Nguyên nhân gây ra bệnh tai xanh là do vi-rút thuộc họ

Arteriviridae trong bộ Nidovirales có cấu tạo di truyền là RNA mạch đơn xoắn

thuận Hiện nay, dựa trên việc phân tích cấu trúc gen, người ta đã xác định được 2 nhóm chủng, nhóm tuýp I là các chủng có nguồn gốc Châu Âu, nhóm tuýp II là các chủng có nguồn gốc Bắc Mỹ, các chủng Trung Quốc cũng thuộc nhóm này

Nghiên cứu di truyền cho thấy có sự khác biệt khá lớn về tính sinh miễn dịch, độc lực và đa dạng về trình tự giữa 2 nhóm chủng [5] Ngoài ra, những nghiên cứu gần đây cho thấy, vi-rút PRRS tồn tại dưới hai dạng, dạng cổ điển có độc lực thấp và dạng biến thể có độc lực cao, dạng biến thể gây nhiễm và gây chết nhiều heo Vi-rút gây bệnh tai xanh ở Trung Quốc từ năm 2006 đến nay thuộc trong nhóm biến thể này [6]

I.2 Khác biệt di truyền giữa các chủng vi-rút PRRS

Vi-rút PRRS có 2 chủng nguyên mẫu (Prototype), chủng Bắc Mỹ và chủng châu Âu với sự khác biệt di truyền khoảng 40% [7]

Trang 22

TỔNG QUAN

21

Bảng I-1: So sánh độ tương đồng amino axit giữa chủng Bắc Mỹ (VR-2332) và chủng Châu Âu (Lelystad) [8]

rút) [7] Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục thú y, dựa trên phân tích trình tự

nucleotide của ORF5, cho thấy mối tương quan cao giữa những chủng vi-rút PRRS kiểu gen Trung Quốc và của Việt Nam, phân lập từ các ổ dịch bệnh trong các tỉnh vào các năm 2007-2010 [9, 10]

Trang 24

TỔNG QUAN

23

Chủng độc lực cao HP-PRRSV ở Trung Quốc là biến thể của dòng Bắc Mỹ với

đặc điểm là gen nsp2 bị mất một đoạn DNA có tổng chiều dài là 90 Nucleotide, cụ

thể là mất 1 axit amin tại vị trí 482 và 29 axit amin tại vị trí 533-561 trên protein nsp2 [9, 10] Thêm vào đó, độ tương đồng của protein nsp2 giữa chủng Châu Âu

và Bắc Mỹ thấp (32%) [8] Do vậy gen nsp2 mất đoạn trở thành gen đích đặc hiệu

trong phản ứng RT-rtPCR xác định chủng Trung Quốc [11] Qui trình này được ứng dụng trong chẩn đoán nhiễm vi-rút PRRS trong mẫu huyết thanh tại Cơ Quan Thú Y vùng 6

I.3 Nhiễm trùng Streptocccus suis trên heo

Liên cầu khuẩn heo, Streptococcus suis (SS), là vi khuẩn Gram (+) bao gồm 35

serotype được xác định dựa vào sự hiện diện của kháng nguyên polysaccharide vỏ nang Liên cầu khuẩn heo là tác nhân gây bệnh quan trọng cho heo và là một trong những nguyên nhân dẫn đến những tổn thất lớn trong ngành công nghiệp chăn nuôi heo do khả năng gây bệnh và có thể gây thành dịch Các triệu chứng thường gặp trên heo do liên cầu khuẩn heo gây ra gồm viêm phổi, viêm nội tâm mạc, viêm màng não, xảy thai và chết đột ngột Các serotype gây bệnh cho heo thường gặp

là serotype 1, 1/2, 2, 7, 9, 14 [12, 13] Heo được biết là ký chủ tự nhiên của vi khuẩn này, chúng thường sống trong các cơ quan hô hấp như hạch amidan và các

cơ quan sinh sản như tử cung của heo cái Tỉ lệ mang trùng liên cầu khuẩn heo trên amidan heo thay đổi tùy theo tuổi heo, theo đàn/bầy và có thể lên đến 100% Nguy

cơ xảy ra bệnh trong đàn thay đổi, nhưng thường khoảng 1-5%; tuy nhiên nếu không điều trị thích hợp, dịch có thể xảy ra với 20% heo trong đàn [13] Heo trong cùng đàn có thể lây truyền liên cầu khuẩn heo thông qua tiếp xúc trực tiếp, qua không khí hoặc lây nhiễm từ mẹ sang con ngay sau sinh [14, 15] Hiện nay chưa có

Trang 25

TỔNG QUAN

vắc xin hiệu quả cho việc ngăn ngừa nhiễm liên cầu khuẩn heo trên heo, điều trị heo bệnh chủ yếu là dựa vào sử dụng kháng sinh

I.4 Nhiễm trùng SS2 trên người, tác nhân gây bệnh lây nhiễm từ heo

SS2 là tác nhân gây bệnh trên người với trên 700 ca bệnh đã được báo cáo trên thế giới [16] Đa số các đối tượng nhiễm bệnh thường là những người có tiếp xúc trực tiếp với heo như người chăn nuôi heo, cán bộ công tác trong ngành thú y có tham gia chăm sóc và điều trị heo bệnh, công nhân trong lò mổ heo, người vận chuyển hay buôn bán thịt heo… Vì thế heo được xem là nguồn lây nhiễm liên cầu khuần

heo trực tiếp cho người, và liên cầu khuẩn heo được xem là tác nhân gây bệnh

nghề nghiệp [13] Yếu tố nguy cơ dẫn đến việc nhiễm liên cầu khuẩn heo trên người chủ yếu là do tiếp xúc trực tiếp với heo mang trùng thông qua những vùng vết thương hở trên tay chân [17], hoặc tiêu thụ thức ăn chưa được nấu chín có nguồn gốc từ heo bị nhiễm khuẩn [18] Nghiên cứu hồi cứu trên 66 bệnh nhân tại Thái Lan xác định yếu tố nguy cơ của nhiễm trùng liên cầu khuẩn heo trên 39 (59%) người bị bệnh là sử dụng thức ăn có nguồn gốc từ thịt heo chưa được nấu chín hoặc các cơ quan nội tạng [18] Đa số bệnh nhân nhiễm SS có biểu hiện lâm sàng của bệnh VMNM, nhiễm trùng huyết [17, 19] và trong 1 số ít ca bệnh, vi khuẩn này được xác định là tác nhân gây viêm nội tâm mạc (endocarditis) trên người [20]

Dù tỉ lệ tử vong của bệnh nhân bị VMNM do S suis không cao (6%) đối với các ca

bệnh xảy ra riêng lẻ, nhưng di chứng thường gặp trong hơn 35% các bệnh nhân

phục hồi sau VMNM do S suis là tình trạng giảm thính lực từ nhẹ như ù tai đến

điếc hoàn toàn cả 2 tai [20] Di chứng này chắc chắn ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của các bệnh nhân đã phục hồi, của gia đình và xã hội [21]

Các ca bệnh trên người do liên cầu khuẩn heo gây ra thường xảy ra rải rác (sporadic cases), Tuy nhiên, gần đây liên cầu khuẩn heo được biết đến như là một

Trang 26

TỔNG QUAN

25

tác nhân gây dịch bệnh trên người vào năm 2005 tại Trung Quốc, làm 215 người nhập viện, trong đó có 38 (17%) người chết do sốc dẫn đến suy giảm chức năng đa

cơ quan Trận dịch nhiễm SS2 trên người được xác định xảy ra ngay sau và đồng thời với đợt dịch bệnh trên heo gây chết hơn 600 heo trong tỉnh Tất cả những bệnh nhân nhập viện đều là những người có tham gia trực tiếp vào giết mổ heo bệnh Số

ca bệnh trong đợt dịch trên chỉ ngừng gia tăng khi tình trạng giết mổ heo bệnh không hợp pháp chấm dứt [22] Vi khuẩn gây bệnh trên heo và người trong đợt dịch này được phân lập và phân tích sinh học phân tử, kết quả cho thấy là cùng một chủng [23, 24] Kết quả so sánh chủng gây dịch tại Trung Quốc năm 2005 và một đợt dịch liên cầu khuẩn heo trên người xảy ra năm 1998 cho thấy 2 chủng này rất giống nhau về mặt di truyền Điều này chứng tỏ chủng gây dịch tại Trung Quốc đã được lưu hành hơn 7 năm trong đàn heo trước khi gây dịch năm 2005 [25] Đây là bằng chứng cho thấy liên cầu khuẩn heo lây trực tiếp từ heo sang người và có thể gây dịch bệnh trên người trên diện rộng Do vậy nguy cơ gây dịch trên người của liên cầu khuẩn heo vẫn có thể xảy ra trong tương lai Vì thế để hạn chế lây nhiễm trên người và dịch trên heo, việc tầm soát tình trạng mang trùng và nhiễm bệnh do liên cầu khuẩn heo trên heo là điều cần thiết

I.5 Bội nhiễm của Streptococcus suis trên heo nhiễm vi-rút gây hội chứng rối

loạn sinh sản và hô hấp trong nghiên cứu

Một số báo cáo cho thấy biểu hiện lâm sàng của heo nhiễm vi-rút PRRS trở nên nặng hơn với tỉ lệ chết cao hơn trong trường hợp có tác nhân vi khuẩn đồng nhiễm

Trong đó bội nhiễm liên cầu khuẩn heo (S suis) đã được nhiều tác giả chứng minh

trong điều kiện phòng thí nghiệm - với thử nghiệm trên heo con [26, 27] Nghiên cứu dùng 80 heo con chia thành 6 nhóm của Thanawongnuwech và cộng sự cho thấy khi gây nhiễm vi-rút gây bệnh tai xanh và liên cầu khuẩn heo (SS2) cho heo

Trang 27

TỔNG QUAN

con bằng đường mũi, tỉ lệ heo chết cao hơn trong các nhóm này so với nhóm heo chỉ bị gây nhiễm bởi 1 trong 2 tác nhân trên Tỉ lệ chết tăng từ 37,5% lên 87,5% khi chủng vi-rút gây tai xanh có độc tính cao hơn (VR2385) được dùng trong thí nghiệm Cấy phân lập liên cầu khuẩn heo SS2, từ các cơ quan nội tạng và máu của các nhóm heo, cho thấy SS2 được phân lập chỉ trong 7,7% heo bị gây nhiễm bởi 1 tác nhân SS2 Trong khi đó, SS2 được phân lập trên 30% heo trong nhóm gây nhiễm với vi-rút PRRS và SS2 và tỉ lệ này tăng đến 78,6% trong nhóm heo bị gây nhiễm bởi 2 tác nhân với vi-rút PRRS là VR2385 [27]

Nghiên cứu của Feng và cộng sự nhằm khảo sát tình trạng nhạy cảm của heo con, được sinh ra từ heo mẹ nhiễm vi-rút gây bệnh tai xanh trong quá trình mang thai, với liên cầu khuẩn heo, cho thấy đa số (20 trong 22) heo con được sinh ra từ heo

mẹ bị nhiễm vi-rút PRRS chết trong vòng 1 tuần sau khi bị gây nhiễm SS2 Trong khi đó, trong nhóm đơn nhiễm số heo con chết không cao, chỉ có 1 trong 18 heo bị nhiễm vi-rút PRRS từ mẹ và 5 trong 23 heo con chỉ bị nhiễm SS2 sau sinh [26] Các nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm khẳng định tính nhạy cảm với nhiễm liên cầu khuẩn heo của heo bị nhiễm vi-rút gây bệnh tai xanh Trên thực tế,

tỉ lệ heo khoẻ mang trùng SS khá cao, do vậy nguy cơ bội nhiễm vi khuẩn này trong đàn heo nhiễm vi-rút PRRS là không nhỏ

Tình trạng bội nhiễm của SS7 và vi-rút PRRS được xác định trên mẫu thu nhận từ thực địa trong trận dịch PRRS năm 2006 tại Trung Quốc tuy nhiên tác giả không báo cáo tỉ lệ bội nhiễm [3] Nhằm tìm hiểu hiện tượng, chưa được báo cáo trước đây, heo nhiễm vi-rút PRRS thường bị sốt cao, (được gọi tên Porcine High Fever Syndrome-PHFS), Xu và cộng sự đã tiến hành gây đơn nhiễm và đồng nhiễm của 2 tác nhân gây bệnh, chủng vi-rút độc lực cao (high pathogenic) HP-PRRSV và SS7 vào heo con 3 tuần tuổi đã cai sữa sớm Kết quả cho thấy trong khi không có heo chết trong nhóm gây đơn nhiễm với SS7; tỉ lệ heo chết là 80% (8 trong 10 heo) xảy

ra trong nhóm heo đồng nhiễm HP-PRRSV và SS7 từ ngày 10-15 sau gây nhiễm

Trang 28

TỔNG QUAN

27

Tất cả heo chết có biểu hiện lâm sàng của PHFS Trong khi đó, chỉ có 16,7% (2 trong 12) heo trong nhóm đơn nhiễm với HP-PRRSV chết với biểu hiện lâm sàng

có sốt cao (PHFS) và xảy ra từ ngày 13-21 sau gây nhiễm [3]

I.6 Điều trị heo nhiễm PRRSV bị bội nhiễm S suis

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tình trạng bội nhiễm SS trên heo đã nhiễm virút PRRS có thể được khắc phục bằng sử dụng ceftiofur [28, 29] Vì thế, xác định được tình trạng SS bội nhiễm trên heo nhiễm vi-rút gây bệnh tai xanh, chắc chắn sẽ giúp các nhà quản lý đưa ra liệu pháp sử dụng kháng sinh hợp lý nhằm giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi

I.7 Các gen mục tiêu đặc hiệu của S suis dùng trong phản ứng khuếch đại

Dựa trên sự khác biệt về kháng nguyên vỏ nang polysaccharide, 35 serotype huyết thanh được xác định Do vậy nhằm phát triển phản ứng khuếch đại DNA đặc hiệu cho một số các serotype, gen tham gia hình thành vỏ nang polysaccharide thường

được chọn là gen đích Smith và cộng sự đã xác định được gen cps2J là gen đặc hiệu cho S suis serotype 2 Do vậy gen cps2J được chọn là gen đích cho phản ứng khuếch đại xác định SS2 [30] Phản ứng khuếch đại rtPCR phát hiện cps2J/SS2 đã được ứng dụng trong chẩn đoán nhiễm S suis serotype 2 trong mẫu dịch não tủy

tại BV Bệnh Nhiệt Đới [31]

Một số phản ứng PCR phát hiện epf [32], suilysin [33] và gdh [34] cũng được xây

dựng Tuy nhiên các gen này hoặc không hiện diện trong tất cả các chủng hay tất

cả các serotype khác nhau (epf, suilysin) hay chỉ hiện diện với 1 bản sao trong bộ gen (gdh) Trong khi đó 16SrDNA hiện diện với 4 bản sao trong bộ gen của S suis

Do vậy việc sử dụng phản ứng khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu của 16SrDNA của

SS sẽ giúp phát hiện được tất cả SS thuộc các seotype khác nhau

Trang 29

TỔNG QUAN

I.8 Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo tại Việt Nam tập trung chủ yếu giải quyết các nhu cầu cấp bách để đối phó với dịch bệnh Bao gồm các nghiên cứu tập trung vào khảo sát dịch tễ của dịch, phương pháp chẩn đoán, khảo sát đa dạng chủng phân lập từ heo bệnh, khảo sát lưu hành bệnh, thử nghiệm vắc xin và khảo sát yếu tố nguy cơ nhiễm bệnh của heo [35-47] Trong các nghiên cứu này, nghiên cứu của Nguyễn Văn Cảm có đề cập đến bội

nhiễm của heo bệnh tai xanh với S suis trong quá trình thử nghiệm vắc xin [48]

Ngoài ra PGS TS Nguyễn Ngọc Hải cũng đã báo cáo tình trạng nhiễm vi-rút PRRS trên đàn heo sinh sản tại Tp HCM Với tỉ lệ nhiễm là 73,33% ở các hộ chăn nuôi và 54,02% ở các trại Trong đó, heo nái nhiễm với tỉ lệ cao hơn (63,66%) so với heo nọc (42,83%) Tỉ lệ nhiễm PRRSV tại các trại có qui mô công nghiệp trong khảo sát này là 100% trong khi đó tỉ lệ nhiễm tại các cơ sở tư nhân là 67,21% Kết quả này cho thấy tỉ lệ nhiệm PRRSV trên heo ở mức báo động (Đề tài

đã nghiệm thu, Sở KHCN TpHCM, 2011) [49] Tuy nhiên hiện nay chưa có báo

cáo nào có hệ thống về tình trạng đồng nhiễm của S suis trên heo tai xanh ngoại

trừ bài báo cáo gần đây của chúng tôi trên tạp chí CNSH [50]

Thông tin nghiên cứu về liên cầu khuẩn heo tại Việt Nam vẫn còn hạn chế Tuy nhiên liên cầu khuẩn heo đã được biết đến như tác nhân quan trọng gây bệnh VMNM cấp trên người lớn tại Việt Nam [16, 31] Trong chương trình nghiên cứu tại Việt Nam từ năm 2005 đến nay, sử dụng phương pháp cấy phân lập vi sinh từ mẫu dịch não tủy và máu cùng với ứng dụng phương pháp rtPCR trong chẩn đoán, chúng tôi đã xác định được SS2 là tác nhân quan trọng gây VMNM cấp trên người tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới (BVBNĐ) Tp.HCM và BVBNĐ Trung Ương [16, 31] Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy SS là tác nhân quan trọng nhất gây bệnh cho 151/450 (33,6%) bệnh nhân VMNM cấp tại BVBNĐ Tp.HCM Trong đó 50/151 (33,1%) bệnh nhân có tiếp xúc với heo hay thịt heo một tuần trước khi phát

Trang 30

TỔNG QUAN

29

bệnh Hơn 66% bệnh nhân hồi phục bị giảm thính lực từ ù tai đến điếc hoàn toàn 2 tai Tỉ lệ bệnh nhân tử vong do liên cầu khuẩn heo tương đối thấp (4%) so với các báo cáo trên thế giới [31] Trong khi đó, khảo sát tại BV Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương cho thấy SS là tác nhân gây bệnh cho 50 (9%) bệnh nhân VMNM cấp nhập viện tại đây và tỉ lệ tử vong do bệnh nhân nhiễm SS là 3/50 (6%) Tổng cộng có 16/50 (32%) bệnh nhân có tiền sử tiếp xúc với heo và 20% số bệnh nhân có biểu hiện giảm thính lực khi xuất viện Có 8 (16%) bệnh nhân có biểu hiện bệnh nặng cần sự hỗ trợ của máy trợ thở [16]

Trong điều kiện không tìm thấy tài liệu đăng tải trên các tạp chí chuyên ngành

quốc tế khẳng định heo tại Việt Nam có mang trùng S suis Từ năm 2006, chúng

tôi đã tiến hành hợp tác nghiên cứu với các Chi cục Thú y tại Tp.HCM, Tiền Giang

và Đồng Nai nhằm khảo sát tình hình mang trùng SS trên heo khỏe và vai trò của

SS như tác nhân gây bệnh cho heo Kết quả sơ bộ cho thấy heo khoẻ tại các tỉnh phía nam mang trùng SS với tỉ lệ thay đổi từ 14% - 48% , và SS được phân lập từ một số cơ quan khác nhau của heo bệnh Kết quả khảo sát kháng sinh đồ của các chủng SS phân lập từ heo trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, liên cầu khuẩn heo đã kháng với nhiều loại kháng sinh [51] Sự đồng nhiễm của SS và vi-rút PRRS trên một heo bệnh lấy mẫu từ Quãng Ngãi đã được báo cáo [52] Vi khuẩn

S suis đã được phân lập từ mẫu lách, tuy nhiên serotype của vi khuẩn không được

đề cập trong phạm vi bài báo

Với nỗ lực nhằm tìm hiểu nguy cơ nhiễm SS trên người TS Hồ Đặng Trung Nghĩa

và cộng sự đã xác định tiêu thụ thực phẩm là thịt heo chưa được nấu chín như các

cơ quan nội tạng, tiết canh heo là nguy cơ gây nhiễm cho hơn 30% bệnh nhân tại Việt Nam [53] Theo thống kê tại BV Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương, số ca bệnh trên người do liên cầu khuẩn heo có chiều hướng gia tăng trong đợt dịch heo tai xanh

Do vậy nhằm khẳng định nguy cơ này, chúng tôi đã phối hợp với chi cục thú y của hai tỉnh Tiền Giang và Sóc Trăng, là 2 tỉnh đầu tiên công bố dịch heo tai xanh tại

Trang 31

TỔNG QUAN

Miền Nam vào tháng 6/2010, để khảo sát tình trạng bội nhiễm S suis trên heo

nhiễm vi-rút PRRS

Xác định tình trạng bội nhiễm liên cầu khuẩn heo (Streptococcus suis) trên heo

nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) sẽ giúp chúng ta có hiểu rõ hơn về tình trạng bội nhiễm của SS trên heo bệnh tai xanh tại các tỉnh phía nam nhằm hỗ trợ cho tình hình chống dịch trên heo bệnh và đưa ra khuyến cáo về nguy cơ nhiễm SS trên người trong giai đoạn dịch heo tai xanh

Trang 32

31

VẬT LIỆU &

PHƯƠNG PHÁP

Trang 33

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

II Thiết kế và nội dung nghiên cứu

II.1 Thiết kế nghiên cứu

 Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang

 Vật liệu và Đối tuợng nghiên cứu:

1 Chủng vi sinh: S suis serotype 2 và các chủng S suis với các serotype

khác nhau, cụ thể: serotype 15,16,28 (chủng này cho kết quả dương tính với cả 3 loại huyết thanh định serotype 15,16 và 28); serotype 12; serotype 25; serotype 33; serotype 9,31; serotype 15,20; serotype 1; serotype 3; serotype 13; serotype 26; serotype 16,28; serotype 1,12;

serotype 16; S suis serotype 6; serotype 8 và serotype 14

Các chủng E.coli; Acinetobacter; Staphylococcus aureus; Salmonella;

Streptococcus pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Pasteurella multocida; Klebsiella; Methicilline Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA); MSSA

2 Mẫu mô và mẫu máu không đông trong ống chứa sodium citrate và huyết thanh của heo bệnh tai xanh được xác định chẩn đoán dựa vào lâm sàng

3 Mẫu máu của heo khỏe không có biểu hiện bệnh thu được nhận tại các hộ chăn nuôi không có heo bệnh trong suốt đợt dịch heo tai xanh (tuổi heo không hoàn toàn tương ứng giữa 2 nhóm heo bệnh và heo khỏe)

Tiêu chuẩn chọn mẫu

o Heo bệnh tai xanh:

 Heo trong tỉnh đã công bố dịch tai xanh

 Heo được nuôi trong nhiều hộ gia đình khác nhau và có biểu hiện lâm sàng như sau:

 Sốt cao

Trang 34

 Có biểu hiện bệnh về hô hấp như khó thở, ho

 Sưng mí mắt, viêm kết mạc trên heo con và heo thịt

 Heo nái đã bị xảy thai trong thời gian xảy ra dịch

 Xác định nhiễm vi-rút PRRS bằng phương pháp RT-rtPCR

o Heo không có biểu hiện lâm sàng (nhóm đối chứng- heo khỏe)

 Heo khỏe không có triệu chứng lâm sàng của bệnh tai xanh hay bệnh khác

 Được xác nhận đàn heo không nhiễm virút PRRS bằng rtPCR

RT- Thu nhận mẫu

o Thu nhận mẫu: thực hiện tại hiện trường

 Mẫu máu không đông, huyết thanh của 5 heo trên 1 trại và thu mẫu của 100 trại heo tại 2 tỉnh có dịch heo tai xanh

 Mẫu mô: lách, thận, gan, tim, phổi, hạch phổi đuợc thu nhận tùy thuộc vào điều kiện tại hiện truờng giết mổ đảm bảo việc thực hiện được thuận lợi và hạn chế nguy cơ ngoại nhiễm

 Mẫu heo đối chứng (heo khỏe): thu nhận tại cơ sở giết mổ

Trang 35

 Sơ đồ nghiên cứu

Hình II-1: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

II.2 Nội dung nghiên cứu

II.2.1 Nội dung 1: Xác định heo bệnh nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn

sinh sản và hô hấp (heo bệnh PRRS) và ngưỡng phát hiện của phản ứng RT-rtPCR

II.2.1.1 Xác định sự hiện diện của vi-rút

Phản ứng khuếch đại RNA được tiến hành nhằm khuếch đại đoạn RNA đặc hiệu cho chủng PRRSV Trung Quốc, là chủng đã được Cục Thú Y xác định đang gây dịch tại các tỉnh [47] Phương pháp Real time PCR phiên mã ngược mô phỏng theo

Tách chiết RNA

Dùng QIAamp Viral RNA Mini kit

Kiểm tra tính mẫn cảm với

Trang 36

35

qui trình đã được công bố [11] Qui trình sao mã ngược RTPCR được tóm tắt bên dưới và đính kèm trong phần phụ lục Mồi và mẫu dò cho phản ứng được cung cấp bởi Sigma - Singapore

Chúng tôi tiến hành thực hiện RTPCR khuếch đại đoạn gen của nsp2 nhằm phát

hiện PRRSV trên những mẫu huyết tương được chọn ngẫu nhiên từ những hộ chăn nuôi RNA được tách chiết bằng QIAamp viral RNA Mini Spin Columns Kit

(Qiagen, UK) Đồng thời, RNA của vi-rút EAV (Equine arteritis vi-rút) được dùng

làm chứng nội tại trong quá trình tách chiết RNA vi-rút và thực hiện phản ứng rtPCR phát hiện vi-rút PRRS [11]

RT-Chương trình khuếch đại gồm bước đầu tổng hợp cDNA sử dụng mồi random hexamer primers (Roche, Việt Nam) và 45 chu kỳ khuếch đại

Qui trình tổng hợp cDNA từ RNA vi-rút được thực hiện như sau: Hỗn hợp 1 gồm 1

μl Random hexamers (20ng/ μl), 1 μl dNTPs (10 mM), 3 μl nước, 8 μl RNA vi-rút Hỗn hợp 2 gồm 4 μl 5X dung dịch đệm, 1 μl DTT (0.1M), 0,4 μl Rnase Inhibitor (40U/μl), 0,2 μl Superscript III reverse transcriptase, 1,4 μl nước Hỗn hợp 1 được

ủ ở 65oC trong 5 phút và nhanh chóng làm lạnh trên đá ít nhất 1 phút Sau đó cho toàn bộ dung dịch hỗn hợp 2 vào trong hỗn hợp 1 và chạy chương trình tổng hợp cDNA (25oC trong 5 phút, 50oC trong 60 phút và 70oC trong 15 phút)

Hỗn hợp thành phần rtPCR cho thể tích 25 µl (1X dung dịch đệm, 2,8 µM MgCl2, 0,4 µM dNTPs, 0,2 µM EAV–Forward primer, 0,2 µM EAV–Reverse primer, 0,1

µM EAV-probeCy5, 0,2 µM CN-PRRS–Forward primer, 0,2 µM CN-PRRS –Reverse primer, 0,1 µM CN-PRRS –probeFAM, 0,1U/ µl Hot start polymerase, 5

µl DNA template và nước không chứa nuclease cho đến 25 µl) được thực hiện theo chu trình nhiệt gồm chương trình biến tính 95oC trong 15 phút, chương trình khuếch đại lặp lại 44 lần (95o

C trong 30 giây, 60oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây), đọc tín hiệu huỳnh quang sau bước kéo dài 72oC ở mỗi chu kỳ

Trang 37

Kết quả rtPCR được xem là dương tính nếu các chứng âm (không có DNA mục tiêu) đều âm, chứng nội có giá trị Ct (Cy5) trong khoảng 33-35 và mẫu có giá trị Ct (FAM) ≤ 40 Ngược lại, các mẫu được xem là âm tính nếu các chứng âm đều âm, chứng nội có Ct (Cy5) trong khoảng 33-35 nhưng mẫu không thu được giá trị Ct (FAM) hay giá trị Ct (FAM)> 40 Các mẫu có giá trị Ct (FAM)> 38 cần được lặp lại kiểm tra để xác định kết quả 3 lần Nếu chứng nội có giá trị Ct (CY5) nằm ngoài khoảng mong đợi và mẫu có giá trị Ct (FAM)> 40 hoặc không thu được giá trị Ct (FAM) thì kết quả xem như không xác định; trong trường hợp này cần tách chiết DNA từ đầu và lặp lại phản ứng rtPCR

Một số mẫu mô và huyết tương của heo cho kết quả dương tính với RT-rtPCR

khuếch đại gen nsp2 của vi-rút PRRS được dùng để phân lập vi-rút theo sơ đồ sau:

Giai đoạn chuẩn bị

Cho 5 x 105 tế bào MARC-145 vào flask 25 cm2

Ủ ở 37 o

C/ 3-5% CO2

Giám sát sau 48-72 giờ, để hình thành 100% lớp tế bào đơn

Trang 38

37

Phân lập vi-rút

Bước 1: Nghiền 0.5 g mẫu mô trong 5ml PBS chứa 2x kháng sinh

Bước 2: Đổ dịch nghiền vào trong một ống falcon sạch

Bước 3: Ly tâm 2000 g trong 5 phút

Bước 4: Thu nhận dịch nổi trong một ống falcon sạch

có 100% tế bào đơn đã chuẩn bị

Bước 13: Kiểm tra hằng ngày để xác định Cytopathic Effect (CPE) và tế bào

chết do độc tố của mẫu trong 5 – 7 ngày

Bước 12: Lặp lại bước 7 đến bước 11

Trang 39

Môi truờng sử dụng

Môi trường duy trì (Maintenance Media (MM – MARC145 cells)

500ml Eagles Minimum Essential Media (EMEM) 2% Foetal Calf Serum (FCS)

0,25% Penicillin/Streptomycin 2ug/ml Fungizone

10mM Hepes 1% Na Pyruvate 2mM Glutamine 0,5% Lactalbumin hydrolysate (LAH) Phosphate Buffered Saline (PBS)

8g NaCl 0,2g KCl 1,15g Na2HPO4

0,2g KH2PO4

(0,5% Penicillin/Streptomycin + 4ug/ml Fungizone)

II.2.1.3 Xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp phát hiện RT PCR –

PRRS (nps2)

Ngưỡng phát hiện hay còn gọi là giới hạn phát hiện hay độ nhạy phân tích của phương pháp là nồng độ thấp nhất của thành phần cần xác định trong mẫu được xác định một cách nhất quán, không định lượng, trong điều kiện phòng thí nghiệm với loại mẫu nhất định [54] Ngưỡng phát hiện là đặc tính quan trọng cần được xác định cho cả test định tính và định lượng Biết ngưỡng phát hiện của phương pháp

sẽ giúp hiểu được tại giới hạn nào phản ứng sẽ cho kết quả âm tính giả Điều này

Trang 40

39

có thể đóng vai trò quan trọng trong quản lý dịch bệnh của virut gây bệnh có thể lây lan nhanh như PRRS

Ngưỡng phát hiện có thể được xác định bằng bằng cách: (1) sử dụng thống kê, (2)

sử dụng thực nghiệm, thử nghiệm với dãy mẫu pha loãng với nồng độ được biết trước của thành phần, loại mẫu cần xác định Trong các xét nghiệm, ngưỡng phát hiện thường được xác định bằng phương pháp thực nghiệm

Để xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp rtPCR, dãy nồng độ pha loãng có thể được chuẩn bị bằng cách xác định nồng độ vi-rút với phương pháp plaque assay hay tạo dòng

A Xác định nồng độ vi-rút bằng phương pháp plaque assay

Để xác định độ nhạy của phản ứng RT-rtPCR dùng phát hiện PRRSV genotype Trung Quốc chúng tôi tiến hành thực hiện plaque assay để xác định nồng độ vi-rút trong mẫu ban đầu Sau đó tiến hành pha loãng và tách chiết RNA vi-rút và thực hiện phản ứng RT-rtPCR để xác định ngưỡng phát hiện Plaque assay đựơc chúng tôi tiến hành theo sơ đồ ở trang bên

Định dạng
Số trang	118
Dung lượng	1,59 MB