Khảo sát thành phần hóa học cao Cloroform cây Giảo Cổ Lam Gynostemma pentaphyllum họ bầu bí (Curcubitaceae)

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng thảo mộc làm thuốc trị bệnh, tuy nhiên việc sử dụng cây thuốc chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian, không quan tâm đến thành phần hóa học và hàm lượng các hoạt chất có trong cây. Ngày nay, những hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong thực vật như: flavonoid, terpennoid, steroid, glycoside,…ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các ngành y học và dược học. Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học của các loài thực vật là điều kiện cần thiết để góp phần khai thác, sử dụng cây thuốc một cách có hiệu quả và hệ thống. Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có nguồn thực vật phong phú và đa dạng, trong đó có nhiều cây thuốc quý. Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum), thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae), từ lâu nó được sử dụng cho vua chúa để tăng sức khỏe, kéo dài tuổi thọ và làm đẹp. Vì thế, trên tinh thần mong muốn góp phần tìm hiểu mối quan hệ giữa thành phần hóa học của cây với những công dụng dược tính đã được sử dụng trong dân gian, nên chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao cloroform của cây giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum).

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





NGUYỄN THÁI KHƯƠNG NINH

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO CLOROFORM

CÂY GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM

HỌ BẦU BÍ (CURCUBITACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Lê Quan, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn GS.TSKH Nguyễn Công Hào - Viện Công nghệ hóa học , PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh - Viện Công nghệ hóa học, TS Nguyễn Trung Nhân và TS Đoàn Ngọc Nhuận - Bộ môn Hóa hữu

cơ trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn

Em xin cảm ơn các Thầy cô Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học

Tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả bè bạn đã quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

s singlet, mũi đơn

d doublet, mũi đôi

dd doublet of doublet, mũi đôi đôi

m multiplet, mũi đa

br broad, rộng

J coupling constant, hằng số ghép

SKBM sắc ký bản mỏng

RP-18 Reversed Phase-18, pha đảo C-18

NMR Nuclear Magnetic Resonance

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

COSY COrrelation spectroscopy ROESY Rotating frame Overhause Effect SpectroscopY Ara α-L-arabinopyranosyl

Rha α-L-rhamnopyranosyl Glu β-D-glucopyranosyl

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

1 TỔNG QUAN 1

1.1 Vài nét về họ Curcubitaceae 1

1.2 Sơ lược về cây giảo cổ lam 1

1.2.1 Mô tả thực vật 1

1.2.2 Phân bố sinh thái 2

1.2.3 Dược tính 3

1.2.4 Thành phần hóa học trong cây giảo cổ lam 3

1.2.4.1 Các carotenoid 4

1.2.4.2 Các polysaccharid 6

1.2.4.3 Các sterol 6

1.2.4.4 Các flavonoid 8

1.2.4.5 Các saponin 9

2 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 20

2.1 Giới thiệu chung 20

2.2 Biện luận và kết quả 20

2.2.1 Hợp chất CN1 20

2.2.2 Hợp chất CN2 24

2.2.3 Hợp chất CN3 26

2.2.4 Hợp chất CN4 29

2.2.5 Hợp chất CN5 32

2.2.6 Hợp chất CN6 35

2.2.7 Hợp chất CN7 .41

3 THỰC NGHIỆM 47

3.1 Điều kiện thực nghiệm 47

3.2 Trích ly cao thô 48

3.3 Quá trình cô lập 50

3.3.1 Khảo sát phân đoạn C1 51

3.3.2 Khảo sát phân đoạn C4 52

3.3.3 Khảo sát phân đoạn C5 53

3.3.4 Khảo sát phân đoạn C7 54

3.3.5 Khảo sát phân đoạn C8 55

4 KẾT LUẬN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng thảo mộc làm thuốc trị bệnh, tuy nhiên việc sử dụng cây thuốc chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian, không quan tâm đến thành phần hóa học và hàm lượng các hoạt chất có trong cây Ngày nay, những hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong thực vật như: flavonoid, terpennoid, steroid, glycoside,…ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các ngành y học và dược học Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học của các loài thực vật là điều kiện cần thiết để góp phần khai thác, sử dụng cây thuốc một cách có hiệu quả và hệ thống

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có nguồn thực vật phong phú

và đa dạng, trong đó có nhiều cây thuốc quý Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum), thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae), từ lâu nó được sử dụng cho vua chúa để tăng sức khỏe,

kéo dài tuổi thọ và làm đẹp Vì thế, trên tinh thần mong muốn góp phần tìm hiểu mối quan hệ giữa thành phần hóa học của cây với những công dụng dược tính đã được sử dụng trong dân gian, nên chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao cloroform

của cây giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)

1.2 Sơ lược về cây giảo cổ lam:[2], [3], [4]

Giảo cổ lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, thuộc họ Bầu bí (Curcubitaceae), còn gọi là cam trà vạn, cây trường sinh, cây cỏ thần

kỳ, cây bổ đắng, sâm phương nam, dây lõa hùng, trường sinh thảo, ngũ diệp sâm, phúc âm thảo, jiaogulan (Trung Quốc), amachazuru (Nhật Bản), dungkulcha (Hàn Quốc), cha-satun (Thái Lan)

1.2.1 Mô tả thực vật:[5]

Giảo cổ lam là một loài cây thảo, có thân mảnh, leo nhờ tua cuốn đơn ở nách

lá Cây đực và cây cái riêng biệt Lá kép hình chân vịt

2

Cụm hoa hình chùy, mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, các cánh hoa rời nhau xòe hình sao, bao phấn dính thành đĩa, bầu có ba vòi nhụy Ra hoa vào tháng bảy hay tháng tám và bắt đầu có quả vào tháng chín hay tháng mười

Quả khô, hình cầu, đường kính 5-9 mm, khi chín màu đen

1.2.2 Phân bố sinh thái:[5]

Giảo cổ lam mọc trên đất đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng tới vùng núi cao 2000 m ở Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Triều Tiên, Indonesia và một số nước châu Á khác Ở nước ta, cây mọc từ Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Thừa Thiên Huế, Kon Tum vào tới Đồng Nai

- Giúp bình ổn huyết áp, chống kết tụ tiểu cầu, làm tan huyết khối, ngăn ngừa xơ vữa mạch, ngăn ngừa các tai biến về tim, mạch, não

- Chống lão hóa, ngăn ngừa stress, giúp ăn ngon miệng, ngủ ngon giấc

- Ngăn ngừa ung thư não, phổi, thận, vú, tử cung, da, tuyến tiền liệt, tuyến giáp Giúp bệnh nhân sau phẫu thuật, chiếu tia xạ truyền hóa chất ăn ngủ tốt, mau hồi phục sức lực

- Làm giảm đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường, giúp giảm biến chứng do bệnh tiểu đường gây ra và tăng sức lực cho bệnh nhân

- Làm tăng miễn dịch của cơ thể, bảo vệ gan khỏi tác hại của hóa chất, rượu

- Chữa các trường hợp viêm phế quản mãn tính, mất ngủ, béo phì

- Làm cho nhuận tràng, giúp đại tiểu tiện thông suốt, dễ dàng

- Kích thích quá trình chuyển hóa lượng mỡ dư thừa trong cơ thể nhanh chóng

mà không cần phải ăn kiêng Đây là một bất ngờ lớn và đã được các nhà khoa học thế giới công nhận

Hiện nay ở Việt Nam, giảo cổ lam đã được sử dụng rộng rãi như một loại thực phẩm chức năng, được bào chế dưới dạng trà túi lọc, viên nang, nước giải khát rất thuận tiện cho người tiêu dung

1.2.4 Thành phần hóa học trong cây giảo cổ lam:[7]

Thành phần hóa học chủ yếu của giảo cổ lam là saponin (2.4%) và flavonoid Các saponin trong cây giảo cổ lam (còn gọi là gypenosid hay gynosaponin) có cấu trúc

4

triterpen khung dammaran, trong đó có nhiều hợp chất đã được xác định có trong thành phần saponin của nhân sâm và tam thất Ngoài ra, giảo cổ lam còn chứa các carotenoid, polysaccharid, sterol, các acid amin tan trong nước, nhiều vitamin và các nguyên tố vi lượng như Zn, Fe, Se

1.2.4.1 Các carotenoid:[8]

Vai trò của các carotenoid đã được chứng minh có tác dụng ngăn ngừa

các bệnh mãn tính Chẳng hạn như, lutein (1) làm giảm nguy cơ thoái hóa điểm vàng

và nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, lycopen (2) và β-caroten (3) ức chế sự tổng

hợp các cholesterol, do đó có khả năng làm tăng sự thoái biến các lipoprotein có phân

tử lượng thấp

Năm 2004, tác giả H L Liu và các cộng sự đã xác định một số carotenoid có trong cây giảo cổ lam bằng phương pháp HPLC, trong đó nhiều nhất là

5

lutein (1), tiếp theo là neoxanthin (4), neochrome (5), violaxanthin (6), luteoxanthin (7), β-caroten (3)

6

1.2.4.2 Các polysaccharid:[10]

Năm 2008, tác giả Xingbin Yang và các cộng sự đã xác định rằng glucose là monosaccharide chiếm nhiều nhất trong tổng lượng đường hiện diện trong cây giảo cổ lam với 23.2%, kế đến là galactose chiếm 18.9%, arabinose 10.5%, rhamnose 7.7%, acid galacturonic 4.7%, xylose 3.9%, mannose 3.1% và acid glucoronic 1.2%, ngoài ra còn có một lượng nhỏ ribose và fucose

1.2.4.3 Các sterol: [7], [11], [12]

Năm 2005, tác giả V R Naumovski và các cộng sự đã xác định trong

cây giảo cổ lam có sự hiện diện của các sterol thường gặp như ergostanol (8), sitosterol (9) và stigmasterol (10) với hàm lượng rất thấp (khoảng 0.0001%)[7] Các dẫn xuất thế 24,24-dimetylcholestanol cũng được Akihisa tìm thấy vào năm 1988-

1989 trong các loại cây thuộc họ Curcubitaceae Chondrillasterol (11) và spinasterol (12), hai xuyên lập thể phân tại C-24, là hai sterol chính có trong cây này Ngoài ra, các acetylen sterol đầu tiên (13, 14, 15, 16) cũng được cô lập từ cây giảo cổ lam vào

năm 1989.[12]

7

9

1.2.4.5 Các saponin:

Năm 1996, tác giả Lihong Hu và các cộng sự đã cô lập từ dịch trích

metanol của thân cây giảo cổ lam được bốn triterpenoid saponin (22-25) [14]

10 Năm 2004, tác giả Xin Liu và các cộng sự đã cô lập được năm saponin

mới khung ocotillon từ phần thân cây giảo cổ lam, đặt tên là gynosid A-E (26-30) [15]

HO

R1

OO

HOHO

OH

OOH

OHO

OHO

HO

OH

OOH

O OOH

30

Tiếp tục nghiên cứu trên cây này, vào năm 2004, tác giả Feng Yin cùng

các cộng sự đã cô lập được ba gypenosid mới (31-33) cùng với ba hợp chất khác đã nhận danh (34-36) [16]

12

OO

HO

OH

HOHO

OH

O

13

14

Cũng trong năm 2004, tác giả Ăke Norberg và các cộng sự, trong đó có các nhà khoa học Việt Nam đã cô lập được một gypenosid mới, đặt tên là phanosid (21,23)-epoxy,3β-,20-,21-trihydroxydammar-24-ene-3-O-{[α-D-rhamnopyranosyl(1

→2)][β-D-glycopyranosyl(1 →3)]-β-D-lyxopyranoside} (37) Phanosid với liều 500

µM kích thích tạo ra insulin in vitro ở mức gấp 10 lần khi lượng glucose là 3.3 mM và

có khả năng kích tạo insulin ở mức gấp bốn lần khi mức glucose là 16.7 mM Ở mức đường huyết trên, 2 µM hoạt chất glibenclamid, một thuốc tân dược quan trọng điều trị tiểu đường, chỉ có khả năng kích tạo insulin gấp hai lần Khi cho chuột uống phanosid (40 và 80 mg/ml), khả năng hấp thụ glucose được cải thiện đáng kể và mức insulin huyết thanh cũng được tăng cường [17]

15

Năm 2005, tác giả Feng Yin và các cộng sự đã cô lập được sáu hợp chất

triterpen saponin (38-43) có khung 21,23-lacton từ dịch trích metanol của thân cây

16

Năm 2006, tác giả Feng Yina cùng các cộng sự đã cô lập được chín

saponin mới (45-53) có khung dammaran từ dịch trích metanol của cây giảo cổ lam mọc hoang ở Trung Quốc Các hợp chất 45, 48 và 52 có hoạt tính kháng tế bào ung

thư dạ dày SGC-7901 và tế bào ung thư gan BEL-7402.[20]

17

R1O

R2HOHO

52R1= S2 R2= Me

53R1= S1 R2 = CHO

OH

Năm 2009, tác giả Xiao Wen Wang và các cộng sự đã cô lập được một

lignan mới là ligballinone (54) và đã ly trích thành công một lignan là ligballinol (55).[21]

Năm 2010, tác giả Đào Thị Ngọc Minh cùng các cộng sự đã cô lập được

sáu hợp chất, gồm ba flavonoid glycosid là BM1-3 (56-58), và ba triterpen saponin

có khung dammaran là BM4-6 (59-61) từ cao n-butanol của cây giảo cổ lam Trong

đó, (59) lần đầu tiên được cô lập từ cây này; (57), (58), (60) và (61) là bốn hợp chất

mới lần đầu tiên được công bố trên thế giới.[22]

18

19

20

2 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ

2.1 Giới thiệu chung:

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của phần trên mặt đất của cây giảo cổ lam, được thu hái ở vùng núi Phan Xi Păng (thuộc dãy núi Hoàng Liên Sơn) vào tháng 9 năm 2006 Mẫu cây được phơi khô, xay nhỏ rồi trích kiệt với metanol theo phương pháp đun hoàn lưu, lọc, thu hồi dung môi thu được cao metanol thô Cao metanol đem hòa tan vào nước rồi trích lỏng-lỏng lần lượt với

các dung môi eter dầu hỏa, cloroform, n-butanol thu được các cao tương ứng

Trên cao cloroform, thực hiện sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường và pha đảo nhiều lần với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau chúng tôi đã cô lập

được bảy hợp chất, ký hiệu CN1, CN2, CN3, CN4, CN5, CN6 và CN7 Sau đây là

phần biện luận để xác định cầu trúc các hợp chất này

2.2 Biện luận và kết quả:

2.2.1 Hợp chất CN1:

Hợp chất CN1 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi

metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly eter dầu hỏa-etyl acetat (7:3) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu vàng

21

Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH

7.68 (1H, dd, J 2.5; 8.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 7.08 (1H, d, J

8.5, H-5′) và δH 7.72 (1H, d, J 2.5, H-2′); và hai proton ghép cặp meta với các proton ở

δH 6.37 (1H, d, J 2.0, H-6) và δH 6.68 (1H, d, J 2.0, H-8), cho thấy CN1 có hai vòng

thơm, một vòng mang ba nhóm thế và một vòng mang bốn nhóm thế Ngoài ra còn có

sự hiện diện của hai nhóm –OCH3 ở δH 3.85 (3H, s), 3.85 (3H, s) và một nhóm –OH

kiềm nối ở δH 12.45 (1H, s)

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 17 carbon, trong đó có 10 carbon tứ cấp, năm carbon metin, và hai carbon metyl Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon carbonyl ở δC 176.1 (C-4),

14 carbon vòng thơm và hai carbon sp3 Vậy hợp chất CN1 là một flavonoid có hai

nhóm thế -OCH3

Trên phổ HMBC, proton ở δH 6.37 (H-6) và δH 6.68 (H-8) ghép cặp

meta với nhau và đều cho tương quan với carbon vòng thơm tứ cấp gắn oxygen ở δC165.0 và tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 104.0 nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-10 Hai proton này cũng lần lượt cho tương quan với hai carbon vòng thơm oxygen hóa ở δC 156.1 và 160.4 nên hai carbon này lần lượt

là C-9 và C-5

Proton ở δH 7.68 (H-6′) và δH 7.72 (H-2′) đều cho tương quan với carbon

tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 123.3 và hai carbon vòng thơm gắn oxygen

ở δC 149.5 và δC 146.8; đồng thời proton ở δH 7.08 (H-5′) cho tương quan với carbon ở

δC 149.5 mà không cho tương quan với carbon ở δC 146.8 nên ba carbon này lần lượt phải là C-1′ (123.3), C-2 (146.8) và C-4′ (149.5) Bên cạnh đó, tương quan HMBC giữa H-5′ và H-2′ với carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δC 146.2 khẳng định đây chính là C-3′

Đặc biệt tín hiệu proton của hai nhóm metyl ở δH 3.85 (6H,s) cho tương quan HMBC lần lượt với C-7 và C-4′, cho thấy hai nhóm –OCH3 lần lượt gắn vào các

vị trí này

22

Hình 1: Tương quan HMBC của CN1 (phụ lục 1.6)

Từ những dữ liệu trên kết luận CN1 là 7,4′-dimetylquercetin, còn có tên

gọi khác là ombuin, một dẫn xuất dimetyl của quercetin Hợp chất này đã được công

bố trước đây từ cây giảo cổ lam [13]

146.8 136.4 176.1 160.4 97.5 165.0 91.9 156.1 104.0 123.3 114.8 146.2 149.5 111.8 119.8 55.6 56.0

C-5, C-7, C-8, C-10

C-7, C-9, C-6, C-10

C-3′, C-2,C-6′, C-4′ C-2′, C-4′, C-5′

C-4′, C-2′,C-1′,C-3′ C-2′, C-5′, C-2,C-4′

24

2.2.2 Hợp chất CN2:

Hợp chất CN2 được cô lập dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, tan

trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng pha đảo giải ly bằng hệ dung ly nước (1:2) cho vết tròn có Rf 0.5, hấp thu UV, hiện hình bằng hơi iod

metanol-Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH

7.57 (1H, dd, J 2.0;8.5, H-6) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 6.98 (1H, d, J 8.5,

H-5) và δH 7.45 (1H, d, J 2.0, H-2), cho thấy CN2 có một vòng thơm mang ba nhóm

thế Ngoài ra còn có sự hiện diện của một nhóm –OCH3 ở δH 3.93 (3H, s), và hai

nhóm –OH ở δH 4.86

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của tám carbon, trong đó có bốn carbon tứ cấp, ba carbon metin và một carbon metyl Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon của nhóm ester gắn trên vòng thơm ở δC 170.0 Vậy hợp chất CN2 là một vòng thơm có ba nhóm thế, trong đó

có một nhóm là dẫn xuất của acid carboxylic

Trên phổ HMBC, proton ở δH 7.57 (H-6) và δH 7.45 (H-2) ghép cặp

meta và đều cho tương quan với carbon carbonyl của acid gắn trên vòng thơm ở δC170.0 và tương quan với carbon vòng thơm tứ cấp gắn nhóm ester ở δC 124.4, nên carbon này là C-1 Proton ở δH 7.45 (H-2) và δH 6.98 (H-5) đều cho tương quan với hai carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δC 156.3 và δC 147.3 nên hai carbon này lần lượt là C-4 và C-3 Tín hiệu proton của nhóm metyl ở δH 3.93 (3H, s) cho tương

quan HMBC với carbon carbonyl của nhóm acid, cho thấy nhóm –OCH3 gắn trên vị trí này

25

Hình 2: Tương quan HMBC của CN2 (phụ lục 2.5)

Từ những dữ liệu trên kết luận CN2 là metyl 3,4-dihydroxybenzoat

Bảng 2: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất CN2 (MeOH-d4)

7.45 (d, J 2.0)

6.98 (d, J 8.5) 7.57 (dd, J 2.0; 8.5)

124.4 117.3 147.3 153.3 111.7 123.7 170.0 56.4

C-2, C-4, C-1, C-7

C-5, C-4, C-2 C-2, C-1, C-3

26

2.2.3 Hợp chất CN3:

Hợp chất CN3 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi

metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform-metanol (9:1) cho vết tròn có Rf 0.3, hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu vàng

Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH

8.10 (2H, d, J 8.5, H-2′ và H-6′) ghép cặp ortho với δH 6.91 (2H, d, J 8.5, 3′ và 5′); và hai proton ghép cặp meta ở δH 6.41 (1H, d, J 2.0, H-6) và δH 6.20 (1H, d, J 2.0,

H-H-8) cho thấy CN3 có hai vòng thơm, một vòng thơm mang hai nhóm thế và một

vòng thơm mang bốn nhóm thế

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 vả DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 15 carbon, trong đó có chín carbon tứ cấp, sáu carbon metin Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon carbonyl ở δC 177.4 (C-4), 14 carbon vòng thơm

Vậy hợp chất CN3 là một flavonoid

Trên phổ HMBC, proton ở δH 6.41 (H-6) và δH 6.20 (H-8) ghép cặp

meta với nhau và đếu cho tương quan với carbon tứ cấp gắn oxygen ở δC165.6 và tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 104.6 nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-10 Hai proton này cũng lần lượt cho tương quan với hai carbon vòng thơm oxygen hóa ở δC 158.3 và 162.5 nên hai carbon này lần lượt là C-5

và C-9

27

Proton ở δH 8.10 (H-2′ và H-6′) cho tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 123.7 và carbon vòng thơm gắn oxygen ở δC 148.1 nên hai carbon này lần lượt là C-1′ và C-2′

Proton ở δH 8.10 (H-2′ và H-6′) và δH 6.91 (H-3′ và H-5′) đều cho tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δC 160.5 nên carbon này là C-4′

Hình 3: Tương quan HMBC của CN3 (phụ lục 3.5)

Từ những dữ liệu trên kết luận CN3 là 3,4′,5,7-tetrahydroxyflavon hay

còn gọi là kaempferol

6.91 (d, J 8.5) 8.10 (d, J 8.5)

148.1 137.1 177.4 158.3 94.5 165.6 99.3 162.5 104.6 123.7 116.3 130.7 160.5 130.7 116.3

C-5, C-7, C-8, C-10

C-7, C-9, C-6, C-10

C-3′, C-2, C-6′, C-4′ C-2′, C-4′, C-1′, C-5′

C-4′, C-6′, C-1′, C-3′ C-5′, C-2, C-4′, C-2′

O OH

2

3 4 5

6

7

8 9

10

1'

2'

3' 4' 5' 6'

Glu

Hợp chất CN4 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi

metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform-metanol (8:2) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu vàng

Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH

7.73 (1H, dd, J 2.5; 8.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 7.06 (1H, d, J

8.5 H-5′) và δH 7.60 (1H, d, J 2.5, H-2′); và hai proton ghép cặp meta với các proton ở

δH 6.38 (1H, d, J 2.0, H-6) và δH 6.72 (1H, d, J 2.0, H-8) Ngoài ra còn có sự hiện diện

của hai nhóm –OCH3 ở δH 3.86 (3H, s, 7-OCH3), 3.86 (3H, s, 4′-OCH3) Những dữ

kiện này cho thấy aglycon của CN4 có cấu trúc của 7,4′-dimetylquercetin, tương tự như CN1 Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR của CN4 còn chocác mũi cộng hưởng của một proton anomer ở δH 5.51 (1H, d, J 7.5, H-1′′)

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 23

ba carbon, trong đó có 15 tín hiệu carbon khung flavonol tương tự như CN1, một carbon metylen và năm carbon metin vùng đường chứng tỏ CN4 có một đơn vị đường

là D-glucose Ngoài ra, CN4 cũng có hai nhóm thế -OCH3 ở δC 56.1 và δC 55.7

Phổ COSY và HSQC xác nhận một đơn vị đường là D-glucose Phổ

HMBC của CN4 còn cho thấy proton anomer của đơn vị đường ở δH 5.51 (H-1′′) cho

5.51 (d, J 7.5) 3.23 (m) 3.24 (m) 3.09 (m) 3.25 (m) 3.60 (dd, J 11.5);

3.33 (m)

156.3 133.8 177.6 160.9 97.9 165.2 92.2 156.2 105.1 122.5 115.8 145.9 150.1 111.4 121.5 56.1 55.7

100.7 74.1 76.5 70.0 77.6 61.0

C-5, C-7, C-8, C-10

C-7, C-9, C-6, C-10

C-1′, C-3′, C-2, C-4′, C-6′

C-4′, C-1′, C-3′, C-6′ C-2′, C-4′, C-2

32

2.2.5 Hợp chất CN5:

Hợp chất CN5 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi

metanol , sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform-metanol-nước (8:2:0.2) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu vàng

Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH

7.73 (1H, dd, J 1.5; 8.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 7.05 (1H, d, J

8.5 H-5′) và δH 7.53 (1H, d, J 1.5, H-2′); và hai proton ghép cặp meta với các proton ở

δH 6.37 (1H, d, J 1.5, H-6) và δH 6.68 (1H, d, J 1.5, H-8) Phổ 1H-NMR của CN5 còn

xác nhận sự hiện diện của hai nhóm –OCH3 ở δH 3.86 (3H, s, 7-OCH3) và δH 3.86

(3H, s, 4′-OCH3) Những dữ kiện trên cho thấy aglycon của CN5 có cấu trúc dimetylquercetin tương tự như CN1 và CN4 Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho các mũi cộng hưởng của hai proton anomer ở δH 4.39 (1H, br.s, H-1′′′), δH 5.40 (1H, d, J 7.5,

7,4′-H-1′′) và sự hiện diện nhóm metyl –CH3 của một đơn vị đường deoxymannose ở δH

0.98 (3H, d, J 6.0, H3-6′′′)

Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 29

carbon, trong đó có 17 tín hiệu carbon của aglycon tương tự CN1 và CN4, một tín

hiệu carbon metylen, một nhóm metyl của đường α-L-rhamnose và 10 tín hiệu carbon

metin vùng đường, chứng tỏ CN5 có hai đơn vị đường là D-glucose và L-rhamnose

33

Sử dụng phổ COSY, HSQC cho phép xác định hai đơn vị đường chính

là β-D-glucose và α-L-rhamnose Ngoài ra, phổ HMBC của CN5 còn cho thấy hai

proton anomer của các đơn vị đường ở δH 5.51 (H-1′′), δH 4.39 (H-1′′′) lần lượt cho tương quan với δC 133.8 (C-3), δC 66.9 (C-6′′) Như vậy, đường D-glucose sẽ gắn trên khung flavonol tại vị trí C-3 và đường L-rhamnose sẽ gắn trên đường glucose tại vị trí C-6′′

Hình 5: Tương quan HMBC của CN5 (phụ lục 5.6)

Từ những dữ liệu trên kết luận CN5 là

7,4′-dimetylrutin-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1
2)][α-L-rhamnopyranosyl(1
6)]-β-D-glucopyranosid, còn có tên gọi khác là ombuosid Hợp chất này đã được công bố trước đây từ cây giảo cổ lam.[13, 22]

7.60 (d, J 2.5)

7.06 (d, J 8.5) 7.73 (dd, J 2.5; 8.5)

5.51 (d, J 7.5) 3.23 (m) 3.24 (m) 3.09 (m) 3.25 (m) 3.60 (dd, J 11.5);

3.33 (m)

4.39 (s) 3.41 (br.s) 3.33 (m) 3.06 (m) 3.27 (m) 0.97 (d, J 6.0)

156.7 133.8 177.5 160.9 98.0 165.2 92.3 156.4 105.0 122.5 115.8 145.9 150.1 111.3 121.5 56.1 55.6

101.2 74.0 76.4 69.8 75.8 66.9

100.8 70.6 70.4 71.8 68.2 17.7

C-5, C-7, C-8, C-10 C-7, C-9, C-6, C-10

C-1′, C-3′, C-2, C-4′, C-6′

C-4′, C-1′, C-3′, C-6′ C-2′, C-4′, C-2