Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra

MỞ ĐẦU Nuôi trồng thủy sản là thế mạnh của nước ta, trong 10 năm gần đây ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2010, diện tích nuôi trồng thủy sản được mở rộng lên 1,1 triệu ha, sản lượng đạt 2,8 triệu tấn và giá trị xuất khẩu thủy sản đạt 5,034 tỉ USD [3]. Vấn đề dịch bệnh, năng suất và chất lượng của sản phẩm thủy sản luôn được đặt lên hàng đầu. Để quản lý dịch bệnh thì kháng sinh đã và đang là sự lựa chọn hàng đầu của nhiều hộ nuôi, hệ quả là chất lượng thủy sản giảm do hàm lượng kháng sinh tồn dư trong sản phẩm sau khi thu hoạch. Việc lạm dụng kháng sinh quá mức còn gây ra nguy cơ kháng kháng sinh của các chủng gây bệnh, khiến cho liều lượng kháng sinh sử dụng mùa sau cao hơn mùa trước hoặc phải sử dụng luân vòng kháng sinh gây khó khăn cho việc điều trị và kiểm soát dịch bệnh [122]. Với mục tiêu thay thế dần phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống, các phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immuno stimulants), chế phẩm sinh học như probiotic. Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên đối tượng thủy sản vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm . Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus , nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc đối với vật nuôi [117]. Do đó, phương pháp trị liệu sinh họ c bằng vi sinh vật có lợi như probiotic đang được đánh giá cao và trở thành công cụ phòng ngừa , điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh. Hiện nay có khoảng hơn 400 thương hiệu chế phẩm sinh học đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, tuy nhiên các chế phẩm này chủ yếu có nguồn gốc ngoại nhập hoặc sản xuất trong nước, đa số chưa rõ nguồn gốc, các chủng được sử dụng làm probiotic chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Saccharomyces, Nitrobacter sp [11]. Trong số các nhóm vi sinh vật nói trên thì Bacillus là một ứng viên quan trọng cho việc sản xuất probiotic vì nhóm này có các đặc tính như: c ó khả năng sinh bào tử, và có khả năng sản sinh các sản phẩm thứ cấp như chất kháng khuẩn, enzyme, hầu hết không gây hại cho người và động vật. Enzyme của Bacillus phân cắt các hợp chất carbohydrate, lipid, protein… rất hiệu quả [29], [79], [108], [120]. Vì những lý do trên, cùng sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và sự cho phép của Khoa Sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, tôi thực hiện đề tài “Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra”.

VĂN THỊ THÚY

ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus spp CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC TỪ

AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

L ỜI CẢM ƠN

Lu ận văn này được thực hiện ở Phòng Sinh học Thực Nghiệm- Viện Nghiên Cứu Nuôi Tr ồng Thủy Sản 2 dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh

 Kính g ửi đến TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất

v ề sự quan tâm, giúp đỡ và tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này

 Kính g ửi đến Th.s Võ Minh Sơn lời cảm ơn chân thành về sự quan tâm, giúp đỡ

c ũng như đã hỗ trợ kinh phí lẫn kiến thức để tôi thực hiện khóa luận

 Kính g ửi đến quý Th ầy, Cô trường Đại học Khoa học Tự Nhiên- ĐHQG TpHCM lòng bi ết ơn về những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho tôi trong suốt quá trình h ọc

 C ảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong cuộc sống này

Văn Thị Thúy

M ỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Mục lục ii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục biểu đồ vii

Danh mục hình viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 3

1.1.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng thủy sản 3

1.1.2 Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh cho động vật thủy sản 4

1.1.3 Các loại bệnh thường gặp trên động vật thủy sản 6

1.1.4 Tác động tiêu cực của việc dùng thuốc trong nuôi trồng thủy sản 9

1.2 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

12

1.2.1 Định nghĩa probiotic 13

1.2.2 Đặc điểm chung của probiotic 14

1.2.3 Các cơ chế tác động của probiotic 14

1.2.4 Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản 20

1.2.5 Tình hình nghiên cứu prob iotic ứng dụng trong thủy sản ở Việt Nam và trên thế giới 21

1.3 BẺ GÃY QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING – CÁCH TIẾP CẬN MỚI TRONG VIỆC KIỂM SOÁT HỆ VI SINH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

23

1.3.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing 23

1.3.2 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh 24

1.3.3 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh

25

1.4 TỔNG QUAN VI KHUẨN Bacilllus 27

1.4.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus 27

1.4.2 Dinh dưỡng và sinh trưởng 28

1.4.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus 28

1.4.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản 30

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 31

2.1.1 Thời gian tiến hành 31

2.1.2 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 31

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Nguồn vật liệu phân lập và chủng vi sinh vật kiểm định 31

2.2.2 Địa điểm thu mẫu 31

2.2.3 Môi trường - hóa chất- thiết bị - dụng cụ sử dụng 34

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35

2.3.2 Phương pháp thu mẫu 37

2.3.3 Phương pháp phân lập 37

2.3.4 Phương pháp chọn lọc 38

2.3.5 Định danh các chủng tuyển chọn 42

2.3.6 Khảo sát các đặc tính probiotic khác 48

2.3.7 Khảo sát các đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn 51

2.3.8 Khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 55

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 56

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 57

3.1.1 Kết quả thu mẫu, phân lập và chọn lọc bước một 57

3.1.2 Kết quả sàng lọc dựa vào khả năng sinh enzyme hemolysin 58

3.1.3 Thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng thử nghiệm 61

3.1.4 Kết quả định danh các chủng đã tuyển chọn 65

3.1.5Kết quả khảo sát các đặc tính probiotickhác của các chủng tuyển chọn

67

3.1.6 Kết quả khảo sát một số đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn

71

3.1.7 Kết quả khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 81

3.2 THẢO LUẬN 82

Chương 4- KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 88

4.2 ĐỀ NGHỊ 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

PHỤ LỤC PL1

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AHL N- Acyl Homoserine Lactone

CMC Cacboxyl Methyl Cellulose

FAO Food and Agriculture Organization

HHL N- Hexanoyl- L- Homoserine Lactone

PBS Phosphate Buffer Saline

WHO World Health Organization

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu 31

Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hemolysin 58

Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào 61

Bảng 3.3: Kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa 66

Bảng 3.4: Tóm tắt kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử 67

Bảng 3.5: Kết quả đối kháng của các chủng thử nghiệm với một số chủng gây bệnh

67

Bảng 3.6: Tốc độ phân hủy phân tử HHL bởi các chủng tuyển chọn ở thời điểm 9h và 24h 69

Bảng 3.7: Log (cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các nồng độ muối khác nhau sau 24 giờ 71

Bảng 3.8: Log( cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các giá trị pH khác nhau sau 24 giờ 73

Bảng 3.9: Log (cfu/ml) các chủng khảo sát sau 24giờ nuôi ở các nhiệt độ 74

Bảng 3.10: Tỷ lệ sống sót (%) của các chủng khảo sát ở nồng độ muối mật khác nhau vào các thời điểm 1giờ, 2giờ, 3giờ và 6giờ 75

Bảng 3.11: Tỷ lệ sống sót (%) của các chủng khảo sát ở pH2 và pH3 theo thời gian

79

Bảng 3.12: Kết quả tương thích giữa các chủng khảo sát 81

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ phần trăm số lượng enzyme của các chủng khảo sát 64

Biểu đồ 3.2: Mối tương quan giữa đường kính vòng violacein và Ln[HHL] 69

Biểu đồ 3.3: Tốc độ phân hủy HHL ở thời điểm 9 giờ và 24 giờ 70

Biểu đồ 3.4: Log(cfu/ml) của các chủng thử nghiệm ở các nồng độ muối khác nhau sau

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh 6

Hình 1.2: Vi khuẩn Aeromonas và cá tra bị xuất huyết do Aeromonas 6

Hình 1.3: Vi khuẩn Vibrio phát sáng trên môi trường TCBS và mang tôm sú bị đen do nhiễm Vibrio 7

Hình 1.4: Vi khuẩn E.ictaluri và cá tra bị bệnh do nhiễm Edwardsiella 8

Hình 1.5: Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn 25

Hình 1.6: Sự phân hủy phân tử AHL bằng enzyme 26

Hình 1.7: Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus 29

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

Hình 2.2 Dụng cụ thu mẫu nước và bùn của ao nuôi cá tra 37

Hình 2.3: Bảng đặc tính sinh hóa của một số chủng Bacillus 43

Hình 2.4: Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc 49

Hình 3.1: Sự đa dạng khuẩn lạc từ mẫu phân lập trên môi trường DSM 57

Hình 3.2:Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường DSM 57

Hình 3.3: Tế bào tạo nội bào tử và tế bào sinh dưỡng 58

Hình 3.4: Kết quả kiểm tra enzyme catalase: catalase dương tính, catalase âm tính

58

Hình 3.5: Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 61

Hình 3.6: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào 65

Hình 3.7: Chủng N3.19.2 đối kháng với V.alginolyticus 68

Hình 3.8: Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen aiiA của chủng N3.19.2 68

Hình 3.9: Đường kính vòng violacein ở nghiệm thức đối chứng ở các thời điểm 0 giờ, 9 giờ và 24 giờ 70

Hình 3.10: Vòng violacein của chủng N3.10.1 ở thời điểm 9h và 24h 71

M Ở ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản là thế mạnh của nước ta, trong 10 năm gần đây ngành thủy

sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ Theo

thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2010, diện tích nuôi

trồng thủy sản được mở rộng lên 1,1 triệu ha, sản lượng đạt 2,8 triệu tấn và giá trị xuất

khẩu thủy sản đạt 5,034 tỉ USD [3] Vấn đề dịch bệnh, năng suất và chất lượng của sản

phẩm thủy sản luôn được đặt lên hàng đầu Để quản lý dịch bệnh thì kháng sinh đã và đang là sự lựa chọn hàng đầu của nhiều hộ nuôi, hệ quả là chất lượng thủy sản giảm do hàm lượng kháng sinh tồn dư trong sản phẩm sau khi thu hoạch Việc lạm dụng kháng sinh quá mức còn gây ra nguy cơ kháng kháng sinh của các chủng gây bệnh, khiến cho

liều lượng kháng sinh sử dụng mùa sau cao hơn mùa trước hoặc phải sử dụng luân vòng kháng sinh gây khó khăn cho việc điều trị và kiểm soát dịch bệnh [122]

Với mục tiêu thay thế dần phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống, các phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immuno stimulants), chế phẩm sinh

học như probiotic Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên đối tượng thủy sản vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus , nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc đối

với vật nuôi [117] Do đó, phương pháp trị liệu sinh họ c bằng vi sinh vật có lợi như probiotic đang được đánh giá cao và trở thành công cụ phòng ngừa , điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức

chế vi sinh gây bệnh

Hiện nay có khoảng hơn 400 thương hiệu chế phẩm sinh học đang lưu hành trên

thị trường Việt Nam, tuy nhiên các chế phẩm này chủ yếu có nguồn gốc ngoại nhập

hoặc sản xuất trong nước, đa số chưa rõ nguồn gốc, các chủng được sử dụng làm

probiotic chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Saccharomyces, Nitrobacter sp [11].

Trong số các nhóm vi sinh vật nói trên thì Bacillus là một ứng viên quan trọng

cho việc sản xuất probiotic vì nhóm này có các đặc tính như: có khả năng sinh bào tử,

và có khả năng sản sinh các sản phẩm thứ cấp như chất kháng khuẩn, enzyme, hầu hết không gây hại cho người và động vật Enzyme của Bacillus phân cắt các hợp chất

carbohydrate, lipid, protein… rất hiệu quả [29], [79], [108], [120] Vì những lý do trên, cùng sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và sự cho phép của Khoa Sinh

học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, tôi thực hiện đề tài “Phân lập các chủng

Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra”

1.1 T ỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY

S ẢN

1.1.1 Tình tr ạng ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng thủy sản

Ước tính mỗi năm, ngành nuôi trồng thủy trên toàn thế giớ i đã thải ra môi trường nước xấp xỉ 3 triệu tấn bùn ở dạng chất thải hữu cơ gần như chưa được xử lý

Mầm bệnh từ các ao nuôi cũng đã đi theo nguồn thải này ra hệ thống sông rạch làm

chất lượng nhiều vùng nước suy giảm nặng nề [7]

Cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng thủy sản, để đáp ứng cho nhu cầu

xuất khẩu và tiêu dùng ngày càng tăng cao, người nuôi thường thả với mật độ quá dày trong khi không có biện pháp xử lý môi trường thích hợp sẽ dẫn đến hiện tượng thối

ao, làm giảm oxy hòa tan Các chất độc sinh ra làm cho động vật bị stress và ngộ độc,

có thể gây chết hàng loạt cho tôm cá, không những gây thiệt hại cho nuôi trồng thủy

sản mà còn gây ô nhiễm môi trường xung quanh [7]

1.1.1.1 Độc tính của chất hữu cơ

Các chất hữu cơ trong đầm ao được tích lũy ngày càng tăng sẽ gây ô nhiễm môi

trường nước, làm giảm lượng oxy hòa tan Hàm lượng oxy hòa tan nằm dưới ngưỡng

chịu đựng của tôm, cá sẽ gây ngạt thở và hội chứng stress Ngoài ra, lớp bùn hữu cơ

lắng đọng lâu ngày là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn kị khí có khả năng sinh metan gây độc cho động vật thủy sản [7]

1.1.1.3 Độc tính của hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa

Vi khuẩn oxy hóa amon

Hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa gồm nitrite (NO2

-) và nitrate (NO3-) Nồng độ nitrite cho phép trong nuôi trồng thủy sản là dưới 0,1 mg/l, nếu vượt quá ngưỡng cho phép sẽ gây độc Nitrate được tạo thành nhờ vi khuẩn oxy hóa nitrite:

Nồng độ nitrate cho phép trong môi trường nuôi trồng hải sản là < 10mg/l Ở

nồng độ lớn hơn hoặc bằng 10mg/l sẽ làm cho tảo phát triển Khi tảo quá nhiều sẽ kết thành khối nổi lên mặt nước, khi bị phân hủy sẽ gây ô nhiễm nước làm nước bị đục,

thối, giảm nồng độ oxy hòa tan Khi nồng độ nitrate > 50mg/l sẽ gây sốc nghiêm trọng cho tôm, cá [7]

1.1.2 M ối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh cho động vật thủy sản

Động vật thủy sản và môi trường sống là một thể thống nhất, khi chúng mắc

bệnh là kết quả tác động qua lại của ba nhân tố: Môi trường sống, tác nhân gây bệnh,

vật chủ- động vật thủy sản

1.1.2.1 Môi trường sống

Các yếu tố môi trường đều là các mối nguy trong nuôi trồng thủy sản, bởi tỷ lệ

sống, sinh sản và sinh trưởng của các loài động vật thủy sản phụ thuộc vào môi trường thích hợp Có nhiều yếu tố môi trường có khả năng ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản, nhưng chỉ một số có vai trò quyết định Nhiệt độ và độ mặn là giới hạn quan trọng của loài nuôi thủy sản ở một địa điểm nhất định Dinh dưỡng, độ kiềm tổng số và độ cứng

tổng số cũng là những yếu tố quan trọng không những điều chỉnh thực vật phát triển

mà chúng còn ảnh hưởng đến s inh vật thủy sản Độ trong ảnh hưởng đến mức độ ánh sáng chiếu vào nước, tác động đến sự quang hợp và các chuỗi thức ăn, độ trong cũng ảnh hưởng trực tiếp đến cá và các động vật không xương sống khác Những yếu tố môi trường khác ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản là pH, oxy hòa tan, CO2, NH3, nitrite,

H2S [8]

1.1.2.2 Tác nhân gây b ệnh

NO2- + O2 Vi khuẩn oxy hóa nitrite NO3

-Các yếu tố hữu sinh làm cho động vật thủy sản mắc bệnh gọi là tác nhân gây

bệnh Các tác nhân gây bệnh được chia ra hai nhóm:

- Tác nhân gây bệnh truyền nhiễm: Virus, Ricketsia, vi khuẩn, nấm

- Tác nhân gây bệnh kí sinh: Nguyên sinh động vật, giun, sán, đỉa, giáp xác [8]

1.1.2.3 V ật chủ

Khi chỉ có các nhân tố ngoại cảnh (yếu tố vô sinh và hữu sinh) tác động thì động

vật thủy sản không thể mắc bệnh được, mà nó còn phụ thuộc vào sức đề kháng của cơ

thể với từng loại bệnh: Vật chủ thường biểu hiện bằng những phản ứng khi môi trường thay đổi Những phản ứng của cơ thể có thể kéo dài 2-3 ngày hoặc 2 -3 tuần tùy theo

mức độ bệnh [8]

1.1.2.4 M ối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh cho thủy sản

Nước là môi trường sống của động vật thủy sản Động vật thủy sản sống được

phải có môi trường sống tốt, đồng thời chúng cũng phải có khả năng thích ứng tốt với môi trường sống Nếu môi trường sống của động vật thủy sản xảy ra những thay đổi không có lợi cho chúng , những con nào thích ứng sẽ duy trì được cuộc sống, những con nào không thích ứng được thì sẽ mắc bệnh hoặc chết

Khi cả ba nhân tố (môi trường, tác nhân gây bệnh, vật chủ) được duy trì ở mức

có lợi thì động vật thủy sản không mắc bệnh Nếu giữ môi trường nuôi tốt sẽ tăng sức

đề kháng với mầm bệnh cho động vật thủy sản, khi đó động vật thủy sản có mang mầm

bệnh thì bệnh không thể phát sinh được Để ngăn cản những nhân tố trên không thay đổi theo chiều hướng xấu cho động vật thủy sản thì con người phải tác động vào ba nhân tố như: cải tạo ao tốt, tẩy trùng ao hồ, diệt mầm bệnh, thả giống tốt, cung cấp thức

ăn đầy đủ về chất và lượng thì bệnh khó xuất hiện [8]

Hình 1.1: Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh [8].

1.1.3 Các lo ại bệnh thường gặp trên động vật thủy sản

1.1.3.1 Bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Aeromonas di động

Hình 1.2: Vi khuẩn Aeromonas (hình a) và cá tra bị xuất huyết do Aeromonas (hình b)

[7], [115]

Chi Aeromonas thu ộc họ Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gamma proteobacteria, ngành Proteobacteria Trong chi Aeromonas có hai nhóm:

 Nhóm 1: Bao gồm các loài Aeromonas không di động ( A.salmonicida) thường

gây bệnh ở môi trường nước lạnh

 Nhóm 2: Bao gồm các loài Aeromonas di động, bao gồm A.hydrophila, A.caviae, A.sorbia , di động nhờ tiên mao C ác loài vi khuẩn Aeromonas di động đều

phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là loài A.hydrophila Bệnh

Môi trường (1)

Mầm

b ệnh (2)

Vật chủ (3)

Bệnh (1+ 2+3)

nhiễm trùng do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp., di động thường gặp ở nhiều loại động

vật thủy sản nước ngọt Ở Việt Nam các loài cá nuôi lồn g, bè và nuôi ao nước ngọt thường gặp bệnh đốm đỏ như: cá trắm cỏ, cá trôi, cá chép, cá tra….Ngoài ra nhóm vi khuẩn còn có thể gây bệnh ở ba ba, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng xanh Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường 30-70%, ở cá giốn g có thể lên đến 100% [9], [118]

1.1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio ở động vật thủy sản

Chi Vibrio thu ộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Chúng không hình thành bào tử và di động nhờ m ột tiên mao

hoặc nhiều tiên mao Chúng sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa

sông, liên quan đến các động vật biển, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và

động vật biển Đối với cá, Vibrio sp gây bệnh nhiễm trùng máu là chủ yếu, đối với tôm Vibrio sp gây b ệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kittin Vibrio sp gây bệnh ở cả

hai nhóm động vật thủy sản nước mặn và ngọt: cá, giáp xác, nhuyễn thể Những vi khuẩn này thường là tác nhân cơ hội, khi động vật thủy sản sốc do biến đổi xấu hoặc bị nhiễm các bệnh khác như nấm, virus, kí sinh trùng, các loài vi khuẩn Vibrio sp có cơ

hội gây bệnh nặng làm động vật thủy sản chết rải rác tới hàng loạt [9]

Hình 1.3: Vi khuẩn Vibrio phát sáng trên môi trường TCBS (hình a), mang tôm sú bị đen do nhiễm Vibrio (hình b) [9]

1.1.3.3 B ệnh đốm trắng (hoại tử cơ quan nội tạng) cá da trơn do vi khuẩn

Edwardsiella

Chi Edwardsiella thu ộc họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Thường gặp hai loài gây bệnh là:

E.tarda và E.ictaluri

E.tarda là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá da trơn

E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng như gan, thận, tụy của cá không vảy , gây bệnh nhiễm trùng đường ruột trên cá da trơn ở Mỹ , là tác nhân gây

bệnh gan thận mũ trên cá tra ở Việt Nam

Edwardsiella thường gây bệnh ở động vật máu lạnh: rắn, cá sấu, cá… và một số động vật thủy sản khác Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá hương (cỡ từ 4-6cm) đến 5-6 tháng tuổi, ít xuất hiện hơn ở cá có kích cỡ trên 15cm, tỷ lệ tử vong của cá từ 60-70%, có trường hợp tới 100% Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu

và trong ao nuôi mật độ cao, nuôi cá lồng bè [9], [18], [32], [121]

Hình 1.4: Vi khuẩn E.ictaluri (hình a), nội tạng cá tra bị bệnh do nhiễm Edwardsiella

(hình b) [121]

1.1.3.4 M ột số bệnh nhiễm khuẩn khác trên đối tượng thủy sản

Ngoài các bệnh trên, động vật thủy sản còn gặp một số bệnh như bệnhsưng phù

và nổ mắt trên cá lóc, cá lóc bông và nhiều loài cá nước ngọt cũng như cá biển do vi khuẩn Streptococcus spp., bệnh xuất huyết và nhiễm trùng máu trên cá hương mè,

trắm cỏ, mè vinh, cá trê, tôm càng xanh do vi khuẩn Pseudomonas spp., bệnh đục cơ

a b

trên tôm càng xanh do cầu khuẩn Lactococcus garvieae, bệnh xuất huyết, hoại tử da,

cơ ở cá nước ngọt và nước mặn như cá lóc, cá trác… do vi khuẩn Mycobacterium,

bệnh hoại tử cơ ở cá nheo mỹ do Bacillus mycoides …[9], [17]

1.1.4 Tác động tiêu cực của việc dùng thuốc trong nuôi trồng thủy sản

Việc dùng thuốc trong nuôi trồng thủy sản có thể mang nhiều lợi ích khác nhau: tăng hiệu quả sản xuất, tăng tỷ lệ sống sót, tiêu diệt tác nhân gây bệnh… Đến nay không thể phủ nhận một điều là thuốc sử dụng hiện nay đã và đang làm giảm đáng kể

rủi ro do bệnh tật, việc dùng thuốc đúng cách, đúng liều lượng và đúng thời điểm đã phòng trị được một số bệnh do nhiễm khuẩn, nấm, kí sinh trùng Tuy nhiên việc dùng thuốc quá lạm dụng trong nuôi trồng thủy sản nói chung và trong nuôi công nghiệp đã

và đang phổ biến ở Việt Nam cũng như một số nước trên thế giới có thể dẫn tới hậu

quả nghiêm trọng cho sức khỏe con người, phá hủy môi trường sinh thái, làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và tạo ra các chủng kháng thuốc… Những ảnh hưởng này càng nặng nề khi người nuôi trồng không có ý thức và hiểu biết ít về hiệu quả và tác dụng của từng loại thuốc mà họ dùng hàng ngày [8]

Khi sử dụng thuốc trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản người ta đặc biệt chú ý tới các tác động tiêu cực sau:

1.1.4.1 Tác động đến môi trường sinh thái

Một số loại thuốc có khả năng diệt khuẩn cao, phổ diệt khuẩn rộng như các chất sát trùng, các chất diệt địch hại, khi cho vào môi trường, ngoài tác dụng tiêu diệt tác nhân gây bệnh và địch hại, chúng còn tiêu diệt luôn cả những sinh vật có lợi cho môi trường sinh thái hay có lợi cho con người

Khi dùng các hóa chất như: Nuval, Iodine, Formol… diệt kí sinh trùng trong các

ao nuôi tôm, cá có thể tiêu diệt luôn cả những thực vật và động vật có lợi trong ao nuôi, làm nghèo hệ sinh vật phù du và sinh vật đáy Khi dùng kháng sinh để phòng và trị

bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản, một phần kháng sinh không được vật

nuôi hấp thụ và đào thải ra môi trường, gây tác động đáng kể đến môi trường xung quanh khu vực nuôi

Ngoài ra, việc điều trị bằng kháng sinh và hóa chất, đặc biệt khi dùng quá nhiều hóa chất sẽ tiêu diệt phần lớn các vi khuẩn có lợi trong nước ao, chứ không chỉ các vi khuẩn gây bệnh Các kháng sinh và hoá chất không thể sử dụng để phục hồi sự suy

giảm chất lượng nước và môi trường sinh thái

Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một phần nhỏ kháng sinh sẽ hòa tan trong nước nên tác động đến hệ sinh thái không lớn, nhưng phần lớn dư lượng kháng sinh lại lắng đọng cùng với các trầm tích, gây tác động không nhỏ đến môi trường sinh thái Dư lượng kháng sinh tồn tại trong lớp trầm tích đáy làm giảm mật độ hệ vi sinh

vật có nhiệm vụ phân hủy các chất hữu cơ, làm chậm quá trình tự làm sạch vùng nuôi, tăng quá trình phân hủy yếm khí, sản sinh ra nhiều khí độc vào nước Từ đó làm xáo

trộn hệ vi sinh vật dẫn đến những xáo trộn theo chiều hướng xấu của hệ sinh thái [7]

1.1.4.2 Ảnh hưởng tới vật nuôi thủy sản

Những loại thuốc dùng trong nuôi trồng thủy sản để tiêu diệt tác nhân gây bệnh

hoặc địch hại, còn có tác động tiêu cực tới sức khỏe vật nuôi Sau khi dùng kháng sinh

trộn vào thức ăn tôm cá, kháng sinh có thể gây độc cho gan, thận và tiêu diệt những sinh vật có lợi trong đường ruột, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn của vật nuôi, gây hiện tượng chậm lớn, còi cọc ở đàn cá nuôi thương phẩm và chậm phát dục ở đàn cá nuôi vỗ thành thục

Trong sản xuất tôm sú giống ở Việt Nam, để phòng bệnh nhiễm khuẩn người ta thường dùng nhiều loại kháng sinh liên tục trong suốt quá trình ương ấp, tác dụng phòng bệnh rất hạn chế nhưng lại làm suy yếu sức khỏe của đàn cá giống, khi thả chúng ra ao nuôi thương phẩm những con giống này sẽ trở nên mẫn cảm với tác nhân gây bệnh [7]

1.1.4.3 Gây hi ện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn gây bệnh

Khi động vật thuỷ sản mắc bệnh thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh

Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra

hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh và tích tụ dư lượng kháng sinh trong cơ thể động vật thuỷ sản

Hiện tượng kháng kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động của một hoặc nhiều loại kháng sinh Các gen kháng thuốc có thể được hình thành trong các loài vi khuẩn khác thông qua sự trao đổi gen với một vi khuẩn có mang gen kháng, do vậy chúng có khả năng tạo ra cơ chế làm trung hoà hoặc phá huỷ tác dụng

của các loại kháng sinh [122]

1.1.4.4 Ảnh hưởng tới sức khỏe con người

Mặc dù kháng sinh đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều

bệnh tật cho con người và các loài động vật thuỷ sinh, nhưng việc sử dụng bừa bãi trong nuôi trồng thuỷ sản có thể gây ra nhiều vấn đề nghi êm trọng như gây độc, biến đổi hệ vi sinh của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng bị kháng thuốc [122] Theo báo cáo mới đây của Tiến sĩ Felipe Cabello và các cộng sự tại trường Cao đẳng Y tế New York, việc lạm dụng kháng sinh trong hoạt động nuôi trồng thuỷ sản có

thể gây hại cho sức khoẻ thuỷ sản, động vật và cả con người

Việc lạm dụng thuốc kháng sinh sẽ gây nhờn thuốc và có thể dẫn đến sự phát triển của các vi khuẩn có khả năng kháng thuốc trong cơ thể động vật và người, cũng như trong thuỷ sản Đặc tính kháng thuốc ở vi khuẩn trong nước có thể truyền sang các vi khuẩn gây bệnh ở người và động vật [9]

Nếu kháng sinh được trộn vào thức ăn nuôi thuỷ sản, có thể tìm thấy dư lượng kháng sinh trong thịt động vật thuỷ sản và các sản phẩm chế biến Những người ăn động vật thuỷ sản chứa dư lượng kháng sinh sẽ vô tình hấp thụ kháng sinh vào cơ

thể, dẫn đến những thay đổi trong hệ vi khuẩn bình thường, khiến họ trở nên dễ bị nhiễm khuẩn hơn [122].

Trước những tác động tiêu cực của việc dùng hóa chất, kháng sinh trong nuôi

trồng thủy sản, việc tìm ra các giải pháp thay thế là khá cấp thiết Việc ứng dụng các sinh vật có lợi (probiotic) bắt đầu từ những năm 1980 là cách tiếp cận hiệu quả, thân thiện với môi trường trong việc phòng ngừa dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản [7]

Nhu cầu tiêu dùng thủy sản của thế giới ngày càng gia tăng, sản lượng thủy sản khai thác tự nhiên không thể đáp ứng đủ cho nhu cầu tiêu dùng Do đó, nuôi trồng thủy

sản là vấn đề cấp thiết để giải quyết nhu cầu này Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản

hiện nay đang gặp khó khăn do vấn đề dịch bệnh, chủ yếu là bệnh do vi khuẩn Khi phát hiện bệnh, nông dân thường sử dụng các hợp ch ất kháng khuẩn để điều trị bệnh,

rất nhiều nông dân sử dụng kháng sinh với số lượng lớn để phòng trừ bệnh, thậm chí khi chưa xác định được tác nhân gây bệnh

Lời giải cho vấn đề này nằm ở lĩnh vực sinh thái học chứ không phải ở lĩnh vực dược học Nông dân cần phải học cách chung sống nhờ vào một quần xã vi si nh phức

tạp và điều khiển chúng Phương pháp sử dụng các vi khuẩn có lợi, tức là probiotic để

loại trừ các vi khuẩn có hại tốt hơn nhiều so với sử dụng kháng sinh Ngày nay, kháng sinh đã bị hạn chế sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng và phòng bệnh trong nuôi

trồng thủy sản (NTTS)

Xu hướng sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng lên, các

kết quả nghiên cứu cho thấy chúng có khả năng làm tăng năng suất và ngăn ngừa bệnh

Có hai phương pháp sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản: Đưa trực tiếp vào nước để vi khuẩn probiotic khu trú trong nước và trộn vào thức ăn [14]

1.2.1 Định nghĩa probiotic

Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy lạp “probios” có nghĩa là “cho sự

sống” Thông qua thời gian cùng với sự phát triển của khoa học và sự hiểu biết của nhân loại thuật ngữ này được định nghĩa lại nhiều lần

Vào năm 1965, Lilly và Still đã định nghĩa probiotic là những nhân tố thúc đẩy phát triển được sản xuất bởi vi sinh vật Vào năm 1974 Parker đã định nghĩa probiotic

dựa trên mối quan hệ giữa vi sinh với vật chủ “probiotic là những sinh vật và những cơ

chất có lợi cho động vật, có khả năng cải thiện hệ vi sinh đường ruột” Đến năm 1989, Fuller mở rộng định nghĩa “probiotic là sinh vật sống được cung cấp dưới dạng thức ăn cho động vật nhằm cải thiện cân bằng hệ sinh vật đường ruột” Havenaar và Huis Int Veld (1992) định nghĩa “probiotic là một chủng hay một hỗn hợp vi sinh vật sống, cung cấp cho người hoặc động vật, có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh bản địa” Gatesoup (1999) định nghĩa “probiotic là những sinh vật sống cung cấp dưới dạng thức ăn nhằm cải thiện sức khỏe cho vật chủ”

Reid và cs (2003) định nghĩa “probiotic là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ”

Vào năm 2003, Fioramonti và cs đã định nghĩa probiotic một cách ngắn gọn nhưng đầy xúc tích: “probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật ảnh hưởng có lợi lên sức khỏe và tốt cho vật chủ”

Trước đây, probiotic thường được ứng dụng cho con người và động vật trên cạn,

vì vậy thuật ngữ probiotic thường được ngụ ý là những vi khuẩn gram dương chủ yếu

là Lactobacillus Dần dần các sinh vật được áp dụng làm probiotic ngày càng đa dạng bao gồm cả vi khuẩn gram âm, vi khuẩn gram dương, bacteriophage, nấm men và tảo đơn bào, phạm vi sử dụng rộng hơn, ngoài con người và động vật trên cạn, probiotic ngày nay được ứng dụng trên cả đối tượng động vật thủy sản [60], [87]

Khác với người và động vật trên cạn, động vật thủy sản được bao bọc bởi môi trường nước và ở đó các tác nhân gây bệnh tồn tại một cách độc lập với vật chủ

Những vi sinh vật gây bệnh được hấp thụ liên tục bởi vật chủ thông qua quá trình tiêu

thụ thức ăn, động vật thủy sản tiêu hóa một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường nước, kết

quả của mối tương tác tự nhiên giữa khu hệ vi sinh trong môi trường và đối tượng thủy

sản Trong nuôi trồng thủy sản mối tương tác giữa probiotic và vật chủ không chỉ giới

hạn trong đường ruột của vật chủ, probiotic còn có thể hoạt động trên mang, da và cả môi trường nước xung quanh vật chủ Do vậy, Verschuere và cs (2000) đã đề xuất một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ probiotic trong nuôi trồng

thủy sản “probiotic là hỗn hợp vi sinh vật sống được bổ sung và ảnh hưởng có lợi cho

vật chủ bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hoặc quần xã vi sinh vật xung quanh, cải thiện khả năng sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường

khả năng chống chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống của vật chủ”

1.2.2 Đặc điểm chung của probiotic

 Có khả năng sống sót trong môi trường acid dạ dày, tồn tại tạm thời hoặc hình thành khuẩn lạc trong ruột non

 Không gây hại cho vật chủ

 Probiotic phải được đưa tới đúng vị trí cần tác động trong cơ thể vật chủ

 Biểu hiện có lợi đối với vật chủ (cạnh tranh đối kháng với các sinh vật gây bệnh, sinh các enzyme hoặc các chế phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng được)

 Không chứa gen gây độc hoặc gen kháng kháng sinh [69], [123]

1.2.3 Các cơ chế tác động của probiotic

Gia tăng khả năng bám hoặc đối kháng trực tiếp những ảnh hưởng có hại của tác nhân gây bệnh là những yếu tố quan trọng của probiotic để làm giảm tính gây độc trong suốt quá trình nhiễm bệnh Các chủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi khuẩn gây bệnh ở điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau Đa

số các nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong thập niên qua, trong đó có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic Nhìn chung, probiotic có các cơ

chế tác động sau:

1.2.3.1 S ản sinh ra các hợp chất ức chế

Kháng khuẩn là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên Vì vậy, sự tương tác

giữa các vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đảm bảo trạng thái cân bằng giữa vi sinh

vật hữu ích và những vi sinh vật gây bệnh [20]

Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học có

khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy năng lượng hay các chất hóa học Những hợp chất này bao gồm: bacteriocin, siderophore, lysozyme, protease, hydrogen peroxide và các acid hữu cơ V i khuẩn sinh acid lactic

tạo hợp chất bacteriocin giúp ức chế các vi khuẩn khác Có rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của một số chủng vi khuẩn được chọn lựa bổ sung vào môi trường ương nuôi ấu trùng [102]

Gaixa (1889) đã có báo cáo đầu tiên về sự tồn tại của vi khuẩn trong nước biển

có khả năng ức chế Vibrio sp Sau đó, Rosenfeld và Zobell (1947) nghiên cứu việc sản

sinh chất ức chế vi sinh vật biển và kể từ đó nhiều nghiên cứu tiếp theo theo hướng sử

dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát sinh học Nogami và Maeda (1992), Nogami và cs (1997) đã chứng minh vi khuẩn Thalasobacter utilis ức chế vi khuẩn Vibrio anguillarum, do đó làm gia tăng khả năng sống sót của ấu trùng cua xanh

Portunus trituberculatus , đồng thời cũng làm giảm số lượng Vibrio trong nước ương

ấu trùng Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng này ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn V angillarum trên cá bơn trưởng thành Scophthalmus maximus và Limanda limanda S ử dụng V alginolyticus như một probiotic đã được đề cập để tăng cường khả năng sống sót và phát triển của ấu trùng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei ở các

trại nuôi ở Ecuador Theo Chythanya và cs (2002), một chủng vi khuẩn nước mặn,

Pseudomonas I2, có kh ả năng sinh hợp chất ức chế lại Vibrio gây bệnh trên tôm Hợp

chất kháng khuẩn này được chứng minh có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt, tan trong chloroform, và kháng được sự thủy giải của các ezyme [24], [85]

1.2.3.2 C ạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng sẵn có

Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay trong môi trường nuôi thủy sản

Minh chứng điển hình cho tác đ ộng này là những vi khuẩn có khả năng sinh siderophore Tất cả vi khuẩn đều cần sắt để tăng trưởng, siderophore là chất có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng gắn với ion sắt Siderophore có thể hòa tan sắt kết tủa thành dạng dễ sử dụng, do đó nó là một công cụ thu lượm sắt hiệu quả [47], [104]

Các chủng vi khuẩn vô hại có thể sản xuất siderophore được sử dụng như probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính gây bệnh có liên quan đến

việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy phân tử sắt trong môi trường thiếu sắt

ở giai đoạn cần thiết [47], [98].Chủng Vibrio E có thể cải thiện khả năng đề kháng đối

với vi khuẩn gây bệnh Vibrio P, Vibrio splendidus ở ấu trùng cá bơn Nghiên cứu in vitro cho th ấy rằng, Vibrio E có thể phát triển trong môi trường đã bị tách hết sắt trong khi Vibrio P thì không Hơn nữa, cá bơn bột đ ược cho ăn rotifer được làm giàu chất siderophore deferoxamine của Vibrio E đã đạt được tỉ lệ sống cao hơn sau khi gây

nhiễm với Vibrio P, so với lô đối chứng Từ những kết quả có liên quan trong các thí

nghiệm in vitro và in vivo, các nhà khoa học đã kết luận rằng hiệu quả probiotic của Vibrio E có thể một phần là do sự đấu tranh giành lấy phân tử sắt với tác nhân gây

bệnh [47]

1.2.3.3 C ạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại

Khả năng hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic trong biểu

mô ruột và trong lớp nhầy đường ruột vật chủ là cơ chế bảo vệ vật chủ chống lại tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh các thụ quan bám dính, dinh dưỡng và không gian, oxy và sự sản sinh các cơ chất kháng khuẩn Một số cơ chế liên quan đến sự bám dính của vi sinh vật lên tế bào biểu mô ruột bao gồm: Liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, vị trí gắn dựa trên các cấu trúc chuyên biệt Những đặc tính này là một thế mạnh

cạnh tranh quan trọng giúp duy trì vi khuẩn trong đường ruột động vật [20], [23], [90]

Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành khuẩn lạc của vi sinh vật có thể phụ thuộc vào:

- Mối quan hệ với vật chủ như: nhiệt độ cơ thể, enzyme, đặc tính kháng do di truyền Ví dụ, vi khuẩn có thể theo nguồn nước và thực phẩm đến miệng và đóng góp vào quá trình dinh dưỡng, ở đó một số chủng được giữ lại trở thành quần cư của vi khuẩn đường ruột Những chủng còn lại bị tiêu diệt thông qua quá trình tiêu hoá và bị

loại thải thông qua quá trình bài tiết Ngoài ra, sự sinh trưởng của vi khuẩn trong đường ruột còn có thể bị ức chế do hợp chất kháng khuẩn tiết ra từ vật chủ

- Các yếu tố có mối quan hệ với vi sinh vật như: ảnh hưởng của các hợp chất kháng khuẩn, protease, bacteriocin, hydrogen peroxide, sự hình thành NH3, diacetyl, và

sự biến đổi pH do sản sinh các acid hữu cơ

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chủng Lactobacillus plantarum có khả

năng bám dính và hình thành màng nhầy bên trong đường ruột, chủng này sử dụng vị trí gắn chuyên biệt là manose để cạnh tranh vị trí gắn với các chủng gram âm gây bệnh trên lớp nhầy đường ruột của cá

Ngoài ra, sự hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic đóng vai trò quan trọng trong điều hòa và kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào chủ [61], [82]

1.2.3.4 Đóng góp về mặt dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vi sinh vật ảnh hưởng có lợi cho quá trình tiêu hóa của động vật thủy sản: khử độc các hợp chất độc hại trong thức ăn, phân hủy các

hợp chất khó tiêu như chitin, cellulose…trong thức ăn nhờ các enzyme thủy giải cellulase, amylase…) Ngoài ra probiotic còn cung cấp vitamin (biotin và vitamin B12), carotenoid, protein, acid béo chuỗi ngắn và chuỗi acid béo không bão hòa (PUFAs - polyunsaturated fatty acids) như eicosapentaenoic acid (EPA) và docosahexaenoic acid (DHA) cần thiết cho sự sinh trưởng của cá [34]

Ở mức độ in vivo, có nhiều báo cáo cho rằng khi cho cá ăn probiotic ở nồng độ

từ 103

-1012 cfu/g trong thời gian từ 30 -90 ngày có thể gia tăng tỷ lệ sống sót, tăng

trọng, giảm hệ số chuyển đổi thức ăn [14]

Ở cá, có báo cáo cho rằng Bacteroides và Clostridium đã đóng góp về mặt dinh dưỡng cho vật chủ đặc biệt là cung cấp acid béo và vitamin Một số vi sinh vật như Agrobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp., và Staphylococcus sp có thể đóng góp vào quá trình tiêu hóa ở cá hồi chấm hồng Bắc cực

(Salvelinus alpinus L.) M ột số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B subtilis, B polymixa, B laterosporus và B circulans) thúc đẩy tăng trưởng của ấu trùng cá tầm

Acipenser nudiventris: tăng chiều dài và khối lượng, tă ng hệ số chuyển đổi thức ăn, tăng hệ số tăng trưởng đặc hiệu (Specific Growth Rate) Ngoài ra một số vi khuẩn còn tham gia vào quá trình tiêu hóa của những loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng cách sản sinh các enzyme ngoại bào như protease, lipase, đồng thời cung cấp các nhân tố dinh dưỡng cần thiết Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú ở tôm

Penaeus chinensis bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa và các hợp chất đồng hóa tương tự như ở động vật [52], [89], [103], [112]

1.2.3.5 C ải thiện chất lượng nước

Việc bổ sung các chủng probiotic đặc biệt là các chủng Bacillus sp có thể góp

phần cải thiện chất lượng nước Các chủng gram dương có khả năng chuyển đổi các

hợp chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn các chủng gram âm Có báo cáo cho rằng việc sử

dụng các chủng Bacillus sp cải thiện chất lượng nước, tăng khả năng sống và tăng tốc

độ phát triển của tôm sú Penaeus monodon và làm giảm tác nhân gây bệnh Vibrio

Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được

chất hữu cơ trong nước ao nuôi thủy sản, giảm hàm lượng BOD (nhu cầu oxy sinh học)

và giảm độc tố do ammonia, nitrite và hydro sulfua, khống chế được vi khuẩn gây

bệnh, tăng năng suất tôm cá [20], [54]

1.2.3.6 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi probiotic, quá trình hình thành khuẩn lạc và sự bám dính của probiotic trong ruột cá là điều kiện cần thiết để tăng cường đáp ứng miễn dịch thông quan liên kết giữa các kiểu phân tử liên quan đến vi khuẩn - BAMPs (bacteria associated molecular patterns) có tính bảo tồn cao và các thụ thể chyên biệt trên bề mặt của tế bào biểu mô ruột

Một số nghiên cứu đã chứng minh Clostridium butyricum giúp gia tăng khả năng kháng Vibrio của cá hồi và gia tăng hoạt tính thực bào của bạch cầu Rengpipat

và cs (2000) cho rằng sử dụng Bacillus sp (chủng S11) đã bảo vệ tôm sú Penaeus monodon khỏi tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ thống miễn dịch dịch thể ở tôm Balca´zar (2003) chứng minh sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp và Vibrio sp

ảnh hưởng tốt tới sự phát triển và khả năng sống sót của ấu trùng tôm thẻ chân trắng

đồng thời bảo vệ chống lại Vibrio harveyi và virus gây hội chứng đốm trắng Sự bảo vệ

này xuất phát từ sự kích thích hệ thống miễn dịch bằng việc gia tăng thực bào và hoạt động kháng khuẩn Ngoài ra, nhiều tác giả chứng minh sử dụng vi khuẩn lactic

Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) ở hàm lượng 105

cfu/g, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, L sakei kích thích miễn dịch ở cá hồi

Oncorhynchus mykiss bằng cách thúc đẩy hoạt tính thực bào, sản sinh superoxide, lyzozyme, tăng cường hoạt tính bổ trợ (ACH50) [20], [21], [62], [80], [120]

1.2.3.7 Tác động kháng virut

Một số vi khuẩn được sử dụng như probiotic có tác dụng kháng virut, mặc dù cơ

chế này vẫn chưa được hiểu chính xác Việc kiểm tra trong phòng thí nghiệm chỉ ra có

sự bất hoạt virut nhờ các hợp chất hóa học và hợp chất sinh học như là dịch chiết từ tảo

biển và dịch chiết ngoại bào từ vi khuẩn

Kamei và cs (1988) báo cáo cho rằng các chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp, Aeromonas sp và nhóm Coryneform phân lập từ các trại ấp trứng cá hồi có hoạt tính kháng virus IHHNV (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) Direkbusarakom và cs (1998) phân lập được hai chủng Vibrio spp NICA 1030 và

NICA 1031 có hoạt tính kháng IHHNV và Oncorhynchus masou virus (OMV) với tỷ lệ

giảm mật độ hai loại virus trên lần lượt từ 62% và 99% [20]

1.2.4 Vai trò c ủa probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, các vi sinh vật sẻ sinh sôi và phát triển rất nhanh trong môi trường nước Sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi sẽ có các tác dụng sau đây trong các ao hồ nuôi thủy sản:

Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng

của lớp bùn đáy

Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát sinh), do

đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước

Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí thay nước

Nâng cao khả n ăng miễn dịch của tôm cá (do kích thích hệ miễn dịch không đặc

hiệu ở tôm, cá)

Ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có

lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại) Trong môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được sự phát triển của mầm bệnh

Ngoài ra, một số probiotic còn được sử dụng bằng cách trộn vào thức ăn để nâng cao khả năng hấp thu bởi tôm cá, làm giảm hệ số thức ăn và phòng chống các

bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cho tôm cá

Do đó, sử dụng probiotic sẽ có ý nghĩa nhiều mặt trong việc nâng cao hiệu quả kinh

tế cho các mô hình nuôi thủy sản như:

 Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn (giảm hệ số thức ăn)

 Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi

 Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt

 Giảm chi phí thay nước

 Giảm chi phí sử dụng thuốc, kháng sinh và hóa chất trong việc điều trị bệnh [9], [11], [13]

1.2.5 Tình hình nghiên c ứu probiotic ứng dụng trong thủy sản ở Việt Nam và trên th ế giới

1.2.5.1 Tình hình nghiên c ứu probiotic trên thế giới

Có nhiều nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong nhiều thập niên qua

Khởi đầu các nghiên cứu đầu thập niên 80 tập trung vào các nghiên cứu sử dụng probiotic cho đối tượng con giống và cá thương phẩm trong khi các nghiên cứu ứng

dụng cho đối tượng ấu trùng bắt đầu trễ hơn vào khoảng thập niên 90 Tuy nhiên đa số các nghiên cứu ở giai đoạn này tập trung vào ảnh hưởng về mặt dinh dưỡng của probiotic lên vật chủ như các nghiên cứu của Brown và cs (1996), Ringø và cs (1995), Sakata (1990)

Các nhóm tác giả Gatesoupe (1994, 1997), Gildberg và cs (1997) đã chứng minh được ảnh hưởng của probiotic lên khả năng kháng bệnh của cá bột và cá giống

Austin (2006), Nikoskelainen và cs (2003), Sakai và cs (1995) chứng minh khả năng kích thích miễn dịch của probiotic Các nghiên cứu của Gildberg và cs (1995), Kelly và

cs (2007), Nikoskelainen (2006) đã chứng minh tăng cường khả năng bám dính và hình thành khuẩn lạc trong ruột

1.2.5.2 Tình hình nghiên c ứu probiotic ở Việt Nam

Trong những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng

bệnh và cải thiện môi trường trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triển

mạnh Theo thống kê của Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng trên 400 thương hiệu chế phẩm sinh học và vitamin đang bán trên thị trường nước ta Đa số các

chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nhiều nước: Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc… được bán

với giá cao Trong những năm gần đây, các nhà khoa học Việt Nam bắt đầu nghiên cứu

“nội địa hóa” chế phẩm sinh học ứng dụng trong thủy sản nhằm hạ giá thành, giúp

giảm chi phí sản xuất, nâng cao lợi nhuận cho người nông dân [2], [11] Có thể kể đến các nghiên cứu sau:

- Võ Thị Hạnh và cs thuộc Viện Sinh học nhiệt đới Tp HCM nghiên cứu và tạo

chế phẩm BIO II có tác dụng: phân hủy những thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định pH và màu nước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh cho

tôm, cá như nhóm vi khuẩn Vibrio spp, tăng năng suất nuôi trồng

- Chế phẩm EM (Effective microorganism) được giáo sư Teruo Higa-Nhật Bản phát minh năm 1980, được ứng dụng trong các lĩnh vực nông-ngư nghiệp trên thế giới Tuy nhiên, chế phẩm EM ở dạng lỏng được nhân giống từ EM gốc của Nhật Bản với

mật độ tế bào vi sinh vật có lợi cho nuôi trồng thủy sản thấp (< 107

cfu/ml) nên hiệu

qủa sử dụng không cao Để góp phần hoàn thiện và nâng cao hiệu quả chế phẩm EM,

nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Sở Khoa học và Công nghệ Tp.HCM, phòng Vi sinh ứng

dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm VEM sử dụng bổ sung với chế phẩm BioII Chế phẩm VEM (Vietnamese effective microorganisms)

gồm tập hợp các vi sinh vật hữu ích có trong chế phẩm EM Ngoài ra, còn có thêm một

số loài vi khuẩn Bacillus spp được chọn lọc và vi khuẩn quang dưỡng, không chỉ có

tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản mà còn cạnh tranh và đối kháng với các loài vi khuẩn gây bệnh tôm-cá Mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus spp và

vi khuẩn quang dưỡng thêm vào tương ứng là 1010

và 107 CFU/ml [2]

- Các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện KH&CN

Việt Nam) đã nghiên cứu thành công quy trình sản xuất chế phẩm sinh học đa năng Hudavil - HUD 5 với thành phần Bacillus subtilis, Nitrosomonas sp, Nitrobacter sp, Thiobacter thioparus với mật độ 108

cfu/ml để xử lý môi trường ở các hồ nuôi thủy

sản, đặc biệt là hồ nuôi tôm sú, cá tra [13]

- Võ Thị Thứ và cs với chế phẩm sinh học Biochie bao gồm một số chủng thuộc

chi Bacillus (B.subtilis, B megaterium, B.licheniformis) và Lactobacillus (L

acidophilus) Chúng có chức năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và

chất thải nhờ khả năng tổng hợp enzym phân hủy hữu cơ như protease, amylase Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây

bệnh phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas… do chất lượng nước nuôi bị giảm

Sử dụng chế phẩm sinh học Biochie để xử lý nước nuôi tôm cá có tác dụng làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay nước và cải thiện môi trường (tăng oxi hòa tan,

giảm COD, BOD) Ngoài ra, còn có tác dụng giảm tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng [13]

- Ts Nguyễn Hữu Phúc, Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM đã nghiên cứu chế tạo thành công hai chế phẩm sinh học để nuôi tôm Hai chế phẩm này có tên là Probact dùng để trộn vào thức ăn của tôm, và Ecobact dùng để xử lý môi trường nước trong ao nuôi tôm Hai chế phẩm sinh học này có tác dụng giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cải thiện chất lượng nước và bùn trong các ao nuôi tôm Hai chế phẩm này đã được sử dụng thử nghiệm tại một số hộ nông dân ở huyện Cần Giờ, Nhà Bè, các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, cho kết quả khá tốt Tôm ít bị bệnh, tăng trưởng tốt, năng

suất thu hoạch tăng từ 30-45% [13]

TRONG VI ỆC KIỂM SOÁT HỆ VI SINH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 1.3.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing

Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học Chúng

tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các

quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm soát việc biểu hiện gen đối với

sự thay đổi về mật độ tế bào Quá trình này được gọi là quorum sensing Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học … [94]

Trong thế giới vi sinh vật tồn tại cả hai loại ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ

phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài và

giữa các loài Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân

tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide có chiều dài 5 đến 17 amino acid [46], [72]

Quá trình giao tiếp thông qua hệ thống tín hiệu LuxI/LuxR được xem như là cơ

chế chuẩn được các vi khuẩn Gram âm sử dụng để thông tin liên lạc với nhau Hệ

thống quorum sensing kiểu này được sử dụng để kiểm soát việc biểu hiện gen ở trên 25 loài vi khuẩn Gram âm [22], [73] Trong mọi trường hợp, AHL là một loại phân tử tín

hiệu mà việc tổng hợp phụ thuộc vào protein kiểu LuxI Một protein khác (protein kiểu LuxR) chịu trách nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL và sau đó là quá trình

hoạt hóa việc phiên mã của một số gen đích Phân tử tín hiệu AHL đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình quorum sensing ở nhiều tác nhâ n gây bệnh ở người

và thực vật, như Pseudomonas aeruginosa [91], Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens [111], cũng như ở Vibrio harveyi [70] và những loài vi khuẩn gây bệnh khác trong nuôi trồng thủy sản [25]

1.3.2 B ẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp

ti ếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh

Có hai chiến lược chủ yếu trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn, hoặc giết

chết vi khuẩn gây bệnh, hoặc làm suy giảm độc lực của nó để sau đó mầm bệnh không

thể thích nghi với môi trường bên trong vật chủ hoặc dễ dàng bị đào thải bởi hệ miễn

dịch tự nhiên của vật chủ Việc phát hiện ra hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn, có

chức năng gắn liền với việc sản xuất ra các hợp chất trao đổi chất thứ cấp và những yếu

tố liên quan đến độc lực, là tiền đề cho cách tiếp cận thứ hai [44]

Việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh đã được đề nghị như

là cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn Một số phương pháp bẻ gãy hệ thống quorum sensing đã được nghiên cứu, bao gồm (Hình 1.5):

(1) Ức chế quá trình sinh tổng hợp phân tử tín hiệu quorum sensing;

(2) Ứng dụng các hợp chất đối kháng quorum sensing;

(3) Ức chế bằng hóa học đối với phân tử tín hiệu quorum sensing;

(4) Phân hủy sinh học bằng các enzyme của vi khuẩn

Một số báo cáo liên quan đến việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở các vi khuẩn gây bệnh trong môi trường nước, cùng với những kết quả đạt được đối với vi khuẩn gây bệnh ở người và thực vật, chỉ ra rằng phương pháp tiếp cận mới này có nhiều tiềm năng trong việc kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản[35]

Hình 1.5: Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn [35]

1.2.3 S ự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh

Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong giới vi khuẩn Những enzyme có thể ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các loài vi khuẩn thuộc nhóm

Phân tử tín hiệu

Đáp ứng điều hòa

Gen mục tiêu Gen mục tiêu

Độc tố

ß-Proteobacteria [114], α-Proteobacteria và γ -Proteobacteria [101] cũng như ở một số loài thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương [25], [39] Những loài vi khuẩn này có thể khóa

hệ thống quorum sensing của những loài vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn

lọc Quá trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL có thể được xúc tác bởi hai l oại enzyme: AHL-acylase và AHL-lactonase

Enzyme AHL-acylase có khả năng bẻ gãy mạch cacbon của phân hủy AHL thành acid béo và homoserine lactone, tuy nhiên không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc

của phân tử AHL [38], [65], [106] Trong khi đó enzyme AHL-lactonase, điều khiển

bởi gen aiiA, có khả năng phân hủy phân tử AHL bằng cách xúc tác phản ứng mở vòng

lactone Điều này dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc hình thể tương đối của phân tử AHL, gây trở ngại cho việc gắn kết của phân tử AHL với protein điều tiết việc phiên mã LuxR, vì vậy một số kiểu hình (trong đó có yếu tố độc lực ở vi khuẩn gây bệnh) không

thể được biểu hiện Gen aiiA đầu tiên được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Bacillus sp

240B1 [37] Các dạng tương đồng của gen aiiA sau đó được tìm thấy ở nhiều loài Bacillus khác, bao g ồm Bacillus thuringiensis, B cereus, B anthracis, B mycoides và

B subtilis [39], [65], [86], [100], [106]. Các gen này có độ tương đồng cao (89 – 96%)

so với gen aiiA của chủng 240B1 Gần đây, Yin và cs (2010) đã phát hiện được sự có

mặt gen của gen aiiA từ Bacillus amyloliquefaciens, một loài tương đồng với B

Hình 1.6: Sự phân hủy phân tử AHL bằng enzyme [35]

Axít béo

subtilis Gen này có độ tương đồng 87- 99,3% so vớ i các dạng tương đồng ở các loài

Bacillus khác, trong khi trình tự acid amin của AHL-lactonase có độ tương đồng 89,6 – 99,6%

1.4 TỔNG QUAN VI KHUẨN Bacillus

1.4.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus

Theo khóa phân loại của Bergey , chi Bacillus được phân loại như sau:

Chi Bacillus là một chi lớn (51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài

chưa được phân loại rõ ràng), và đa dạng, thuộc họ Bacillaecea Họ này chia làm 5 chi

gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfotomaculum; đặc

trưng của họ này là sự hình thành nội bào tử

Đặc điểm của chi Bacilllus được mô tả như sau:

Tế bào hình gậy, hoặc thẳng, kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10 μm, các tế bào thường

xếp thành cặp hoặc chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông Là vi khuẩn gram dương, di động

nhờ roi Một tế bào chỉ có duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình

trụ, chịu được điều kiện bất lợi như nhiệt độ, acid, sự hình thành bào tử không bị ngăn

cản bởi sự tiếp xúc không khí Là vi khuẩn g ram dương hoặc chỉ cho gram dương ở giai đoạn đầu của sự phát triển, con đường biến dưỡng bằng lên men hoặc hô hấp, hầu

hết có catalase dương tính Là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có phổ chịu đựng

pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn tại được trong điều kiện bất lợi một thời gian dài nên đa

số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn khác nhau Một số loài gây bệnh cho người như B.anthracis, B.cereus … [58].

Việc phân loại Bacillus trước đây dựa vào hai đặc tính: sinh trưởng trong điều

kiện hiếu khí và khả năng hình thành nội bào tử, kết quả đã phân loại nhiều vi khuẩn có đặc tính sinh lý và đặc điểm sinh học khác nhau Tuy nhiên do sự không đồng nhất về đặc điểm sinh lý, sinh thái và di truyền học dẫn đến khó khăn cho việc phân loại chi

Bacillus Vi ệc ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại cho thấy chi Bacillus có

thành phần G-C khoảng 32-69% Khi tiến hành lập cây phát sinh loài bằng trình tự 16S RNA cho thấy chi Bacillus có quan hệ gần với một số nhó m loài không sinh bào tử: như có quan hệ với Enterococcus, Lactobacillus, và Streptococcus ở mức bộ và Listeria và Staphylococcus ở mức họ Mặc khác, một số thành viên trước đây thuộc chi

Bacillus đã được phân loại lại và thuộc những họ mới bao gồm:

Acyclobacillaceae, Paenibacillaceae và Planococcaceae [58]

1.4.2 Dinh dưỡng và sinh trưởng

Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hoá dị dưỡng có khả năng

hô hấp khi sử dụng một số hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, amino acid, acid hữu

cơ Trong một số trường hợp , chúng có khả năng lên men hỗn hợp cacbonhydrat tạo glycerol và butandiol Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus (ngoại trừ B.megaterium và

một số loài khác) yêu cầu amino acid, vitamin B hoặc cả hai hợp chất trên cho sự tăng trưởng Phần lớn, chúng là vi khuẩn ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu

từ 30- 45o

C, một số là vi khuẩn chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu lên tới 65o

C, còn lại là những vi khuẩn ưa lạnh, có thể sinh trưởng và tạo bào tử ở 0o

C Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus sinh trưởng trong khoảng pH rộng từ 2-11 Trong phòng thí

nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu Bacillus có thời gian thế hệ khoảng 25 phút

[58], [124]

1.4.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus

Nội bào tử được mô tả đầu tiên bởi Cohn (1872) khi nghiên cứu về B.subtilis và sau đó đượ c Koch (1875) mô tả khi nghiên cứu về B.anthracis Cohn đã chứng minh

khả năng chịu nhiệt của bào tử B.subtilis trong khi Koch cũng đã mô tả được sự hình

thành bào tử trong B.anthracis Do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử

được cho là dạng tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào, chúng

có khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài, có thể hàng triệu năm

Ở trạng thái không nhuộm màu, nội bào tử có màu đen ở mép, rất sáng và chiết quang Cấu trúc của một bào tử gồm:

- Nang bào tử

- Áo bào tử

- Vỏ bào tử

- Lõi bào tử: gồm thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất, vùng nhân

Hình 1.7: Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus [124]

Bào tử không được hình thành trong suốt hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào Nội bào tử chỉ hình thành khi tế bào bắt đầu đi vào pha ổn định và trong điều kiện môi trường bất lợi thường thiếu dinh dưỡng hoặc sinh ra các sản phẩm trao đổi chất có

hại Thông thường mỗi tế bào chỉ hình thành một bào tử và sau khi trưởng thành bào tử được phóng thích ra khỏi tế bào Ở bào tử trưởng thành không diễn ra quá trình trao đổi

chất (được xem như ở trạng thái ngủ), có khả năng chịu đựng điều kiện môi trường

khắc nghiệt như nhiệt độ (có thể sống sót sau khi đun sôi vài giờ), phóng xạ, acid, chất

tẩy….Vì vậy sự hình thành nội bào tử là cơ chế đảm bảo cho sự sống còn của vi khuẩn khi trải qua điều kiện khắc nghiệt không phải là một cơ chế sinh sản [124]

Trong các loài Bacillus đã được nghiên cứu, quá trình hình thành bào tử tương

tự nhau Toàn bộ quá trình diễn ra trong vòng 6-7 giờ và có sự tham gia điều hòa của hơn 50 gen, bắt đầu bằng việc DNA xoắn lại, và một nhiễm sắc thể được bao quanh

bởi màng nguyên sinh chất hình thành nên bào tử sơ khai, kết thúc quá trình này bằng

việc hình thành áo bào tử, vỏ bào tử và nang bào tử Tiếp theo đó, bào tử bị mất nước

để hình thành bào tử trưởng thành và phóng thích khỏi tế bào mẹ [124]

1.4.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản

Bacillus ứng dụng trong thủy sản như: làm tăng khả năng sống, thúc đẩy sinh trưởng [120], kích thích tiêu hóa [82], tăng cường đáp ứng miễn dịch [102] và cải thiện

chất lượng nước [76] Các chủng B subtilis sản xuất enzyme ngoại bào như protease

và một số enzyme khác đã đóng góp vào hoạt tính enzyme tự nhiên của tôm, cá [81],đóng góp nguồn vi lượng và đa lượng bổ sung thức ăn [104] Hơn nữa, B subtilis sản

sinh các hợp chất kháng khu ẩn, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống góp phần

ức chế vi khuẩn gây bệnh [102]. B.licheniformis được chứng minh có hoạt t ính kháng virut [106], trong khi đó B pumilus sản xuất enzyme ngoại bào bao gồm amylase,

cellulase, là những enzyme quan trọng trong hoạt động tiêu hóa của cá bột [49]

Sử dụng B licheniformis, B subtilis, B polymixa, B laterosporus và B circulans tăng

hiệu quả sử dụng thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng ấu trùng cá tầm Acipenser nudiventris [120]

Hơn nữa Bacillus có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, giúp giảm chu kì thay

nước và cải thiện môi trường, do có khả năng khử nitrate, phân hủy chất hữu cơ thải ra

từ thức ăn thừa nhờ có các enzyme ngoại bào như protease, amylase, lipase….Ngoài

ra, một số chủng Bacillus còn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng Vibrio sp, Aeromonas

sp, … giúp phòng và ức chế bệnh trong nuôi trồng thủy sản [57], [106]