nghiên cứu sản xuất sinh khối rễ cây hoàng liên gai làm nguồn dược liệu sản xuất berberin bằng công nghệ khí canh

Ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng đến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gai trồng trong khí canh tại Hà nội sau 5 tháng theo dõi.... ‐ Nghiên cứu ảnh

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i 

DANH MỤC CÁC BẢNG iv 

DANH MỤC CÁC HÌNH vii 

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 

1.1 Tính cấp thiết 1 

1.2 Mục tiêu 3 

1.3 Yêu cầu 3 

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3 

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 4 

1.5 Tính mới 4 

1.6 Tính độc đáo 4 

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 5 

2.1 Phân loại, đặc điểm hình thái và giá trị sử dụng 5 

2.1.1 Phân loại, đặc điểm hình thái và phân bố 5 

2.1.2 Giá trị sử dụng 6 

2.2 Ứng dụng của công nghệ thuỷ canh, khí canh trong sản xuất nông sản 8 

2.3 Ứng dụng công nghệ thuỷ canh và khí canh trong việc nhân nhanh giống cây trồng 9 

2.4 Tình hình nghiên cứu cây Hoàng liên gai trong và ngoài nước 12 

PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 

3.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 16 

3.2 Nội dung nghiên cứu 16 

3.3 Các phương pháp nghiên cứu 18 

3.4 Các kỹ thuật sử dụng 19 

3.5 Bố trí thí nghiệm 19 

3.5.1Nội dung 1: Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu 19 

3.5.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Hà Nội 21 3.5.3 Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sapa 25 3.5.4.Nội dung 4: Nghiên cứu thu hoạch, đánh giá các hoạt chất làm thuốc của nguồn sinh khối tạo ra 27 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết quả nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu 29 4.1.1 Kết quả điều tra thu thập nguồn gen cây Hoàng liên gai tại Lào Cai 29 4.1.2 Nghiên cứu đánh giá giá trị dược lý của mẫu giống Hoàng liên gai thu thập được 30 4.1.3Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất auxin xử lý kích thích ra rễ cành giâm nhằm tạo vật liệu sớm đưa vào thử nghiệm trồng khí canh 31 4.1.4 Kết quả nghiên cứu phương pháp tạo nguồn vật liệu bằng gieo hạt in vitro 34 4.2 Nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Hà Nội 37 4.2.1 Nghiên cứu khả năng nhân giống in vivo cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Hà Nội 37 4.2.2 Kết quả nghiên cứu xác định ảnh hưởng của dung dịch dinh dưỡng đặc hiệu (thành phần dinh dưỡng, pH, EC,…) tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội 39 4.2.3 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của chế độ phun dinh dưỡng tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai 43 

4.2.4 Kết quả nghiên cứu xác định ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của

cây Hoàng liên gai tại Hà Nội 46 

4.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố ngoại cảnh (nhiệt độ môi trường, ánh sáng) tới sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội 49 

4.2.6 Kết quả nghiên cứu biện pháp thu hoạch sinh khối rễ cây Hoàng liên gai để tăng năng suất trong khí canh tại Hà Nội 54 

4.3 Kết quả nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sapa 57 

4.3.1 Kết quả nghiên cứu khả năng nhân giống in vivo cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sa Pa 57 

4.3.2 Kết quả nghiên cứu xác định ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gaitại Sa Pa 61 

4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố ngoại cảnh (nhiệt độ môi trường, ánh sáng) của vùng Sa Pa tới sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gaitại Sa Pa 64 

4.3.4 Kết quả nghiên cứu khả năng tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai trong khí canh so với trồng địa canh tại Sa Pa 68 

4.4 Kết quả nghiên cứu thu hoạch, đánh giá các hoạt chất làm thuốc của nguồn sinh khối tạo ra 73 

4.4.1 Nghiên cứu thu hoạch sản phẩm (thời gian, sản phẩm, cách thu hoạch 1 lần hoặc nhiều lần) 73 

4.4.2 Kết quả phân tích đánh giá các hoạt chất làm thuốc trong rễ cây Hoàng liên gai tạo ra bằng khí canh và nguồn trong tự nhiên 76 

PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 77 

5.1 Kết luận: 77 

5.2 Đề nghị 78 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 Kết quả đánh giá hàm lượng berberin trong cây Hoàng liên gai

thu thập được ngoài tự nhiên (tại Sapa-Lào Cai) 31 Bảng 2: Ảnh hưởng của các chế độ khử trùng khác nhau đến tỷ lệ sống

của mẫu nuôi cấy (sau 10 ngày theo dõi) 34 Bảng 3 Ảnh hưởng của các nền môi trường khác nhau đến sự cảm ứng

hình thành chồi của mẫu nuôi cấy (sau 30 ngày theo dõi) 35 

Bảng 4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích ra rễ αNAA đến

khả năng hình thành rễ mới của cây Hoàng liên gai trên hệ thống khí canh tại Hà Nội 38 Bảng 5 Kết quả theo dõi sự ra rễ, ra lá và tái sinh trưởng của cây Hoàng

liên gai trong khí canh sau trồng 1 tháng 39 Bảng 6 Kết quả theo dõi sự sinh trưởng của cây Hoàng liên gai trong khí

canh sau trồng 3 tháng 40 Bảng 7 Kết quả theo dõi sự sinh trưởng của cây Hoàng liên gai trong khí

canh sau trồng 6 tháng 40 Bảng 8 Ảnh hưởng của ngưỡng dung dịch dinh dưỡng đến sự ra rễ và tái

sinh trưởng của cây Hoàng liên gai trong khí canh sau trồng 1 tháng 41 Bảng 9 Ảnh hưởng của ngưỡng dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng

của cây Hoàng liên gai trong khí canh sau trồng 6 tháng 42 Bảng 10 Khả năng ra rễ và tái sinh trưởng của cây Hoàng liên gai trong

khí canh tại Hà Nội sau trồng 1 tháng ở các chế độ phun khác nhau 43 Bảng 11 Khả năng sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gai trong khí

canh tại Hà Nội sau trồng 9 tháng ở các chế độ phun khác nhau 45 Bảng 12 Nhiệt độ dung dịch của các công thức 46 

Bảng 12 Ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng đến khả năng ra

rễ, sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gai trồng trong

khí canh tại Hà nội sau 5 tháng theo dõi 48 

Bảng 13 Đánh giá khả năng ra rễ và sự sinh trưởng của cây Hoàng liên gai trồng vào mùa thu trong khí canh tại Hà Nội 50 

Bảng 14 Đánh giá khả năng ra rễ và sự sinh trưởng của cây Hoàng liên gai trồng vào mùa đông trong khí canh tại Hà Nội 51 

Bảng 15 Đánh giá khả năng ra rễ và sự sinh trưởng của cây Hoàng liên gai trồng vào mùa xuân trong khí canh tại Hà Nội 52 

Bảng 16 Đánh giá khả năng ra rễ và sự sinh trưởng của cây Hoàng liên gai trồng vào mùa hè trong khí canh tại Hà Nội 53 

Bảng 17 Khối lượng rễ cây Hoàng liên gai thu được ở các thời điểm thu hoạch khác nhau 56 

Bảng 18 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng αNAA đến khả năng ra rễ của cây Hoàng liên gai trồng trong khí canh tại SaPa 60 

Bảng 19 Nhiệt độ dung dịch của các công thức 61 

Bảng 20.Ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng đến khả năng ra rễ, sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gai trồng trong khí canh tại Sa Pa 63 

Bảng 21 Diễn biến thời tiết khí hậu vùng Sa Pa từ tháng 7/2011-06/2012 65 

Bảng 22 Động thái sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gai trồng trong khí canh trong các mùa khác nhau 66 

Bảng 23 Sự cảm ứng ra lá và rễ mới của cây Hoàng liên gai khi trồng bằng khí canh 68 

Bảng 24 Sự sinh trưởng, phát triển của cây Hoàng liên gai trồng bằng

khí canh 69 

Bảng 25 Khả năng tạo rễ của cây Hoàng liên gai khi trồng bằng khí canh 70 

Bảng 26 Sự sinh trưởng, phát triển của Hoàng liên gai khi trồng khí canh

Bảng 29 Ảnh hưởng của số lần thu hoạch đến sản lượng rễ cây Hoàng

liên gai trồng trong hệ thống khí canh 75 

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Đồ thị về sự thay đổi các chỉ tiêu theo dõi của cành giâm Hoàng

liên gai khi xử lý αNAA ở các nồng độ khác nhau 33 

Hình 2 Động thái tăng trưởng thân lá, ra rễ và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai trong khí canh ở các mức EC khác nhau sau trồng 9 tháng 45 

Hình 3 Biến động nhiệt độ môi trường và nhiệt độ dung dịch

của các công thức 47 

Hình 4 Biến động hiệt độ môi trường và nhiệt độ dung dịch của

các công thức 62 

Hình 5 Diễn biến thời tiết khí hậu vùng Sa Pa từ tháng 7/2011-06/2012 65 

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết

Việt Nam có 3.920 loài thực vật được dùng làm thuốc, chiếm 16% số cây thuốc đã được biết trên thế giới Chúng không chỉ có tác dụng chữa bệnh, bồi bổ sức khoẻ mà còn góp phần xoá đói giảm nghèo Tuy nhiên, một số cây thuốc quý đang có nguy cơ tuyệt chủng do khai thác bừa bãi, thiếu quy hoạch bảo tồn, cùng với việc xuất lậu cây thuốc tràn lan nên nguồn dược liệu thiên nhiên quý của nước ta đang ngày càng cạn kiệt.Trong giai đoạn từ năm 2006, mỗi năm có gần 50.000 tấn thực vật hoang dã bị khai thác và buôn bán bất hợp pháp (Theo Cục kiểm lâm -Việt báo số 28/2/2006) Trong Sách Đỏ Việt Nam 1996, Việt Nam có 24 loài thực vật thuộc diện nguy cấp thì đến Sách Đỏ

2004, Việt Nam có 191 loài, và Sách Đỏ 2007 đã liệt kê 196 loài (trong đó có

45 loài rất nguy cấp)

Họ Hoàng mộc, còn gọi là họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ này thuộc bộ Mao lương (Ranunculales) Họ chứa khoảng 570 loài, trong đó phần lớn (khoảng 450 loài) thuộc về chi Berberis Hoàng liên gai còn là nguồn gen

quý hiếm, trong rễ và thân có chứa berberin, hàm lượng 3 %, dùng làm thuốc chữa bệnh đường ruột

Hoàng liên gai không nằm trong danh sách đỏ của IUCN nhưng thuộc nhóm đang nguy cấp (EN) trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 và nằm trong nhóm Ia của Nghị Định 32-CP Số lượng cá thể đang bị suy giảm nghiêm trọng, ước tính

số lượng cá thể hiện còn khoảng 50-100 cá thể/quần thể, giảm tới 80% trong khoảng 10 năm trở lại đây Các biện pháp bảo tồn tại chỗ (insitu) hiện nay tỏ ra không có hiệu quả vì Hoàng liên gai vẫn bị khai thác ồ ạt và sản phẩm vẫn được bày bán phổ biến ở chợ địa phương Tại vườn cây thuốc của Viện Dược liệu tại

Sa Pa loài này đã trồng và bảo tồn, tuy nhiên số lượng cá thể còn hạn chế VQG Hoàng Liên đã phối hợp với dự án Oxfarm Anh để nhân giống và giao cho các

hộ gia đình trong khu vực để gây trồng (Báo cáo dự án “Điều tra đánh giá tình trạng bảo tồn các loài thực vật rừng nguy cấp, qúy hiếm thuộc danh mục nghị

định 32/2006/NĐ-CP theo vùng sinh thái”-Trung tâm Tài nguyên và Môi trường Lâm nghiệp-Viện Điều tra Quy hoạch Rừng, tháng 12 năm 2010)

Chính vì vậy, nhiệm vụ đặt ra cho các nhà khoa học là phải nghiên cứu tìm ra biện pháp nhân giống và bảo tồn loại cây này, đồng thời áp dụng các tiến

bộ khoa học công nghệ mới để nhân sinh khối loại cây dược liệu quý hiếm này Được biết Viện Công nghệ Sinh học – Viện KH&CN Việt Nam đã bước đầu nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh sinh khối mô của cây Hoàng Liên gai trong điều kiện nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào là phương pháp có hiệu quả để nhân giống Đây là phương pháp đang được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân thương mại một số lượng lớn các loài thực vật, bao gồm cả các loài cây thuốc quý (Rout

et al., 2000) Tuy nhiên, cho đến nay sự triển khai rộng rãi công nghệ này ngoài sản xuất còn khá hạn chế Do cây nuôi cấy mô được nhân ra trong điều kiện nhân tạo (ánh sáng, nhiệt độ, môi trường dinh dưỡng,…) nên tiêu hao về điện năng và hóa chất tương đối lớn chưa kể về trang thiết bị Kết quả làm cho giá thành sản xuất của cây nuôi cấy mô luôn cao khoảng trên 1000 đồng/cây, chưa tính lãi suất

Richard J Stoner (1983)ở đại học Colorado Mỹ lần đầu tiên nghiên cứu

và áp dụng thành công công nghệ khí canh trong nhân giống cây trồng, bằng cách phun ngắt quãng các dinh dưỡng và chất kích thích ra rễ trong các hộp nhân giống 20 lần/giờ Công nghệ đã được tác giả nghiên cứu hoàn thiện cho phép ra đời một công nghệ mới gọi là công nghệ RPB (Rapid Propagation Biotechnology) Công nghệ này được xem như là bước đột phá trong lĩnh vực

nghiên cứu và sản xuất giống vô tính cây trồng Các nhà nhân giống in vitro gọi

kỹ thuật này là thế hệ mới của công nghệ nhân giống và cho rằng đây sẽ là phương pháp nhân giống vô tính cây trồng quan trọng của thế kỷ 21 Công nghệ này cho phép nhân được nhiều loại cây trồng, chu kỳ nhân giống nhanh hơn, nhiều hơn, công suất tăng 30 lần so với kỹ thuật truyền thống, tiết kiệm lao động, vật liệu, giảm giá thành cây giống

Việc kết hợp giữa công nghệ nuôi cấy mô tế bào với các công nghệ tiên tiến như công nghệ thủy canh, khí canh để nhân giống và sản xuất cây trồng trên quy mô công nghiệp là một bước đi có tính chất đột phá Công nghệ khí canh do Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ĐHNN Hà Nội nghiên cứu lần đầu tiên có mặt tại Việt nam là một bước tiến có tính đột phá Công nghệ thể hiện tính ưu việt trong nhân giống và sản xuất những loại cây lấy củ và rễ Xuất phát từ những yêu cầu bức thiết của thực tế và những tiến bộ kỹ thuật đạt được, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sản xuất sinh khối rễ cây Hoàng liên gai làm

nguồn dược liệu sản xuất berberin bằng công nghệ khí canh ”

1.2 Mục tiêu

Đưa ra một công nghệ mới phối hợp giữa công nghệ nuôi cấy mô và công nghệ khí canh nhằm tăng một cách đột phá sự hình thành sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai, làm cơ sở cho sự hình thành các xí nghiệp công nghiệp sinh học

sản xuất sinh khối dược liệu

1.3 Yêu cầu

+ Thu thập được nguồn vật liệu nghiên cứu, tạo được sớm nhất nguồn cây giống phục vụ cho nghiên cứu khí canh (có thể sử dụng kỹ thuật giâm cành) + Xây dựng được hệ thống tái sinh và nhân in vitro cho vật liệu thu thập được và tạo được nguồn nguyên liệu đưa ra trồng khí canh

+ Xác định được các biện pháp kỹ thuật tác động phù hợp cho sản xuất sinh khối rễ cây hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh và sản xuất được 2-5kg sinh khối rễ cây hoàng liên gai trong thời gian thực hiện, đồng thời bước đầu đánh giá được thành phần hoạt chất trong sinh khối cây hoàng liên gai sản xuất ra bằng công nghệ khí canh (nếu có thể)

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

‐ Đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về khả năng nhân giống và

tạo sinh khối rễ cây hoàng liên gai (Berberidaceae)bằng công nghệ khí canh

‐ Các kết quả thu được sẽ làm cơ sở cho việc nghiên cứu và giảng dạy đối

với cây dược liệu Hoàng liên gai (Berberidaceae)

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất được một quy trình nhân giống và nuôi trồng sinh khối rễ cây

Hoàng liên gai (Berberidaceae) bằng công nghệ nuôi cấy mô và công nghệ khí

đượcmột khối lượng lớn sinh khối rễ cây Hoàng liên gai (Berberidaceae) trong

một thời gian ngắn

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1 Phân loại, đặc điểm hình thái và giá trị sử dụng

2.1.1 Phân loại, đặc điểm hình thái và phân bố

Trong một số hệ thống phân loại cũ thì họ Berberidaceae chỉ chứa 4 chi

(Berberis, Epimedium, Mahonia, Vancouveria), còn các chi khác được xếp vào các họ khác nhau như Leonticaceae (Bongardia, Caulophyllum,

Gymnospermium, Leontice), Nandinaceae (Nandina) và Podophyllaceae

(Achlys, Diphylleia, Dysosma, Jeffersonia, Podophyllum, Ranzania)

Hoàng liên gai (Berberis juliane Schneid.)

thuộc họ Hoàng mộc (Berberidaceae), bộ Mao

lương (Ranunculales), chi Berberis, là loài cây

bụi, cao 2 - 3 m, thân và rễ có màu vàng đậm,

phân cành nhiều, có gai dài, chia 3 nhánh, mọc

dưới các túm lá Lá mọc vòng 3 - 7 cái, gần như

không cuống, phiến lá cứng hình thuôn, nhọn 2

đầu, hơi bóng ở mặt trên, dài 3 - 9cm, rộng 1,2 -

2,5cm, mép có răng cưa nhỏ và đều Hoa nhiều

(10 - 30 cái), mọc ở giữa các túm lá Hoa nhỏ,

cuống dài 1 - 1,3cm, màu vàng nhạt

Tổng bao hình mác rộng Lá đài hình trứng ngược, xếp thành 2 vòng, những vòng trong lớn hơn vòng ngoài.Quả mọng hình trái xoan, khi chín có màu tím đen, trong chứa 3 - 4 hạt đen

Cánh hoa nhỏ hơn đài, hình trứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy Nhị ngắn hơn cánh hoa, bao phấn hình trứng Bầu hình trụ tròn, hơi phồng ở giữa, chứa 1 - 2 noãn Quả mọng hơi hình bầu dục hoặc hình trứng thuôn, đầu nhụy tồn tại rõ, khi chín màu đen hơi có phấn hạt Mùa hoa tháng 5 - 6, mùa quả tháng 6 - 10 Thân cành bị chặt nhưng vẫn có khả năng tái sinh chồi Hoa, quả nhiều có khả năng trồng được bằng hạt (Sách đỏ Việt Nam - trang 70)

Theo Phạm Hoàng Hộ - Cây cỏ Việt Nam (quyển 1) thì Hoàng liên gai

(Berberis wallichiana DC.) là loại tiểu mộc cao 2-3m, nhánh không lông Lá

đơn, hình bầu dục thon, nhọn 2 đầu, bìa có răng thưa, dày, cứng, không lông, gân phụ, có 6-7 cặp lá; cuống dày 4-6mm; gai dài 1-2cm, thường chẻ 3 từ đáy Cánh hoa màu vàng, 5-8mm Hoàng liên gai chứa berberin, dùng trị kiết, bệnh mắt, hạ huyết áp Loài này thường được trồng ở Sapa

Hoàng liên gai được coi là loài đặc hữu của Trung Quốc, nhưng được trồng làm cảnh ở nhiều nơi trên thế giới như: Cộng hòa Séc, Cộng hòa liên bang Đức, Hợp chủng quốc Hoa Kỳ Ở Việt Nam, Hoàng liên gai được phát hiện mọc

ở độ cao 1300-1400m ở Quản Bạ tỉnh Hà Giang và trên 1600m (thị trấn Sa Pa,

xã Sa Pả, xã Tả Phìn, xã Tả Giàng Phình (huyện Sa Pa) trong rừng kín thường xanh (http://thuocdongduoc.vn)

Ngoài ra becberin còn được sử dụng trong điều trị các bệnh tim mạch, thử nghiệm lâm sàng mới nhất được đăng tải trên tạp chí tim mạch của Mỹ (American Cardiology), Zheng XH (2003) đã cho thấy khả năng tăng chức năng của cơ tim, giảm số lượng kích thích sớm của tâm thất và giảm tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân bị suy tim mà không có một tác dụng có hại nào Một vài tác dụng mới của becberin cũng được nghiên cứu, các nhà khoa học còn cho biết: berberin có khả năng ức chế bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm

cholesterol và triglycerid, chống tiểu đường, ức chế cơn nhịp nhanh thất, giảm viêm cho người bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của những bệnh nhân xuất huyết, giảm tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin

Các nhà khoa học thuộc Đại học khoa học y học, Mashhad, IR Mashhad Iran đã tiến hành nghiên cứu tác dụng dược lý và điều trị cũng như thành phần

hoạt tính berberin của giống Berberis vulgaris Berberis vulgaris L là loại cây

trồng nổi tiếng ở Iran và các bộ phận khác nhau của nó gồm cả rễ, vỏ cây, lá và trái cây đã được sử dụng trong y học dân gian Hai thập kỷ nghiên cứu đã chứng minh tác dụng dược lý và điều trị khác nhau của các alkaloid có trong Berberis vulgaris (đặc biệt là berberine) Nghiên cứu được thực hiện trên thành phần hóa

học của các hoạt tính có trong Berberis vulgaris và thành phần quan trọng nhất

của nó lá các isoquinoline alkaloids như berberine, berbamine và palmatine Berberine là một trong những nghiên cứu nhiều nhất trong số các alkaloid tự

nhiên và ngoài Berberis vulgaris berberine có trong nhiều loài thực vật khác và

được sử dụng để điều trị các bệnh khác nhau Bài viết này đánh giá việc sử dụng truyền thống và tác dụng dược lý của chiết xuất hoàn toàn và thành phần các

hoạt động của Berberis vulgaris (berberine).(Imanshahidi M et al.,2008)

Theo luận án tiến sĩ của AHMED, ASIF, Đại học Nông nghiệp, Rawalpindi “Các nghiên cứu hoá sinh và phân tích các chiết xuất thu được từ

Berberis Lyceum Royal”:Cây dược liệu chính là nguồn gốc của các loại thuốc

được sử dụng để điều trị các rối loạn sức khỏe khác nhau Berberis Lyceum

Royal một cây bản địa ở Đông Bắc của Pakistan được lựa chọn để khám phá giá

trị chữa bệnh của nó trong quá trình nghiên cứu này Đây là giống có giá trị chữa bệnh và đang được sử dụng chống lại nhiều bệnh / bệnh nhiễm trùng bởi dân địa phương từ nhiều thế kỷ Nghiên cứu đã tiến hành phân tích các hàm lượng chất, axit béo, phân tích ion kim loại, trích ly và thanh lọc các alkaloid Phân tích sinh

hóa của mẫu gốc của Berberis Lyceum Royal cho thấy sự biến đổi giữa các

thông số khác nhau, trong đó bao gồm hàm lượng protein (4,4 - 6,24%), chất xơ

thô (14,96 - 16,40%) và tro thô (3,79 - 6,99%) trên cơ sở trọng lượng khô Hai alkaloid, berberine và palmatine được phân tích và định lượng bằng TLC và HPLC và proton và tín hiệu carbon đã được phát hiện trong 1H và quang phổ 13C-NMR Việc phân tích quang phổ NMR của berberine và Palmatine tiết lộ rằng các proton H-13 cộng hưởng như một đơn (H-13 của 1: δ 8,72; H-13 của 2:

δ 8,81) có thể được sử dụng để định lượng Các chất chiết xuất thô và Berberine

của Berberis Lyceum Royal được đánh giá là rất có giá trị trong chữa đái tháo

đường, kháng khuẩn và làm lành vết thương Đối với sinh thử nghiệm kháng

khuẩn, các chất chiết xuất từ gốc của Berberis Lyceum Royal được cho vào

trong ba dung môi khác nhau, methanol, ethanol và dung dịch nước và thử nghiệm chống lại các loại vi khuẩn khác nhau, nấm và các chủng nấm men Hoạt động kháng khuẩn được đánh giá bằng cách sử dụng phương pháp xét nghiệm khuếch tán đĩa và pha loãng Micro Quan sát cho thấy rằng tất cả các

chất chiết xuất từ gốc của Berberis Lyceum Royal có hiệu quả cao chống lại vi

khuẩn và các loại nấm khác nhau Các kết quả thu được trong nghiên cứu này

chỉ ra rằng gốc rễ của Berberis Lyceum Royal chứa một số chất phytochemical

có hoạt động kháng khuẩn và có thể được sử dụng cho các ngành công nghiệp dược phẩm cho sự phát triển của các loại thuốc mới cần thiết cho sức khỏe con người và động vật Với mục đích điều tra tác dụng của berberine và trích xuất

toàn bộ Berberis Lyceum Royal với hàm lượng đường trong máu và các thông

số khác liên quan với bệnh tiểu đường, so sánh ảnh hưởng của chiết xuất thô với berberine tinh khiết, họ đã tiến hành các thí nghiệm trên chuột và nhận thấy nếu

cho các con chuột thí nghiệm uống 50 mg / kg Berberis trích xuất và berberine

cho thấy so với những con chuột mắc bệnh tiểu đường bình thường thì giảm đáng kể lượng đường trong máu từ ngày 3 -7 ngày do đó xác nhận việc sử dụng

nó như một cách điều trị bệnh đái tháo đường (AHMED, ASIF, 2009)

2.2Ứng dụng của công nghệ thuỷ canh, khí canh trong sản xuất nông sản

Ngành công nghiệp thuỷ canh thương mại của thế giới đã tăng từ 4 đến 5 lần trong 10 năm qua Diện tích canh tác bằng hệ thống thuỷ canh trên thế giới

tăng mạnh mẽ: trong những năm 1940 chỉ là 10 ha thì đến những năm 1970 đã

mở rộng khoảng 300 ha và những năm 80 đã lên đến 6,000 ha (Donnan, 1998) Tính đến năm 2001, diện tích này ước khoảng 20,000 đến 25,000 ha đạt giá trị sản xuất khoảng 6 - 8 tỷ USD

Các nước sản xuất thương mại các sản phẩm từ công nghệ thuỷ canh lớn nhất là Hà lan (10,000 ha), Tây Ban Nha (4,000 ha), Canada (2000 ha), Nhật bản (1,000 ha), New Zealand (550 ha), Úc (500 ha), Anh (460 ha), Mỹ (400 ha)

và Ý (400 ha) Những nước phát triển nhất về thuỷ canh ở châu Á bao gồm Singapore, Đài Loan, Nhật bản, Trung Quốc, Hồng Kông, Hàn quốc, Malaysia

Các cây trồng chủ yếu bằng hệ thống hydroponic là cây rau (cà chua, dưa chuột, ớt, cà, đậu, xà lách, củ cải, hành lá); các loại hoa cắt (cúc, hồng, cẩm chướng, đồng tiến); cây ăn quả (dâu tây, các loại dưa.)

Ở Hà lan, sản xuất bằng hydroponics chiếm khoảng 50 % tổng giá trị sản lượng quả và rau sản xuất trong nước

Ở Canada hydroponic là phương pháp sản xuất rau phổ biến nhất trong nhà kính và chiếm khoảng 25 % tổng sản lượng rau của cả nước

Ở Nhật các sản phẩm từ hydroponic được trả tăng từ 20-30 % so với các phẩm sản xuất truyền thống do tính an toàn và không sử dụng thuốc hoá học

Ở Singapore, người ta ứng dụng công nghệ khí canh để trồng rau diếp; bắp cải; cà chua; xu hào và một số loại rau ôn đới cung cấp cho nhu cầu rau tươi trong nước Dự tính đến trong vài năm tới lượng rau trồng bằng khí canh ở nước này sẽ cung cấp thêm 20% nhu cầu tiêu dùng (Lê Tấn Phước, 1996)

2.3 Ứng dụng công nghệ thuỷ canh và khí canh trong việc nhân nhanh giống cây trồng

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ thuỷ canh vào nhân giống cây trồng đã được D.R Hoagland và D.I Arnon ở Trường ĐH Califorlia tiến hành đầu tiên vào năm 1938 Bằng kỹ thuật này họ đã điều khiển cho cây ra rễ và sinh trường hoàn toàn trong dung dịch dinh dưỡng Tuy nhiên do những điều kiện kỹ thuật phức tạp (thông khí, kiểm soát hấp thu dinh dưỡng, pH của dung dịch, ) công

nghệ này có nhiều nhược điểm nên không được ứng dụng Tiếp nối các công trình của Klotz, L.G (1944); Vyvyan,G.F; Went, F.W (1957)đã tiến hành nghiên cứu trên cây có múi, cà phê, táo, cà chua và phát hiện sự ra rễ của chúng rất thuận lợi và sạch bệnh khi trồng trong điều kiện phun mù dinh dưỡng cho bộ phận dưới mặt đất Went, F.W (1957) đã đưa ra thuật ngữ khí canh (aeroponic)

để chỉ các quá trình sinh trưởng của bộ rễ trong không khí Đến năm 1970, với công nghệ nhà kính đã phát triển, các công ty hướng tới việc ứng dụng công nghệ khí canh để nhân giống cây trồng phục vụ mục đích thương mại Năm

1983, Richard J Stoner ở đại học Colorado Mỹ lần đầu tiên đã đưa ra và áp dụng thành công công nghệ khí canh để nhân giống cấy trồng bằng cách sử dụng việc phun dinh dưỡng kèm chất kích thích ra rễ ngắt quãng cho phần gốc của cành giâm trong các hộp nhân giống 20 lần/giờ (Richard J Stoner, 1983) Công nghệ đã được tác giả liên tục nghiên cứu hoàn thiện cho phép ra đời một công nghệ mới gọi là công nghệ RPB (Rapid Propagation Biotechnology) Công nghệ này được xem như là bước đột phá trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất giống

vô tính cây trồng Các nhà nhân giống in vitro gọi kỹ thuật này là thế hệ mới của công nghệ nhân giống và cho rằng đây sẽ là phương pháp nhân giống vô tính cây trồng quan trọng của thế kỷ 21 Kỹ thuật này có thể thay thế phương pháp nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào do có lắp đặt hệ thống lọc khử trùng dung dịch và không khí buồng trồng Toàn bộ các khâu điều khiển pH, độ

EC của dung dịch, nhiệt độ của dung dịch và môi trường đều được tự động hóa nhờ các phần mềm chuyên dụng Công nghệ này là sự phối hợp giữa công nghệ sinh học, công nghệ tin học, công nghệ vật liệu mới và công nghệ tự động hóa Công nghệ này cho phép nhân được nhiều loại cây trồng, chu kỳ nhân giống nhanh hơn nhiều hơn, công suất tăng 30 lần so với kỹ thuật truyền thống, loại bỏ khâu khử trùng (môi trường, mẫu vật) rất phức tạp trong nuôi cấy mô, tiết kiệm lao động, vật liệu, giảm giá thành Có thể nêu ví dụ việc ứng dụng công nghệ này trong sản xuất củ giống khoai tây: công nghệ “Quantum Tubers biotechnology” là công nghệ có tính cách mạng, hoàn toàn, mới mẻ trong lĩnh

vực sản xuất giống khoai tây Công nghệ này cho phép sản xuất hoàn toàn chủ động trên diện tích nhỏ được một lượng khổng lồ củ giống khoai tây chất lượng cao, số lượng củ giống có thể tăng từ 600% - 1400% so với phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô và trồng trong nhà màn Công suất của hệ thống này lớn hơn bất kể một hệ thống sản xuất giống nào hiện có (info.quantum TubersTM.com)

Hàng trăm loài cây trồng đã được nghiên cứu nhân giống và thương mại hóa thành công bằng phương pháp trên Công nghệ này cũng rất hiệu quả đối với những cây có khả năng ra rễ kém Hiện nay trên toàn cầu đã có trên 1500 cơ

sở lắp đặt và sử dụng thiết bị RPB kể trên để nhân giống cây trồng đặc biệt là khoai tây chủ yếu là ở các cơ sở hợp tác với Mỹ Việc sản xuất cây giống và cà chua thương phẩm, khi áp dụng công nghệ này đã rút ngắn thời gian tạo cây giống (từ 28 ngày xuống còn 10 ngày), thời gian cho thu hoạch lần đầu (từ 68 ngày xuống còn 30 ngày) qua đó làm tăng số vụ trồng/năm trồng trong nhà kính

từ 3,4 lên 7,7 lần (http//www.biocontrols.com, 2006)

Hơn nữa hệ thống khí canh lại được ứng dựng một cách thành công trên đối tượng cây lấy củ đặc biệt trên đối tượng khoai tây Các tác giả Dong Chil Chang và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp của vùng rễ đến

sự hình thành củ cây khoai tây trồng trong khí canh và nhận thấy nhiệt độ thấp của vùng rễ có ảnh hưởng rõ rệt đến số củ hình thành Vụ đông có thể cho 20-24 củ/cây (giống Superior) trong khi vụ hè chỉ thu được 6-12 củ/cây

Tuy nhiên những công bố mang tính quy trình sản xuất khoai tây còn rất hạn chế vì đó là những bí quyết công nghệ mang tính bản quyền

Có thể nói, công nghệ nhân giống bằng khí canh là công nghệ có tính đột phá trong lĩnh vực nhân giống cây trồng và là công nghệ của nền nông nghiệp công nghiệp hoá Tuy nhiên công nghệ này bao gồm cả thiết bị và quy trình công nghệ vẫn là những bí quyết không tuỳ tiện công bố và chuyển giao Việc nghiên cứu, tìm hiểu và làm chủ công nghệ trên, cải tiến và áp dụng thành công

ở Việt Nam là vấn đề hết sức cần thiết

Hệ thống này cũng được Viện Sinh học Nông nghiệp – trường đại học nông nghiệp nghiên cứu, chế tạo và áp dụng thành công đểsản xuất giống khoai

tây hoàn thiện quy trình khép kín từ nhân giống in vitro đến tạo củ giống nguyên

chủng cho sản xuất khoai tây thương phẩm và nhân nhanh một số giống cây trồng (cẩm chướng, cà chua,… ) (đề tài cấp nhà nước KC04)

2.4 Tình hình nghiên cứu cây Hoàng liên gai trong và ngoài nước

Trên thế giới đã có rất nhiều những công trình nghiên cứu về các loại cây thuốc quý trong đó các loài thuộc chi Berberis được nghiên cứu khá nhiều Theo tài liệu điều tra của Viện Môi trường và phát triển Himalaya -Ấn Độ, bộ lạc Apatani của Arunachal Pradesh, phía đông dãy Himalaya đã sử dụng 158 loài

cây thuốc, trong đó có Hoàng liên gai (Berberis wallichiana) và có khoảng 52

loại bệnh được chữa khỏi bằng cách sử dụng 158 loài cây thuốc này

Nokes (1986) đã kết luận rằng thật khó để tạo rễ để tạo rễ khi sử dụng các

kỹ thuật truyền thống, có thể nhân nhanh bằng hạt nhưng có thể thu được những biến đổi không mong muốn về gen

Tiếp sau đó, Karhu and Hakala (1991) đã thành công trong nuôi cấy

Berberis thunbergii DC., Họ đã khẳng định rằng BA có thể làm tăng khả năng

tạo chồi, môi trường thích hợp ra rễ là môi trường không bổ sung auxin

Trường đại học Texas A&M Nuôi cấy chồi từ cây Berberis trifoliata Moric Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng môi trường nuôi cấy cơ bản cho Berberis trifoliata Moric đó là môi trường WPM (woody plant medium)

MS (salts and Murashige and Skoog vitamins) có chứa 30 g/L–sucrose, 0.8% Phytagar, 11.1 µM BA Cytokinins (benzyladenine, kinetin, and thidiazuron), giai đoạn cấy chuyển và tuổi mẫu nuôi cấy cũng được nghiên cứu Môi trường nhân nhanh là môi trường WPM có bổ sung 5.5 µM BA , chồi được sử dụng là chồi được trải qua giai đoạn tiền nuôi cấy 4 tuần Tuổi cây không tác động đến khả năng nhân nhanh chồi nhưng lại ảnh hưởng đến khả năng ra rễ Các thí nghiệm ban đầu về 1.0 µM NAA cho thấy gần như 100% chồi dưới 6 tháng tuổi

ra rễ Trên môi trường cơ bản có bổ sung NAA (5.4 µM), 68% chồi ra

rễ.(Francisco et al 1996)Berberis tinctoria Lesch là một cây trồng bản địa của

ở vùng núi cao Nilgiris, cây này có giá trị làm thuốc rất cao Để nâng cao hiệu quả nhân nhanh có thể sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô Các môi trường sử dụng là môi trường có bổ sung 0,5mg/l BAP và 0,5mg/l NAA cho tỷ lệ tạo callus cao nhất, môi trường nhân nhanh chồi là môi trường có bổ sung 0.5 mg/1 BAP, môi trường có bổ sung 1mg/l NAA là môi trường thích hợp để tạo rễ (Paulsamy, et

al 2004)

Cácnhàkhoa học thuộc phòng Khoa học thực vật, Đại

thìgiống Berberis thunbergii DC không chỉ là một loại cây thuốc quý mà còn là

một trong nhữngloại cây bụi trồng vườn phổ biến nhất ở Hoa kỳ Chỉ riêng ở

Connecticut, giá trị bán lẻ hàng năm của Berberis thunbergii D C là 5 triệu đô

la (Heffernan, 2005) Tuy nhiên, các giống trồng lại khó khăn trong việc xác

định do được bày bán dưới nhiều tên Ví dụ như Berberis thunbergii ‘Crimson

Pygmy’ được bày bán dưới cái tên B thunbergii ‘Little Gem’, B thunbergii

‘Little Beauty’, B thunbergii ‘Little Favorite’, và B thunbergii ‘Atropurpurea

Nana’ Tại Canada, việc xác định đúng giống cây trồng là cần thiết để ngăn chặn

việc nhập khẩu các giống dễ bị gỉ B thunbergii kể từ khi những giống nhập vào

có khả năng mang các loại nấm mà nguyên nhân gốc gây bệnh gỉ sắt trong các cây ngũ cốc (Gardner, 2006) Chính vì thế các nhà khoa học Mỹ đã tiến hành sử dụng 174 marker phân tử AFLP để phân biệt sự khác nhau giữa 43

giống Berberis thunbergiivà phân tích sự tương đồng di truyền của 62 kiểu gen Berberis thunbergii,Berberis julianae, Berberis Koreana, Berberis vulgaris,

Berberis vulgaris Atropurpurea

Đối với bảy giống Berberis thunbergii ‘Crimson Pygmy’ nhập từ nhiều

nguồn khác nhau thông qua kỹ thuật AFLP cho thấy hệ số tương đồng cao, trong

đó những giống Berberis thunbergii ‘Crimson Pygmy’, ‘Crimson Dwarf’, và

‘Monomb’ Cherry Bomb™ dường như chỉ có một kiểu gen Các giống Berberis

thunbergii ‘Concorde’ và ‘Criruzam’ Crimson Ruby™ có thể cùng một kiểu

gen với giống Berberis ottawensis… Các kết quả nghiên cứu là chìa khoá có thể được sử dụng để đảm bảo rằng chỉ các giống đủ quy phạm pháp luật mới được bán và đồng thời ngăn chặn việc nhập khẩu nhạy cảm các giống gỉ vào Canada.(JESSICA D LUBELL, et al., 2007)

Berberis buxifolia Lam là một loại cây bụi có tầm quan trọng rất

lớn do sớm được ứng dụng trong y học và làm thuốc nhuộm Các nhà khoa học

Argentina đã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro loại cây này và kết quả

nghiên cứu cho thấy: trên môi trường MS có bổ sung 0,55µM BA cho hệ số nhân đạt 1:4.7 ở ngày thứ 63 Chồi thu được trên môi trường MS chứa một nửa hàm lượng muối đa lượng Nuôi cấy chồi với chu kỳ 4 ngày tối sẽ bắt đầu cho ra

rễ, khoảng 7 ngày nếu trên môi trường có bổ sung 1.25µM IBA, khoảng 28 ngày nếu môi trường không có IBA, cho tỷ lệ ra rễ đạt 80% Như vậy hoàn toàn có

thể nhân in vitro giống Berberis buxifolia Lam (Arena ME et al.,2000)

Các nhà khoa học của Ba Lan lại nghiên cứu theo hướng tìm hiểu ảnh hưởng của các loại cắt đến quá trình tạo rễ trong việc lựa chọn các giống thuộc chi Berberis nhằm xác định hiệu quả của phương pháp cắt đến tỷ lệ ra rễ và chất

lượng hệ thống rễ Đối tượng nghiên cứu là hai giống Berberis julianae và

Berberis verruculosa Đây là giống phát triển rất thích hợp với điều kiện khí hậu

của Ba Lan Họ tiến hành cắt gốc ở cây mẹ 7 tuổi, một nửa mẫu được loại bỏ gai trước khi cấy, các hộp cắt gốc được đặt trong nhà kính và sau 7 tháng sẽ đánh giá tỷ lệ ra rễ và chất lượng hệ thống rễ tạo ra Kết quả nghiên cứu cho thấy: hầu

hết các gốc cắt của giống Berberis julianae đều ra rễ thành công, (trung bình

đạt 94%) và việc loại bỏ gai không ảnh hưởng tới tỷ lệ ra rễ, số rễ chịu ảnh

hưởng của chiều dài đoạn cắt Giống Berberis verruculosa có tỷ lệ ra rễ thấp

hơn (44-52%), tỷ lệ những cành giâm không gai hình thành rễ cao hơn.(Urszula Puczel, 2008)

Bên cạnh những nghiên cứu các giống thuộc chi Berberis với mục đích tạo giống trồng vườn làm cảnh cũng có không ít các nghiên cứu đi sâu tìm hiểu

về các đặc tính sinh lý sinh hoá của các giống thuộc chi này Đã từ lâu các nhà

khoa học thuộc Viện Thực vật học Hán Vũ-Trung Quốc tiến hành nghiên cứu và báo cáo những thay đổi tích lũy chất khô và protein hòa tan cũng như sự oxi

hoá trong quá trình nuôi cấy đình chỉ các tế bào Berberis julianae Schneid Báo

cáo đã chỉ rõ các quá trình tích lũy chất khô có thể được chia thành bốn giai đoạn: giai đoạn tụt hậu; giai đoạn tăng trọng lượng chậm; giai đoạn tăng trọng lượng tuyến tính; và giai đoạn giảm Sau khi cho các tế bào vào môi trường mới thì sự sinh tổng hợp protein tăng nhanh chóng trong vòng 2-5 ngày, sau đó giảm dần

Tại Việt Nam, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) vào đầu năm 2006, công bố đã hoàn chỉnh quy

trình nhân nhanh sinh khối mô của cây Hoàng Liên gai (BerberisWallichiama

DC) bằng công nghệ tế bào thực vật để làm nguồn dược liệu sản xuất thuốc berberine

Để đáp ứng nhu cầu sản xuất thuốc, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học đã lấy quả xanh của cây Hoàng Liên gai tại vùng núi Sapa, tách lấy phôi và đưa vào nuôi cấy mô Chỉ trong một thời gian rất ngắn (khoảng 6 tuần) sinh khối thu được từ rễ cây Hoàng Liên gai tăng gấp gần 10 lần so với lượng

mô ban đầu Quan trọng hơn là trong khối tế bào này vẫn chứa berberine có chất lượng và hàm lượng tương đương với rễ của cây Hoàng Liên gai tự nhiên Ở môi trường tự nhiên, cây Hoàng Liên gai muốn thu hoạch được phải mất thời gian ít nhất là 3 năm

Có thể nhận thấy những nghiên cứu về các giống thuộc chi Berberies là rất phong phú nhưng những nghiên cứu chuyên sâu trên giống Hoàng liên gai còn rất khiêm tốn cả ở trong nước và trên thế giới

PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng: Hoàng liên gai, mẫu được thu thập tại Sapa-Lào cai

Hoàng liên gai Phân loại khoa học

Giới (regnum): Plantae

Ngành (divisio): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Ranunculales

Họ (familia): Berberidaceae

Chi (genus): Berberis

Loài (species): B julianae

Tên hai phần

Berberis julianae SCHNEID

- Môi trường: Murashige & Shoog (1962)

- Các chất điều tiết sinh trưởng: BA, αNAA,…

- Thiết bị khí canh do Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội cung cấp

- Dung dịch dinh dưỡng: dinh dưỡng khí canh do Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội chế tạo, dung dịch dinh dưỡng Woodplant

Thời gian: 07 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012

Địa điểm: Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại Học Nông Nghiệp

Hà Nội – Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội; Sapa – Lào Cai

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu

‐ Điều tra thu thập nguồn gen cây Hoàng Liên gai tại Lào Cai

‐ Nghiên cứu đánh giá giá trị dược lý của mẫu giống Hoàng liên gai thu thập được

‐ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất auxin xử lý kích thích ra rễ cành giâm nhằm tạo vật liệu sớm đưa vào thử nghiệm trồng khí canh

‐ Nghiên cứu phương pháp tạo nguồn vật liệu bằng gieo hạt in vitro

‐ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường, của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh in vitro cây Hoàng liên gai

‐ Nghiên cứu xác định tiêu chuẩn cây in vitro thích hợp đưa vào trồng trong khí canh

Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Hà Nội

‐ Nghiên cứu khả năng nhân giống in vivo cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Hà Nội

‐ Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của dung dịch dinh dưỡng đặc hiệu (thành phần dinh dưỡng, pH, EC,…) tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội

‐ Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của chế độ phun dinh dưỡng tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội

‐ Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng tới

sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gaitại Hà Nội

‐ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố ngoại cảnh (nhiệt độ môi trường, ánh sáng) tới sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội

‐ Nghiên cứu biện pháp thu hoạch sinh khối rễ cây Hoàng liên gai để tăng năng suất trong khí canh tại Hà Nội

Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sa Pa

‐ Nghiên cứu khả năng nhân giống in vivo cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sa Pa

‐ Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gaitại Sa Pa

‐ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố ngoại cảnh (nhiệt độ môi trường, ánh sáng) của vùng Sa Pa tới sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gaitại Sa Pa

‐ Đánh giá khả năng tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai trong khí canh

so với trồng địa canh tại Sa Pa

Nội dung 4: Nghiên cứu thu hoạch, đánh giá các hoạt chất làm thuốc của nguồn sinh khối tạo ra

‐ Nghiên cứu thu hoạch sản phẩm: (thời gian, sản phẩm, cách thu hoạch 1 lần hoặc nhiều lần)

‐ Nghiên cứu phân tích đánh giá các hoạt chất làm thuốc trong rễ cây Hoàng liên gai tạo ra bằng khí canh và nguồn trong tự nhiên

3.3 Các phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thu thập và xử lý thông tin được truy cập từ các kênh thông tin trong và ngoài nước về đặc điểm thực vật học, phân loại, phân bố của loài cây thuốc

quý; các công nghệ và thiết bị sản xuất các giống cây quý hiếm in vitro và in vivo

- Phương pháp điều tra trực tiếp kết hợp với thu thập thông tin của Trạm cây thuốc Sa Pa và phỏng vấn trực tiếp người dân tại nơi điều tra

- Tham khảo những tư vấncủa chuyên gia: thu thập thông tin và kinh nghiệm của các chuyên gia trong và ngoài nước trong việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ khí canh để nhân giống và sản xuất các loại cây trồng quý hiếm

- Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành: Các mẫu Hoàng liên gai sau khi khử

trùng được được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung các chất điều

tiết sinh trưởng Các mẫu được đặt trong phòng nuôi theo chế độ nhiệt độ là

220C, cường độ chiếu sáng 3000-4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/ngày

- Phương pháp trồng cây bằng công nghệ khí canh

- Phương pháp phân tích hoạt chất (phương pháp HPTLC, HPLC theo Viện Dược liệu)

- Phương pháp bố trí thí nghiệm (cụ thể theo từng nội dung nghiên cứu)

+ Sử dụng các phương pháp nghiên cứu nông học để đánh giá tình trạng sinh trưởng, phát triển và năng suất của đối tượng nghiên cứu

+ Sử dụng các thiết bị đo đếm các thông số về điều kiện ngoại cảnh (nhiệt

độ, ánh sáng, độ ẩm) trong và ngoài nhà sản xuất

+ Sử dụng kỹ thuật phân tích các thành phần dược liệu

3.5 Bố trí thí nghiệm

3.5.1Nội dung 1: Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu

Thí nghiệm 1: Điều tra thu thập nguồn gen cây Hoàng liên gai tại Lào Cai

- Thu thập thông tin thông qua Trạm Cây thuốc tại Sa Pa

- Tiến hành khảo sát thực tế tại các điểm có sự phân bố hiện diện của cây Hoàng liên gai để đánh giá hiện trạng trong tự nhiên

- Khảo sát đánh giá thực tế việc khai thác, tiêu thụ sản phẩm cây Hoàng liên gai tại địa bàn Sa Pa

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu đánh giá giá trị dược lý của mẫu giống Hoàng liên gai thu thập được

Tiến hành thu thập mẫu Hoàng liên gai trong tự nhiên và đem đi phân tích hàm lượng berberin tại Viện Dược liệu

Lượng cây mẫu gửi: 50 cây (0,86kg)

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất auxin xử lý kích thích ra rễ cành giâm nhằm tạo vật liệu sớm đưa vào thử nghiệm trồng khí canh

Công thức 1: Không xử lý αNAA

Công thức 2: Xử lý cành giâm bằng αNAA nồng độ 1000ppm

Công thức 3: Xử lý cành giâm bằng αNAA nồng độ 2000ppm

Công thức 4: Xử lý cành giâm bằng αNAA nồng độ 3000ppm

Công thức 5: Xử lý cành giâm bằng αNAA nồng độ 4000ppm

Bố trí thí nghiệm:

Mỗi Công thức tiến hành trên 50 cành giâm, tiến hành theo dõi điểm 9 cành, đánh giá tỷ lệ ra rễ của cành giâm của các công thức

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Ngày ra rễ sau giâm

- Tỷ lệ ra rễ của cành giâm

- Số lượng rễ ra trên mỗi cành giâm

- Chiều dài rễ của các cành giâm sau một khoảng thời gian

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu phương pháp tạo nguồn vật liệu bằng gieo hạt in vitro

Hạt, đoạn thân mang mắt ngủ của cây Hoàng liên gai được thu thập từ vùng núi Sapa được sử dụng làm vật liệu tạo nguồn vật liệu in vitro ban đầu

Thí nghiệm 4 1:Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ khử trùng khác nhau đến

tỷ lệ sống của các vật liệu vào mẫu in vitro

- Công thức 1: Khử trùng 1 lần với HgCl2 0,1% trong 5 phút

- Công thức 2: Khử trùng lần 1 với HgCl2 0,1% trong 2 phút và lần 2 với dung dịch Johnson trong 5 phút

- Công thức 3: Khử trùng lần 1 với dung dịch Johnson trong 5 phút và lần 2 với Johnson trong 10 phút

Thí nghiệm 4 2:Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường khác nhau đến

sự tạo chồi các mẫu nuôi cấy

Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường khác nhau đến sự nảy mầm của hạt gieo

- Công thức 1: sử dụng nước cất vô trùng

- Công thức 2: sử dụng môi trường MS lỏng

- Công thức 3: sử dụng môi trường MS có bổ sung agar

Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường khác nhau đến sự cảm ứng bật chồi của đoạn thân

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng nhân giống in vivo cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Hà Nội

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích ra rễ α – NAA đến khả năng

hình thành rễ mới trong điều kiện khí canh tại Hà Nội

CT1 (Đ/C) : không xử lý xử α – NAA

CT2 : xử lý cành giâm bằng α – NAA nồng độ 1000ppm

CT3 : xử lý cành giâm bằng α – NAA nồng độ 2000ppm

- Số rễ trung bình tạo ra sau những khoảng thời gian trồng khác nhau

Chiều dài rễ trung bình: Tính từ gốc rễ đến đầu mút của rễ

Thí nghiệm 2:Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của dung dịch dinh dưỡng đặc hiệu (thành phần dinh dưỡng, pH, EC,…) tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội

Thí nghiệm 2.1:Xác định loại dung dịch dinh dưỡng thích hợp cho cây Hoàng liên gai trồng trong khí canh

- CT1: Sử dụng dung dịch dinh dưỡng Woodplant

- CT2: Sử dụng dung dịch dinh dưỡng dùng cho khí canh của Viện Sinh học Nông nghiệp nghiên cứu ra

Thí nghiệm 2.2: Xác định mức EC thích hợp nhất cho sự sinh trưởng phát triển

và tạo sinh khối rễ cây Hoàng liên gai trồng trong khí canh

- Công thức 1: Đặt dung dịch dinh dưỡng ở mức EC = 1000µs/cm

- Công thức 2: Đặt dung dịch dinh dưỡng ở mức EC = 1300µs/cm

- Công thức 3: Đặt dung dịch dinh dưỡng ở mức EC = 1600µs/cm

- Công thức 4: Đặt dung dịch dinh dưỡng ở mức EC = 1900µs/cm

- Khả năng tái sinh rễ của cây

- Tốc độ ra lá, phát triển chiều cao và ra rễ của cây

- Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của chế độ phun dinh dưỡng tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai tại Hà Nội

- Công thức 1: Phun 15 giây, nghỉ 10 phút

- Công thức 2: Phun 15 giây, nghỉ 15 phút

- Công thức 3: Phun 15 giây, nghỉ 20 phút

Bố trí thí nghiệm

Mỗi thời vụ tiến hành trên 50 cây, đánh giá tỷ lệ sống của cây, tiến hành theo dõi 9 cây để đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây

Các chỉ tiêu theo dõi

- Khả năng ra rễ và thời điểm ra rễ sau trồng

- Tốc độ ra lá và ra rễ của cây

- Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng tới sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gaitại Hà Nội

- Công thức 1: Không điều khiển nhiệt độ dung dịch

- Công thức 2: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 15OC

- Công thức 3: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 20OC

- Công thức 4: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 25OC

Bố trí thí nghiệm:

Mỗi công thức tiến hành trên 15 cây, các cây được trồng trên hệ thống khí canh do Viện Sinh học nông nghiệp – Đại học Nông nghiệp Hà nội thiết kế.Các cây sẽ được theo dõi và đánh giá tỷ lệ sống, khả năng sinh trưởng phát triển cũng như khả năng tạo sinh khối rễ

Các chỉ tiêu theo dõi

- Nhiệt độ dung dịch của các công thức

- Khả năng sống

- Khả năng ra rễ và thời điểm ra rễ sau trồng

- Tốc độ ra lá và ra rễ của cây

- Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố ngoại cảnh (nhiệt độ môi trường, ánh sáng) tới sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gaitại

Hà Nội

- Thời vụ 1: Trồng vào mùa thu (tháng 08/2011)

- Thời vụ 2: Trồng vào mùa đông (tháng 11/2011)

- Thời vụ 3: Trồng vào mùa xuân (tháng 2/2012)

- Thời vụ 4: Trồng vào mùa hè (tháng 5/2012)

Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu biện pháp thu hoạch sinh khối rễ cây Hoàng liên gai để tăng năng suất trong khí canhtại Hà Nội

Nội dung nghiên cứu:

Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần thu hoạch đến sản lượngsản lượng rễ cây Hoàng liên gai trồng bằng hệ thống khí canh

- Công thức 1: Thu 1 lần sau trồng 10 tháng

- Công thức 2: Thu 2 lần sau trồng 8 tháng và 10 tháng

- Công thức 3: Thu 3 lần sau trồng 6 tháng, 8 tháng, 10 tháng

Bố trí thí nghiệm:

- Mỗi công thức tiến hành trên 15 cây, theo dõi và thu hoạch để đánh giá khối lượng rễ tươi đạt được và khối lượng rễ sau khi sấy khô

- Mỗi lần thu hoạch tiến hành cắt 50% số rễ của 1 bên

Các chỉ tiêu theo dõi

- Khối lượng rễ tươi thu được ở các thời điểm khác nhau

- Khối lượng rễ khô thu được tương ứng tại các thời điểm đó

3.5.3 Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng sản xuất sinh khối và một số giải pháp tăng cường năng suất sinh khối cây hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sapa

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng nhân giống in vivo cây Hoàng liên gai bằng công nghệ khí canh tại Sa Pa

Thí nghiệm nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng

α – NAA đến khả năng hình thành rễ mới trong điều kiện khí canh tại Sapa CT1 (Đ/C) : không xử lý α – NAA

- Số rễ trung bình tạo ra sau những khoảng thời gian trồng khác nhau

- Chiều dài rễ trung bình: Tính từ gốc rễ đến đầu mút của rễ

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của nhiệt độ dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng phát triển và tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên

gaitại Sa Pa

- Công thức 1: Không điều khiển nhiệt độ dung dịch

- Công thức 2: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 15OC

- Công thức 3: Đặt nhiệt độ dung dịch ở 25OC

Bố trí thí nghiệm:

Mỗi Công thức tiến hành trên 20 cây, đánh giá tỷ lệ sống của cây, tiến hành theo dõi 9 cây để đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây cũng như khả năng tạo sinh khối rễ

Các chỉ tiêu theo dõi

- Nhiệt độ dung dịch của các công thức

- Khả năng sống

- Khả năng ra rễ và thời điểm ra rễ sau trồng

- Tốc độ ra lá và ra rễ của cây

- Sinh khối rễ của cây tạo ra trong khí canh

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố ngoại cảnh (nhiệt độ môi trường, ánh sáng) của vùng Sa Pa tới sự sinh trưởng phát triển của cây Hoàng liên gaitại Sa Pa

Tiến hành bố trí trồng cây Hoàng liên gai trên hệ thống khí canh tại Sa Pa, theo dõi sự biến động của điều kiện ngoại cảnh cũng như sự sinh trưởng phát

triển của cây qua các mùa khác nhau để đánh giá sự ảnh hưởng của ngoại cảnh

Các chỉ tiêu theo dõi

- Sự ra rễ của cây trong các mùa

- Sự lá mới của cây trong các mùa

- Sự tăng trưởng chiều cao của cây trong các mùa

Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng tạo sinh khối rễ của cây Hoàng liên gai trong khí canh so với trồng địa canh tại Sa Pa

Bố trí thí nghiệm: Tiến hành trồng 50 cây, theo dõi điểm 9 cây

Các chỉ tiêu theo dõi

- Ngày ra rễ sau trồng trên khí canh (ngày)

- Ngày ra lá mới sau trồng trên khí canh (ngày)

- Chiều cao cây (cm)

- Chiều dài rễ (cm)

- Số lá (lá/cây)

- Số rễ (rễ/cây)

- Số đốt (đốt/cây)

- Khối lượng rễ (g/cây)

3.5.4.Nội dung 4: Nghiên cứu thu hoạch, đánh giá các hoạt chất làm thuốc của nguồn sinh khối tạo ra

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu thu hoạch sản phẩm: (thời gian, sản phẩm, cách thu hoạch 1 lần hoặc nhiều lần)

Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến sản lượng

rễ cây Hoàng liên gai trồng bằng hệ thống khí canh

- Công thức 1: Thu 1 lần sau trồng 6 tháng

- Công thức 2: Thu 1 lần sau trồng 9 tháng

- Công thức 3: Thu 1 lần sau trồng 12 tháng

- Công thức 1: Thu 1 lần sau trồng 12 tháng

- Công thức 2: Thu 2 lần sau trồng 9 tháng và 12 tháng

- Công thức 3: Thu 3 lần sau trồng 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng

Bố trí thí nghiệm:

Mỗi công thức tiến hành trên 15 cây, theo dõi và thu hoạch để đánh giá khối lượng rễ tươi đạt được và khối lượng rễ sau khi sấy khô

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Khối lượng rễ tươi thu được ở các thời điểm khác nhau

- Khối lượng rễ khô thu được ứng tại các thời điểm đó

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu phân tích đánh giá các hoạt chất làm thuốc trong

rễ cây Hoàng liên gai tạo ra bằng khí canh và nguồn trong tự nhiên

Gửi mẫu rễ cho Viện Dược liệu để phân tích so sánh nồng độ hoạt chất Berberin có trong rễ cây hoàn liên gai tạo ra bằng hai phương pháp khác nhau (khí canh và nguồn trồng trong điều kiện tự nhiên)

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu

4.1.1 Kết quả điều tra thu thập nguồn gen cây Hoàng liên gai tại Lào Cai

Qua thực tế điều tra cho thấy hiện nay cây Hoàng liên gai đã bị khai thác đến cạn kiệt Trước đây, Hoàng liên gai (còn gọi là Hoàng mù) được người dân khai thác và bán sản phẩm thân sễ tại các chợ ở địa bàn Sa Pa với tên gọi là cây mật gấu Tuy nhiên, đây chưa phải là nguyên nhân chính dẫn đến cây Hoàng liên gai bị suy giảm nghiêm trọng và cạn kiệt Nguyên nhân chính là do gần đây người dân (chủ yếu là đồng bào dân tộc thiểu số) tại địa bàn Huyện Sa Pa đã tiến hành khai thác triệt để để bán cho thương lái Trung Quốc Theo thông tin được cung cấp bởi KS Lê Văn Nhân – Trạm trưởng Trạm Cây thuốc Sa Pa, hiện nay ngoài tự nhiên cây Hoàng liên gai chỉ còn với số lượng rất ít Chủ yếu tập trung

ở 2 khu vực chính là Ô Quy Hồ và Tả Phìn – Sa Pa

Thực tế khảo sát, chúng tôi nhận thấy hiện tại đúng như thông tin đã được tham khảo từ Trạm Cây thuốc Sa Pa Khi khảo sát tại một số địa bàn cụ thể như

Ô Quy Hồ, Tả Phìn, Sa Pả, Tả Giàng Phình, Trung Lèng Hồkết quả chỉ còn thấy

ở 2 khu vực chính là Ô Quy Hồ và Tả Phìn trong đó tập trung chủ yếu là ở Ô Quy Hồ

Về hiện trạng cây Hoàng liên gai, qua khảo sát thực tế cho thấy chúng mọc chủ yếu ở khe đá trên các vách núi Những cá thể phát hiện và tìm ra phần lớn là các chồi mọc từ gốc cây cũ đã bị đốn hạ (do bà con dân tộc đã khai thác bằng cách chặt sát gốc) Có một tỷ lệ nhỏ (chiếm khoảng 35%) là cây con mọc

từ hạt có tuổi đời từ 2-3 năm (theo nhận định của cán bộ Trạm Cây thuốc) có chiều cao khoảng 25-35cm Việc phát hiện ra một tỷ lệ cây con nhất định còn tồn tại ngoài tự nhiên, theo nhận định của cán bộ Trạm Cây thuốc Sa Pa nguyên nhân chính là do cây nhỏ, việc khai thác, tìm kiến mất nhiều thời gian và số lượng thu thập được trong một ngày không nhiều nên đã có sự trùng xuống

trong việc tận thu khai thác của người dân chứ không phải là do đã có chính

sách bảo vệ và quản lý tốt

Theo đánh giá của Anh Lê Văn Giỏi – Cán bộ Trạm Cây thuốc Sa Pa thì cây Hoàng liên gai có thể cho khai thác hiệu quả với hàm lượng hoạt chất berberin đảm bảo khi đạt 8-10 năm tuổi Như vậy, với thực trạng này nếu không

có chính sách bảo vệ và kiểm soát tốt thì trong 5-6 năm tới cây Hoàng liên gai sẽ lại tiếp tục bị khai thác kiệt quệ và với đã này thì một thời gian không xa nữa sẽ mất dạng hẳn cây Hoàng liên gai ở ngoài tự nhiên do không kịp tái sinh

Hiện nay tại Trạm Cây thuốc Sa Pa đang có 12 cá thể cây hoàng liên gai đang được trồng bảo tồn và lưu giữ nguồn gen tại chỗ với các độ tuổi khác nhau (từ 5-12 năm tuổi) Những cây này xét về tiêu chuẩn thì đã đảm bảo cho việc tạo

ra một lượng hạt giống tốt để phục vụ cho việc nhân và trồng trọt trở lại trong điều kiện tự nhiên Tuy nhiên, để việc này được thực hiện thuận lợi thì nhất thiết cần phải có sự can thiệp và chung tay của các cấp chính quyền, các đơn vị, cơ quan nghiên cứu và bảo tồn phát triển nguồn gen thực vật

Kết luận:Từ điều tra trên ở Sa Pa – Lào Cai, cây Hoàng liên gai chủ yếu tập trung ở 2 vùng Tả Phìn và Ô Quy Hồ, trong đó phần lớn là ở Ô Quy

từ hạt có tuổi đời từ 2-3 năm (theo nhận định của cán bộ Trạm Cây thuốc) có chiều cao khoảng 25-35cm Việc phát hiện ra một tỷ lệ cây con nhất định còn tồn tại ngoài tự nhiên, theo nhận định của cán bộ Trạm Cây thuốc Sa Pa nguyên nhân chính là do cây nhỏ, việc khai thác, tìm kiến mất nhiều thời gian và số lượng thu thập được trong một ngày không nhiều nên đã có sự trùng xuống

trong việc tận thu khai thác của người dân chứ không phải là do đã có chính

sách bảo vệ và quản lý tốt

Sau khi thu thập được mẫu cây Hoàng liên gai từ Sapa chúng tôi tiến hành

xác định giá trị dược lý các hoạt chất có trong thân và rễ cây Hoàng liên gai thu

được Kết quả thu được như sau:

Bảng 1 Kết quả đánh giá hàm lượng berberin trong cây Hoàng liên gai thu

thập được ngoài tự nhiên (tại Sapa-Lào Cai)

Hàm lượng berberin trong rễ 3,6%

Theo các tài liệu thì hàm lượng berberin trong cây Hoàng liên gai khoảng

3-5% Như vậy có thể thấy rằng khi cây Hoàng liên gai thu hoạch ở độ tuổi 2- 3

năm thì hàm lượng berberin chưa đạt tối đa Thời gian thu hoạch kéo dài cộng

với sự khai thác quá mức đã làm cho cây Hoàng liên gai ngày càng khan hiếm

Vì vậy, vấn đề duy trì và bảo tồn nguồn gen thuốc quý này cần được các cơ quan

chức năng quan tâm

Như vậy cácmẫu Hoàng liên gai thu thập được tại Sapa đều có độ tuổi

2-3 năm tuổi, hàm lượng berberinchứa trong thân lá 3,3%, và trong rễ là

3,6%

4.1.3Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất auxin xử lý kích

thích ra rễ cành giâm nhằm tạo vật liệu sớm đưa vào thử nghiệm trồng khí

canh

Cây Hoàng liên gai về bản chất là một cây có dầu, chính vì vậy khi thu

thập mẫu cây từ ngoài tự nhiên về nếu không đưa vào tiến hành thí nghiệm kịp

thời lá cây sẽ chuyển sang màu nâu đen và rụng rất nhanh chóng trong khoảng

thời gian > 24h sau khi nhổ khỏi đất Xác định được những khó khăn đó nên

việc tiến hành thí nghiệm đã được triển khai hết sức nhanh chóng và khẩn trương

Thực hiện xử lý chất điều tiết sinh trưởng αNAA với các nồng độ khác nhau chúng tôi thu được kết quả nghiên cứu như sau:

Khi không xử lý chất điều tiết sinh trưởng αNAA thì cành giâm hoàn toàn không ra rễ và đều bị chết Vậy có nghĩa là với cây Hoàng liên gai, không thể tiến hành nhân in vivo (giâm cành) nếu không có can thiệp của chất điều tiết sinh trưởng αNAA

Khi xử lý cành giâm bằng chất điều tiết sinh trưởng αNAA nồng độ 1000ppm chúng tôi thu được kết quả tỷ lệ ra rễ của cành giâm đã đạt đến 55,56% Đây là một con số đáng khích lệ khi so với không xử lý αNAA thì không có một cành giâm nào ra rễ Với nồng độ αNAA 1000ppm thì cành Hoàng liên gai ra rễ sau giâm bình quân 30,8 ngày Đến thời điểm 40 ngày sau giâm, số rễ bình quân đạt 2,6 rễ/cành và chiều dài rễ đạt bình quân 2,4cm/rễ

Tiếp tục tiến hành xử lý ngọn giâm bằng αNAA ở nồng độ 2000ppm, kết quả thu được về tỷ lệ cây ra rễ đạt 66,67% Mặc dù thời điểm xuất hiện rễ không khác nhiều so với xử lý αNAA ở nồng độ 1000ppm (30,5 so với 30,8 ngày sau giâm) nhưng đã có sự cải thiện rõ rệt về số lượng rễ/cành giâm (2,83 so với 2,60) và chiều dài rễ của cành giâm (3,17cm/rễ so với 2,4cm/rễ) ở thời điểm 40 ngày sau xử lý giâm cành

Kết quả xử lý cành giâm bằng αNAA ở nồng độ 3000ppm thì thời điểm xuất hiện rễ, số rễ trung bình/cành giâm và chiều dài của rễ không sai khác nhiều so với xử lý αNAA ở nồng độ 2000ppm nhưng tỷ lệ cành giâm ra rễ đã tăng đáng kể lên 77,78% Điều này có ý nghĩ hơn cả về mặt nhân giống vô tính tạo cây con để đưa vào trồng trong khí canh tạo sinh khối rễ

Tiếp tục xử lý cành giâm bằng αNAA ở nồng độ 4000ppm chúng tôi thu được kết quả tất cả các thông số về tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cành giâm và chiều dài của rễ đều giảm

Tổng hợp tất cả các kết quả cho thấy: Không xử lý cành giâm bằng chất điều tiết xinh trưởng αNAA thì cành giâm không ra rễ và chết Khi xử lý cành giâm bằng αNAA ở các nồng độ khác nhau thì tỷ lệ ra rễ, ngày xuất hiện rễ của cành giâm, số lượng rễ/cành giâm cũng như chiều dài rễ là khác nhau, đặc biệt là

tỷ lệ ra rễ của cành giâm So sánh tất cả các chỉ tiêu theo dõi ở các công thức, qua đồ thị 1 cho thấy nồng độ αNAA ở mức 3000ppm là thích hợp nhất cho xử

lý giâm cành Hoàng liên gai

Hình 1.Đồ thịvề sự thay đổi các chỉ tiêu theo dõi của cành giâm Hoàng liên

gai khi xử lý αNAA ở các nồng độ khác nhau

Từ những kết quả đạt được của thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất auxin tới xử lý kích thích ra rễ của cành giâm cho thấy: không thể nhân in vivo cây Hoàng liên gai bằng biện pháp giâm cành khi không xử lý chất điều tiết sinh trưởng (αNAA) Nồng độ thích hợp nhất sử dụng trong giâm cành Hoàng liên gai là 3000ppm, ở nồng độ này tỷ lệ cành giâm ra rễ và sống đạt cao nhất (77,78%)