Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua

3.2 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm qua bọ phấn 31 3.3 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm bằng ghép

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VĂN QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHÂN TẠO ĐỂ LÂY NHIỄM VIRUS GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA

Chuyên nghành : Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hải Yến

Thái nguyên tháng 10 - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn này là do tôi nghiên cứu, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Hải Yến và sự giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn đã được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu, các tài liệu trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Văn Quang

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Thị Hải Yến, giảng viên Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ phòng thí nghiệm Sinh học – Khoa Khoa học Sự sống – Trường Đại học Khoa học, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học đã truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành các thí nghiệm trong luận văn Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Thái nguyên, ngày10 tháng 9 năm 2014

Học viên

Nguyễn Văn Quang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

1 Đặt vấn đề……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu……… 2

3 Nội dung nghiên cứu ……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1 Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua………… 3

1.1.1 Nguồn gốc và Phân loại……… 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học……… 4

1.1.3 Một số bệnh hại cà chua……… 5

1.2 Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua……… 7

1.2.1 Triệu chứng biểu hiện bệnh……… 7

1.2.2 Phân loại virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua……… 8

1.2.3 Đặc điểm hình thái và cấu tạo……… 8

1.2.4 Đặc điểm lây lan và môi giới truyền bệnh……… 10

1.2.5 Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua……… 13

1.3 Các phương pháp lây nhiễm TYLCV trong thực nghiệm……… 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu……… 19

2.1.1 Vật liệu thực vật……… 19

2.1.2 Chủng vi khuẩn ……… 20

2.1.3 Hoá chất, thiết bị máy móc……… 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 21

2.2.1 Phương pháp lây nhiễm bằng bọ phấn ……… 21

2.2.2 Phương pháp lây nhiễm bằng ghép áp……… 22

2.2.3 Phương pháp lây nhiễm bằng Agro - inoculation ……… 22

2.2.4 Phương pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)…… 23

2.2.5 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ biểu hiện bệnh……… 23

2.2.6 Phương pháp phân tích sự có mặt của virus TYLCV………… 24

2.2.6.1 Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số……… 24

2.2.6.2 Phương pháp điện di trên gel agarose……… 25

2.2.6.3 Phương pháp PCR nhân gen của TYLCV ……… 26

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………… 27

3.1 Kết quả tạo nguồn bệnh……… 27

3.1.1 Kết quả lây nhiễm virus trong vườn có nguồn bệnh………… 27

3.1.2 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh…… 28

3.2 Kết quả lây nhiễm TYLCV cho cà chua bằng bọ phấn ………… 30

3.3 Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng phương pháp ghép cây lành với cây bị bệnh……… 32

3.4 Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng Agro - inoculation ………… 35

3.5 Đánh giá hiệu quả lây nhiễm TYLCV của các phương pháp lây nhiễm nhân tạo……… 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 41

1 KẾT LUẬN……… 41

2 ĐỀ NGHỊ……… 41

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Acid

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction

TYLCV Virus gây bệnh xoăn vàng lá

3.2 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua

sau lây nhiễm qua bọ phấn

31

3.3 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua

sau lây nhiễm bằng ghép áp

33

3.4 Kết quả giá trị OD ở bước sóng 660 nm của các chủng khuẩn sau

nuôi lắc phục vụ thí nghiệm lây nhiễm

35

3.5 Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh sau lây nhiễm TYLCV bằng

Agro- inoculation vào các giống cà chua

36

3.6 Tổng hợp kết quả theo dõi biểu hiện bệnh trung bình của thí

nghiệm lây nhiễm TYLCV vào cây cà chua bằng 3 phương pháp

38

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Hình ảnh cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV trồng

tại vườn có nguồn bệnh sau 50 ngày

3.4 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của

virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng bọ phấn

32

3.5 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của

virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng phương

pháp ghép

34

3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 10 ngày lây

nhiễm bằng Agro- inoculation

37

3.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 50 ngày lây

nhiễm bằng Agro- inoculation

37

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua”

2 Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hải Yến

3 Người thực hiện: Nguyễn Văn Quang

4 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm được phương pháp lây nhiễm virus TYLCV phù hợp để lây bệnh cho

cà chua nhằm tạo phương pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho

cà chua trong điều kiện nhà lưới và vườn thí nghiệm

5 Nội dung nghiên cứu

1 Thu thập các giống cà chua mẫn cảm với virus, kháng tự nhiên với virus

3 Tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho cà chua

4 Theo dõi và phân tích kết quả, đánh giá mức độ biểu hiện bệnh sau khi lây nhiễm

5 Đưa ra quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua

6 Kết quả nghiên cứu

(1) Thu thập giống cà chua phục vụ thí nghiệm:

+ Giống PT 18 do viện rau quả Việt Nam cung cấp Cà chua PT18 có chiều cao trung bình 80 – 100 cm, dạng cây gọn, màu lá xanh nhạt, phân cành ít, sinh trưởng hữu hạn PT18 là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV + Giống F1 GM - 2008, là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp Quả của F1

GM - 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tươi, thịt dày, rắn chắc F1 GM -

2008 sinh trưởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, giống F1 GM2008 được lai tạo theo hướng kháng bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV

+ Giống DV 2962 là giống lai F1 có nguồn gốc từ Ấn Độ DV 2962 có biên độ thích ứng rộng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 17o

C – 32oC thuộc loại hình sinh trưởng bán hữu hạn, sinh trưởng khoẻ Cây cao trung bình từ 110 – 130 cm, nhiều hoa, sai quả, được chọn tạo theo hướng kháng virus TYLCV

(2) T được 63 dòng cây bị bệnh trong tổng số 75 cây

Các dòng cây bệnh đã được kiểm tra sự có mặt của TYLCV bằng phương pháp PCR với cặp mồi pRV 324N/pRC889N

(3) Đã tiến hành lây nhiễm thành công virus TYLCV trên 3 giống cà chua PT18,

GM - 2008, DV - 2962 bằng 3 phương pháp : (i) phương pháp ghép áp giữa cây

lành với cây bệnh, (ii) phương pháp nuôi thả bọ phấn, (iii) Lây nhiễm bằng Agro

- inoculation

(4) Đã đưa ra 01 quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm là phương pháp ghép áp giữa cây lành với cây bệnh, có thể áp dụng trong thực nghiệm để đánh giá khả năng kháng virus TYLCV của các giống cà chua

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây cà chua (Lycopersicon esculentum) là loại cây trồng phổ biến hiện nay,

quả cà chua chín là loại thực phẩm giàu dinh dưỡng và vitamin, được con người sử dụng thường xuyên Cà chua dễ trồng, chi phí đầu tư ban đầu thấp, là loại cây thích ứng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau, thời gian từ khi trồng đến thu hoạch ngắn, do vậy có thể mở rộng sản xuất ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới

Cũng như các cây trồng khác, các giống cà chua đang trồng ở trên thế giới và Việt Nam bị tấn công bởi các loại sâu bệnh như nấm, côn trùng, vi khuẩn và đặc biệt là virus Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV gây nên được xem là bệnh gây hậu quả nghiêm trọng nhất [17], [21] Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100% TYLCV là loài virus

thuộc chi Begomovirus, họ Geminividae và chúng chỉ truyền nhiễm vào cây thông qua vector truyền bệnh là bọ phấn Bemisia tabaci một cách nhanh chóng và liên tục

dẫn đến bùng phát thành dịch bệnh [7], [9] Sự kiểm soát bệnh TYLCV ở các vùng trồng cà chua chú trọng chính vào sự kiểm soát bọ phấn bằng các loại thuốc hóa học tiêu diệt côn trùng hoặc các bẫy bắt, các rào cản vật lý như lưới chắn bọ phấn… Tuy nhiên, các phương pháp kiểm soát bệnh TYLCV vừa nêu gây tốn kém

về kinh phí và sức lực con người trong sản xuất, hơn nữa còn gây ô nhiễm môi trường và tích lũy độc tính trong quả vì sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại diệt

bọ phấn [26]

Biện pháp hiệu quả nhất để phòng, chống virus là sử dụng giống cà chua kháng virus, trong thực tế hiện nay các giống tự nhiên kháng virus không nhiều vì vậy các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo các giống có khả

năng kháng virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua để đưa vào sản xuất Tuy nhiên,

để đánh giá các dòng cây tạo ra có kháng được với virus hay không thì công việc lây nhiễm virus để kiểm tra khả năng kháng là rất quan trọng Virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua không truyền qua hạt giống, qua hạt, đất, qua va chạm cơ học nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn Dựa trên đặc điểm lan truyền của TYLCV, các nhà khoa học cũng đã đề xuất một số phương pháp để lây nhiễm TYLCV cho cà chua, tuy nhiên vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống

Xuất phát từ thực tiễn và cơ sở lý luận trên chúng tôi thực hiện nghiên cứu

đề tài là “Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh

xoăn vàng lá cà chua” Nhằm phục vụ trong nghiên cứu, đánh giá khả năng kháng

virus TYLCV ở cà chua

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được phương pháp lây nhiễm virus TYLCV cho cà chua trồng trong điều kiện nhà lưới và vườn thí nghiệm, nhằm tạo phương pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho cà chua

3 Nội dung nghiên cứu

1 Thu thập các giống cà chua mẫn cảm với virus, kháng tự nhiên với virus

3 Tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho cà chua

4 Theo dõi và phân tích kết quả, đánh giá mức độ biểu hiện bệnh sau khi lây nhiễm

5 Đưa ra 01 quy trình lây nhiễm virus TYLCV cho cà chua

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cà chua (Lycopersicon esculentum L.) có bộ nhiễm sắc thể 2n = 24 và đa số

chúng là cây tự thụ phấn Cà chua có nguồn gốc từ Nam mỹ (Bolivia, Chile, Colombia, Peru) [19] Những loài cà chua hoang dại gần gũi với loài cà chua trồng hiện nay vẫn tìm thấy ở dọc dãy núi Andes (Peru), đảo Galapagos (Ecuado) và Bolivia Từ thế kỷ 16 cà chua đã được trồng ở Châu Âu, sau đó lan sang các vùng khác như Trung Quốc và Đông Nam Á (thế kỷ 17), Nhật Bản (thế kỷ 18) Đến thế kỷ

18, nhiều vùng trên thế giới trồng cà chua làm thực phẩm và giống cà chua đã trở nên phong phú và đa dạng Vào đầu thế kỷ 19, quả cà chua đã trở thành loại thực phẩm phổ biến và quen thuộc của con người Đến cuối thế kỷ 19 cà chua được đưa vào trồng ở nước ta ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và một số tỉnh vùng cao

Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp cúc (Asteridae), lớp ngọc lan (Magnoliosida) [40], [31] Từ lâu đã có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua và thành lập hệ thống phân loại theo quan điểm của riêng mình Theo hệ thống phân loại của Muller (1940) thì cà chua trồng hiện

nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller Tác giả phân loại chi phụ thành 7 loài, loài trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum) thuộc loài thứ nhất Theo Nonnecke(1989) thì L esculentum là loài cà chua trồng có 4 chủng chính (1) L esculentum var Commune bao gồm hầu hết những giống cà chua hiện nay với đặc điểm là lá rậm, quả có khối lượng trung bình lớn; (2) L esculentum var Grandiolium có đặc điểm lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít; (3) L esculentum var Validium là cà chua anh đào với thân đứng mập và (4) L esculentum var Pyriforme là cà chua quả lê

1.1.2 Đặc điểm sinh học

Đặc điểm bộ rễ cà chua là rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn Trong điều kiện thuận lợi nhất những giống tăng trưởng mạnh có rễ ăn sâu 100 - 150 cm và rộng 150 - 250 cm Vì vậy cà chua chịu hạn tốt

Bộ rễ ăn sâu, mạnh hay yếu đều có liên quan đến mức độ phân cành và phát triển của bộ phận trên mặt đất, do đó khi trồng cà chua tỉa cành, bấm ngọn, bộ rễ thường

ăn nông và hẹp hơn so với điều kiện trồng tự nhiên

Cây cà chua có thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân dần dần hóa gỗ Thân mang lá và phát hoa ở nách lá là chồi nách Chồi nách ở các vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau, thường chồi nách ở ngay dưới chùm hoa thứ nhất, có khả năng tăng trưởng mạnh và phát dục sớm so với các chồi nách gần gốc Tùy khả năng sinh trưởng và phân nhánh mà các giống cà chua được chia làm 4 dạng là: (1) Dạng sinh trưởng hữu hạn

(determinate) (2 ) Dạng sinh trưởng vô hạn (indeterminate) (3) Dạng sinh trưởng bán hữu hạn (semideterminate) (4) Dạng lùn (dwart)

Lá thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3 - 4 đôi lá chét, rìa lá chét đều có răng cưa nông hay sâu tùy giống Phiến lá thường phủ lông tơ Đặc tính lá của giống thường thể hiện đầy đủ sau khi cây có chùm hoa đầu tiên

Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Sự thụ phấn chéo ở cà chua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa các alkaloid độc nên không hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được Số lượng hoa trên chùm thay đổi tùy giống và thời tiết, thường từ 5 - 20 hoa

Quả cà chua thuộc loại mọng nước, có hình dạng thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài Vỏ quả có thể nhẵn hay có khía Màu sắc của quả thay đổi tùy giống và điều kiện thời tiết Thường màu sắc quả là màu phối hợp giữa màu vỏ và thịt quả

Cà chua là loại cây thân thảo, ngắn ngày sinh trưởng hàng năm, ưa khí hậu

ấm áp và ánh sáng đầy đủ Đủ ánh sáng cây mới sinh trưởng phát triển tốt nhất Cà chua sinh trưởng, phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22o

1.1.3 Một số bệnh hại cà chua

- Bệnh mốc sương (Phytophtaora infestans)

Bệnh mốc sương gây ra do một loại nấm có tên là Phytophtaora infestans

Đây là loài nấm ký sinh chuyên tính có khả năng hình thành nhiều chủng khác nhau Nấm gồm 16 chủng trong đó có cả các chủng đơn và chủng hỗn hợp tuy nhiên số lượng chủng nấm thay đổi tuỳ khu vực sinh thái trồng trọt hoặc ở từng nước khác nhau Bệnh mốc sương thường phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 15 -

22oC, thích hợp nhất là 18 - 20o

C và độ ẩm không khí cao Độ ẩm thấp nhất cho nấm phát triển là 76%, có ý kiến cho là 65%, độ ẩm càng cao bệnh lây lan và gây hại càng mạnh Trong điều kiện thiếu ánh sáng, trời âm u, mưa phùn càng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá tạo vết xám xanh nhạt sau đó lan rộng vào phiến lá Phần giữa vết bệnh chuyển màu đen và xung quanh vết bệnh thường có cành bào tử màu trắng xốp bao phủ giống một lớp mốc trắng như sương muối làm cho lá chết lụi nhanh chóng, bệnh cũng xuất hiện ở cuống lá, cành và thân [38]

- Bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum Smith)

Bệnh gây hại nghiêm trọng đối với cây cà chua ở các vùng trồng cà chua ở Việt Nam, các vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới và những vùng trên thế giới có khí hậu

ấm áp Bệnh phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 26o

C - 30oC, bệnh thích nghi độ pH trong phạm vi tương đối rộng, độ pH thích hợp cho bệnh phát triển từ 6,8 - 7,2, bệnh phát triển mạnh ở những chân đất cao, đất vàn, trên những chân ruộng luân canh với cây trồng cạn, đặc biệt là cây họ cà Bệnh héo xanh thường thể hiện triệu chứng ngay sau khi vi khuẩn xâm nhập vào rễ hoặc phần thân sát mặt đất Vi khuẩn gây bệnh héo xanh là loài đa thực có phổ ký chủ rộng, có thể xâm nhiễm, ký sinh gây hại trên nhiều họ cây trồng khác nhau, đặc biệt trên các cây trồng thuộc họ cà,

họ đậu, họ bầu bí Vi khuẩn có thể sống trong đất từ 5 - 6 năm, trên các bộ phận của cây vi khuẩn này có thể tồn tại từ 6 - 7 tháng còn nếu bám dính trên bề mặt hạt chỉ tồn tại 2 ngày Vi khuẩn xâm nhiễm qua những vết thương trên cây, lan truyền nhờ nước và côn trùng Vi khuẩn gây hại ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng phát triển

của cây, nhưng nghiêm trọng nhất là thời kỳ hoa và đậu quả

Hiện nay, chưa có loại thuốc đặc hiệu để phòng trừ loại bệnh này, nên khi bệnh hại xâm nhiễm đã gây ra tổn thất lớn cho sản xuất Biện pháp phòng trừ chủ

yếu là thông qua biện pháp canh tác

- Bệnh đốm nâu (Alternaria solani)

Bệnh do nấm gây hại ở hầu hết các vùng trồng cà chua có khí hậu nhiệt đới Nấm phá hại thân, lá, hoa, quả Triệu chứng bệnh là những đốm nâu, gồm những vòng tròn đồng tâm trên những lá già và những vết lõm màu nâu tối ở trên thân, khi cây bị bệnh hại nặng thì quả cũng bị hại Bệnh phát triển nhanh trong điều kiện thời tiết nóng ẩm Nếu phòng trừ không kịp thời, toàn bộ cây sẽ bị khô chết như bị đốt

cháy Phòng trừ bằng kỹ thuật canh tác tổng hợp Khi cây bị bệnh cần tăng cường chăm sóc, bón thúc Thực hiện luân canh, vệ sinh đồng ruộng

- Bệnh héo vàng (Fusarium oxysporiumf sp Lyco-perisici)

Nguồn bệnh cư trú trong đất, xâm nhập vào cây qua bộ rễ Bệnh phát triển mạnh ở nhiệt độ cao 28oC Triệu chứng của bệnh đầu là những lá ở dưới thấp bị vàng, héo, sau đó lây lan sang lá non và hoa Toàn bộ bó mạch ở hệ rễ bị biến đổi thành màu nâu và cây bị chết Có thể phòng bệnh bằng cách coi trọng công tác vệ sinh đồng ruộng, luân canh triệt để, xử lý đất Khi bệnh phát triển mạnh có thể dùng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây Khi dùng thuốc phải tuân thủ sự hướng

dẫn của ngành bảo vệ thực vật

- Bệnh xoăn lá do virus

Bệnh do virus gây hại cà chua và gồm rất nhiều loại, thuộc nhóm

Germinivirus Bệnh có triệu chứng xoăn ngọn lá, những cây bị bệnh hại sinh

trưởng, phát triển kém, thường không cho quả Vì vậy gây tổn thất nghiêm trọng đến năng suất, có khi không cho thu hoạch Đặc biệt từ sau khi trồng đến thời kỳ ra hoa, cây bị hại sẽ làm giảm khối lượng quả rất lớn Ở Việt Nam, bệnh xoăn lá cà chua phát triển mạnh trong vụ cà chua sớm và vụ xuân hè khi nhiệt độ không khí từ

25 - 30oC, độ ẩm trên 70%

1.2 Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua

1.2.1 Triệu chứng biểu hiện bệnh

Bệnh do virus thuộc nhóm Geminivirus gây hại cà chua ở những vùng nhiệt

đới Virus thường gây ra triệu trứng xoăn lá, nhất là ngọn xoăn rất mạnh Lá có dạng xoắn vào trong, cây lùn thấp, mặt lá thường bị khảm đốm vàng Những cây bị bệnh, sinh trưởng phát triển kém, thường không cho quả

Bệnh xoăn lá do virus có thể gây nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh cà chua khác như: nụ hoa cà chua lớn, cà chua vàng trên đầu, bệnh xoăn lá sinh lý và bệnh thiếu phosphate và magie Bệnh nụ hoa cà chua lớn có thể phân biệt được vì

nó làm cho hoa có màu xanh lá cây Bệnh vàng đầu cà chua có biểu hiện là chỗ lá non có kích thước nhỏ và tròn, mép lá cong lên hoặc cong xuống Bệnh xoăn lá

sinh lý do áp lực nước làm cây còi cọc và mô lá non phát triển mềm chứ không cứng Thiếu phosphate làm cho cây cứng, nhuộm màu hơi tím và các bộ phận của cây nhỏ lại Thiếu magie làm vàng những gân lá ở giữa và dưới thân cây [27]

Biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu là thực hiện nghiêm ngặt chế độ luân canh, không trồng cà chua trên ruộng mà vụ trước đã trồng cây họ cà Vệ sinh đồng ruộng kỹ trước khi làm đất, gieo trồng Khi phát hiện cây bị bệnh phải nhổ bỏ Khi chăm sóc chú ý tránh tác động mạnh làm lây lan bệnh Khi trồng vụ sớm nên chọn các giống có đặc tính kháng bệnh cao Ngoài ra, cần thiết phải diệt bọ phấn truyền

virus [9]

1.2.2 Phân loại virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua

Theo hệ thống phân loại virus quốc tế (ICTV) năm 2013, TYLCV thuộc chi

Begomovirus, họ Geminiviridae Họ này có 7 chi bao gồm Begomovirus (288 loài), Curtovirus (3 loài), Eragrovirus (1 loài), Mastrevirus (29 loài), Topocuvirus (1 loài), Turncurtovirus (1 loài) và Becurtovirus (2 loài) Geminiviridae là họ virus gây bệnh thực vật lớn thứ hai với 325 loài Begomovirus là chi lớn nhất trong họ chủ yếu được lan truyền thông qua vector truyền bệnh là loài bọ phấn Bemisia tabaci [15], [29]

1.2.3 Đặc điểm hình thái và cấu tạo

TYLCV có dạng hình chày, hạt virion luôn ở dạng cầu ghép đôi với kích thước trung bình xấp xỉ 20 × 30 nm Lớp vỏ protein có trọng lượng khoảng

28 – 34 × 103 đvC gồm 22 capsome giống nhau, mỗi capsome gồm có 5 phân tử protein [18], [38] Những loài TYLCV phát hiện trước đây có hệ gen gồm các gen trùm nằm trên cùng một vòng DNA – A sợi đơn kích thước khoảng 2,8 kb (thể monopartite) Sau đó, người ta phát hiện nhiều chủng virus có hệ gen gồm hai vòng DNA sợi đơn tách biệt với kích thước xấp xỉ nhau khoảng 2,5 – 3,0 kb là DNA – A

và DNA – B (thể bipartite) Gần đây, người ta còn phát hiện một số loài thuộc

nhóm một vòng gen ngoài vòng DNA – A còn có một hoặc hai vòng DNA vệ tinh (DNAβ và DNAα) với kích thước xấp xỉ một nửa DNA – A có tác dụng tăng cường tái bản hệ gen virus và biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ [6], [10], [15], [23]

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc genome của TYLCV

Hệ gen của TYLCV gồm 6 gen chức năng đó là gen CP (V1), prepCP (V1), C1, C2, C3, C4 Các gen trong hệ gen của TYLCV có thể nằm trên cùng một vòng DNA – A hoặc hai vòng DNA – A và DNA – B riêng biệt ngăn cách với nhau bởi một vùng liên gen (IR – intergenic region) có độ dài khoảng 200 nucleotide Trên vùng IR đó có chứa điểm khởi đầu sao chép và vùng điều khiển cho sự tái bản vòng gen virus theo cả hai hướng Dạng trình tự điển hình nhất trong vùng IR là hai trình

tự bảo thủ lặp lại đảo ngược của TAATATT/AC được định vị trên một cấu trúc vòng (stem – loop) có liên quan tới việc tái bản sợi DNA mới và một trình tự lặp lại cần thiết cho việc nhận biết và bám vào của protein Rep (Replication) trong quá trình phiên mã [18], [25]

Các chủng Begomovirus monopartite ngoài vòng DNA – A có thể có một hoặc

hai vòng DNA sợi đơn với kích thước xấp xỉ một nửa DNA – A được gọi là DNA

vệ tinh (gồm DNAβ và DNAα) DNA vệ tinh được phát hiện lần đầu tiên trong chủng virus gây bệnh xoăn lá cà chua (TLCV) phân lập từ phía bắc Australia vào năm 1997 với kích thước khoảng 682 nucleotide đó là ToLCV – sat [20]

Vòng DNAβ có kích thước xấp xỉ khoảng 1360 nucleotide, trình tự nucleotide khá bảo thủ Trên đó bao gồm một vùng giàu adenin (A – rich region), một vùng vệ tinh (SCR – Satelite conserved region) và một trình tự đọc mở (ORF) trên sợi bổ sung mã hóa cho protein βC1 Vùng SCR chứa cấu trúc vòng (stem – loop) mang đoạn trình tự khởi đầu tái bản TAATATT/AC giống như vùng liên gen (IR) của DNA – A Chức năng của vòng DNAβ được cho là góp phần làm tăng cường biểu hiện triệu chứng bệnh bằng cách làm bất hoạt gen của cây chủ hoặc thuận lợi cho việc mở rộng phạm vi lây nhiễm

DNAα cũng giống như DNAβ có trình tự rất bảo thủ trong đó có chứa một khung đọc mở mã hóa cho protein tái bản (Rep), một trình tự giàu Adenin và một điểm khởi đầu tái bản nằm trên cấu trúc vòng (stem – loop) chứa trình tự bảo thủ TAATATT/AC giống như những nanovirus khác DNAα có khả năng tự tái bản nhưng cần sự trợ giúp của virus trong quá trình biểu hiện và vận chuyển trong cây chủ DNAα hiện chưa xác định là có ảnh hưởng lên sự biểu hiện bệnh ở cây chủ [16]

1.2.4 Đặc điểm lây lan và môi giới truyền bệnh

Các virus này lây truyền từ cây này qua cây khác trong tự nhiên nhờ một loại

vector đó là loài bọ phấn trắng (Bemicia tabaci) Đây là loại côn trùng nhỏ hút

nhựa cây có mặt ở khắp nơi trên thế giới, được phát hiện đầu tiên tại Úc (năm 1989) trên cây thuốc lá và cho đến nay đã biết được khoảng hơn 1000 loài [3], [5], [28], [39]

Bọ phấn trắng có chu kỳ sinh trưởng khoảng 18 – 28 ngày để phát triển từ trứng thành con trưởng thành trong điều kiện thời tiết ấm áp và khoảng 30 – 40 ngày trong mùa đông Chu kỳ sinh trưởng gồm những giai đoạn sau: (1) trứng nở trong khoảng 7 đến 10 ngày; (2) giai đoạn bò kéo dài khoảng 3 – 4 ngày; (3) Giai đoạn thiếu trùng kéo dài khoảng 6 – 12 ngày; (4) giai đoạn nhộng kéo dài khoảng 4 – 6 ngày; (5) con trưởng thành sống trong khoảng thời gian 6 – 16 ngày và có thể sống đến 50 ngày (Hình 1.2)

nhanh làm đen lá và đen

bề mặt quả Trong điều

kiện tự nhiên bọ phấn trắng có thể di chuyển xa tới 2 km và làm lây lan bệnh rất nhanh [4]

Năm 1966, Cohen và Nitzany đã tiến hành những thử nghiệm đầu tiên nhằm kiểm soát dịch bệnh TYLCV Trước hết là tìm hiểu mối quan hệ giữa virus – vector bằng cách kiểm tra hiệu quả truyền TYLCV bởi bọ phấn trắng Sau 48 giờ nuôi cộng sinh bọ phấn trắng với cây WT (wild type – cà chua dại) nhận thấy chỉ có 5% ruồi đực truyền virus, tuy nhiên hiệu quả truyền virus ruồi trắng cái tới 32% gấp 6 lần ruồi đực Tiến hành thử nghiệm với các số lượng 1, 3, 5, 10 và 15 bọ phấn cái/1

Hình 1.2 Chu kỳ sinh trưởng của bọ phấn (Bemisia

tabaci)

cây WT thì hiệu quả nhiễm bệnh tương ứng là 32%, 83%, 84%, 86% và 100% [8] Những virus này được duy trì liên tục trong cơ thể côn trùng Khi bọ phấn tiêm chích lên cây chủ, virus sẽ được truyền sang và lây lan Các ngưỡng thu nhận và truyền tải đã được tìm thấy là khoảng 15 đến 30 phút Tuy nhiên, để có tỷ lệ lây nhiễm cao cần ít nhất 4 giờ Giai đoạn tiềm ẩn khoảng từ 21 – 24 giờ Thử nghiệm với những bọ phấn cái có thời gian sống khoảng 20 – 50 ngày cho thấy, sau 48 giờ lây nhiễm, chỉ có 2 trong 28 con cái là giữ lại các virus tới 20 ngày Thời gian cộng sinh ngắn dẫn đến khoảng thời gian lưu giữ virus cũng ngắn hơn

Hiệu quả lây nhiễm TYLCV qua bọ phấn giảm theo thời gian, hầu hết những con cái có thể truyền virus trong khoảng 10 ngày sau khi mang nguồn bệnh Bên cạnh nguồn bệnh từ những con trưởng thành, các virus còn được tìm thấy trong cơ thể bọ phấn ở các giai đoạn phát triển khác Khi cộng sinh trên thực vật bị nhiễm bệnh, 28% số con trưởng thành có thể làm lây lan virus

Để kiểm tra sự lây truyền virus từ bọ phấn mẹ cho thế hệ con, người ta đã tiến hành thử nghiệm bằng cách cho bọ phấn cái mang virus đẻ trứng trên cây bông kháng với TYLCV cho nở thành nhộng Sau đó các con trưởng thành được chuyển sang các thực vật nhạy cảm với TYLCV Nhận thấy, chỉ có TYLCV truyền từ môi giới trung gian sang cây chủ và ngược lại mà không được truyền qua các thế hệ côn trùng

Trong khi nghiên cứu sự tương tác giữa vector và virus, một hiện tượng độc

đáo gọi là “periodic acquisition” đã được quan sát [11], [22] Đó là sau khi mang

nguồn virus từ các cây bệnh, những cá thể bọ phấn mang virus dần dần mất khả năng lây nhiễm sau khoảng 10 ngày trích hút trên thực vật, hầu hết chúng không còn khả năng truyền virus nữa Trong suốt thời gian trích hút, lượng virus bị suy giảm không thể bù đắp thêm từ những cây bệnh Bọ phấn phải hoàn toàn mất khả năng truyền tải trước khi nó có thể thu nhận thêm virus [38]

Ở nước ta, bệnh xoăn lá cà chua do virus phát triển mạnh trong vụ cà chua sớm và vụ xuân hè Sự lây lan của TYLCV có thể ngăn bằng cách loại bỏ các cây

ký chủ ra khỏi vùng có bệnh và bằng cách ngăn chặn loài bọ phấn có mặt trên đồng ruộng trước khi loại bỏ cây Tuy nhiên, phương pháp này tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và nông phẩm khi sử dụng chất hóa học độc hại tiêu diệt côn trùng

1.2.5 Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua

Bệnh xoăn vàng lá cà chua đã được biết đến nhiều năm, tuy nhiên vẫn chưa

có phương pháp phòng tránh hiệu quả và những thiệt hại do virus này gây ra vẫn rất đáng kể Tổn thất trung bình từ 5 – 90 % và có thể lên tới 100% khi mật độ quần thể bọ phấn cao Việc khống chế TYLCV chủ yếu thông kiểm soát qua môi giới truyền bệnh Các biện pháp truyền thống đã được sử dụng bao gồm phương pháp

cơ học, hóa học và sử dụng các giống kháng với TYLCV Một số phương pháp phòng chống TYLCV có thể kể đến bao gồm:

- Phương pháp tránh nguồn lây bệnh

Thời gian hoặc hoặc địa điểm canh tác được bố trí nhằm tránh những nơi hiện diện của quần thể bọ phấn thường sẽ có tác động đáng kể đến việc giảm tỷ lệ mắc bệnh do TYLCV trên đồng ruộng Ở một số nước như Israel, TYLCV lây lan chủ yếu trong thời gian cuối mùa hè và đầu mùa thu mật độ bọ phấn cao điểm từ tháng chín đến tháng mười một Do đó, để tránh nguồn bệnh, cà chua được trồng vào đầu mùa xuân, thường là cuối tháng ba hoặc đầu tháng tư, và được thu hoạch 3 tháng sau đó Cà chua sẽ được thu hoạch trước khi các quần thể lớn bọ phấn được hình thành Ngoài ra, các khu vực cà chua canh tác mới không nên đặt gần khu vực

đã trồng cũ cũng như không nên ở gần bất kỳ loại cây trồng nào là vật chủ của TYLCV Điều này đặc biệt đúng khi các giống cà chua kháng TYLCV không có triệu chứng bệnh nhưng vẫn có thể là nguồn lây nhiễm TYLCV cho cây trồng nhạy cảm

- Các biện pháp cơ học

Sử dụng tấm phủ phản quang trong việc giảm khả năng lây nhiễm của

TYLCV lên cà chua đã từng được áp dụng thành công Tấm phủ phản quang có tác dụng phản xạ hiệu quả hoàn toàn hoặc một phần aluminized và phản ánh của

ánh sáng cả ngày Nó có tính chất phản xạ cả ánh sáng khả kiến và tia cực tím có tác dụng làm mất phương hướng của bọ

Sử dụng phương pháp này có thể khống chế đồng thời các vector của virus khác (các loài rệp và bọ trĩ) và làm giảm tỷ lệ mắc bệnh với một số virus cà chua khác Biện pháp này tỏ ra hiệu quả khi được sử dụng trên đồng ruộng ở Florida và Israel Bằng cách sử dụng lớp phủ màu vàng, ở các ruộng được bảo vệ bởi lớp phủ chỉ có 10% xuất hiện các triệu chứng TYLCV

so với gần 100% của các ruộng trồng cà chua không che phủ Tuy nhiên, hiệu quả

sử dụng giảm tương ứng với sự tăng lên của những tán cây và các lớp bao phủ

Nhựa hấp thụ tia cực tím được sử dụng dưới dạng như nhà kính hoặc lưới

chống côn trùng đã thu được thành công trong việc khống chế bọ phấn ở cánh đồng thuộc Israel Nhựa hấp thụ UV có thể làm giảm mức độ của ánh sáng tia cực tím, gây mù các cá thể bọ phấn mà sử dụng bước sóng ánh sáng tia cực tím để định hướng Những lưới hấp thụ tia cực tím đã cho thấy hiệu quả trong việc ức chế sự xâm nhập của bọ phấn vào nhà kính và giảm chuyển động của bọ phấn trong nhà kính Tỷ lệ nhiễm TYLCV của cà chua được trồng trong các tấm hấp thụ UV chỉ có 1% so với khoảng 80% trong điều kiện không có bất kỳ ứng dụng của thuốc trừ sâu Điều quan trọng cần lưu ý là bên cạnh chi phí sản xuất cao hơn, việc sử dụng màn lưới này cũng có thể dẫn đến tăng nhiệt độ và độ ẩm bên trong nhà lưới

Hàng rào vật lý như lưới chống côn trùng đã được sử dụng trong lưu vực

Địa Trung Hải từ năm 1990 để bảo vệ cây trồng từ TYLCV Kết hợp với một vài đợt phun thuốc trừ sâu, tỷ lệ nhiễm TYLCV trong các khu vực được bảo vệ trong

18 tuần sau khi trồng chỉ còn 1%

Sử dụng chất hóa học

Phương pháp sử dụng các chất hóa học để tiêu diệt bọ phấn nhằm làm giảm thiệt hại do TYLCV ở cây trồng được sử dụng nhiều nhất Một số các lớp hóa chất khác nhau đã được sử dụng để tiêu diệt bọ phấn bao gồm các hydrocarbon clo, organophosphates, neonicotinoids, pyridin-azomethines, và pyrethroids Tuy nhiên khi sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thường xuất hiện các tác động không mong muốn Các hóa chất ngoài tác dụng diệt bọ phấn, thường có tác động gây hại lên môi trường và các côn trùng có ích Ngoài ra, trong nhiều trường hợp sử dụng, bọ phấn đã phát triển đề kháng với rất nhiều các hóa chất này và hiệu quả đã giảm theo thời gian Mặt khác, việc sử dụng lặp đi lặp lại và thường xuyên của các thuốc bảo

vệ thực vật trong việc kiểm soát bọ phấn đã gây ra sự bùng phát của sâu bệnh thứ cấp ví dụ như sâu ăn lá

kháng đã được sử dụng như TY-1 trên nhiễm sắc thể số 6 của L chilense) Gen kháng với TYLCV khác có nguồn gốc từ L pimpinellifolium trên nhiễm sắc thể số

6 nhưng khác locus với TY-1 đã được xác định bằng phản ứng RAPD dựa vào

marker phân tử Gen kháng với TYLCV-Thái lan được tìm thấy trên nhiễm sắc thể

số 8 và 11 của L hirsutun

Giống cà chua kháng TYLCV đầu tiên được tạo ra là kết quả của lai giống

gen kháng TY20 có nguồn gốc từ L peruvianum Ngoài ra, gen kháng TY-1 cũng đã được sử dụng thành công để kháng lại Tomato yellow mosaic virus (ToYMV) và

Tomato mottle virus (ToMoV) Tuy nhiên, những giống kháng thương mại tạo ra

bằng lai giống bị hạn chế bởi trong kiểu gen thường mang những gen không mong muốn và quá trình đưa một gen kháng từ một giống hoang dại vào một giống thương mại thường rất mất thời gian và phức tạp do liên quan đến cơ chế di truyền của toàn bộ genome

Hiện nay, chuyển gen tạo cây kháng đang là giải pháp hiệu quả nhất Cây kháng được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền có nhiều lợi thế hơn các cây kháng thu được từ lai giống các gen của bộ gen thực vật Trong thực tế, một số cây trồng chuyển gen kháng virus đã được phát triển bằng cách sử dụng một trình tự của genome virus trong thay đổi vật chất di truyền cây trồng Khái niệm này được gọi

là tính kháng có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh (PDR) Cho đến nay, sử dụng PDR trong việc nâng cao sức đề kháng của cà chua chống lại TYLCV cũng như các

Begomovirus khác đã cho thấy đây là một phương pháp triển vọng Để tạo cây

trồng kháng với TYLCV có thể tác động vào các đích sau: (1) tác động đến protein

vỏ (2) tạo cây kháng thông qua ức chế protein vận chuyển (3) làm thay đổi DNA, (4) sử dụng các gene antisense và (5) sử dụng các gen chức năng đã bị cắt ngắn hoặc đột biến để chuyển vào cây trồng Trong thực tế, một số giống kháng đã được tạo ra bởi cách tiếp cận này đã cho thấy khả năng xây dựng tính kháng có thể trở

thành nền tảng cho các chương trình quản lý Begomovirus trên toàn thế giới

1.3 Các phương pháp lây nhiễm TYLCV trong thực nghiệm

Việc tìm hiểu về các con đường truyền nhiễm virus thực vật trong tự nhiên

và nhân tạo, có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác chọn tạo giống cây trồng kháng lại mầm bệnh do virus thực vật gây ra Đây là công việc thực sự có ý nghĩa trong khoa học và ứng dụng vào công tác chọn tạo giống cây trồng kháng lại virus

và vector vật truyền trung gian

Đối với TYLCV Trong tự nhiên chỉ lây nhiễm từ cây này sang cây khác qua

Bemicia tabaci, do đó bằng cách sử dụng Bemicia tabaci làm vật truyền trung gian

(vector truyền bệnh) để lây nhiễm nhân tạo TYLCV từ cây mang mầm bệnh sang cây lành trong vườn thí nghiệm, nhà lưới hoặc đồng ruộng rồi thống kê kết quả và đánh giá khả năng kháng lại TYLCV của các giống cà chua tham gia khảo nghiệm, nhằm chọn tạo ra giống có khả năng kháng bệnh tốt nhất do loài virus này gây ra Phương pháp này đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và báo cáo vào năm 1960 [5], [8], [26]

Năm 2007, Inoue-Nagata

2 đến 4 tuần [21] Hiện nay, phương pháp lây nhiễm TYLCV thông qua bọ phấn để đánh giá khả năng kháng bệnh do virus này vẫn được sử dụng [16], [1], [38], [26] Hiệu quả phương pháp này là cao nhưng phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh thái của bọ phấn Mặt khác việc nuôi dưỡng bọ phấn mang virus rất phức tạp và tốn nhiều công sức do bọ phấn có kích thước rất nhỏ, vòng đời ngắn và sức sống yếu

Trong quá trình nghiên cứu, người ta nhận thấy sau khi TYLCV được nhiễm vào cây cà chua thì sự lan truyền của chúng qua cầu nối sinh chất giữa các tế bào cạnh nhau trong mô cây là rất nhanh chóng Do đó phương pháp ghép áp cây lành với cây đã bị bệnh để gây nhiễm TYLCV đã được thử nghiệm và mang lại hiệu quả cao [32] Phương pháp này được tiến hành như sau: Tiến hành trồng các dòng cây cần lây nhiễm vào chậu thí nghiệm, tiến hành ghép sau khi cây đạt chiều cao khoảng 30 – 35 cm Dùng dao lam cắt vát một miếng nhỏ (dài 1,5 – 2 cm, rộng 0,4 – 0,5 cm) vừa chạm vào lớp mạch gỗ của thân ở vị trí gần cành non của cây Áp

chỗ cắt của cây lành với cây bệnh, dùng băng dính buộc chặt lại, tạo điều kiện cho virus di chuyển từ cây bệnh sang cây lành Dùng bình xịt phun sương lên cây sau khi ghép, chụp lồng cách li côn trùng Theo dõi biểu hiện bệnh trong 50 ngày Phương pháp này cho hiệu quả lan truyền rất cao [38]

Những năm gần đây, phương pháp Agro - inoculation sử dụng để lây truyền

virus thực vật nói chung và TYLCV nói riêng đã lây nhiễm thành công virus vào

cây ký chủ [1], [2] Phương pháp Agro - inoculation sử dụng trong lây nhiễm

TYLCV là phương pháp mới nhất, sự tổng hợp đoạn DNA đầy đủ trình tự của genome virus được tái tổ hợp trong plasmid – T và được lây nhiễm thông qua vi

khuẩn đất Agrobacteium tumefaciens truyền TYLCV vào cây cà chua, sau một thời

gian sự biểu hiện triệu chứng bệnh do virus này gây ra xuất hiện, sử dụng các phương pháp sinh học phân tử như PCR đặc hiệu đã xác định được sự có mặt của

TYLCV trong cây bệnh với tần suất cao Nhược điểm của phương pháp inoculation là biểu hiện bệnh thường nhẹ, không rõ ràng và khó để phân loại mức

Agro-độ biểu hiện bệnh dẫn đến kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh cho cà chua khó chính xác

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

(1) Giống cà chua PT18

Cà chua PT18 có chiều cao trung bình 80 - 100cm, dạng cây gọn, màu lá xanh nhạt, phân cành ít, sinh trưởng hữu hạn (100 - 120 ngày), kháng bệnh khá, nhất là bệnh héo xanh vi khuẩn PT18 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong mùa khô dưới nhiệt độ 21 – 25oC Thời vụ gieo hạt thích hợp nhất là tháng 9 - 10 Cà chua PT18 trồng được cả 3 vụ (vụ sớm, vụ chính và vụ muộn) Đây là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV

(2) Giống cà chua F1 GM – 2008

Giống cà chua F1 GM – 2008 là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp Quả của F1 GM – 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tươi, thịt dày, rắn chắc F1GM

2008 sinh trưởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, có thể trồng sớm ngay từ tháng

7, nhanh thu hoạch Đây là giống lai tạo theo hướng kháng bệnh héo xanh và xoăn

DV 2962 có khả năng chống chịu tốt một số bệnh nguy hiểm như héo xanh, mốc sương, xoăn lá do virus

(4) Cà chua dại mang virus TYLCV thu thập ở vườn có áp lực bệnh cao Sử dụng

trong lây nhiễm bằng bọ phấn và ghép áp để lây nhiễm TYLCV

2.1.2 Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA404 mang vector

PCAMBIA 2300 chứa genome TYLCV do bộ môn bệnh cây nhiệt đới, Trường Đại

học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp gồm 2 dòng : A tumefaciens LBA404/2300/TY

(chứa đầy đủ vòng DNA – A của TYLCV) và A tumefaciens LBA404/2300/β

(chứa vòng DNA vệ tinh β của TYLCV) Chủng vi khuẩn này có đặc tính kháng

rifamycin và kanamycin

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 do Phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ

Việt Nam cung cấp

2.1.3 Hoá chất, thiết bị máy móc

(1) Hoá chất

Sodium chloride (NaCl), Tris – HCl, EDTA, CTAB, sorbitol, sodium

dihydrogen phosphate (NaH2PO4), chloroform (CHCl3), isoamyl alcohol

((CH3)2CHCH2CH2OH), ethanol (C2H5OH) Taq polymerase, dNTPs (dATP,

dCTP, dGTP, dTTP), buffer PCR, MgCl2, mồi xuôi (Forward primer), mồi ngược

(Reverse primer), agarose, TAE, glycerol, bromophenol blue, thang DNA chuẩn

(Fermentas) – DNA marker, ethydium bromide (EtBr), glucose, Tris – base, NaOH,

SDS, CH3COOK, MES, AS, bacto – tryptone, yeast extract, bacto – agar,

kanamycin, rifamycin, cồn 90o

(2) Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

Các thiết bị, dụng cụ thuộc phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống

trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên gồm: máy ly tâm lạnh (Hettich -

Germany), box cấy (Nuaire - USA), máy lắc (Korea), máy soi gel (Wealtec - USA),

bộ điện di (USA), máy vortex (CLP - USA), máy đo quang phổ, máy PCR

(Applied Biosystems), máy đo pH (Martini - Rumani), tủ lạnh - 20 – 4o

C (Fiochetti

- Italy), cân điện tử (Sartorius), lò vi sóng (Sharp - Japan), bể ồn nhiệt (Joiotech), nồi hấp vô trùng, máy cất nước, pipetman (Hettich - Germany), đầu côn các loại, ống eppendorf, ống fancol, cối chày sứ, bơm kim tiêm y tế, bình tam giác (loại 100,

250, 500 ml), cốc đong, ống đong, gang tay cao su, đũa thủy tinh

Ngoài ra trong đề tài còn sử dụng các dụng cụ, thiết bị khác như lọ penicilin, bông, kéo, găng tay y tế, xi lanh tiêm, lồng lưới, chậu trồng cây, dao lam, băng dính

y tế, giấy bạc, đũa inốc, bình xịt thuốc sâu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lây nhiễm bằng bọ phấn

Gieo hạt và cách li cây sau nảy mầm, sau đó tiến hành lây nhiễm bọ phấn, tiến hành thả 10 -20 cá thể bọ phấn cùng với cây bệnh trong lồng cách li Nuôi cộng sinh trong 48 giờ, tiến hành phun thuốc diệt côn trùng để diệt bọ phấn Sau lây nhiễm 10

THU THẬP GIỐNG

TẠO NGUỒN BỆNH

LÂY NHIỄM VIRUS

KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ

ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH LÂY NHIỄM

Phương pháp ghép Phương pháp Agroinoculation

PCR nhân gen virus

Phương pháp nuôi thả bọ phấn

Theo dõi biểu hiện

ngày, tiến hành thu lá để tách DNA kiểm tra gen virus trong các dòng lây nhiễm bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Theo dõi biểu hiện bệnh sau 50 ngày sau nuôi thả bọ phấn, tiến hành thu lá tách DNA kiểm tra gen virus

2.2.2 Phương pháp lây nhiễm bằng ghép áp

:

3 hoặc 4 Trồng cây ở vườn có áp lực bệnh cao có nguồn bọ phấn trắng để tạo cây bệnh

sạch bệnh phục vụ thí nghiệm

: sau khi cây con 15

: T

-

5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50

2.2.3 Phương pháp lây nhiễm bằng Agro - inoculation

(1) Gieo hạt và trồng cây thí nghiệm

(2) Cách ly cây sau nảy mầm bằng lồng cách ly

(3) Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: nuôi lắc các dòng khuẩn lây nhiễm C58/PC2300/TY (PCAMBIA 2300 mang vòng DNA – A genome TYLCV) và C58/PC2300/β (PCAMBIA 2300 mang vòng DNAβ vệ tinh của TYLCV) riêng biệt trên môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin, sau đó

ly tâm thu cặn tế bào vi khuẩn và hòa từng dòng khuẩn vào dung dịch lây nhiễm (MgCl2 10 mM, MES 10 mM, AS 100 µM, H2O), cuối cùng trộn hai dòng khuẩn này lại với nhau với tỷ lệ 1 : 1, để ở nhiệt độ phòng 1 – 2 giờ rồi tiến hành tiêm cho các cây cà chua thí nghiệm

(4) Tiến hành lây nhiễm bằng tiêm: Sau khi cây con cao khoảng 10 cm khỏe mạnh, tiến hành tiêm khoảng 5 ml/cây (OD dịch khuẩn 0,5 – 1) Lặp lại thí nghiệm

3 lần, mỗi lần cách nhau 10 ngày

1.2.6 Phương pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)

Dung dịch tế bào vi khuẩn được đo OD bằng máy quang phổ ở bước sóng

660 nm (OD660) Khi độ OD660 = 0,5 – 1 thì dịch khuẩn có thể dùng cho thí nghiệm lây nhiễm ở trên (mục 2.2.3)

DNA được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm Nồng độ DNA được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/µl) = OD260 × 50 × hệ số pha loãng

Độ sạch DNA = OD260/OD280

Trong đó: OD260 là chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm, OD280 là chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm

Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 – 2,0 thì DNA đó là tinh sạch

2.2.5 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ biểu hiện bệnh