Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể bưởi thanh trà (citrus grandis (l ) osbeck) ở thành phố huế

Các kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữu hiệu, đã được ứng dụng rất rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền cũng như xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau.. Cây bư

MỞ ĐẦU

Từ lâu, bưởi Thanh trà là một trong số các trái cây đặc sản có giá trị của Thừa Thiên Huế, nổi tiếng với hương vị thơm ngon đặc biệt của chúng Tuy nhiên, ngay tại đây, bưởi Thanh trà được trồng ở các vùng khác nhau cũng có chất lượng khác nhau Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu trên đối tượng Thanh trà nhưng chủ yếu tập trung điều tra về phân bố [1], [2]; đánh giá thực trạng sản xuất [7]; các quá trình dinh dưỡng khoáng cũng như sử dụng phân bón cho Thanh trà [19], [29], [30]; nghiên cứu các tác nhân gây bệnh [14], [21]; nghiên cứu nhân giống [5] chứ chưa

có những nghiên cứu về mối quan hệ cũng như sự đa dạng về mặt di truyền của quần thể bưởi Thanh trà

BưởiThanh trà ở Thừa Thiên Huế nói chung và Huế nói riêng là loại trái cây đặc sản được người tiêu dùng nhiều nơi trong nước ưa chuộng, nhưng hiện nay sản lượng Thanh trà vẫn còn thấp Do trồng trọt lâu đời, do các đột biến tự nhiên và các quá trình lai tạo diễn ra trong một thời gian dài nên độ đồng nhất của giống cũng giảm đi, có nhiều dạng kiểu hình mới xuất hiện Nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của quần thể bưởi Thanh trà ở đây là cơ sở để chọn lọc và bảo quản các giống gốc, tạo tiền đề cho việc nhân giống với số lượng lớn sau này

Các kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữu hiệu, đã được ứng dụng rất rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền cũng như xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu

tính đa dạng di truyền của quần thể bưởi Thanh trà (Citrus grandis (L.)

Osbeck) ở thành phố Huế" làm cơ sở cho việc chọn giống Thanh trà sau này.

Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây bưởi và cây bưởi Thanh trà

1.1.1 Cây bưởi

Những ghi nhận lịch sử và phân tích di truyền có thể kết luận chỉ có 3 loài

thực sự trong chi Citrus (thanh yên, quýt và bưởi) và nhiều dạng sinh học dưới loài

Cam, chanh, chanh cốm, bưởi chùm mặc dù được thừa nhận rộng rãi nhưng chúng rất giống nhau về mặt di truyền, được tạo ra do chọn lọc, nhân giống bằng chiết ghép hay bằng hạt Sự khác nhau giữa các dạng này có nguồn gốc từ các đột biến soma Hơn nữa, nhiều thế hệ cây lai được tạo ra và được con người chọn lọc từ các

dạng ăn được hay theo các tiêu chí công nghiệp tạo nên sự đa dạng trong chi Citrus

như hiện nay [56]

Bưởi (Citrus grandis (L.) Osbeck), còn có các tên khác là C maxima (J Burm.) Merr hay C decumna L., được biết đến như là cây truyền thống của chi

Citrus (Scora, 1975) Bưởi thuộc họ cam chanh (Rutaceae), dưới họ Aurantioidae,

tộc Citreaea, dưới tộc Citrinae Chi này có thể được chia thành hai dưới chi là

Citrus và Papeda dựa vào đặc điểm lá, hoa, quả [46].

Hệ thống phân loại của chi Citrus được dùng phổ biến nhất là của Swingle

và Tanaka Swingle (1967) cho rằng chi Citrus có 16 loài, trong khi đó Tanaka (1977) lại cho rằng có đến 162 loài thuộc chi Citrus Tuy nhiên Scora (1975) lại cho rằng chỉ có 3 loài là thanh yên (C medica), quýt (C reticulata), và bưởi (C

grandis; hoặc C maxima) và Papeda là một nhóm của chi Citrus [46].

Bưởi thuộc cây thân gỗ, cao khoảng 10 m Lá có phiến to, dày, gân phụ 5-6 cặp, cuống có cánh rộng Hoa có chùm ngắn, trục có lông, cánh hoa trắng, dài 3,5

cm, tiểu nhụy nhiều, dính nhau Trái to, gần như tròn Bộ nhiễm sắc thể 2n=18 [13]

Bưởi là một loài cây ăn quả sống lâu năm, lá thường xanh, thân cây cao, tán cây có dạng hình tròn tự nhiên, hình dẹt hoặc nón Cành thường to hơn cam, quýt, cành lá phát triển mạnh Các bộ phận lá, cành, quả khi còn non thường phủ một lớp

lông tơ mỏng Nhìn chung, cây có múi có bộ rễ ăn cạn, các rễ lông mọc yếu nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng thấp [6], [27].

Bưởi có thể sinh sản hữu tính bằng hạt hay nhân giống bằng giâm, chiết cành Thông thường bưởi được nhân giống bằng hạt và thường ít được chú ý chăm sóc, chọn lọc nên có xu hướng ngày càng đa dạng so với các loài cây kinh tế khác

trong chi Citrus Bưởi được xem là cây trồng có khả năng thích nghi rộng với khí

hậu mặc dù điều kiện sống tự nhiên của chúng là ở vùng nhiệt đới ẩm [58]

Các nhà phân loại thực vật nhận thấy hiện nay bưởi hoang dại không còn tồn

tại phổ biến nữa Nếu có một số loài mọc hoang gần gũi với chi Citrus thì chúng

cũng không có quan hệ trực tiếp về mặt di truyền với những loài đang được trồng Bưởi được trồng trên khắp thế giới, ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, những nơi mà mùa đông có nhiệt độ ôn hòa, cây có thể sống sót và có đủ nước để sinh trưởng, phát triển (Gmitter và cs, 1992) Chất lượng quả bưởi tốt nhất là ở các vùng

cận nhiệt đới Các vùng trồng Citrus phổ biến nhất là châu Mỹ (Brazil, Mỹ,

Argentina và Mexico), lưu vực Địa Trung Hải (Nam Âu, Tây Nam Á, Bắc Phi), châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản) và Nam Phi Theo FAO, sản lượng bưởi

và bưởi chùm trên thế giới là 4 triệu tấn, được trồng ở 74 quốc gia với diện tích là 264.000 ha Mỹ là nước có sản lượng bưởi và bưởi chùm lớn nhất thế giới Vùng Đông Nam Á, đặc biệt là Đông Ấn Độ, Bắc Burma và Tây Nam Trung Quốc được

xem là trung tâm phát sinh và đa dạng của chi Citrus và những chi có quan hệ gần gũi với nó Tổng sản lượng quả của chi Citrus toàn cầu trong thời gian 2004-2005 là

105,5 triệu tấn [8], [46]

Bưởi là loài cây ăn quả đặc sản của nước ta, được trồng phổ biến từ Bắc đến Nam, từ đồng bằng, trung du đến miền núi Ở nước ta từ lâu đã hình thành những vùng trồng bưởi và những giống bưởi nổi tiếng như bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), bưởi đường Hương Sơn (Hương Sơn, Hà Tĩnh), bưởi Phúc Trạch (Hương Khê, Hà Tĩnh), bưởi Thanh trà (Thừa Thiên Huế), bưởi Biên Hòa (Đồng Nai), bưởi Năm roi, bưởi Da xanh (Vĩnh Long) [2]

Bưởi có nhiều giá trị về mặt y học đồng thời là thực phẩm ăn kiêng tốt cho nhiều loại bệnh Bưởi có thể được sử dụng trực tiếp hay chế biến thành nhiều món ăn khác nhau như các loại mứt, bánh kẹo, gỏi và nước uống Về thành phần dinh dưỡng, trong 100 g phần ăn được của bưởi chứa 90,3 g nước; 0,3 g chất khoáng; 38 kcal; 0,5 g protein; 0,3 g chất béo; 8,5 g carbohydrate; 37 mg calcium; 0,2 mg sắt; 120 μg carotene; 0,06 mg vitamin B1; 0,04 mg vitamin B2 và 105 mg vitamin C [36] Tuy nhiên, các thành phần dinh dưỡng của bưởi theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ có hơi khác (Bảng 1.1).

Thành phần chủ yếu của tinh dầu lá bưởi là dipenten, linalola và citrala Trong tinh dầu vỏ quả có 26% citrala và ester Trong vỏ quả bưởi, ngoài tinh dầu còn chứa pectin naringin (một glucoside), các enzyme peroxydase, amylase, đường ramnose, vitamin A và C, hesperidin (hesperidin còn gọi là hesperidoside) [17] Bưởi là trái cây nhiệt đới đa công dụng Trái bưởi không những ngon, có tác dụng bổ dưỡng mà lá, hoa, vỏ đều chứa nhiều tinh dầu nên thường được dùng để xông giải cảm Vỏ hạt bưởi tươi có tác dụng cầm máu rất tốt, bằng cách lấy hạt vỏ tươi dịt vào chỗ chảy máu Hạt bưởi bỏ vỏ ngoài, nướng chín đen, nghiền thành bột bôi lên chỗ chốc lở có thể lành bệnh rất nhanh [17]

Ngày nay, khoa học còn khám phá thêm những đặc tính trị liệu mới của bưởi Trong bưởi chứa nhiều pectin, là chất sợi hòa tan chứa polysaccharide giúp hấp thu cholesterol của thức ăn và muối mật nên làm giảm lượng cholesterol trong máu [17] Hesperidin và naringin là hai flavonoid chính của cùi bưởi có công dụng giúp bảo vệ tính đàn hồi của mạch máu, ngừa xơ cứng động mạch, gián tiếp chống cao huyết áp và tai biến mạch máu não Lycopene trong bưởi ruột hồng và bưởi ruột đỏ

là một carotenoid đặc biệt có khả năng ức chế hoạt động của các khối u, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu thêm về dược tính quý giá này

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của bưởi

Vitamin B-6 0,036 mg Vitamin A, IU 8 IU

Thành phần khác β-Carotene 0 µg α-Carotene 0 µg β-Cryptoxanthin 10 µg

Nguồn: United States Department of Agriculture(USDA), 2004

1.1.2 Cây bưởi Thanh trà

Bưởi Thanh trà (Citrus grandis (L.) Osbeck) là loài cây ăn quả đặc sản, có

giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao của Thừa Thiên Huế Bưởi Thanh trà đã được trồng ở Huế từ rất lâu Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa khẳng định được cây bưởi Thanh trà được trồng ở Huế khi nào Theo thông tin điều tra được từ người dân thì bưởi Thanh trà được trồng ở đây ít nhất cũng đã gần hai trăm năm Đây là loại bưởi thơm ngon, có hương vị và phẩm vị đặc biệt nên được người tiêu dùng rất ưa

chuộng, trước đây được trồng để phục vụ riêng cho giới quý tộc trong thời phong kiến Ngày nay, đã được trồng khá phổ biến để phục vụ người dân và khách du lịch [22]

Bưởi Thanh trà thuộc nhóm cây thân gỗ lớn, cao từ 6-8 m, có khi hơn Lá có dạng hình trứng ngược, mép lá gợn sóng, đuôi lá chẻ hơi lõm xuống phía ngọn lá Hoa bưởi Thanh trà lưỡng tính, có màu trắng và thơm, hoa mọc thành từng chùm hoặc đơn, có 5 cánh, có khoảng 30 chỉ nhị trên hoa, chỉ nhị màu vàng dính với nhau

từ 3-4 cái, có khi rời (1 cái) Đầu nhụy màu xanh vàng, có chất nhầy bao phủ và có dạnh hình thang ngược, bầu trên có 8-12 lá noãn hoặc hơn, hoa nở vào tháng 1 và tháng 2, có khi tháng 6 (trái vụ) Quả dạng hình quả lê, vỏ quả nhẵn, khi chín có màu vàng sáng, có từ 12-14 múi, tép mọng nước nhưng bóc không dính tay, quả chín có vị ngọt thanh và chua nhẹ Hạt đơn phôi có màu trắng, kích thước hạt 1,5× 0,8 cm, nhiều hạt trong một quả, trung bình có 60-85 hạt, có khi đến 100 hạt [22]

Thanh trà là loại cây ăn quả đặc sản của Thừa Thiên Huế và là giống bưởi ngon so với nhiều giống bưởi khác như: bưởi Năm roi, bưởi Phúc Trạch, bưởi Đoan Hùng, Nó có vị ngọt thanh, không đắng Tuy nhiên, Thanh trà có nhược điểm là

có nhiều hạt, khối lượng quả biến động và độ đồng đều thấp [22]

Thành phần hóa học của bưởi Thanh trà ở Thừa Thiên Huế như sau [18]:

Hòa (Hương Thủy), Phú Mậu (Phú Vang) với diện tích 302 ha, chiếm 48,5% tổng diện tích trồng Thanh trà ở Thừa Thiên Huế Trên đất phù sa ven sông Bồ như Hương Vân (Hương Trà), Quảng Thọ, Quảng Phú (Quảng Điền), Phong Sơn, Phong

An (Phong Điền) với diện tích 174 ha, chiếm khoảng 28% tổng diện tích Ven sông

Ô Lâu như ở Phong Thu, Phong Hòa, thị trấn Phong Điền, Phong Mỹ (Phong Điền)

có diện tích 112 ha, chiếm khoảng 18% Phần còn lại, Thanh trà được trồng ven sông Truồi ở Lộc Điền và Lộc Hòa (Phú Lộc) với diện tích khoảng 16,5 ha (2,6%) Ngoài ra, Thanh trà còn được trồng rải rác ở một số nơi khác như Lộc An, Lộc Thủy (Phú Lộc) và Hương Hòa (Nam Đông) [2]

Bưởi Thanh trà là loại trái cây cao cấp được người tiêu dùng nhiều nơi trong nước ưa chuộng, nhưng hiện nay sản lượng vẫn còn thấp Việc phát triển mở rộng diện tích trồng bưởi Thanh trà thành vùng sản xuất hàng hóa lớn theo định hướng của tỉnh còn gặp nhiều khó khăn, tốc độ phát triển hàng năm chậm Nguyên nhân của vấn đề này là do các hộ nông dân còn thiếu vốn đầu tư để mở rộng diện tích, bên cạnh đó do không được đầu tư đúng mức, do ảnh hưởng nặng nề của thiên tai, dịch hại nên giống bưởi này đã có biểu hiện thoái hóa, năng suất và phẩm chất giảm sút [7] Ngoài ra, do trồng trọt lâu đời, do các đột biến tự nhiên và các quá trình lai tạo diễn ra trong một khoảng thời gian dài nên độ đồng nhất của giống giảm, có nhiều dạng kiểu hình mới xuất hiện, tạo cho bưởi Thanh trà trồng ở các vùng khác nhau có những đặc điểm không giống nhau

1.2 Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di

truyền chi Citrus

Trong xu hướng hiện nay, để chọn giống cây trồng hay xác định nguồn gốc của các loài cây trồng người ta thường sử dụng các chỉ thị phân tử (molecular marker) Việc sử dụng các chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết kiệm thời gian do các đặc điểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái, không chịu tác động của môi trường Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử là một công cụ đắc lực để phân tích tính đa dạng di truyền của rất nhiều loài

Gần đây, các phân tích phân tử như trình tự các đoạn nucleotide lặp lại ngắn (microsatellite), các đoạn lặp lại đơn giản (SSR), kết hợp SSR và microsatellite (ISSR), đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP), đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD), đa hình các đoạn khuếch đại với các primer được thiết kế

cho các vùng đặc biệt (SCAR), phản ứng RAPD cho gen ctv (CAPS)… đã được sử dụng để kiểm tra mối quan hệ họ hàng trong số các nhóm phân loại chi Citrus [56]

1.2.1 Kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội Việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu

đa dạng di truyền đã được rất nhiều tác giả quan tâm và thực hiện trên nhiều đối tượng vi sinh vật, thực vật và động vật [64]

Ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rất rộng rãi trên nhiều đối tượng cây trồng, như dưa leo [15], vải thiều [3], khoai tây [31], dừa [16], lúa cạn [23], đậu xanh [24]… nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền, chọn lọc các loại cây trồng có

chất lượng tốt, trong đó có các loài thuộc chi Citrus.

Bưởi Năm roi là giống bưởi ngon nổi tiếng của đồng bằng sông Cửu Long và được trồng nhiều nhất ở huyện Bình Minh, Vĩnh Long Giống bưởi này được nhân trồng trong sản xuất chủ yếu bằng phương pháp chiết cành nên đã tạo ra tập đoàn bưởi có phẩm chất không đồng nhất cũng như có 3 nhóm chính là nhóm hạt to, nhóm hạt mài và nhóm hoàn toàn không hạt Võ Công Thành và cs (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của bưởi Năm roi bằng cách mỗi nhóm chọn 10

cây trong 4 xã khác nhau sau đó phân tích trên 3 loại điện di là protein, enzyme peroxidase và DNA để đánh giá tính đa dạng di truyền, phục vụ cho công tác chọn giống sau này Kết quả phân tích cho thấy cả 3 nhóm bưởi đều rất đa dạng về kiểu hình (Ho) và kiểu gen (HEP) nhưng sự khác biệt giữa các nhóm không có ý nghĩa thống kê Việc nhận dạng bằng 3 loại chỉ thị phân tử dễ dàng đối với nhóm hạt mài, chưa khác biệt rõ giữa nhóm hạt to và nhóm không hạt [25].

Vũ Thị Nhuận và cs (2005) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của 146 cây bưởi Năm roi ở xã Mỹ Hòa, Bình Minh, Vĩnh Long bằng phương pháp RAPD Kết quả nghiên cứu cho thấy 4 trong 7 primer được chọn để phát hiện các chỉ thị phân

tử cho kết quả tốt ở tất cả các cây trên Tập đoàn bưởi ở đây được chia làm 6 nhóm, trong đó có 5 nhóm giống nhau nhiều và 1 nhóm khác hẳn Khoảng cách di truyền của tập đoàn này thay đổi từ 0 đến 36% Trong tổng số 56 chỉ thị RAPD có 8 chỉ thị hiện diện ở tất cả các cây, 1 chỉ thị có tần số thấp nhất (chỉ có 3 cây) và 3 chỉ thị hiện diện ở 4 cây Kết quả nghiên cứu này cho thấy tập đoàn bưởi ở Mỹ Hòa rất đa dạng về mặt di truyền mặc dù chúng có sự tương đồng cao về mặt hình thái và sinh trưởng [20]

Để đánh giá nguồn vật liệu di truyền, Nguyen Thanh Nhan và cs (2003) đã phát triển kỹ thuật RAPD nhằm xác định đặc tính và phát hiện đa hình của các giống quýt và cam thương mại và truyền thống ở Việt Nam, cũng như đã điều tra

mối quan hệ di truyền ở 37 giống của các loài khác nhau trong chi Citrus Tác giả

đã sử dụng 150 primer để kiểm tra, trong đó có 15 primer tạo sản phẩm khuếch đại

có độ đa hình cao ở 15 giống quýt và 11 thể lai được chọn lọc Sử dụng chỉ thị RAPD trong xác định các loài cam chanh giúp hiểu biết tốt hơn về các biến dị di truyền, đánh giá biến dị di truyền của chúng so với các loài khác, ứng dụng các loài cam chanh và các thể lai có liên quan trong nhân giống các cây giống hay giống gốc [57]

Tính đa dạng sinh học của các loài cây có múi ở Gò Quao (Kiên Giang) đã được Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) nghiên cứu dựa vào các đặc điểm hình thái và phân tử Các đặc điểm về hình thái học cho thấy cây có múi tại Gò Quao, Kiên

Giang chia làm 5 nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh và hạnh Sử dụng 4 primer

là A-02, A-04, A-11 và A-13 (Operon Technologies, CA) trong phân tích đa dạng

di truyền bằng kỹ thuật RAPD cho kết quả 49 băng được ghi nhận Giản đồ phả hệ cho thấy cây có múi của Gò Quao, Kiên Giang chia thành 4 nhóm: bưởi, cam-quýt, chanh và hạnh Kết quả phân tích cho thấy khoảng cách di truyền giữa các nhóm biến động từ 0-43% Trong 49 băng có 11 băng xuất hiện ở 100% số cá thể, 26 băng trên 90%, 4 băng trên 80%, 2 băng trên 70%, 6 băng dưới 70% và có 1 băng là 45% [11]

Nguyễn Xuân Thụ và cs (2004) đã xây dựng cây phát sinh của một số giống bưởi trồng ở Việt Nam nhờ vào chỉ thị RAPD Tác giả đã sử dụng 17 primer (Operon Technologies, CA) để phân tích 13 giống bưởi trồng của Việt Nam, kết quả

là tất cả các primer đều khuếch đại được DNA của bưởi, trong tổng số 153 băng được ghi nhận có 124 băng đa hình (81,05%), 29 băng đơn hình (18,95%) Các băng có kích thước từ 150 bp đến 2450 bp Tỷ lệ các băng đa hình cao chứng tỏ các giống bưởi ở Việt Nam có quan hệ di truyền xa nhau Dựa trên kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD, tác giả đã tính hệ số đồng dạng di truyền theo công thức của Nei

và Li (1979), theo đó hệ số đồng dạng di truyền giữa các giống bưởi Red Pomelo và bưởi Thanh trà cao nhất (0,800); hệ số đồng dạng thấp nhất là giữa hai giống bưởi Phúc Trạch và bưởi Năm roi (0,566) Tính chung thì hệ số đồng dạng di truyền giữa giống bưởi Phúc Trạch và JoJoRa Flame với các giống khác là thấp nhất Hệ số đồng dạng di truyền của hai giống bưởi Red Pomelo và bưởi Thanh trà với các giống khác là cao nhất Trên cây phả hệ, bưởi Phúc Trạch nằm tách biệt trên một nhánh, giống bưởi JoJoRa Flame cũng chiếm vị trí tách biệt trên cây phát sinh, các giống bưởi thuộc nhóm BC (BC40, BC43, BC39, BC11) và giống bưởi Năm roi tập hợp trên một nhánh Các giống bưởi còn lại (Thanh trà, Lá cam, bưởi Diễn, Da xanh

và giống BC15) nằm trên nhánh còn lại của cây phát sinh [28]

Ngày nay, việc sử dụng chỉ thị RAPD để xây dựng bản đồ di truyền, xác định

sự đa dạng di truyền cũng như nguồn gốc của các giống bưởi nói riêng và những

cây thuộc chi Citrus nói chung đã được rất nhiều tác giả trên thế giới quan tâm

nghiên cứu (Ellisiario và cs, 1999; Federici và cs, 1998; Hussein và cs, 2004; Hao

và cs, 2004; Yahata và cs, 2005 ) [43], [44], [49], [50], [63]

Bản đồ di truyền dựa trên các chỉ thị RAPD của chi Citrus đã được Cai và cs

thực hiện năm 1994 Sự đa hình của các đoạn DNA khuếch đại được quan sát thấy ở gần một nữa trong tổng số 140 primer ngẫu nhiên được sử dụng, thể hiện cho 266 locus khác nhau Việc xác định các nhóm liên kết được thực hiện trên 60 cây của quần thể BC1 có nguồn gốc từ lai tự nhiên C grandis (L.) Osb.×[C grandis (L.) Osb.×Poncirus trifoliata (L.) Raf.] (Durham và cs, 1992) Phần lõi của bản đồ liên

kết được xây dựng bao gồm 9 nhóm liên kết chứa 109 chỉ thị RAPD cùng với 51 chỉ thị AFLP và isozyme từ các công trình nghiên cứu trước đó Bảy mươi chín chỉ thị khác không được sắp xếp một cách rõ ràng vì các allele của chúng có liên quan đến các nhóm liên kết cụ thể và có mối quan hệ đến phần lõi Phần lõi của bản đồ có tổng chiều dài là 1,192 cM với khoảng cách trung bình giữa các locus là 7,5 cM và chiếm khoảng 70-80% của genome [38]

Machado và cs (1996) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự đa hình và

độ tương đồng di truyền cho 39 kiểu gen của quýt Địa Trung Hải Kết quả khuếch đại bằng 21 primer ngẫu nhiên thu được 111 băng, trung bình xuất hiện 2,2 chỉ thị RAPD cho mỗi primer, tương đương với 42% số băng xuất hiện Các chỉ thị đặc hiệu kiểu gen cũng được tìm thấy, chủ yếu cho các dạng lai đã biết Phân tích cây phả hệ UPGMA cho thấy ít có sự khác nhau về mặt di truyền giữa các mẫu quýt Địa

Trung Hải, trong khi đó sự khác nhau giữa các dạng lai với các loài trong chi Citrus

nhiều hơn Hai mươi mẫu quýt cho năng suất như nhau, sự đa hình về mặt di truyền xác định bằng kỹ thuật RAPD cho thấy sự khác nhau giữa các mẫu là khá thấp, như vậy có thể chúng là một dòng đơn Với số lượng dạng lai lớn cùng với sự đa hình giữa các mẫu thấp có thể khẳng định giả thuyết rằng tất cả quýt Địa Trung Hải là

dạng lai của loài quýt phổ biến Citrus reticulata Blanco [55].

Để nghiên cứu sự tương đồng di truyền trên 35 mẫu quýt, bao gồm 10 loài và

7 dạng lai, Filho và cs (1998) đã sử dụng 23 primer (22 primer chứa 10 nucleotide

và 1 primer gồm 8 nucleotide) để thực hiện phản ứng khuếch đại tạo ra 109 băng,

trong đó có 45 băng đa hình Hệ số Jaccard được sử dụng để tính độ tương đồng di truyền và phân tích UPGMA được sử dụng để xây dựng cây phả hệ Kết quả phân tích RAPD cho thấy có những băng đặc trưng cho mẫu và các mẫu phân biệt được tập hợp thành các nhóm Sự tương đồng di truyền bên trong nhóm quýt đạt khá cao (GJ=0,77) cho thấy các giống quýt được trồng có một nguồn gốc di truyền hẹp Sự

tương đồng di truyền giữa quýt với các loài Citrus khác như thanh yên (C medica L.) và bưởi (C grandis Osbeck) thấp hơn (thấp nhất GJ=0,27) Tác giả cho rằng

nhóm các mẫu quýt nghiên cứu thuộc cùng 1 loài (C reticulata Blanco) với một vài

khác biệt di truyền giữa các cá thể và một lượng lớn các cây lai hơn là một nhóm loài trong cùng một bậc phân loại [45]

Ba mươi hai mẫu Citrus và Microcitrus cũng đã được kiểm tra bằng phân tích RAPD Sự hiện diện của các băng ít gặp trong chi Citrus được tìm thấy trong

các chi gần gũi cho thấy có dấu hiệu của sự di nhập gen, trong khi sự hiện diện của một vài băng duy nhất cho thấy sự không dung hợp (non-involvement) của các loài này trong các dạng lai Hầu hết các loài được mô tả là các dạng lai với độ tương đồng di truyền cao và ít các băng duy nhất Ma trận khoảng cách và cây phả hệ được xây dựng dựa trên hệ số bắt cặp đơn (simple matching coefficient) và phân tích các nhóm họ hàng Dữ liệu RFLP và RAPD cho ra kết quả gần giống nhau, các

kết quả này cho thấy C maxima cùng nhóm với loài không ăn được C hongheensis

và C latipes C medica cùng nhóm với C indica và chanh cốm, chanh và các dạng

gần gũi Quýt không thực sự thuộc về các nhóm trên mà là một loài khác, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy có rất nhiều mẫu đã được định loài sai [45]

Bastianel và cs (2001) đã sử dụng các chỉ thị RAPD để phân tích sự tương

đồng về mặt di truyền của 15 giống thuộc chi Citrus (Citrus spp.) ở Brazil, bao gồm

4 giống cam ngọt (C sinensis Osbeck), 4 giống quýt (C reticulata Blanco, C

nobilis Loureiro, C sunki Loureiro và C deliciosa Tenore), cam chua (C aurantium L.), bưởi chùm (C paradisi Marcf.), bưởi (C grandis Osbeck), thanh

yên (C medica L.), chanh cốm (C latifolia) và 2 dạng lai [C clementina T.×(C

tangerina T.×C paradisi Macf.)] Sự tương đồng di truyền của 15 giống này được

quan sát từ 12 primer ngẫu nhiên, độ tương đồng di truyền giữa các giống quýt thấp

nhất là 0,81 Độ tương đồng thấp hơn thấy ở các loài ít quan hệ là C medica, C

grandis và C latifolia Bốn giống cam ngọt (C sinensis Osbeck) không có sự khác

nhau dựa vào chỉ thị RAPD, chúng có độ tương đồng cao nhất [36]

Đa dạng di truyền của 38 mẫu bưởi chùm (Citrus paradisi Macf.) và 3 mẫu bưởi (C maxima (Burm.) Merr.) đã được Corazza-Nunes và cs (2002) thực hiện

dựa trên kỹ thuật SSR và RAPD Khoảng 49% trong tổng số 198 chỉ thị RAPD thể hiện sự đa hình và 4,6 allele/SSR locus đã được xác định Giá trị hàm lượng thông tin đa dạng (PIC-polymorphism information content) thay đổi từ 0,093 đến 0,450 Cây phả hệ UPGMA được xây dựng và hai nhóm bưởi chùm chính cũng đã được xác định Mẫu bưởi “do Cabo” và “Siamesa-Filipinas” có mối quan hệ rất gần với bưởi ở nhóm A Nhóm B có 3 phân nhóm, chứa hầu hết các mẫu bưởi chùm còn lại Các mẫu bưởi chùm chính có sự tương đồng di truyền cao chứng tỏ sự đa dạng về kiểu hình quan sát được trong nhóm phải có nguồn gốc từ các đột biến soma và không xác định được bằng các chỉ thị phân tử [41]

De Oliveira và cs (2003) đánh giá quá trình chọn lọc trong quần thể lai

Citrus bằng phân tích RAPD Sự phân ly của 123 chỉ thị phân tử giữa quýt Cravo

(Citrus reticulata Blanco) và cam Pêra (C sinensis (L.) Osbeck) được phân tích từ

94 con lai F1 Thành phần di truyền, sự đa dạng, tính dị hợp tử, sự khác nhau trong cấu trúc nhiễm sắc thể và sự hiện diện của các gen lặn có hại được xác định dựa trên

tỷ lệ phân ly khi quan sát Một tỷ lệ lớn chỉ thị phân tử có sự sai khác so với tỷ lệ phân ly 1:1 Nhiều chỉ thị cho kết quả phân ly theo tỷ lệ 3:1 ở cả 2 giống và 1:3 ở cam Pêra, có lẽ là do quá trình chọn lọc trực tiếp [42]

Cevík và cs (2006) đã xây dựng bản đồ di truyền liên kết của chi Citrus bằng kỹ thuật RAPD Tác giả đã chọn ngẫu nhiên 30 cây trong quần thể lai hỗn tạp {C grandis (L.) Osb.×[C paradisi Macf.×Poncirus trifoliata (L.) Raf.]}×{[(C paradisi Macf.×P

trifoliata (L.) Raf.)×C reticulata Blanco]×[(C paradisi Macf.×P trifoliata (L.) Raf.)×

C sinensis (L.) Osb.]} để nghiên cứu DNA tổng số được tách chiết từ lá sau đó

khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng các primer (10-mer) ngẫu nhiên Kết quả cho

thấy có tất cả 111 chỉ thị phân tử được xác định sau khi được khuếch đại bằng 38 primer, bản đồ di truyền liên kết đã được xây dựng trên các chỉ thị này Bản đồ sau khi xây dựng chứa 63 chỉ thị chia làm 9 nhóm, thể hiện cho bộ nhiễm sắc thể đơn bội n=9

của chi Citrus Tổng chiều dài nhóm liên kết trong thí nghiệm này là 314,8 cM với

khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị phân tử là 5,07 cM [40]

Shaaban và cs (2006) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống

cam địa phương (Citrus aurantium L.) của Ai Cập, 7 giống cam được nghiên cứu là

Succary, Valencia, Balady, Abusoura và 3 cây chưa xác định được đánh số 1, 2 và

3 Tác giả đã đánh giá về các đặc tính sinh lý, hóa sinh của quả cũng như phân tích

đa dạng di truyền bằng kỹ thuật RAPD Kết quả nghiên cứu cho thấy cây số 3 có 5 đặc điểm của quả nổi bật là khối lượng quả, thể tích quả, khối lượng vỏ, chiều dài quả và đường kính quả Cây này cũng có 3 chỉ tiêu hóa sinh cao hơn các giống khác

là hàm lượng ascorbic acid, tỷ lệ chất rắn hòa tan tổng số (TSS)/acid và tỷ lệ acid vô

cơ trong chất rắn hòa tan tổng số (titratable acidity TSS)/acid Phân tích RAPD cho thấy có sự phân biệt rõ dấu DNA (DNA fingerprint) giữa cây số 3 với các giống còn lại, cây này thuộc về 1 nhóm (cluster A) và những giống còn lại thuộc một nhóm khác (cluster B) với sự không tương đồng di truyền đạt xấp xỉ 100% giữa 2 nhóm này Dựa vào các kết quả nghiên cứu này, tác giả đã xem cây số 3 như là một giống mới với một số đặc điểm sinh lý, hóa sinh nổi bật [61]

Việc nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên kỹ thuật RAPD cũng đã được nhiều tác giả thực hiện ở nhiều đối tượng thực vật khác, như đu đủ [10], đậu xanh [12], tảo [9] Để đánh giá tính đa dạng di truyền và thu thập nguồn gen quý của chi

Lilium từ 32 mẫu đại diện cho các giống Lilium bản địa và nhập nội khác nhau,

Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2009) đã sử dụng chỉ thị RAPD Trong số 20 primer RAPD sử dụng, chỉ có 3 primer (chiếm 15%) là các primer cho các băng đa hình Ba primer OPA10, P615 và P650 đã tạo ra tổng số 123 băng DNA với trung bình đạt 0,8; 1,7 và 3,8 băng DNA trên mỗi mẫu nghiên cứu Mức độ đa hình khác

nhau được thể hiện bởi 3 primer này cũng đã quan sát được ở các nhóm Lilium khác

nhau Số băng DNA đa hình cao nhất (61 băng) thu được ở các giống Lily thuộc nhóm

Oriental chiếm 49,59%, tiếp sau đó là nhóm L longiflorum và các con lai của chúng

đạt 33,3%, nhóm các loài Lily hoang dại thu thập từ Nhật Bản đạt 8,13%; các giống Lily thuộc nhóm Asiatic đạt 7,32% và nhóm các loài Lily bản địa của Việt Nam đạt 1,63% Phân tích RAPD cùng với việc thiết lập cây phân loại di truyền đã cho thấy sự

đa dạng và mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen Lilium đã thu thập [26].

Nguyễn Thị Thanh Bình và cs (2004) đã dùng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu tính đa hình của 8 giống tằm đang được nuôi tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB, TML, VC, ĐS1, ĐS2, BM, THT, VYD, trong đó có 4 giống được sử dụng nhiều trong vài năm gần đây, đó là hai giống địa phương thuộc tập đoàn gốc đa hệ: vàng chấm (VC) và Đồ Sơn (ĐS) hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình (TTB) và trắng Mai Lĩnh (TML) Trong tổng số 67 băng nhận được có 26 băng đơn hình (chiếm 38,81%) và 41 băng đa hình (chiếm 66,19%), kích cỡ của các băng từ 100 bp đến

3500 bp Trong 8 giống tằm nghiên cứu có 2 giống lưỡng hệ tương đối xa nhau về quan hệ di truyền, còn 6 giống đa hệ địa phương có họ hàng khá gần gũi với nhau Các băng đa hình là cơ sở phân biệt giữa các giống với nhau, có băng đa hình chỉ xuất hiện ở một giống mà không xuất hiện ở các giống khác như băng OPO19-1200

bp và OPO19-1000 bp chỉ thấy ở giống TML, băng OPO19-800 bp ở giống TTB và trong nhóm đa hệ chỉ xuất hiện ở giống BM Với primer OPO16, băng 300 bp quan sát thấy ở giống TTB, còn băng 400 bp có ở giống TML và duy nhất ở VC trong nhóm đa hệ Hiện tượng này còn thấy ở primer OPO13, băng 550 bp ở giống THT, băng 100 bp xuất hiện trong giống TML, còn băng 1600 bp chỉ thấy ở TTB Primer

101, riêng giống TTB có băng 100 bp và VC duy nhất mang băng 400 bp trong nhóm đa hệ Băng A7-1300 bp, 900 bp và 300 bp không có ở 7 giống khác mà hiện diện ở TTB Giống ĐS1 và ĐS2 cho các băng hệt như nhau ở 4 primer nghiên cứu, primer thứ 5 có 2 băng phân biệt So sánh tất cả các primer sử dụng, primer OPO16

có tỷ lệ băng đa hình cao nhất 11/12, còn primer 101 có tỷ lệ đa hình thấp nhất 6/15 Giống TTB có hệ số đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,547 đến 0,703, thấp nhất trong các giống nghiên cứu, còn ở giống TML chỉ số này cao hơn, biến đổi từ 0,766 đến 0,906 Các giống trong nhóm đa hệ có hệ số đồng dạng di truyền thay đổi từ 0,766 đến 0,984 Giống ĐS1 và ĐS2 có hệ số cao nhất 0,984, có khả năng đây chỉ là một giống nhưng nuôi ở hai địa phương khác nhau [4]

Kỹ thuật RAPD đã được Kumari và cs (2006) sử dụng để xác định sự đa dạng và mối quan hệ gần gũi giữa 11 cây hoa cúc bị gây đột biến từ hai giống hoa cúc Ajay và Thai Chen Quee Trong số 40 primer được sàng lọc, 21 primer có sự khuếch đại, tỷ lệ băng đa hình khác nhau ở các primer, từ 20% (OPR-2) đến 100% (OPS-2, OPK-3) Hầu hết các primer đều không khuếch đại đối với các mẫu đột biến màu vàng và cam sáng của giống Thai Chen Queen (trong số 40 primer, có 15 primer khuếch đại đối với cả hai dạng đột biến) Tuy nhiên, primer OPB-11 đã có

sự khuếch đại đối với cả hai dạng đột biến này và có 1 băng đặc hiệu cao (1,9 kb) Khi so sánh với các mẫu đột biến khác, thấy rằng đây là băng đa hình Tổng số băng được khuếch đại bởi 21 primer là 156 cả đối với cây bị đột biến do phóng xạ và cây

bố mẹ, trong đó có 118 băng đa hình Số băng khuếch đại khác nhau ở các primer, nhỏ nhất là 3 băng và lớn nhất là 14 băng Khoảng cách di truyền giữa 13 cây khác nhau từ 0,43-0,96 Cây phả hệ dựa vào sự phân tích UPGMA có 3 nhóm chính A, B

và C Nhóm A gồm 4 giống đột biến (Red, Pink Cups, Yellow và Fluted) bắt nguồn

từ cây bố mẹ Ajay; nhóm B gồm cây bố mẹ Thai Chen Queen và 5 giống gồm 7 cây đột biến (Orange, Small Yellow, Spoon Yellow, Pink và Purple) Hai giống đột biến vàng và cam sáng của Thai Chen Queen được xếp vào một nhóm hoàn toàn khác biệt, nhóm C Điều này chứng tỏ có sự đa dạng di truyền rất cao giữa các cây đột biến và các cây bố mẹ [53]

Sự đa dạng di truyền và cấu trúc của 4 quần thể tự nhiên thuộc loài

Paramichelia baillonii (Pierre) Hu (họ Ngọc lan) ở Trung Quốc đã được Li và cs

(2007) đánh giá dựa vào kỹ thuật RAPD và các đặc tính hình thái Theo kết quả phân tích RAPD, 17 primer được chọn có tổng số băng khuếch đại là 152, trong đó có 63 băng đa hình, chiếm 41,4% Hệ số Shanon (Ho) khác nhau ở các quần thể, từ 0,555-1,121, với giá trị trung bình là 0,955 Sự đa dạng ở cấp độ loài Hsp=1,217 [54]

Chuối được xem là một loài cây ăn quả có giá trị kinh tế và là một loại thực phẩm ăn kiêng rất tốt Jain và cs (2007) đã phân tích mối quan hệ di truyền của 4 giống chuối khác nhau được trồng ở miền Nam Ấn Độ (Grand Naine, Red Banana, Nendran và Rasthali) bằng kỹ thuật RAPD với 3 primer (OPA-19, OPB-18, OPD-

16) Kết quả có 43,47% sản phẩm khuếch đại là băng đơn hình, chung cho tất cả các

kiểu gen, trong khi đó có 30,43% là băng duy nhất, nhưng chỉ có 26,08% thể hiện

mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gen này Trong số các primer đã chọn, primer OPB-18 tạo ra số lượng băng đa hình cao nhất (4 băng), tiếp theo là primer OPA-19

và primer OPD-16 Các ma trận khác nhau đã được tính toán bằng cách sử dụng chỉ

số SED (Squard Euclidean Distance) để ước đoán sự khác nhau của tất cả các cặp trong sản phẩm khuếch đại, chương trình được xây dựng bởi phương pháp của Ward sử dụng thuật toán phương sai nhỏ nhất Sự phân tích cụm biểu hiện 4 kiểu gen được xác định bằng chương trình của Grandnaine và Rasthali Giá trị sai khác

về mặt di truyền là từ 2,82%-3,6%, sự sai khác lớn nhất là 3,6% được phát hiện giữa hai giống Red Banana và Rasthali, và thấp nhất là ở hai giống Nendran và Rashali (2,23%) [51]

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) là một trong những loại rau quả

quan trọng nhất ở Ấn Độ, với sản lượng hàng năm lên đến 4,5 triệu tấn Archak và

cs (2002) đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa 27 giống cà chua ở Ấn Độ dựa vào kỹ thuật RAPD, 42 primer được chọn đã khuếch đại tạo ra 174 băng với các kích thước khác nhau ở 27 giống Số lượng băng trên primer nhiều nhất là 8 băng, trung bình là 4,1 băng cho mỗi primer Số băng đa hình trên mỗi primer là từ 0 đến

7 băng, trung bình là 2,6 băng Đặc biệt là số băng đa hình tạo ra giữa các giống cao hơn so với nghiên cứu trước đó giữa các giống cà chua này với những loài hoang

dại thuộc chi Lycopersicon [34].

Upadhyay và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá mối quan hệ

về mặt di truyền và sự đa dạng di truyền giữa các giống dừa Ấn Độ, 8 primer sử dụng đã phát hiện ra 77 băng đa hình ở 81 cây Số băng trên mỗi primer khác nhau

từ 7 (OPA 4, OPB 1, OPC 5) đến 15 (OPB 5), trung bình là 9,6 băng trên mỗi primer Kích thước của những băng này từ 200 bp đến 2750 bp, kích thước trung bình là 960 bp Số băng trung bình đối với các giống dừa cao là 61, trong khi đó giống dừa lùn là 52 Tỷ lệ băng đa hình giữa các giống dừa cao từ 22% đến 71%, trung bình là 49%; và đối với các giống dừa lùn là từ 20% đến 44%, trung bình là

36% Số băng được phát hiện bởi mỗi primer phụ thuộc vào trình tự của primer và phạm vi của sự khác nhau là kiểu gen đặc hiệu Số lượng băng khác nhau ở các mẫu khác nhau Nhìn chung, ở các mẫu dừa cao, số lượng băng được phát hiện nhiều hơn so với các mẫu dừa lùn Những kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả (Ashburner và cs, 1997; Perera và cs, 1999; Upadhyay và cs, 2002) khi nghiên cứu sự khác nhau giữa các mẫu dừa cao về số băng đa hình cũng như sự đa dạng về mặt di truyền Sự đa dạng trung bình của các cá thể khác nhau từ 0,057 đến 0,196 [62].

1.2.2 Các kỹ thuật khác

Bên cạnh kỹ thuật RAPD, có rất nhiều loại chỉ thị phân tử được sử dụng để

xác định sự khác nhau giữa các dạng thuộc chi Citrus, bắt đầu từ những nghiên cứu

isozyme vào cuối những năm 1970 (Torres và cs, 1978), đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP) vào những năm 1980 và đầu những năm 1990, và gần đây nhất

là các kỹ thuật AFLP, SSR, ISSR (Fang và Roose,1997; Bretó và cs, 2001; Sankar

và Moore, 2001) Bức tranh tổng thể được dựng lên từ những nghiên cứu này là sự

đa dạng rất lớn từ các nhóm loài tổ tiên thuộc chi Citrus, đặc biệt là quýt và bưởi

[60]

RFLP-đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác RFLP

là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay RFLP có ưu điểm là chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp, do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng các chỉ thị tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Phân tích PCR-RFLP đã được sử dụng thành công khi nghiên cứu đa

dạng di truyền ở rất nhiều loài cây ăn quả như Prunus (Badenes và Parfitt, 1995),

Diospyros (Yonemori và cs, 1998) và Mangifera (Eiadthong và cs, 1999) [32].

Abkenar và cs (2004) đã phân tích PCR-RFLP trên DNA lục lạp (cpDNA) để

xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại của 30 mẫu “cây ăn quả Citrus thật” (“true

citrus fruit trees”) thuộc dưới tộc Citrinae, họ Rutaceae gồm 6 loài Fortunella spp., 1 loài Eremocitrus sp., 2 dạng Poncirus sp., 1 loài

Clymenia sp., 5 loài Microcitrus spp và 16 loài Citrus spp Bốn vùng khuếch

đại trên cpDNA là rbcL-ORF106, psaA-trnS, trnH-trnK và trnD-trnT được phân tích

với 15 enzyme cắt giới hạn khác nhau Trong số 140 đoạn cắt thu được có 108 đoạn

đa hình và tác giả đã dựa vào kết quả này để xây dựng cây phát sinh của chúng Kết

quả cho thấy tất cả các loài Microcitrus đều có sự phân hóa với nhau và với các loài khác Eremocitrusi nằm trong nhóm với Microcitrus nhưng có kiểu cpDNA khác với các loài Microcitrus Trong khi đó Clymenia, Fortunella và Poncirus theo thứ tự tạo thành các nhóm độc lập, ba chi này gần với Citrus hơn Microcitrus và Eremocitrus Các loài Citrus được phân thành 3 nhóm chính và nguồn gốc của các loài Citrus đã

được đề cập đến [32]

SSR là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế primer Các trình tự gần

kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR SSR primer sau đó được sử dụng tương tự như các RAPD primer SSR là một chỉ thị đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin cậy vì vậy đã được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng cây

trồng như cam chanh (Nunes và cs, 2002; Golein và cs, 2005), táo (Guilford và cs,

1997) và nho (Tomas và Scott, 1993) [47], [48]

Hai mươi mốt chỉ thị trình tự lặp lại đơn giản được Barkley và cs (2006) sử dụng để xác định đa dạng ở mức độ phân tử từ 370 mẫu (chủ yếu là hữu tính) có

nguồn gốc từ các giống Citrus trong bộ sưu tập các vật liệu giống cây Citrus được

lưu giữ tại Đại học California, Riverside Tổng số có 275 allele đã được xác định với trung bình là 11,5 allele trên locus và chỉ số đa hình trung bình là 0,625 Phân tích đa dạng di truyền đã được thực hiện cho từng chỉ thị SSR, cho toàn bộ quần thể

và cho các loài Citrus Mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các mẫu Citrus và các mẫu không phải Citrus cũng được xác định bằng xây dựng cây phả hệ Kết quả

nghiên cứu cho thấy rõ tính đơn gốc ở mức độ loài khi các dữ liệu về bậc phân loại

cho dạng lai bị loại bỏ Hai cây phát sinh này cũng cho thấy nhóm Fortunella nằm trong chi Citrus nhưng Poncirus là chi tương đồng với Citrus Hơn nữa, các giống

Citrus có thể được xác định như các quần thể hay các đa quần thể nếu kiểu gen của

chúng cho thấy một sự hòa trộn bởi cách tiếp cận theo mô hình nhóm Các nghiên cứu phân tách (khoảng cách và mô hình) đều chứng minh cho giả thuyết rằng chỉ có

một số ít loài tự nhiên trong chi Citrus và hầu hết các dạng khác của Citrus là các

dạng lai giữa các dạng tự nhiên đó [35]

Sự biến dị di truyền của 8 giống cam ngọt (Citrus sinensis (L.) Osbeck) và 6 giống quýt (Citrus reticulata Blanco) đã được đánh giá thông qua phân tích SSR

Tác giả đã xác định được tổng số 52 dạng allele thông qua 7 cặp primer và số lượng allele trên cặp primer nằm trong khoảng từ 3-10 (trung bình là 7,42) Giá trị hàm lượng thông tin đa hình (polymorphic information content-PIC) thay đổi từ 0,505 đến 0,950 và các chỉ thị vi vệ tinh phân biệt các biến dị giữa các giống quýt nhưng các biến dị ít được quan sát thấy giữa các giống cam Cây phân loại được xây dựng cho thấy có một nhóm cam ngọt chính chứa 3 nhóm nhỏ và 4 nhóm quýt đã được xác định Đa số các giống cam có độ tương đồng di truyền cao, vì vậy, những đa hình về mặt hình thái quan sát được giữa các nhóm phải là các biến dị soma và không được xác định chính xác bằng các chỉ thị phân tử [47]

ISSR là kỹ thuật đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu đa dạng di truyền

(Kantety và cs, 1995; Charters và cs, 1996), và đã được dùng để phân biệt giữa các giống cây Citrus khó thực hiện bởi các chỉ thị phân tử khác (Fang và Rose, 1997) Mối quan hệ di truyền giữa các giống chanh thương mại (Citrus limon) đã được

Capparelli và cs (2004) phân tích bằng kỹ thuật ISSR và phân tích dòng chuỗi (flow cytometry) Hai giống với các đặc điểm khá giống nhau đã được phân biệt bằng cách sàng lọc với 10 SSR primer

và xác định hàm lượng DNA trong nhân trước khi nhuộm [39]

AFLP-sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng

những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích

và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài và các primer thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài Có nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật này để phân tích đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng như bưởi chùm

(Cervera và cs, 1998), dừa (Pepera và cs, 1998), đu đủ (Kim và cs, 2002), Carya

illinoinensis (Beedanagari và cs, 2005) [37]

Quả không hạt là một tính trạng mong muốn ở những cây thuộc chi Citrus và

là mục tiêu quan trọng trong nhân giống JinPing và cs (2009) đã sử dụng kỹ thuật

AFLP để tìm ra các chỉ thị phân tử cho quýt không hạt Ponkan (Citrus reticulata

Blanco) Tác giả đã chọn ra được 5 cặp primer có liên quan trực tiếp đến tính trạng mong muốn sau khi sàng lọc 72 cặp primer, sự bắt cặp này đã được kiểm tra bằng phân tích AFLP từ các nhóm cá thể Năm đoạn khuếch đại đã được tạo dòng, phân tích trình tự và so sánh tương đồng, kết quả cho thấy 4 chỉ thị có sự tương đồng cao với các gen chức năng, điều này có thể giúp hiểu được cơ chế phân tử của tính trạng

không hạt ở chi Citrus Dựa trên các thông tin về trình tự, 8 primer đặc hiệu đã được

thiết kế và 2 đoạn AFLP-2 và AFLP-5 đã được chuyển đổi thành công sang dạng chỉ thị SCAR Vì vậy, có thể đẩy nhanh các chương trình chọn giống bằng cách sàng lọc các đột biến không hạt dựa trên các chỉ thị đã được chọn lọc [52]

Chương 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bưởi Thanh trà: Citrus grandis (L.) Osbeck

Chi: Citrus

Họ cam quýt: Rutaceae

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 32 cá thể bưởi Thanh trà thu được ở các địa điểm Kim Long, Hương Long, Thủy Biều (làng Trung Thượng và làng Lương Quán) thuộc thành phố Huế Trong đó, số lượng mẫu ở mỗi vùng như sau:

- Hương Long có 8 mẫu (2HL, 5HL, 9HL, 11HL, 13HL, 14HL, 15HL và 17HL)

- Kim Long có 4 mẫu (1KL, 2KL, 3KL và 4KL)

- Trung Thượng có 10 mẫu (1TT, 2TT, 5TT, 6TT, 7TT, 8TT, 11TT, 12TT, 14TT và 16TT)

- Lương Quán có 10 mẫu (3LQ, 4LQ, 6LQ, 8LQ, 10LQ, 12LQ, 14LQ, 15LQ, 17LQ và 19LQ)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Luận văn của chúng tôi được tiến hành từ tháng 4/2009 đến tháng 10/2009 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gene, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế

2.2.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái

Chúng tôi tiến hành đánh giá một số đặc điểm hình thái của bưởi Thanh trà theo phương pháp của Vũ Thị Nhuận và cs (2005)

- Kích thước lá: chiều dài lá, chiều rộng lá, chiều dài cánh lá và chiều rộng cánh lá được đo qua chỗ rộng nhất bằng thước kẹp

- Kích thước quả: dùng thước đo chiều cao và chiều rộng của quả

- Khối lượng quả, khối lượng phần ăn được: dùng cân để xác định

- Độ dày vỏ: đường kính quả-đường kính phần ăn được của quả

- Số lượng quả trên cây

- Số lượng múi trên quả

- Số lượng hạt trên múi.

2.2.2 Phương pháp RAPD

DNA được tách chiết từ lá bưởi Thanh trà theo phương pháp của Ahmed và

cs (2009) có cải tiến: cắt lá bưởi Thanh trà (200 mg) thành từng mảnh nhỏ; đồng hóa mẫu với 500 µL đệm chiết DNA (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250mM NaCl) Sau đó thêm 50 µL SDS 20%, ủ ở 65oC trong 50 phút Mẫu được chiết 2 lần với cùng thể tích của hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại bỏ protein và lấy dịch trong chứa DNA hòa tan ở pha trên Loại polysaccharide bằng ether hydrate hóa Kết tủa DNA bằng ethanol 100% lạnh trong 30 phút ở -20oC Thu kết tủa DNA bằng ly tâm 11.000 vòng/phút, ở 25oC trong 12 phút Rửa tiểu thể DNA bằng ethanol 70% Hòa tan tiểu thể bằng nước cất vô trùng, thêm 1

µL RNase, bảo quản ở -20oC dùng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR-RAPD [33] Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số được xác định bằng phương pháp quang phổ trên máy NanoDrop ND-1000 (Thermo, Mỹ)

Chín primer ngẫu nhiên (theo Operon Technologies, CA) đã được sử dụng để khuếch đại DNA các mẫu lá bưởi Thanh trà (tên và trình tự từng primer được trình bày ở bảng 2.1) theo phương pháp của Rao và cs (2007): hỗn hợp phản ứng gồm 0,8 pmol mỗi loại primer ngẫu nhiên; 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP mỗi loại, 0,05 units/µL Taq DNA polymerase (Fermentas PCR Master Mix 2×); 25 ng DNA khuôn mẫu trong tổng số dung tích 25 µL Khuếch đại PCR theo quy trình: 92oC/2 phút; 42 chu kỳ gồm: 92oC/1 phút, 36oC/1 phút, 72oC/2 phút và cuối cùng 72oC/10 phút Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên agarose gel 1,4% và nhuộm bằng Ethidium bromide [59]

Hình ảnh điện di được thu nhận bằng hệ thống thu nhận hình ảnh Gel Documentation và phân tích bằng phần mềm Quantity one

Bảng 2.1 Trình tự của các primer sử dụng STT Primer Trình tự 5'-3' Tài liệu tham khảo

1 OPA-02 5'-TGCCGAGCTG-3' Vũ Thị Nhuận và cs, 2005

2 OPA-04 5'-AATCGGGCTG-3' Vũ Thị Nhuận và cs, 2005

3 OPA-18 5'-AGGTGACCGT-3' Shaaban và cs, 2006

4 OPB-05 5'-TGCGCCCTTC-3' Cevik và cs, 2006

5 OPB-10 5'-CTGCTGGGAC-3' Cevik và cs, 2006

6 OPC-02 5'-GTGAGGCGTC-3' Cevik và cs, 2006

7 OPC-04 5'-CCGCATCTAC-3' Cevik và cs, 2006

8 OPAA-10 5'-TGGTCGGGTG-3' Rao và cs, 2007

9 OPAD-10 5'-AAGAGGCCAG-3' Rao và cs, 2007

2.2.3 Phương pháp xây dựng giản đồ phả hệ

Xây dựng giản đồ phả hệ và phân tích cụm theo thuật toán UPGMA bằng phần mềm NTSYS 2.0 (Exeter Software, Mỹ) dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng trên phổ điện di sản phẩm PCR-RAPD của các mẫu với các primer theo nguyên tắc đánh số "1" nếu có xuất hiện băng và số "0" nếu không xuất hiện băng

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý để thu giá trị trung bình và phân tích Duncan’s test với mức

ý nghĩa p<0,05 bằng chương trình SAS.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đặc điểm hình thái của quần thể bưởi Thanh trà ở thành phố Huế

Chúng tôi tiến hành điều tra và thu thập mẫu lá Thanh trà ở 3 vùng trên địa bàn thành phố Huế: Kim Long, Hương Long, Thủy Biều (Trung Thượng, Lương Quán) Kết quả phân tích các đặc điểm về kích thước lá và quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Một số đặc điểm hình thái của quần thể bưởi Thanh trà ở thành phố Huế

Địa điểm Lương

Quán

Trung

Qua bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy đặc tính hình thái của quả ở các xã thuộc thành phố Huế không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê Điều này có thể do các đặc điểm hình thái của quả ít chịu sự tác động của nền đất Trong khi đó, kích thước

lá lại có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các vùng với nhau, ở vùng Lương

Quán chủ yếu là các cây có thời gian trồng khá dài (5-40 năm) nên kích thước trung bình của lá nhỏ nhất, tiếp theo là Trung Thượng (3-25 năm), có kích thước lá trung bình lớn hơn so với ở Lương Quán nhưng lại nhỏ hơn so với hai xã còn lại là Hương Long và Kim Long (3-17 năm) Khi cây càng già, kích thước lá càng nhỏ Ở những cây này, kích thước quả cũng nhỏ hơn so với các cây mới được trồng nhưng

số lượng quả trên cây khá nhiều (250-350 quả) và rất ngon

3.2 Đa hình quần thể bưởi Thanh trà ở thành phố Huế

3.2.1 Chất lượng DNA tổng số

Sản phẩm tách chiết DNA tổng số được điện di trên agarose gel 0,8% và đo

OD260/280 để kiểm tra chất lượng và nồng độ Kết quả cho thấy DNA tổng số của 32 mẫu lá Thanh trà nghiên cứu ít bị đứt gãy và khá sạch (OD260/280 từ 1,73-1,81), nồng

độ các mẫu tương đối đồng đều (340-497 ng/µL) Chất lượng và nồng độ DNA của các mẫu đáp ứng yêu cầu cho các phản ứng PCR-RAPD (Bảng 3.2 và hình 3.1)