Bước đầu nghiên cứu việc sử dụng nấm mốc để xử lý sinh khối rơm thành các đường dùng để sản xuất Ethanol

Sự thay đổi khí hậu, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên có giới hạn và nhu cầu sử dụng năng lượng toàn cầu tăng là một vấn đề cần quan tâm cấp thiết. Nhu cầu năng lượng toàn cầu tăng 50% vào năm 2025 và sự tăng trưởng kinh tế một cách nhanh chóng của các quốc gia thuộc Châu Á như Ấn độ, Trung Quốc. Để đáp ứng lại sự tăng trưởng kinh tế vào thế kỷ 21, chúng ta cần cố gắng hơn nữa việc nghiên cứu và sản xuất năng lượng sinh học từ nguồn nguyên liệu tái tạo, chi phí thấp và nguyên liệu có sẵn tại địa phương như chất thải sinh học và các phần còn lại từ nông nghiệp. Sự nỗ lực này không những làm giảm sự ô nhiễm môi trường, mà còn giảm việc khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt. Phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học hiện nay có giá thành rất cao, tuy nhiên, vì mục đích bảo vệ môi trường và phát triển bền vững nên sử dụng nhiên liệu sinh học. Công nghệ sinh học về lên men là một trong những kỹ thuật mà có thể ứng dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulosic, sẽ giúp chúng ta đạt được mục tiêu giữ được môi trường và nguồn năng lượng sử dụng. Đứng trước những nguy cơ thiếu hụt về nguồn nhiên liệu hóa thạch như dầu mỏ, than đá và cũng là mối quan tâm hàng đầu hiện nay, vì vậy nội dung và phạm vi của đề tài là “Bước đầu nghiên cứu việc sử dụng nấm mốc để xử lý sinh khối rơm thành các đường để sản xuất ethanol” sẽ góp phần vào việc nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu tái tạo được để sản xuất ethanol sinh học phục vụ cuộc sống bền vững Đề tài được thực hiện qua những nội dung như sau: A. Giai đoạn 1: Sử dụng nấm mốc để thủy phân rơm rạ thành đường. 1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm. 2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm.

PHẠM THỊ THANH THÚY

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU VIỆC SỬ DỤNG NẤM MỐC ĐỂ XỬ LÝ SINH KHỐI RƠM THÀNH CÁC ĐƯỜNG DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT ETHANOL

Chuyên ngành: Hóa Sinh

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

Khi bắt đầu để viết Luận văn, đặt biệt là Lời cảm ơn Em vô cùng xúc động

và xin gửi lòng cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Hoàng Quốc Khánh, trưởng Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam Thầy là người đã đưa ra ý tưởng về đề tài và luôn quan tâm, hướng dẫn, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt luận văn này.

Em xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa cũng như quí thầy cô Khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh, đã tận tâm truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt khóa học này.

Tôi xin cảm ơn anh Ngô Đức Duy, em Đào Thị Thu Hiền, cán bộ nghiên cứu Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, đã quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian làm luận văn.

Cảm ơn tất cả những người bạn thân thiết lớp cao học Hóa Sinh K15, chúng ta đã cùng nhau vượt qua khó khăn và động viên nhau trong học tập.

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn, con xin chân thành cảm ơn ông bà, cha mẹ đã luôn hết lòng yêu thương, chăm sóc, dạy dỗ con Gia đình là điểm tựa, là niềm tin để con vươn lên.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 08 năm 2010 Chân thành cảm ơn

Phạm Thị Thanh Thúy

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sản xuất nhiên liệu sinh học 3

1.1.1 Tình hình trên thế giới và tiềm năng 3

1.1.2 Tình hình ở Việt Nam và tiềm năng 4

1.2 Nguyên liệu lignocellulose 5

1.2.1 Cellulose 6

1.2.2 Hemicellulose 8

1.2.3 Lignin 9

1.3 Cơ chất xylan 10

1.4 Từ sinh khối cellulose thành Ethanol 11

1.5 Đạc điêm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm men Saccharomyces cerevisiae 11

1.6 Đạc điêm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm men Pichia stipitis 12

1.7 Đạc điêm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm sơi Trichoderma reesei 13

1.7.1 Mọt số đạc tính hệ enzyme cellulase và xylanase từ Trichoderma reesei 13

1.7.2 Mọt số yêu tố ảnh hương đên khả năng sinh enzyme cellulase và enzyme xylanase từ nấm Trichoderma reesei 16

1.7.2.1 Nguồn cacbon 16

1.7.2.2 Nguồn nitơ 17

1.7.2.3 Chất hoạt động bề mặt 17

1.7.2.4 pH và nhiệt độ 18

1.7.2.5 Sục khí 18

1.7.2.6 Lên men bán rắn 19

1.8 Các yêu tố ảnh hương đên quá trình thuy phân rơm rạ bơi enzyme cellulase và xylanase từ nấm mốc Trichoderma reesei 19

1.8.1 Anh hưởng của cấu trúc nguyên liệu 19

1.8.2 Anh hưởng của nhiệt độ 19

1.8.3 Anh hưởng của pH 20

1.8.4 Tương tác giưa cơ chất và enzyme 20

1.8.5 Anh hưởng của các chất kiềm hãm 20

1.9 Chuyên hóa sinh học từ cellulose thành ethanol 20

1.9.1 Vi sinh vật phân hủy 21

1.9.2 Lên men ethanol 21

1.10 Chuyên hóa sinh học từ xylose thành ethanol và các yêu tố ảnh hương đên quá trình lên men ethanol 22

1.11 Kêt quả nghiên cứu ngoài nước 24

1.12 Kêt quả nghiên cứu trong nước 27

Chương 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 29

2.1.1 Nguyên vật liệu 29

2.1.1.1 Rơm 29

2.1.1.2 Vi sinh vật 29

2.1.2 Hóa chất và môi trường 30

2.1.2.1 Hóa chất 30

2.1.2.2 Môi trường hoạt hóa và nuôi cấy vi sinh vật 31

2.2 Các phương pháp sử dụng 32

2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái Trichoderma reesei 32

2.2.1.1 Quan sát đại thể 32

2.2.1.2 Quan sát vi thể 32

2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái tê bào nấm men Pichia stipitis và Saccharomyces cerevisae 33

2.2.3 Phương pháp xác định mật đọ bào tử nấm sơi và tê bào nấm men bằng buồng đêm hồng cầu 33

2.2.4 Phương pháp định lương đường khử 34

2.2.4.1 Nguyên tắc 34

2.2.4.2 Xây dựng đường chuẩn 34

2.2.4.3 Phương pháp đo mẫu thí nghiệm 34

2.2.4.4 Tính kết quả 34

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase và enzyme xylanase 35

2.2.5.1 Nguyên tắc 35

2.2.5.2 Xây dựng đường chuẩn Glucose/Xylose xác định hoạt tính enzyme 35

2.2.5.3 Phương pháp đo mẫu thí nghiệm 36

2.2.5.4 Tính kết quả hoạt tính enzyme cellulase và xylanase 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm 37

2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm 37

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm 38

2.3.4 Khảo sát hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm 38

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy phân rơm 39

2.3.6 Thủy phân rơm rạ trong bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ BTM, pH và chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm 39

2.3.7 Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis 40

Chương 3: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN 3.1 Khảo sát ảnh hương cua yêu tố thời gian đên hàm lương đường khử tạo ra trong quá trình thuy phân rơm 42

3.1.1 Theo dõi sự thay đổi pH trong quá trình thủy phân 42

3.1.2 Hàm lượng đường khử theo thời gian 43

3.1.3 Hoạt tính enzym cellulase 45

3.1.4 Hoạt tính enzym xylanase 46

3.1.5 Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm 48

3.2 Khảo sát ảnh hương cua mật đọ bào tử mốc đên hàm lương đường khử trong quá trình thuy phân rơm 50

3.2.1 Hàm lượng đường khử theo các kiểu mật độ bào tử mốc 50

3.2.2 Hoạt tính enzym cellulase và xylanase 51

3.2.3 Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm 52

3.3 Khảo sát ảnh hương cua yêu tố pH ban đầu đên hàm lương đường khử trong quá trình thuy phân rơm 52

3.3.1 Hàm lượng đường khử 52

3.3.2 Hoạt tính enzyme cellulase 52

3.3.3 Hoạt tính enzyme xylanase 54

3.3.4 Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm 55

3.4 Khảo sát hàm lương đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thuy phân rơm 56

3.4.1 Hàm lượng đường khử 56

3.4.2 Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase 57

3.4.3 Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm 58

3.5 Khảo sát ảnh hương cua chất hoạt đọng bề mạt lên quá trình thuy phân rơm 58

3.5.1 Hàm lượng đường khử 58

3.5.2 Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase 59

3.5.3 Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm 61

3.6 Thuy phân rơm rạ trong bình lên men với các điều kiện thời gian, mật đọ bào tử mốc, pH và chất hoạt đọng bề mạt đã chọn ơ các thí nghiệm trên 61

3.6.1 Hàm lượng đường khử 62

3.6.2 Hoạt tính cellulase và xylanse 62

3.7 Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức đọ khác

nhau với chung Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis 63

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận 664.2 Đề nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Danh mục thiết bị và dụng cụ

Phụ lục 2 Phương pháp phân tích

Phụ lục 3 Kết quả xử lý thống kê

- ODo : Mật độ quang thử không

- OD : Trung bình thử thật trừ trung bình thử không

- SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

- SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide gel

electrophoresis

- TCA : Tricloroacetic acid

- YPD : Yeast extract Pepton Destrose

- PVN : Tập đoàn Dầu khí Việt Nam

- NN và PTNN: Nông nghiệp và phát triển nông thôn

- CBMs : Carbohydrate-binding modules

- EMP : Embden-Meyerhoff-Parnas

- HPLC : High-performance liquid chromatography

- PDA : Potato Dextrose Agar

- CMC : Carboxymethyl cellulose

- NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide

- NLSH : Nhiên liệu sinh học

- DP : Degree of Polymerization

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rơm rạ 6

Bảng 1.2 Đặc tính sinh hóa của enzyme xylanases từ Trichoderma reesei 16

Bảng 1.3: Con đường vận chuyển xylose ở một vài loài vi khuẩn và nấm men 22

Bảng 2.1: Tóm tắt quá trình dựng đường chuẩn glucose 34

Bảng 2.2: Các bước tiến hành đo mẫu thí nghiệm 35

Bảng 2.3: Tóm tắt quá trình dựng đường chuẩn glucose/xylose 36

Bảng 2.4: Các bước của quá trình xác định hoạt tính cellulase và xylanase 36

Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm lên men ethanol 41

Bảng 3.1: Hàm lượng đường khử theo thời gian 43

Bảng 3.2: Hoạt tính enzym cellulase 45

Bảng 3.3: Hoạt tính enzym xylanase 47

Bảng 3.4: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm rạ 48

Bảng 3.5: Hàm lượng đường khử được tạo ra theo mật độ bào tử mốc 50

Bảng 3.6: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase 51

Bảng 3.7: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm rạ 52

Bảng 3.8: Hàm lượng đường khử tạo ra tương ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau trong quá trình thủy phân rơm 53

Bảng 3.9: Hoạt tính enzym cellulase 53

Bảng 3.10: Hoạt tính enzyme xylanse 55

Bảng 3.11: Hiệu suất thủy phân rơm ở các điều kiện pH khác nhau 55

Bảng 3.12: Hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 56

Bảng 3.13: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 57

Bảng 3.14: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm rạ 58

Bảng 3.15: Hàm lượng đường khử tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween- 80; 0,1% 59

Bảng 3.16: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi bổ sung và không

bổ sung Tween 80; 0,1% 59

Bảng 3.17: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm 61

Bảng 3.18: Hàm lượng đường khử 62

Bảng 3.19: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase 63

Bảng 3.20: Kết quả nồng độ ethanol 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Công thức hóa học của cellulose 6

Hình 1.2: Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain 7

Hình 1.3: Công thức hóa học của hemicellulose 8

Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin 9

Hình 1.5: Công thức hóa học của lignin 10

Hình 1.6: Vị trí phân cắt của hệ enzyme phân giải cellulose 15

Hình 1.7: Vị trí cắt của hệ enzyme phân giải xylan 16

Hình 1.8 Công thức cấu tạo Tween 80 17

Hình 1.9: Lên men ethanol từ xylose 23

Hình 2.1 Nguyên liệu rơm được xử lý sơ bộ 29

Hình 2.2 Nấm mốc Trichoderma reesei VTT-D-8013 30

Hình 3.1: Đồ thị biểu diên sự thay đổi pH ở các mốc thời gian thí nghiệm 42

Hình 3.2: Đồ thị biểu diên hàm lượng đường khử tạo ra theo thời gian 44

Hình 3.3: Sự biến đổi hoạt tính cellulase theo thời gian 46

Hình 3.4: Sự biến đổi hoạt tính xylanase theo thời gian 47

Hình 3.5: Đồ thị biểu diên hiệu suất quá trình thủy phân rơm 49

Hình 3.6: Biểu đồ biểu diên hoạt tính cellulase, xylanase theo mật độ bào tử mốc 51

Hình 3.7: Biểu đồ biểu diên hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 57

Hình 3.8: Biểu đồ biểu diên enzyme cellulase và xylanase tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween 80; 0,1% 60

MỞ ĐẦU

Sự thay đổi khí hậu, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên có giới hạn và nhu cầu sử dụng năng lượng toàn cầu tăng là một vấn đề cần quan tâm cấp thiết Nhu cầu năng lượng toàn cầu tăng 50% vào năm 2025 và sự tăng trưởng kinh tế một cách nhanh chóng của các quốc gia thuộc Châu Á như Ấn độ, Trung Quốc

Để đáp ứng lại sự tăng trưởng kinh tế vào thế kỷ 21, chúng ta cần cố gắng hơn nữa việc nghiên cứu và sản xuất năng lượng sinh học từ nguồn nguyên liệu tái tạo, chi phí thấp và nguyên liệu có sẵn tại địa phương như chất thải sinh học và các phần còn lại từ nông nghiệp Sự nỗ lực này không những làm giảm sự ô nhiễm môi trường, mà còn giảm việc khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt Phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học hiện nay có giá thành rất cao, tuy nhiên, vì mục đích bảo vệ môi trường và phát triển bền vững nên sử dụng nhiên liệu sinh học Công nghệ sinh học về lên men là một trong những kỹ thuật mà có thể ứng dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulosic, sẽ giúp chúng ta đạt được mục tiêu giữ được môi trường và nguồn năng lượng sử dụng

Đứng trước những nguy cơ thiếu hụt về nguồn nhiên liệu hóa thạch như dầu mỏ, than đá và cũng là mối quan tâm hàng đầu hiện nay, vì vậy nội dung và

phạm vi của đề tài là “Bước đầu nghiên cứu việc sử dụng nấm mốc để xử lý sinh khối rơm thành các đường để sản xuất ethanol” sẽ góp phần vào việc

nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu tái tạo được để sản xuất ethanol sinh học phục vụ cuộc sống bền vững

Đề tài được thực hiện qua những nội dung như sau:

A Giai đoạn 1: Sử dụng nấm mốc để thủy phân rơm rạ thành đường

1 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm

2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm

3 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm.

4 Khảo sát hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm

5 Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy phân rơm

6 Sử dụng bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ bào tử mốc,

pH và chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm trên

B Giai đoạn 2: Lên men ethanol từ các đường được tạo ra

7 Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác

nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis

Nội dung và kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở cho việc ứng dụng công nghệ lên men trong quá trình lên men sinh khối lignocellulosic Từ những kết quả nghiên cứu của đề tài với qui mô phòng thí nghiệm sẽ phát triển thành kỹ thuật ứng dụng cho các mô hình sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulosic qui

mô lớn hơn, đáp ứng việc sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học từ nguồn nguyên liệu tái tạo để phục vụ đời sống

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình sản xuất nhiên liệu sinh học

1.1.1 Tình hình trên thế giới và tiềm năng

Ngày nay, một số quốc gia sản xuất nhiên liệu sinh học (NLSH) như khí sinh học, ethanol sinh học và dầu diesel sinh học từ nguồn nguyên liệu tái tạo ngày càng gia tăng Toàn cầu sản xuất ethanol sinh học tăng từ 17,25 tỷ lít trong năm 2000 đến hơn 46 tỷ lít trong năm 2007, chiếm khoảng 4% của 1.300 tỷ lít xăng tiêu thụ trên toàn cầu Các chương trình ở Mỹ, châu Á và châu Âu dự kiến tổng nhu cầu nhiên liệu ethanol sinh học có thể phát triển hơn 125 tỷ lít vào năm

2020 [45]

Hoa Kỳ là nước sản xuất lớn nhất thế giới về nhiên liệu ethanol sinh học, chiếm gần 47% ethanol sinh học toàn cầu trong năm 2005 và 2006 EU cũng gia tăng sự phát triển năng lượng từ sinh khối gỗ, chất thải và cây trồng nông nghiệp, sản xuất ethanol sinh học tăng 71% và tiêu thụ đạt 2,44 tỷ lít trong năm 2007 Nhu cầu tiềm năng về ethanol sinh học dùng cho nhiên liệu phục vụ giao thông vận tải ở EU ước tính là khoảng 12,6 tỷ lít vào năm 2010 [45]

Brazil là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới về ethanol sinh học và sản xuất lớn thứ hai sau Hoa Kỳ, dự kiến sẽ tăng từ 15,4 tỷ lít trong năm 2004 và 26,0 tỷ lít vào năm 2010 Ethanol từ mía cung cấp 40% nhiên liệu cho xe hơi tại Brazil

và khoảng 20% được xuất khẩu sang Mỹ, EU và các thị trường khác [19]

Hơn 10 nhà máy nhiên liệu sinh học, đang hoạt động hoặc đang được xây dựng ở Canada, 130 nhà máy ở Hoa Kỳ năm 2006 và tại miền đông Canada và Hoa Kỳ, ngô được sử dụng làm nguyên liệu, ở phía tây Canada sử dụng lúa mì làm nguyên liệu Brazil sản xuất một lượng lớn ethanol từ mía, và nhiều xe trong nước đã được thiết kế để chạy trực tiếp bằng nhiên liệu ethanol Ở Châu Âu, ethanol được sản xuất tại Thụy Điển, Đan Mạch, Đức, Anh, Pháp, Ý và Tây Ban Nha Nhiều quốc gia châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, và Indonesia cũng đang phát triển năng lực sản xuất ethanol [43]

1.1.2 Tình hình ở Việt Nam và tiềm năng

Việt Nam có nhiều tiềm năng về NLSH có thể làm nhiên liệu thay thế cho xăng dầu nguồn gốc dầu mỏ Nhiều loại cây như sắn, ngô, mía, có thể sản xuất cồn sinh học mà ở Việt Nam lại có nhiều vùng đất rất thích hợp với các loại cây trồng này Sản lượng sắn cả nước năm 2007 là hơn 7 triệu tấn, mía đường hơn 14 triệu tấn và ngô gần 4 triệu tấn Với sản lượng này có thể đáp ứng được cho nhu cầu sản xuất cồn sinh học ở quy mô vừa và nhỏ Ước tính Việt Nam có thể sản xuất khoảng 500 triệu lít ethanol sinh học mỗi năm nếu như tổ chức quy hoạch và thực hiện vùng nguyên liệu theo hướng sử dụng đất triệt để, tạo ra nhiều loại giống có sản lượng cao và sở hữu các công nghệ tách dầu từ nguyên liệu

Theo đánh giá của Bộ Công Thương, ngành công nghiệp Nhiên liệu sinh học Việt Nam đang tăng tốc nhanh Theo kế hoạch, đến năm 2011, cả nước sẽ có

5 nhà máy sản xuất ethanol nhiên liệu đi vào hoạt động với tổng công suất 365.000 tấn/năm đủ để pha chế 7,3 triệu tấn xăng E5 [47]

Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam đã giao cho các công ty thành viên Tổng Cty Dầu Việt Nam, Tổng công ty Dịch Vụ Tổng hợp dầu khí xây dựng chiến lược phát triển vùng nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất của các nhà máy Nhiên liệu sinh học Công ty NLSH Phương Đông (OBF), đã ký văn bản hợp tác với Sở NN và PTNN của tỉnh Bình Phước về hợp tác trồng cây sắn trên địa bàn của tỉnh Công ty còn làm việc với một số tổ chức tài chính như Tổng công ty Tài Chính dầu khí, Ngân hàng BIDV, Ngân hàng Hàng Hải, Ngân hàng Thương Mại cổ phần Việt Nam (Vietcombank), về khả năng cung cấp những khoản vay tín dụng cho nông dân trồng sắn, cho những doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh, cung cấp sắn lát cho nhà máy ethanol Bình Phước [48]

Song song với việc phát triển vùng nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất ethanol, Tổng công ty Dầu Việt Nam đang tiến hành hợp tác với Công ty Idemitsu và Công ty NBF của Nhật Bản nghiên cứu triển khai việc nhập các giống cây Jatropha có năng suất cao trên thế giới về trồng thử nghiệm tại Bình Thuận, Việt Nam để làm cơ sở phát nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất dầu diesel tương lai Trên cơ sở chọn lọc và thuần hóa các giống quốc tế tại Bình

Thuận, giống Jatropha có năng suất cao sẽ được trồng đại trà tại các nơi đất khô cằn, đất hoang hóa tại Bình Thuận, Ninh Thuận, Quảng Trị, Quảng Ngãi để thu dầu Jatropha PV OIL sẽ tiến hành nghiên cứu việc xây dựng nhà máy diesel sinh học khi sản lượng dầu từ cây Jatropha và việc trồng cây Jatropha có hiệu quả kinh tế đối với nông dân [48].

Tập đoàn Dầu khí Việt Nam cho biết, từ tháng 8 năm 2010 sẽ đưa sản phẩm xăng sinh học E5 bán tại hơn 20 điểm ở TP Hồ Chí Minh, Hà Nội, Vũng Tàu, Hải Phòng và Hải Dương Sau đó, xăng sinh học E5 sẽ được mở rộng ra 3 cửa hàng ở Đà Nẵng, 3 cửa hàng ở Huế và 5 cửa hàng ở Cần Thơ Và bắt đầu năm 2012, PVN sẽ cung ứng khối lượng lớn sản phẩm xăng sinh học E5 cho thị trường cả nước [49]

1.2 Nguyên liệu lignocellulosic

Lignocellulosic gồm các thành phần chính như: cellulose, hemicellulose, lignin Cellulose, là thành phần chính, đã được nghiên cứu nhiều nhất Cellulose

là polymer mạch thẳng được liên kết bởi β (1 → 4) glucosid Không giống như cellulose, hemicellulose là một heterosaccharide bao gồm các monome carbohydrate khác nhau như galactose, mannose, xylose, glucose, và arabinose Hemicelluloses thường được phân loại theo sự hiện diện của đường khử như D-galactan, D-Mannan, D-xylan, L-arabinan, vv Các đường pentose chính trong hemicellulose (tức là, β-D-xylopyranose như được tìm thấy trong xylan) là đại diện chung nhất của một hemicellulose Các đường pentose khác là arabinose, thường liên kết với xylose và galactose trong arabinoxylan và arabinogalactan, tương ứng D-xylan bao gồm 15 - 30% của cây nhiều năm, 20 - 25% gỗ cứng, và

7 - 12% của gỗ mềm Các thành phần của các loại đường khác nhau hiện diện trong polysaccharides cùng với lignin và tro trong vật liệu lignocellulosic khác nhau được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rơm rạ [11]

Lignocellulosic

Hydrate cacbon(% )

Không phải hydrate cacbon (%)Glucose Mannose Galactose Xylose Arabinose Lignin Tro

Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản, các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm Các vi sợi được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi

sự tấn công của enzyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân

1.2.1 Cellulose

Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose được tìm thấy ở thành tế bào thực vật D-glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β (1 - 4) glucosid với mức độ trùng hợp không nhỏ hơn 15.000 DP Thành phần cellulose của gỗ khác nhau giữa các loài từ khoảng 40-50% Mức độ trùng hợp (DP) của cellulose là trong khoảng 10.000-15.000 DP [8]

Hình 1.1: Công thức hóa học của celluloseCác mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình Trong

vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt nên dễ bị tấn công Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình.

Hình 1.2: Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain) [8]

1 Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed Fibrillar): phân tử cellulose kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500Å, xếp xen kẽ với vùng vô định hình

2 Kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm

a và b như trên hình vẽ Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi góc

Sợi đơn, b

Sợi đơn, a

Gấp khúc

Đường thẳng

Kiểu Nhiều sợi nhỏ hợp thành

Kiểu Chuỗi gấp khúc

Vô định hình Vùng kết tinh

liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi

180o cho toàn mạch Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glucosid) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro

Cellulose được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, điều này làm cho cellulose khá bền vững với tác động của enzyme cũng như hóa chất

1.2.2 Hemicellulose

Hemicellulose là một loại polymer phức tạp, phân nhánh và độ trùng hợp

khoảng 70 - 200 DP Hemicellulose chứa cả đường 6 (galactose-D, L-galactose, D-mannose, L-rhamnose, L-fructose) và đường 5 (D-xylose, L-arabinose), acid uronic (D-glucuronic acid) và chứa một lượng nhỏ nhóm acetyl Thành phần của hemicellulose phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu Hemicellulose trong gỗ cứng chứa chủ yếu là xylan (15-30%) trong khi ở gỗ mềm chứa galactoglucomannan (15-20%) và xylan (70-10%) chiếm ưu thế Thành phần cơ bản của hemicellulose

là β - D - xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β - (1,4)

Hình 1.3: Công thức hóa học của hemicelluloseCấu tạo của hemicellulose đa dạng tùy vào từng loại nguyên liệu và có một vài điểm chung gồm:

- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4) Xylose là thành phần quan trọng nhất Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3.

- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này Hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại

ở dạng vô định hình và dễ bị thủy phân hơn so với cellulose

1.2.3 Lignin

Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn Lignin là polymer, được cấu từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p-coumary [9]

Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của ligninLignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia

liên kết cao nhất với khối hemicellulose Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin)

Hình 1.5: Công thức hóa học của lignin

1.3 Cơ chất xylan

Xylan là một hemicellulose phổ biến nhất trong tự nhiên, có thể chiếm từ 30% khối lượng trong rơm rạ (cây một vụ), 15 – 30% cây gỗ lá rộng, 7 – 10% cây gỗ lá kim [9] Xylan là một polymer có liên kết 1,4 của xylose Xylan khu trú trong thành tế bào thực vật bậc cao, đặc biệt trong gỗ mộc và cỏ Xylan có nhiều tên dạng: xylan, xyloglucan (phức hợp của D-xylose and D-glucose), glucomannan (phức hợp của D-glucose và D-mantose), galactoglucomannan (phức hợp của D-galactose, D-glucose và D-mannose) và arabinogalactan (phức hợp của D-galactose và arabinose) Tất cả xylan đều có mạch chính do các đơn phân xylopyranose (C5H10O5) nối với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside Bộ

khung xylan là các chuỗi ngắn của O-acetyl, α-L arabinofuranosyl, D-α glucuronic và các acid phenolic cố định Các chuỗi này được xem như các gốc R phân nhánh tại vị trí gắn kết với các nguyên tử C của khung protein Trong cấu tạo của xylan, các xylose tồn tại trong liên kết β-1,4 Mức độ polymer ở xylan cũng khác nhau, chẳng hạn, trong gỗ lá rộng và gỗ lá kim lần lượt là 150–200 và 70–130 đơn vị glucose/phân tử

Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử Nó khác nhau ở các loài thực vật, ở các mô và tế bào Do đó, sự thủy phân hoàn toàn của xylan đòi hỏi một sự kết hợp mạnh của nhiều enzym hoạt động Nó được thủy phân tốt bởi tổ hợp endoxylanase (1,4-D-xylan xylanohydrolase, EC 3.2.1.8) và 3-xylosidase (EC 3.2.1.37) do nhiều chủng vi khuẩn và nấm sinh tổng hợp

1.4 Từ sinh khối cellulose thành Ethanol

Việc chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh học ethanol có ba bước cụ thể là tiền xử lý, thủy phân và lên men Các nguyên liệu trở nên dễ tiếp cận hơn với các enzym sau khi tiền xử lý Cellulose phân cắt tạo thành đường khử mà đó

là cơ chất cho quá trình lên men

Cellulose là thành phần quan tâm chính và có thể xử lý bằng phương pháp hóa học hoặc thủy phân bằng enzyme để tạo thành glucose làm chất nền chính trong quá trình lên men ethanol Hemicellulose có cấu trúc nhỏ gọn hơn so với cellulose và có thể bị phân hủy đáng kể hoặc hòa tan trong tiền xử lý

1.5 Đặc điểm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm men Saccharomyces cerevisiae

* Đặc điểm hình thái: Nấm men Saccharomyces cerevisiae thuộc cơ thể

đơn bào, tế bào dạng hình oval, chiều dài khoảng 10 micromet và chiều rộng khoảng 5 micromet

* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh

sản bằng phương pháp mọc chồi, sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu 28 – 320C Nấm men có khả năng lên men đường glucose để tạo thành ethanol Nhiệt độ lên men

tối ưu của Saccharomyces cerevisiae từ 28-320C

Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5 – 5,0 Nếu pH thấp khoảng 3,0 – 4,0 nấm men cũng hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp.Thông thường nồng độ dung dịch đường dùng cho lên men

bởi nấm men Saccharomyces cerevisiae từ khoảng 22 % khối lượng hoặc ít hơn.

* Đặc điểm sinh thái: Saccharomyces cerevisiae được phân bố vùng núi

Loài: Pichia stipitis (Pignal 1967)

* Đặc điểm hình thái: Nấm men Pichia stipitis thuộc cơ thể đơn bào, tế bào dạng hình oval

* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Nấm men Pichia stipitis, nhiệt độ tăng

trưởng tối ưu là 280C – 320C, nhiệt độ lên men là 320 – 340C, pH cho tăng trưởng

là 3 – 7, pH lên men là 3 - 8 [24]

* Đặc điểm sinh thái: Nấm men Pichia stipitis được phân bố vùng núi và

vùng nhiệt đới

1.7 Đặc điểm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm sợi Trichoderma reesei

* Phân loại

Trichoderma reesei là một loại nấm sợi sinh sản vô tính được phân lập từ

vải bông ở quần đảo Solomon vào thời Chiến tranh thế chiến thứ II, loài duy nhất

được phân lập là Trichoderma reesei QM6a, và được phân loại như sau [25]:

* Đặc điểm hình thái: Sợi nấm màu trắng, sau đó có màu xanh do bào tử

được hình thành Cuống bào tử có dạng chùm, phân nhánh liên tục, sinh ra các thể bình có dạng hình tam giác, mỗi nhánh kết thúc bởi một thể bình Đính bào tử hình cầu, đường kính 3,6 – 4,5 µm, có màu xanh lục, có vách xù xì

* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Trichoderma reesei sinh trưởng ở nhiệt độ

tối thiểu 00C, tối ưu 20 – 280C, tối đa 30 – 370C Sự tăng trưởng của sợi nấm sinh sắc tố màu vàng cam trên môi trường PDA

* Đặc điểm sinh thái: Trichoderma reesei được phân bố ở vùng cực Bắc,

vùng núi, vùng nhiệt đới

1.7 1 Một số đặc tính hệ enzyme cellulase và xylanase từ Trichoderma reesei

* Enzym Cellulase: là một phức hợp gồm nhiều enzym, các loại phức

hợp này sẽ lần lượt thủy phân cellulose thông qua thủy phân liên kết glucosid tạo sản phẩm cuối cùng là glucose

1,4-ß-* Phân loại: Hệ enzym cellulosic được phân thành ba nhóm chủ yếu:

Endo-ß-glucanase (EC 3.2.1.4), exo-ß-glucanase (EC 3.2.1.91) và ß-glucosidase (EC 3.2.1.21)

- Endo-ß-glucanase hay còn gọi là 1,4-ß-D-glucan glucanohydrolase,

CMCase, Cx: Enzym này tham gia phân giải liên kết β-1,4-glucosid trong mạng cellulose, trong lichenin và β-D-glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose dạng vô định hình, tác động yếu đến cellulose dạng kết tinh

- Exo-ß-glucanase hay còn gọi là 1,4-ß-D-glucan cellobiohydrolase, Avicelase, C1: Enzyme cắt đặc hiệu liên kết β-1,4 glucosid ở đầu tự do của cellulose để tạo thành cellobiose Không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng giúp cho enzym endocellulase phân giải chúng Cellobiohydrolase có hai loại khác nhau như

Trichoderma reesei CBH I và CBH II, trong đó, CBH I cắt chuỗi celluolose ở đầu

khử và CBH II cắt chuỗi cellulose ở đầu không khử [8]

- β-glucosidase hay còn gọi là cellobiase (EC.3.2.1.21): enzym này tham gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose [44]

* Tính chất của enzyme cellulase

Thuộc tính của enzyme cellulase thay đổi tùy theo nguồn gốc của chúng Cellulases là một protein có tính axit Enzyme cellullase có thể hoạt động ở dãy

pH từ 3 – 7, nhưng pH tối ưu là 4 – 5 và nhiệt độ tối ưu là 40 – 50°C Cellulase

bị ức chế bởi các sản phẩm như glucose và cellobiose được tạo ra trong phản ứng thủy phân Glucose ức chế β-glucosidase và cellobiose ức chế Endo-ß-glucanase

và Exo-ß-glucanase [44]

* Vị trí phân cắt của enzyme cellulase

Trong tự nhiên, thủy phân cellulose cần có sự tham gia của tất cả 3 loại enzyme endoglucanase, exolglucanase và β- glucosidase Mỗi loại enzym chỉ tham gia thủy phân một phần trong cellulose Các loại enzyme này thay phiên nhau thủy phân cellulose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose

Hình 1.6: Vị trí cắt của hệ enzyme phân giải cellulose

* Enzym xylanase: là một tác nhân sinh học thuộc nhóm enzym thủy

phân, chủ yếu xúc tác các phản ứng nội thủy phân các cầu nối xylosidic ở xylan và tạo ra xylose, qua đó phân hủy hemicelluloses một trong những thành phần quan trọng nhất của vách tế bào tế bào thực vật [37]

1,4-β-D-* Phân loại: Trichoderma reesei sản xuất ít nhất 4 loại

endo-1,4-β-xylanases (XYN I, II, III and IV, (EC 3.2.1.8) và β-xylosidases (EC 3.2.1.37)

* Tính chất của enzyme xylanase: Endo-1,4-β-xylanase và β-xylosidase thủy phân xylan thành xylose, β-xylosidase có hoạt tính cao với xylobiose nhưng không

có hoạt tính với xylan Tuy nhiên, một vài xylanases cũng có thể thủy giải xylooligomers thành xylose Hoạt tính xylanase cao nhất được xác định ở 80C Tuy nhiên nó vẫn duy trì hoạt tính xấp xỉ 70% ở 90C Tùy nhiệt độ tối ưu, enzym có thể được chia thành: nhóm chịu nhiệt trung bình (40 - 60C), nhóm chịu nhiệt (50

- 80C) và nhóm chịu nhiệt cao (> 80C) Hầu hết xylanase từ nấm thuộc nhóm xylanase chịu nhiệt trung bình và nhiệt độ tối ưu đối với xylanase từ nấm gỗ mục nhìn chung là 50 – 60C [41]

Bảng 1.2 Đặc tính sinh hóa của enzyme xylanases từ Trichoderma reesei [41]

Xylanase Trọng lượng phân tử (kDa) pI pH tối ưu

* Vị trí phân cắt của enzyme xylanase

Hình 1.7: Vị trí cắt của hệ enzyme phân giải xylan

1.7.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme cellulase và

enzyme xylanase từ nấm Trichoderma reesei

1.7.2.1 Nguồn cacbon

Tốc độ tổng hợp enzyme phụ thuộc vào cơ chất dùng cho thủy phân Một loạt các nguồn carbohydrate khác nhau đã được nghiên cứu cho sự tăng trưởng

của Trichoderma reesei QM9414 và cảm ứng xylanase Nhìn chung, lactose là

một nguồn cacbon thông thường và cảm ứng sản xuất enzyme công nghiệp (đặc

biệt là cellulase) đối với nấm Trichoderma reesei [41].

1.7.2.2 Nguồn nitơ

Nguồn nitơ trong nuôi cấy nấm Trichoderma reesei là ammonium sulphate hoặc dung dịch ammonia Nitrate hoặc urea không thích hợp cho nuôi

cấy T reesei, peptone và dịch chiết nấm men có thể làm tăng việc sản xuất

enzyme Ở điều kiện nuôi cấy lắc, 30 g/l lactose and 5 g/l ammonium sulphate là

sự lựa chọn tốt Tỉ lệ C:N (w/w) ban đầu là 4:1 (4gram lactose/1 gram ammonium sulphate) [41]

1.7.2.3 Chất hoạt động bề mặt

Việc phân loại các chất hoạt động bề mặt dựa trên khả năng hòa tan trong nước và được chia thành các loại như sau: chất hoạt động bề mặt có bản chất là Anionic, Nonionic và Cationic [37]

Tween 80 (tên thương mại) là một chất hoạt động bề mặt thuộc nhóm nonionic, có tên gọi là Polyoxyethylene sorbitan monooleate hoặc Sorbitan monooleate ethoxylate Độ hòa tan trong nước là 5-10 g/100 ml ở 23 ºC

Hình 1.8 Công thức cấu tạo Tween 80Bên cạnh nguồn cacbon và nitơ còn có một vài yếu tố khác xem là điều kiện tối ưu cho nuôi cấy Tween-80 là một chất hỗ trợ cho việc tiết enzyme với nồng độ tối ưu là 0,2 ml/l, ở nồng độ cao hơn sẽ không có lợi cho sản xuất enzyme cellulases [41]

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đối với hoạt động của enzyme xylanase và cellulase Một loạt các chất hoạt động bề mặt được sử dụng, bao gồm các nhóm chất có bản chất là anionic, cationic, và nonionic Kết quả cho thấy các hoạt động của các enzyme đã tăng với nhóm chất hoạt động bề mặt có bản chất là cationic và nonionic Kết quả cho thấy hiệu quả sự dụng

enzyme xylanase và cellulase enzyme tăng khi sử dụng kết hợp với nhóm chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic trong các quy trình trong công nghiệp giấy và bột giấy Việc sử dụng nhóm chất hoạt động bề mặt có bản chất là cation được ưa chuộng hơn nhóm chất hoạt động bề mặt có bản chất là anion [24].

Chất hoạt động bề mặt có bản chất là nonionic, Tween 80, tăng tốc độ và mức độ đường hóa cellulose Các cơ chế thủy phân bằng enzym có sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt, các chất này cản trở sự cố định của các enzyme trên

bề mặt cơ chất bằng cách giảm lực liên kết Vì vậy, các enzyme có thể dễ dàng biến đổi và di chuyển đến các vi trí khác của cơ chất [24]

Các nghiên cứu của Ooshima và cộng sự, cho thấy chất hoạt động bề mặt

có bản chất là nonionic, lưỡng tính và cationic tăng cường hoạt tính của enzyme cellulases trong khi chất hoạt động bề mặt có bản chất là anion thì không làm tăng hoạt tính của enzyme cellulase Tuy nhiên, chất hoạt động bề mặt có bản chất cationic và anionic ở nồng độ tương đối thấp làm biến tính cellulase [24]

1.7.2.4 pH và nhiệt độ

pH là một trong những giá trị quan trọng trong việc sản xuất enzyme bởi

T reesei (Denison, 2000) pH (7.0) là là phù hợp cho việc sản xuất enzyme

xylanase từ T reesei Rut C-30 trên môi trường tăng trưởng cơ bản là cellulose và

xylan Trong khi đó, để sản xuất tốt enzyme cellulase thì cần pH thấp là 4,0

Nhiệt độ nuôi cấy không những ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của vi

sinh vật mà còn ảnh hưởng đến mức độ sản xuất enzyme xylanase Trichoderma

reesei Rut C-30 tăng trưởng tốt ở nhiệt độ từ 17, 28 và 37oC khi nuôi cấy trên nguồn cơ chất là lactose, tuy nhiên, ở nhiệt độ cao thì việc sản xuất xylanase tốt hơn, nhưng trái lại việc sản xuất enzyme cellulase thì giảm [41]

1.7.2.5 Sục khí

Khi sử dụng bình lên men để nuôi cấy nấm cho việc sản xuất enzyme, vận tốc lắc và mức độ cung cấp khí ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm và sự tiết enzyme Vận tốc lắc quá mạnh sẽ ảnh hưởng đến việc sản xuất enzyme xylanase

Sản xuất enzyme bởi T reesei QM 9414 cần một vận lắc nghiêm ngặt Khi sử

dụng lactose làm cơ chất trong 15 lít dịch lên men, vận tốc lắc tối ưu là 200

vòng/phút Hoạt tính xylanase thấp khi tốc độ lắc 130 vòng/phút, và với vận tốc lắc 400 vòng/phút hầu hết xylanase không được sản xuất Ảnh hưởng của việc

cung cấp oxygen trong nghiên cứu trên giống T reesei Rut C-30 tăng trưởng 1 %

cellulose hoặc xylan [41]

1.7.2.6 Lên men bán rắn

Bên cạnh việc lên men chìm, lên men bán rắn là một phương pháp phổ biến để sản xuất enzyme xylanase và cellulase từ nấm Nấm sợi là loại tăng trưởng trên môi trường cơ chất rắn, như gỗ, hạt, thân, rễ và lá thực vật So sánh giữa lên men chìm và lên men bán rắn thì lên men bán rắn có nhiều thuận lợi như sản phẩm lên men cao, sản phẩm cuối cao, tính ổn định của sản phẩm cao Tuy nhiên, lên men bán rắn hiện tại chỉ dùng cho việc sản xuất enzyme qui mô nhỏ vì

có một số vấn đề về kỹ thuật [41]

1.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân rơm rạ bởi enzyme

cellulase và xylanase từ nấm mốc Trichoderma reesei

1.8.1 Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu

Sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose sẽ làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên liệu

Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của cellulase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân Cellulose có bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên trong xơ sợi tạo thành Hàm lượng và sự phân bố của lignin trong cấu trúc vật liệu có ảnh hưởng tới khả năng thủy phân của vật liệu đó Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên lịêu đó được loại bỏ gần hết lignin

1.8.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ

giảm dần và đến mức triệt tiêu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ

40 – 50oC Riêng đối với enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu là 50oC Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi hoạt tính Ngược lại khi ở nhiệt độ 0oC, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu

1.8.4 Tương tác giữa cơ chất và enzyme

Cellulase thường chứa liên kết carbohydrate để tạo điều kiện cho sự tương tác giữa enzyme và bề mặt cơ chất Tương tự như các lĩnh vực xúc tác của hydrolases glycosyl, CBMs được chia thành các họ dựa trên cấu trúc tinh thể và cấu trúc tương đồng của acid amin Sự khác biệt tinh tế trong cấu trúc của CBMs dẫn đến những ligand riêng Thông qua liên kết với bề mặt của cellulose tinh thể, CBMs xúc tác với chất cụ thể và tăng cường hiệu quả xúc tác bằng cách tăng hiệu quả tập trung ở bề mặt Ngoài mục tiêu, CBMs thực sự có thể có khả năng phá vỡ cấu trúc của polysaccharides, qua đó nâng cao tốc độ thủy phân [18]

1.8.5 Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm

ứng thủy phân, bao gồm cả cellobiose và glucose đều có tác động kìm hãm hoạt tính của cellulase, đặc biệt là cellobiose [44]

1.9 Chuyển hóa sinh học từ cellulose thành ethanol

Tiền xử lý sinh học để loại bỏ lignin hoặc hemixenluloza từ thành tế bào thực vật So với các quá trình vật lý, hóa học, thì sinh học xử lý sơ bộ bao gồm

các phản ứng phức tạp hơn và tốn nhiều thời gian hơn, tuy nhiên, sẽ ít tốn chi phí

về việc đầu tư các trang thiết bị

1.9.1 Vi sinh vật phân hủy

Trong tiền xử lý sinh học, vi sinh vật, chủ yếu là nấm, được sử dụng để

phân hủy lignin và hemicellulose trong các vật liệu phế thải Pleurotus ostreatus

và Pycnoporus cinnabarinus được dùng cho tiền xử lý sinh học vì hiệu quả cao

làm giảm hoặc thay đổi hàm lượng lignin trong sinh khối chứa lignocellulosic [37] Bên cạnh đó, một số cải tiến đã được thực hiện để trồng nấm nhằm cải thiện

sự phân hủy của lignin và tránh sự suy giảm của cellulose Ví dụ, tạo các đột biến nấm với khả năng sản xuất cellulase yếu hơn đã được thử nghiệm sẽ được áp dụng; hạn chế sự sẵn có của một số chất dinh dưỡng cần thiết cho sự trao đổi chất bình thường của nấm cũng là một cách tiếp cận hiệu quả dẫn đến việc sản xuất các enzyme phân hủy lignolytic hữu ích trong lignin

1.9.2 Lên men ethanol

Quá trình lên men ethanol là quá trình lên men bắt đầu với con đường đường phân và còn gọi là EMP (Embden-Meyerhoff-Parnas) EMP là phản ứng phổ biến nhất cho phản ứng oxy hóa glucose để tạo thành pyruvate mà là một chất chuyển hóa trung gian quan trọng đối với hầu hết các sinh vật sống Con đường EMP gồm có ba giai đoạn, cụ thể là: hoạt hóa của glucose; bẻ mạch hexose và phóng thích năng lượng Các công thức phản ứng tổng quát cho quá trình EMP được tóm tắt trong phương trình

2 ATP + glucose + 4 ADP + 2Pi + 2 NAD+ →

2 ADP + 2 pyruvate + 4 ATP + 2 NADH + 2 H+

Ethanol được tạo ra như là sản phẩm cuối của con đường EMP Trước tiên, acetaldehyde được sản xuất từ pyruvate bằng cách khử một phân tử CO2 của pyruvate, và sau đó acetaldehyde được chuyển thành ethanol theo phản ứng oxi hóa khử giữa NADH và NAD + Ngoài ethanol, acid lactic cũng là một sản phẩm cuối của quá trình lên men vi sinh vật [41]

1.10 Chuyển hóa sinh học từ xylose thành ethanol và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol

Lên men đường xylose tạo thành ethanol được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1959 Đến năm 1976, phát hiện ra chủng nấm men có khả năng đồng hóa xylose nhưng không có khả năng lên men xylose Năm 1960, lần đầu tiên phát hiện ra sự chuyển hóa xylose thành xylulose và đến những năm 1980, mới phát hiện nấm men có khả năng lên men xylose thành ethanol [11]

Xylose đầu tiên được chuyển qua màng và sau đó được chuyển thành xylulose 5-P Nhiều xylose được vẫn chuyển qua kênh proton với điều kiện pH cao ở một số loài vi khuẩn và nấm men, và được tóm tắt ở bảng 1.3

Bảng 1.3: Con đường vận chuyển xylose ở một vài loài vi khuẩn và nấm men [11]

Kênh proton Escherichia coli, Staphylococcus xylosus

Pichia stipitis

Thẩm thấu qua màng Saccharomyces cerevisiae

Kênh proton hiếu khí Rhodotorula sp.

Kênh proton và thẩm thấu qua màng Candida shehatae

Con đường chuyển hóa xylose thành xylulose được biểu diễn ở hình 1.10 Bước đầu tiên xylose được chuyển hóa thành xylitol bằng enzyme xylose reductase (XR) Xylitol được tiết ra khỏi tế bào hoặc bị oxi hóa bởi xylitol dehydrogenase (XDH) Các nghiên cứu của Bruinenberg và cộng sự chỉ ra rằng các enzyme tham gia vào việc đồng hóa xylose ở những nấm men khác nhau có đặc điểm riêng khác nhau đối với các đồng yếu tố như NADPH, NADH, NAD +

và NADP + Pichia stipitis phản ứng đầu tiên có thể sử dụng NADPH hoặc

NADH Như vậy, NAD + được tạo ra và xylitol tích lũy không mạnh như với nấm men khác trong điều kiện yếm khí [11]

Hình 1.9: Lên men ethanol từ xylose [11]

D-xylose được chuyển thành D-xylulose bởi enzyme isomerase (ở vi khuẩn) hoặc oxi hóa khử (như trong nấm men và nấm mốc), quá trình chuyển hóa bằng phản ứng phosphoryl hóa Phản ứng này được xúc tác bởi xylulokinase, chuyển xylulose thành 5-P-xylulose 5-p-xylulose theo con đường pentose phosphate tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-P, glyceraldehyde-3-P tiếp tục theo con đường trung gian glycolytic và chuyển thành pyruvat tham gia vào quá trình chuyển hóa thành ethanol Những chất trung gian được chuyển đổi thành pyruvate trong Parnas Meyerhof embden (EMP) hoặc con đường Doudoroff Entner (ED), và pyruvate được chuyển thành acetaldehyde của pyruvate decarboxylase, đó là tiếp tục giảm xuống ethanol bởi dehydrogenase rượu [10]

Phương trình phản ứng hóa học

3 C 5 H 10 O 5 5 C 2 H 5 OH + 5 CO 2Theo lý thuyết thì 1,67 mol ethanol/1 mol xylose và 2,0 mol ethanol/ 1mol glucose, trên cơ sở khối lượng thì 0,51 g ethanol/g xylose [11]

Sản phẩm tạo ra thấp từ 0,3 - 0,9 g/l/h, đặc biệt là sự hiện diện của oxygen

từ 0,1 - 0,2 g/l/h Giảm sản lượng thu được chủ yếu là do sự tăng trưởng và xylitol tích lũy, mà có lẽ là kết quả của sự ức chế của NADH dehydrogenase xylitol dư thừa trong trường hợp không có đủ hô hấp Quá trình lên men xylose của nấm men phụ thuộc vào nhiều yếu tố Sục khí là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất Nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng nấm men lên men xylose, yêu cầu oxy cho quá trình lên men xylose Trong điều kiện yếm khí,

ethanol rất thấp hoặc không được sản xuất Pichia stipitis chỉ cho sản lượng

ethanol cao trong điều kiện vi hiếu khí [11]

Việc nghiên cứu các chủng nấm men tự nhiên mà có thể chuyển đổi hexoses và pentoses để sản xuất ethanol, các nhà nghiên cứu đang cố gắng tối ưu hóa các điều kiện cho sự tăng trưởng tế bào và quá trình lên men, bao gồm các thành phần thủy phân, pH và nồng độ acetate Các nghiên cứu tập trung vào khả

năng lên men của các chủng Candida shehatae và Pichia stipitis về thủy phân gỗ

với một hỗn hợp 01:01 của glucose và xylose Kết quả thu được, tỷ lệ tối ưu sản xuất ethanol đã thu được với một phạm vi pH giữa 5,5 và 6,0, và một sản lượng ethanol của 0,41-0,46 g/g glucose và xylose có thể đạt được trong những thí nghiệm tối ưu [11]

1.11 Kết quả nghiên cứu ngoài nước

Năm 1998, tác giả Chadrakant và cộng sự báo cáo có ba phương pháp sản xuất ethanol từ cellulose:

Phương pháp thủy giải và lên men riêng lẻ (Separate Hydrolysis and

Fermentation- SHF) là quá trình mà cellulose được thủy giải bằng enzyme

cellulase tạo thành glucose ở bước đầu tiên và glucose được lên men tạo thành

ethanol bằng cách sử dụng Saccharomyces hoặc Zymomonas trong bước thứ hai

Thuận lợi của phương pháp này là thực hiện từng bước với từng điều kiện nhiệt

độ tối ưu, là từ 450C đến 500C, hoặc 300C riêng biệt Khó khăn chủ yếu của quá trình là đường được tạo ra từ sự thủy giải ức chế hoạt động của cellulase trong suốt quá trình thủy giải [11].

Phương pháp chuyển hóa trực tiếp bằng vi sinh vật (Direct Microbial Conversion- DMC) gồm ba quá trình đó là sinh cellulase, thủy giải celluolose và lên men đường trong cùng một bước Vi sinh vật tham gia vào quá trình này là

Clostridium thermocellum Bất lợi của phương pháp này là khả năng chịu đựng

ethanol thấp Những nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng chịu đựng ethanol khoảng 3,5%, ít hơn nhiều so với khả năng chịu đựng của nấm men tạo ethanol (khoảng 10%) và cũng có một phần đáng kể cacbon chuyển hóa tạo thành các sản phẩm phụ như acid acetic và acid lactic [11]

Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (Simultaneous Saccharification and Fermentation-SSF) Trong quá trình này sự thủy phân cellulose để tạo thành glucose gồm enzyme cellulase và lên men đường để tạo

ethanol bởi Saccharomyces hoặc Zymomonas Một trong những yêu cầu quan

trọng trong việc thực hiện thành công quá trình trên là khả năng tương thích của

hệ thống thủy phân và lên men với các điều kiện nhiệt độ, pH và hàm lượng cơ

chất Trichoderma được sử dụng như một nguồn enzyme cellulase cho quá trình Nhiệt độ tối ưu cho enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei là 45 - 500C, trong khi quá trình lên men với Saccharomyces cerevisiae là khoảng 300C Bởi vì nhiệt độ tối ưu của chúng là không tương thích nên sự điều chỉnh giữa hai nhiệt

độ là cần thực hiện Những thuận lợi chính được đề cập trong quá trình này bao

nạp vào thấp, (3) sản lượng sản phẩm cao, (4) giảm sự ức chế của việc lên men của nấm men trong khi tạo ethanol và (5) tăng yêu cầu về điều kiện vô trùng Dựa trên những cải tiến này, quá trình thủy phân và lên men đồng thời là một trong những lựa chọn kinh tế nhất để sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulosic [11]

Theo báo cáo của tác giả Kevin A Gray và cộng sự năm 2006 về vấn đề

chuyển hóa lignocellulosic thành ethanol có ba bước chính (1) tiền xử lý hóa học, (2) thủy phân bằng enzyme, (3) lên men đường bằng các chủng vi sinh vật đặc biệt cho kết quả tốt Tuy nhiên, giá thành cao nên tác giả đề nghị sử dụng vi sinh vật có khả năng sử dụng nhiều loại đường [18].

Năm 2007, tác giả Patel và cộng sự báo cáo kết quả nghiên cứu về việc bước đầu nghiên cứu vấn đề tiền xử lý và lên men các phế phụ phẩm nông nghiệp như trấu gạo và bã mía Sự kết hợp của năm chủng nấm khác nhau được

dùng cho việc tiền xử lý và sử dụng Saccharomyces cerevisiae (NCIM 3095) cho quá trình lên men Trấu gạo và bã mía được xử lý với Aspergillus awamori và

Pleurotus sajor-caju cho sản lượng ethanol tốt (8,5g/l và 9,8g/l) [33]

Tiền xử lý bằng enzyme thủy giải từng bước chuyển hóa cellulose và hemicellulose, polysaccharides thành những đường có thể lên men được Có vài

sự lựa chọn bước thủy phân và lên men: (a) thủy phân và lên men riêng lẻ (SHF) emzyme thủy giải thêm vào trước khi lên men, (b) thủy phân và lên men đồng thời (SSF) enzyme được thêm vào cùng lúc với vi sinh vật, (c) đường hóa và lên men đồng thời, vi sinh vật sản xuất ra enzyme, một quá trình chuyển hóa trực tiếp lignocellulose bởi vi sinh vật (DMC) Mỗi một phương pháp lựa chọn đều có

ưu và khuyết điểm, chất ức chế, sản lượng ethanol, ethanol tolerance, sản phẩm phụ khác nhau

Tiền xử lý sinh khối lignocellulosic là bước đầu tiên để chuyển hóa sinh khối thành các phân tử có thể sử dụng được đòi hỏi năng lượng rất cao (hơi và điện), lò phản ứng chịu được sự ăn mòn và áp suất cao và nhiệt độ cao Những điều kiện này không những làm gia tăng chi phí của quá trình mà còn làm tiêu hao lượng đường Tiền xử lý bằng vi sinh vật được báo cáo là có thể kết hợp hai

ưu điểm là chi phí thấp khắc phục những điều kiện nghiêm ngặt của phản ứng Tám tác nhân sinh học, bao gồm nấm và vi khuẩn, được sử dụng trong việc tiền

xử lý bã mía Các loại nấm và vi khuẩn tham gia vào thí nghiệm chúng đã góp phần làm giảm tỉ lệ C:N từ 108:1 xuống còn khoảng 42:1 đến 60:1 Tỉ lệ C:N

được chuyển hóa mạnh nhất là khoảng 61% đối với nấm Aspergillus terreus,

Cellulomonas uda (52%), Trichoderma reesei và Zymomonas mobilis (49%)

Những tác nhân sinh học này phân hủy bã mía nhờ tạo ra enzyme cellullase

Lượng cellullase được tạo ra nhiều nhất ở Aspergillus terreus, C.uda,

Cellulomonas cartae và Bacillus macerans Vi sinh vật tiền xử lý bả mía tạo

thành các phân tử đường cho quá trình thủy giải mà sử dụng trực tiếp để sản xuất ethanol [21]

Sử dụng kỹ thuật thủy phân và lên men đồng thời (SSF) để sản xuất ethanol từ sinh khối lá và thân cây bắp Ứng dụng kỹ thuật này cho việc tiền xử

lý khoảng 0,5 grams sinh khối với ammonia ở áp suất và nhiệt độ phòng trong 24

giờ, sau đó lên men với Saccharomyces cerevisiae D5A trong vòng 24 giờ có sử dụng Spezyme CP, để thuỷ giải cấu trúc polysaccharides Ethanol thu được sau

24 giờ được phân tích bằng HPLC Sản lượng ethanol sinh ra tối đa là từ 44,9% đến 73% [21]

1.12 Kết quả nghiên cứu trong nước

Rơm rạ chiếm tỷ lệ lớn trong các phụ phẩm nông nghiệp Việt Nam Với thành phần chứa hơn 40% là cellulose, rơm rạ là nguồn nguyên liệu thích hợp

cho quá trình sản xuất ethanol Với đề tài “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên

liệu từ rơm rạ” của tác giả Trần Diệu Lý [5] bằng cách sử dụng rơm rạ cắt nhỏ

và được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu trúc Sau đó được tiến hành thủy phân bằng enzyme cellulase hoặc thủy phân và lên men đồng thời

bằng enzyme cellulase và nấm men Saccharomyces cerevisiae chủng turbo yeast

extra Kết quả cho thấy rằng, quá trình thủy phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11% bã rắn, 5% enzyme, 500C và pH 4,8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55,08g/l và hiệu suất đạt 81% Quá trình thủy phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11% bã rắn, 5% enzyme, 23,6 triệu tế bào nấm men/ml, 500C

và pH 4,8 Quá trình này thu được 30,86g/l ethanol tương ứng hiệu suất là 86,61% Kết quả này cho thấy quá trình thủy phân và lên men đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ [5]

Từ các kết quả nghiên cứu ngoài nước và trong nước trên các đối tượng

khác nhau và các phương pháp đều chưa khắc phục được mức đầu tư và các điều kiện nghiêm ngặt về thiết bị Đề tài này nghiên cứu nhằm mục đích cải tiến điều kiện thiết bị, còn vấn đề mức đầu tư vẫn có chi phí cao, tuy nhiên, vì mục đích phát triển bền vững nên nguồn nhiên liệu sinh học khuyến khích sử dụng Nên chúng tôi bước đầu nghiên cứu việc sử dụng tác nhân sinh học để xử lý sinh khối rơm thành các đường có thể tham gia vào quá trình lên men để sản xuất ethanol

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

Hình 2.1 Nguyên liệu rơm được xử lý sơ bộ: (a) Rơm được cắt nhỏ 1 - 2 cm, (b) Rơm được xay nhuyễn 1 - 2 mm