nghiên cứu môi trường tái sinh của một số giống ngô (zea mays l.) phục vụ chuyển gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ Zea mays L.. Số hóa bởi Trung tâ

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH

CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.)

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH

CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.)

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN VŨ THANH THANH

THÁI NGUYÊN - 2014

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Thái Nguyên, ngày 13 tháng 09 năm 2014

Tác giả luận văn

Trang 4

, ngày 13 tháng 09 năm 2014

Tác giả luận văn

Ngô

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1

2

4 Ý nghĩa khoa học 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về cây ngô 3

3

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây ngô 6

1.1.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 7

10

1.2.1 Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới 10

1.2.2 Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam 14

1.3.Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và thành phần môi trường đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô 14

1.3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 14

của thành phần môi trường 17

1.3.3 in vitro 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

21

2.2 Hóa chất và thiết bị 21

Trang 6

2.3 Phạm vi nghiên cứu 22

2.4 Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu 22

2.5 Phương pháp nghiên cứu 22

2.5.1 Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non 23

2.5.2 Tạo mô sẹo từ phôi và thân non 24

2.5.3 Nghiên cứu khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 26

2.5.4 Nghiên cứu điều kiện đưa cây in vitro ra ngoài môi trường 26

2.6 Xử lý số liệu 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non 28

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi phôi đến khả năng tái sinh cây trực tiếp từ phôi non 28

30

non 35

non 36

2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 38

-proline đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 41

3 đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non 44

2,4-D 48

3.4 Nghiên cứu phôi non 51

kiện đưa cây in vitro ra ngoài môi trường 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

I Kết luận 55

II Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 63

Trang 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

2 đtg

3 IAA Indole-3-acetic acid

4 IBA Indole-3-butyric acid

5 MS Murashige & Skoog, 1962

6 NAA 1 - naphthaleneacetic acid

9 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn

2009 - 2011 7

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012 9

21

28

Bảng 3.2 cây từ phôi 32

34

LVN 25, LVL 61, LVN 66, LVN 99, 36

hưởng của 2,4-D 39

Bảng 3.6 43

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của AgNO3 45

Trang 9

48

51

in vitro sau 54

Trang 10

46

Trang 11

25, LVN 61, LVN 66, LVN 99, LVN 885

AgNO3 46

-25, LVN 61, 49

Trang 12

MỞ ĐẦU

1

Cây ngô (Zea mays L.) là cây lương thực giàu dinh dưỡng có vai trò

-hàng nông sản xuất khẩu có giá trị Cây ngô được gieo

Theo thống kê của FAO, năm 2012 cây ngô

Những năm gần đây, nhờ việc sử dụng phương pháp chuyển gen đã tạo

ra nhiều giống ngô mới có giá trị dinh dưỡng cao [38], [53]; có khả năng chống chịu với các điều kiện môi trường hạn,

, …

Thực tế

nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy in vitro gô

Mặt khác, nguồn vật

thực hiện thông qua sự tái sinh phôi hoặc mô sẹo [41] Trong đó, mô sẹo được hình thành từ phôi non hay từ lát cắt của thân cây non

Trang 13

Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu môi trường tái sinh của một số giống ngô (Zea mays L.) phục vụ chuyển gen”

2

Xác định được các điều kiện thích hợp để tái sinh cây từ phôi non và từ

mô sẹo của 5 giống ngô

3

- Xác định thành phần môi trường nuôi cấy phù hợp để tái sinh cây trực tiếp từ phôi non của 5 giống ngô

- Xác định thành phần môi trường phù hợp để tạo mô sẹo từ phôi non

và thân non của 5 giống ngô

- Xác định môi trường phù hợp để tái sinh cây từ mô sẹo hình thành từ phôi non của 5 giống ngô

4 Ý nghĩa khoa học

-

Trang 14

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về cây ngô

Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Hòa thảo (Poaceae), bộ Hòa thảo (Poales

(theo “Vân Đài loại ngữ” của Lê Quý Đôn)

năm 1920, Sturtevantel đi

(c ) sau đây [6]:

1- Ssp amilaceae - ngô bột

2- Ssp indentata - ngô răng ngựa

Trang 15

-phận sau: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt



: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng Rễ mầm (rễ tạm thời, rễ hạt) mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nước, thức ăn khi cây còn non

dưới lên trên Rễ đốt giúp cây hút nước và dinh dưỡng Rễ chân kiềng (rễ chống) mọc quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây chống đổ, bám chặt vào đất, tham gia hút nước và thức ăn cho cây Thân cây đặc và khá chắc, chia nhiều lóng (dóng) to dần từ dưới lên, nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ

Trang 16

-Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/



Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và đối xứng xen kẽ nhau, hình dải 50 - 100

cm, rộng 5 - 10 cm Căn cứ vào vị trí và hình thái lá trên cây, lá ngô được chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi

 Hoa ngô

; hoa cái mọc sát nhau, được bao bằng lá bắc to, vòi nhụy dài, quả dĩnh, hạt xếp thành hàng, các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông được bao bọc trong một số lớp lá và được bao chặt vào thân [2], [10]

Hạt ngô gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt Lớp alơron nằm dưới vỏ hạt và bao lấy nội nhũ

Phôi ngô

Trang 17

chiếm 1/3 thể tích của hạt, gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm [12]

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây ngô

Ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, ngô đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa gạo Nhưng ngô lại giàu dinh dưỡng hơn lúa mì và lúa gạo, góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, đặc biệt các nước thuộc châu Mỹ La Tinh

được ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học, chọn giống, công nghệ sinh học, cơ giới hóa, điện khí hóa và tin học vào công tác nghiên cứu và sản xuất [12]

-nguyên liệu cho công nghiệp gười ta đã sản xuất khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ

ngô xu

Hầu như 70% chất dinh dưỡng trong thức

ăn tổng hợp là từ ngô Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho gia

tỷ

-tỷ lệ này rất cao như Mỹ 76%, Bồ Đào Nha 91%, Malaysia 91% (CIMMYT, 2001)

, cần khoảng 4 triệu

[57]

Trang 18

ilin, Streptomicin, sản xuất axit acetic

như aceton, nhựa hóa học Phôi ngô chứa 17,2 - 56,8% lipid nên có thể dùng để ép dầu [2]

1.1.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam

1.1.3.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Ngô là cây trồng có địa bàn phân bố rộng, được gieo trồng khắp trên thế giới với sản lượng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lương thực nào Năm

1961, năng suất ngô trung bình trên thế giới chỉ đạt 20 tạ/ha thì đến năm

2011 đã l 51,84 tạ/ha, tăng gấp 1,5 lần Ngô được trồng ở hầu hết các nơi trên thế giới như Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi và Châu Á Do điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, tập quán canh tác dẫn đến diện tích, sản lượng và năng suất ngô ở các khu vực có sự chênh lệch nhau, điều đó được thể hiện ở bảng 1.1 [54]

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới

Trang 19

Qua bảng 1.1 cho thấy, châu Mỹ

Châu Mỹ chiếm 37,85% diện tích và 49,65% sản lượng thứ hai là châu Á với diện tích trồng ngô chiếm 32,2% diện tích trồng ngô thế giới nhưng năng suất thấp chỉ đạt 49,41 tạ/ha (năm 2011)

và xếp ở vị trí thứ ba Châu Âu có năng suất khá cao nhưng diện tích trồng ngô rất thấp, chiếm chưa đến 10% diện tích trồng ngô thế giới, do đó sản lượng chỉ đạt 12,28% tổng sản lượng thế giới Trong những năm gần đây, diện tích trồng ngô ở châu Á và châu Âu đang mở rộng,

cho sản lượng ngô của châu Âu tăng vọt thêm 26,8% chỉ trong 1 năm (2010 - 2011) Ngược lại, ở Châu Mỹ diện tích trồng ngô tăng nhưng năng suất và sản lượng giảm

Những năm gần đây áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến, đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên năng suất và sản lượng ngô thế giới có sự nhảy vọt, nhất là ở các nước có nền kinh tế phát triển thâm canh và sử dụng 100% giống ngô lai trong sản xuất Bên cạnh đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các giống ngô chuyển gen năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh cũng góp phần

sản lượng ngô thế giới

1.1.3.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Ngô được đưa vào nước ta cách đây khoảng 300 năm và trở thành cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây

thêm tiến bộ kỹ thuật, đặc biệt là về giống, cây ngô đã có những bước tăng trưởng đáng kể về diện tích, sản lượng và năng suất

Trang 20

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012

(triệu ha)

Sản lƣợng (triệu tấn)

Năng suất (tạ/ha)

Nếu nhƣ năm 1990, năng

(3,85 triệu tấn)

trồng ngô lai, kết hợp áp dụ

Trang 21

lai và đang ở giai đoạn đầu đi vào công nghệ cao (công nghệ gen, nuôi cấy bao phấn và noãn) [2], [12]

Bên cạnh những thuận lợi và thành tựu đã đạt được, ngành

Sản lượng ngô trong nước không đủ phục vụ cho con người và phát triển ngành chăn nuôi Hàng năm, Việt Nam vẫn phải nhập khẩu lượng lớn ngô để chế biến thức ăn gia súc Vì vậy, việc nghiên cứu tạo giống ngô có năng suất cao, khả năng chống chịu tốt, đồng thời đáp ứng yêu cầu chất lượng là nhiệm vụ rất quan trọng và cấp thiết đối với các cơ quan nghiên cứu, chọn tạo giống

1.2.1 Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới

Nuôi cấy in vitro cây ngô được bắt đầu từ rất sớm vào những năm

1930, khi Lampe và Mills nuôi cấy nội nhũ và phôi non trong môi trường có

bổ sung dịch chiết khoai tây nhưng mô chỉ sinh trưởng có giới hạn [48] Larue

gian dài phôi non và phôi ngô trưởng thành để xác định nhu cầu dinh dưỡng cho sinh trưởng và phát triển

Tái sinh cây từ phôi non hoặc bộ phận khác của những loài ngũ cốc lần đầu tiên được miêu tả trong những năm 1960 đến 1980 [49] Phôi non được

sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ngô Lu

sử dụng phôi có kích thước 1 - 1,5 mm thu được sau 2 tuần thụ phấn cấy vào môi trường MS bổ sung 2,4-D 0,25 - 2,0 mg/l và sucrose 3 - 12% [37] Năm 1975, Green và Phillips

ngô [32]

Trang 22

ai loại mô sẹo của phôi : mô sẹo loại I có đặc điểm cứng, đặc, nhỏ, màu trắng - vàng và có thể sản sinh ra các loại mô khác giống như phôi soma mô sẹo thường tăng trưởng chậm hoặc khó nuôi cấy trong thời gian dài Mô sẹo loại II được quan sát trong 1 số loại ngô

có các đặc điểm đặc trưng là mô sẹo

Chúng có tỷ lệ phôi hóa cao,

, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái sinh cây trực tiếp từ phôi cao

hơn tỷ lệ tái sinh thông qua mô sẹo [20]

Giai đoạn đầu của quá trình tái sinh phôi ngô là giai đoạn phôi soma trưởng thành nảy mầm được cảm ứng bởi nồng độ sucrose cao (60 g/l) trong điều kiện không có ánh sáng và không có chất điều hòa sinh trưởng Giai

đoạn thứ hai của quá trình tái sinh in vitro cây ngô là giai đoạn phát triển chồi

và rễ, được cảm ứng tốt khi giảm nồng độ đường sucrose [28]

Năm 1989, Vain đánh giá ảnh hưởng của ethylene trong nuôi cấy in vitro, sử dụng AgNO3 như chất ức chế hoạt động của ethylene tỷ lệ tạo dạng II ( xốp, vàng, cho tỷ lệ tái sinh cao) được nâng cao khi phôi non được nuôi cấy trong môi trường MS chứa AgNO3 từ 5 đến 20 mg/l Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng tái sinh của trong môi trường có AgNO3 tăng cao hơn [47]

Năm 2004, Zhang nghiên cứu 15 dòng ngô Tangsipingtou thuần bằng

nuôi cấy in vitro để đánh giá ảnh hưởng của kiểu gen, môi trường, chất kích

thích sinh trưởng và phương pháp tạo mô sẹo có nguồn gốc từ phôi non và tái sinh cây cho thấy cả 15 dòng có thể tạo , sự già hóa của

khả năng tái sinh cây giảm đến một mức độ nhất định [52]

Shohael (2003) nghiên cứu 3 dòng ngô CML-161; CML-323; CML-327 Phôi non được nuôi cấy trên môi trường N6, tỷ lệ tạo 56,33

Trang 23

- 72,0% Kết quả cho thấy môi trường đạt tỷ lệ cao nhất (72,0%) là môi trường N6 có bổ sung L-proline 2,3 g/l, hydrolysate casein 200 mg/l và 2,4-D 1,0 mg/l [42]

Năm 2004, Huang và Wei

hình thành từ 80 đến 90% đối với phôi non của con lai và từ 50 đến 80% đối với phôi non của dòng bố mẹ Khả năng phôi hóa được tiến hành ở 6 dòng thuần và 4 dòng lai chỉ 4 dòng thuần và 3 dòng lai

Năm 2011, Gorji nghiên cứu dòng ngô thuần khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây Kết quả trong môi trường N6 tần số tạo cao nhất khi bổ sung dicamba 2 mg/l, trong môi trường MS có bổ sung 2,4-D ở nồng

độ 1 mg/l Môi trường N6 bổ sung dicamba thúc đẩy quá trình tạo cao

Trang 24

hơn so với môi trường N6 bổ sung 2,4-D Tỷ lệ hình thành rễ cao nhất khi đưa chồi vào môi trường MS có bổ sung 2 mg/l NAA Trên môi trường MS có bổ sung BAP 1 mg/l và IAA 0,5 mg/l thúc đẩy tần số hình thành chồi cao, tỷ lệ tái sinh cây đạt từ 53 - 67% [31]

Nguyên liệu được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy tái sinh ngô phục vụ mục đích chuyển gen là phôi chưa trưởng thành [27], [28], [35], [50] Tuy nhiên, việc tạo phôi chưa trưởng thành là một quá trình khắt khe, cần thời gian để trồng cây, thụ phấn, tách các phôi chưa trưởng thành Cây mẹ trồng theo mùa và mẫu cấy được thu vào một khoảng thời gian nhất định mới cho kết quả tái sinh tốt [29], [31] Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các nguyên liệu khác dễ dàng thu nhận hơn là một trong những thách thức lớn để có thể tiến hành chuyển gen nhanh và hiệu quả hơn [24]

Trong tái sinh ngô, các thân non chưa trưởng thành lần đầu tiên được

sử dụng bởi Songstad [46] Trên môi trường N6 trung bình bổ sung 2,4-D, proline và AgNO3 từ nguyên liệu thân non hình thành mô sẹo loại II trên các dòng mô hình như A188 và B73 Ưu điểm của việc sử dụng các thân non chưa trưởng thành là có thể nuôi cấy trong vòng 6 - 7 tuần, không cần đợi đến giai đoạn sinh sản, thụ phấn, thụ tinh, phôi phát triển Đây là nguyên liệu lí tưởng nhất vì mẫu cấy không cần thông qua quá trình giảm phâm và thụ tinh, giảm được sự biến đổi di truyền

L-3 mg/l

-

-0 - 3% [44]

Trang 25

1.2.2 Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam

ngô, đó là: “nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen ở ngô

Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường N6 bổ sung 2,4-D 7 mg/l; casein 100 mg/l; L-prolin 2,88 mg/l; sucrose 40 g/l; agar 8 g/l cho tạo cao

phôi 18 - 20 ngày đối với vụ hè

dòng

2 dòng ngô HR8 và HR9 đạt lần lượt là 75,2% và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9%

và 21,4% [14]

Nguyễn Văn Đồng (2009), tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh từ phôi non của 45 dòng ngô Việt Nam thuộc 3 nhóm ngô tẻ, ngô nếp và ngô ngọt, sử dụng dòng đối chứng là dòng ngô mô hình HR8 có khả năn

Trang 26

sinh trưởng, phân chia tế bào và kiểm soát sự biệt hóa cũng như phát sinh

hình thái của thực vật Trong nuôi cấy tế bào in vitro, các chất điều hòa sinh

trưởng là thành phần quan tr

, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất

cytokinin [15]

Auxin

Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol axetic (IAA) nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng n

Auxin gồm có auxin tự nhiên

và auxin tổng hợp (2,4-D, IBA, NAA …) [8] Trong nuôi cấy in vitro, auxin

có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trưởng của mẫu thô

tác dụng kích thích sự hình thành phôi vô tính trong dung dịch huyền phù nuôi cấy [8], [15]

Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác dụng sinh lí của auxin là kích thích sinh trưởng mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn tới hình thành mô sẹo [3] Nồng độ auxin thấp dẫn tới sự hình thành rễ phụ, nồng độ auxin cao sẽ dẫn tới hình thành mô sẹo Tuy nhiên nếu quá cao sẽ ức chế sự phát triển của rễ Hàm lượng IAA có thể sử dụng từ 1 - 50 mg/l Hàm lượng IAA và NAA thường sử dụng từ 0,1 - 10 mg/l Còn 2,4-D được bổ sung vào môi trường cho hiệu quả tạo mô sẹo ở nhiều loại thực vật [1], [18]

Trang 27

Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô cây ngũ cốc đã được Bhaskaran và Smith (1990) tổng kết Nhìn chung, chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin điển hình là 2,4-D với nồng độ 1 - 3 mg/l cần thiết cho sự hình thành mô sẹo phôi hóa từ phôi hợp tử 2,4-D là yếu tố quan trọng trong sự khởi đầu phát triển của mô sẹo và mô sẹo có khả năng tạo phôi từ phôi non ngô [20]

2,4-D là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất để cảm ứng tạo mô sẹo từ phôi Việc bổ sung các citokynin kết hợp với 2,4-D có thể làm tăng phản ứng của phôi trong một số loài cỏ Kiểu gen là một yếu tố có vai trò cơ bản trong quá trình phôi cảm ứng ngô [27], [35], [36], [51]

Khi nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non dòng ngô lai F1 (M947 x M948) và (M950 x M951) của Das (2001) cho thấy môi trường MS

có bổ sung 2,4-D 2 mg/l là hiệu quả nhất [26] Sairam (2003) cũng đã tạo được mô sẹo từ các mẫu mô phân sinh chồi đỉnh với tần số tương đối cao (80%) khi bổ sung 2,4-D 5 mg/l vào môi trường nuôi cấy

Shohael (2003) nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến sự tạo

phôi của 3 dòng ngô CML-161; CML-323; CML-327 kết luận nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ cao nhất [42] Ombori (2008) đã sử dụng nồng độ 2,4-D 1,5 - 2,5 mg/l và thấy các dòng ngô có nồng độ 2,4-D tối ưu khác nhau [39]

Cytokinin

Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được là zeatin tách từ mầm ngô Ngoài ra còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [8] Cytokinin liên quan tới sự phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy Hàm

Trang 28

lượng cytokinin cao sẽ hoạt hóa thành chồi bất định, chồi nhiều nhưng kích thước nhỏ [17] Các cytokinin thường dùng là: BAP, kinetin…

Những năm 1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BAP có thể kích thích nhiều quá trình, BAP được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật và mục đích nuôi cấy [8]

Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển H

Việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin kết hợp với auxin trong quá trình hình thành phôi soma từ các mẫu mô sẹo của các cây ngũ cốc cũng đã được nghiên cứu Theo Cho (1998), bổ sung BAP 0,1 mg/l kết hợp với 2,4-D 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với sự hình thành và duy trì mô sẹo phôi hóa [25]

của thành phần môi trường của nitrat bạc

Trang 29

-Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

[45]

Vain (1989) là người đầu tiên đi sâu nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng

độ AgNO3 đến khả năng tạo dạng II Tác giả nhận thấy tỷ lệ

dạng II tăng lên khi phôi non được nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung AgNO3 (0, 5, 10 và 20 mg/l) và AgNO3 không ảnh hưởng đến sự phát triển của Nitrat bạc một chất ức chế hoạt tính của ethylene

nội sinh Ethylene được hình thành trong quá trình nuôi cấy in vitro

ảnh hưởng tới phân chia và biệt hóa của tế bào vậy, bổ sung nitrat bạc vào môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo thành mô sẹo và tái sinh cây [47]

Vai trò của L-proline

Armstrong và Green (1991) đã nghiên cứu vai trò của L-proline trong việc duy trì mô sẹo xốp và mô sẹo có khả năng tạo phôi dòng ngô A188 Tác giả tạo mô sẹo và duy trì hơn một năm mà mô sẹo vẫn xốp, không mất khả năng phôi hóa Tỷ lệ tạo mô xốp và mô sẹo phôi hóa tăng với

bổ sung L-proline đến 25 mM vào môi trường N6 [21]

Binott (2005) nhận định rằng nồng độ L-proline 1,87 g/l (10 mM) tạo tốt nhất đó có những nghiên cứu chỉ ra rằng L-proline thích hợp nhất là 2,3 g/l (20 mM) [23]

Vai trò của đường

in vitro

Trang 30

[40] -

in vitro

: nuôi cấy phôi hợp tử (nuôi cấy phôi non, phôi trưởng thành), nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy noãn , nuôi cấy

mô phân sinh

Nuôi cấy phôi non nhằm tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu gây đột biến, chọn dòng vô tính, nuôi cấy tế bào trần, chuyển gen và phân lập gen Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy phôi non phụ thuộc vào: kiểu gen, tuổi phôi, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy

Nuôi cấy phôi trưởng thành có ưu điểm so với nuôi : phôi dễ tách,

Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời ở ngô thường gặp khó khăn hơn

so với nuôi cấy bao phấn các cây trồng quan trọng khác Sự thành công của

kỹ thuật nuôi cấy bao phấn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu gen, môi trường

Trang 31

nuôi cấy, thao tác vô trùng, các bi

Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh là một tro

thuật nuôi cấy

Hệ thống nuôi cấy mô phân sinh chồi có ưu điểm là ít phụ thuộc vào kiểu gen, thao tác tách mô phân sinh nhanh và đơn giản hơn so với việc tách phôi non Mô phân sinh đỉnh chồi là hệ thống nuôi cấy tái sinh tiềm năng đối với các nghiên cứu biến nạp di truyền ở cây ngô Nhưng trong thực tế thường gặp khó khăn lớn trong

mục đích làm sạch virus cho cây trồng Độ lớn của chồi (mô) nuôi cấy có mối tương quan chặt chẽ với tỷ lệ sống, khả năng cảm ứng và mức độ ổn định về mặt di truyền Nếu độ lớn chồi tăng thì tỷ

Ngoài đỉnh sinh trưởng là bộ phận nuôi cấy dễ thành công thì các bộ

phận còn lại của cây ngô cũng có thể sử dụng cho việc nhân giống in vitro,

chẳng hạn như đoạn thân, mảnh lá [15]

Trang 32

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

LVN 66, LVN 99, LVN 885 do Viện Nghiên cứu ngô cung cấp

LVN 25 LVN 61 LVN 66 LVN 99 LVN 885

ngày

95 - 105 ngày

95 - 120 ngày

95 - 110 ngày

Năng suất 8 - 12

(tấn/ha)

8 - 12 (tấn/ha)

9 - 12 (tấn/ha)

8 - 10 (tấn/ha)

Tính

chống chịu

Chống chịu gãy

đổ khá, chịu hạn tốt, kháng sâu bệnh

Chịu đổ, chịu hạn, chịu úng và chịu sâu bệnh tốt

Chịu hạn khá, chống

đổ tốt, ít nhiễm bệnh,

độ đồng đều cao

Chịu hạn tốt, kháng bệnh, thích ứng rộng

: Viện Nghiên cứu ngô)

Trang 33

2.4 Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Trong quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp thường quy của

kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật như khử trùng mẫu, tái sinh cây trực tiếp

từ phôi non, tạo mô sẹo, tái sinh cây từ mô sẹo…

8/2014

Trang 34

Tỷ lệ tái sinh (%) = số mẫu tái sinh x 100

số mẫu cấy Chất lƣợng cây:

+ Cây tốt: cây khỏe, lá xanh, rễ khỏe

+ : cây khỏe, lá hơi úa vàng, rễ ít phát triển

+ Cây kém: cây yếu còi cọc, lá úa, rễ kém

Trang 35

2.5.2 Tạo mô sẹo từ phôi và thân non

Phôi non

[32]

Tạo mô sẹo từ phôi

Môi trường nền tạo mô sẹo: M1 =

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của L-proline đến khả năng tạo

mô sẹo từ phôi non

Trên môi trường M2, L-proline 1,5; 1,8; 2,0; 2,2; 2,5; 2,8; 3,0 g/l thu được môi trường M3 có nồng độ L-proline thích hợp

Trang 36

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non

9; 11 mg/l tìm được môi trường M4 có nồng độ AgNO3 thích hợp nhất

Như v y, môi trường M4 là phù hợp nhất tạo mô sẹo

Tạo mô sẹo từ thân non

70o

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô

sẹo từ thân non

Trong đó: Ncp: Số phôi tạo mô sẹo

Trang 37

Nt: tổng số phôi nuôi cấy

Ci: tỷ lệ tạo mô sẹo

Hình thái: quan sát hình thái mô sẹo để nhận định mô sẹo là loại I hay loại II theo mô tả của Amstrong và Green, 1985 [20]

2.5.3 Nghiên cứu khả năng tái sinh cây từ mô sẹo

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ BAP đến khả

năng tái sinh cây từ mô sẹo

Trong đó: Rc: tái sinh cây

Nr: tổng số mô tái sinh

Nsv: tổng số mô nuôi cấy

Số chồi trung bình tính theo công thức:

2.5.4 Nghiên cứu điều kiện đưa cây in vitro ra ngoài môi trường

Thí nghiệm 9: nh hưởng của các loại giá thể khác nhau

đến khả năng sống sót của cây con in vitro

giá thể cát sạch, đất , cát sạch + trấu hun (tỷ lệ 1:1)

Tổng số chồi

Số chồi trung bình/ mô =

Tổng số mô tái sinh

Định dạng
Số trang	74
Dung lượng	11,54 MB