NGHIÊN cứu các yếu tố ẢNH HƯỞNG đến KHẢ NĂNG SINH TỔNG hợp ENZYME AMYLASE từ nấm aspergillus niger và mucor TRÊN môi TRƯỜNG lên MEN bán rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ NẤM

Aspergillus niger VÀ Mucor TRÊN MÔI

TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN BÁ PHƯƠNG THẢO Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08 năm 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ NẤM

Aspergillus niger VÀ Mucor TRÊN MÔI

TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

CN ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 08 năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Vũ Văn Độ và cô Đỗ Thị Tuyến đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với quý thầy cô trong Khoa Công Nghệ Sinh Học – trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cũng như quý thầy cô là giáo viên thỉnh giảng tại các khoa, trường, viện nghiên cứu đã tận tình giảng dạy em trong thời gian học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện sinh học Nhiệt Đới, quý cô, chú, anh, chị và các bạn sinh viên đang công tác và làm việc tại viện công nghệ sinh học nhiệt đới, và đội bảo vệ đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp DH05SH, đại học chính quy khóa 2005 -2009 đã quan tâm và động viên tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba, mẹ và những người thân trong gia đình đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ cùng với con trong thời gian qua

Nguyễn Bá Phương Thảo

TÓM TẮT

Enzyme amylase là một enzyme có thể tìm thấy ở rất nhiều sinh vật Hiện nay, ezyme này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp

và y học Mục tiêu đề tài là nghiên cứu khả năng tạo enzyme amylase của nấm

Aspergillus niger và Mucor và những yếu tố tác động đến khả năng tạo amylase của

chúng Đề tài đã thu được một số kết quả về sự tác động của các yếu tố môi trường đến

khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm Aspergillus niger và Mucor.

Aspergillus niger khi sinh trưởng và tổng hợp enzyme amylase trên môi trường

bán rắn với cơ chất là cám gạo bổ sung thêm trấu và bã đậu nành chịu tác động của rất nhiều yếu tố môi trường như tỷ lệ cơ chất, pH môi trường, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ,

độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng và tỷ lệ giống Đề tài đã nghiên cứu sự tác động của các yếu tố môi trường nêu trên đầu tiên là ở mức độ riêng lẻ từng yếu tố, sau đó là sự tương tác qua lại của những yếu tố có ảnh hưởng mạnh đến sự tổng hợp enzyme Kết quả thu được cho thấy với những môi trường có tỷ lệ Cám gạo: trấu: bã đậu nành (2:1:1), pH 5, thời gian nuôi cấy là 28 giờ, nhiệt độ 350C, độ ẩm 55%, 2 lần nồng độ dinh dưỡng, tỷ lệ giống 0,8*108 bt/g là tối ưu cho Aspergillus niger sinh tổng hợp

amylase

Khả năng tổng hợp enzyme amylase từ Mucor khi sinh trưởng trên môi trường

bán rắn với cơ chất là cám gạo bổ sung thêm trấu và bã đậu nành chịu tác động của rất nhiều yếu tố môi trường như tỷ lệ cơ chất, pH môi trường, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ,

độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng và tỷ lệ giống Đề tài đã nghiên cứu sự tác động của các yếu tố môi trường nêu trên đầu tiên là ở mức độ riêng lẻ từng yếu tố, sau đó là sự tương tác qua lại của những yếu tố có ảnh hưởng mạnh đến sự tổng hợp enzyme Kết quả thu được cho thấy với những môi trường có tỷ lệ Cám gạo: trấu: bã đậu nành (2:1:1), pH 5, thời gian nuôi cấy là 32 giờ, nhiệt độ 300C, độ ẩm 55%, 3 lần nồng độ dinh dưỡng, tỷ lệ giống 1,6*108 bt/g là tối ưu cho Mucor sinh tổng hợp amylase.

Enzyme amylase can be found in many living organisms Nowadays, this is applied in many domains, such as agriculture, industry and medicine The purpose of

the survey is to find out Aspergillus niger and Mucor’s ability to produce enzyme

amylase, and some factors can affect this ability Finally, the survey has some following results

The first, for Aspergillus niger, they are born and grow up on semi-solid

environments including rice bran, rice rind, and soya residuum Growing up and

biosynthesized enzyme ability of A niger depend on environment factors, such as ratio

of rice bran to rice rind and to soya residuum, time, humidity, nutritious concentration, and ratio of spore The survey finds out affect of environment factors in individual of each and compose of some factors, which have stronger affect Results showed with environments have ratio of rice bran to rice rind and to soya residuum is 2:1:1; after 28 hours at 350C with 55% humidity, double nutritious concentration and ratio of 0,8*108

spore to one g environment is the most suitable for Aspergillus niger to biosynthesize

enzyme amylase on semi-solid fermatable environment

The second, for Mucor, they are born and grow up on semi-solid environments

including rice bran, rice rind, and soya residuum Growing up and biosynthesized

enzyme ability of A niger depend on environment factors, such as ratio of rice bran to

rice rind and to soya residuum, time, humidity, nutritious concentration, and ratio of spore The survey finds out affect of environment factors in individual of each and compose of some factors, which have stronger affect Results showed with environments have ratio of rice bran to rice rind and to soya residuum is 2:1:1, after 32 hours at 300C with 55% humidity, treble nutritious concentration and ratio of 1,6*108

spore to one g environment is the most suitable for Mucor to biosynthesize enzyme

amylase on semi-solid fermatable environments

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của amylose Error: Reference source not found xiii

Đồ thị 4.14 Hoạt tính và hàm lượng theo các nồng độ giống của Mucor Error: Reference source not found xiv

DANH SÁCH CÁC BẢNG xv

Chương 1 1

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

Chương 2 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu sơ lược về enzyme 3

2.1.1 Khái niệm chung về enzyme 3

2.1.2 Tính chất ưu việt của enzyme 3

2.2 Tổng quan về enzyme amylase 4

2.2.1 Amylase 4

2.2.2 Phân loại 4

2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của 3 loại amylase thông dụng 4

2.2.3.1 α-amylase 4

2.2.3.2 β-amylase 5

2.2.3.3 γ-amylase (hay gluoamylase hoặc α-1,4 glucan-glucanhydrolase) 6

2.2.4.1 Thực vật 6

2.2.4.2 Vi sinh vật 7

2.2.5 Ứng dụng 7

2.2.5.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 7

2.2.5.2 Trong công nghiệp dệt, giấy 8

2.2.5.3 Trong y học 8

2.2.5.4 Trong nông nghiệp 9

2.2.5.5 Trong công nghệ tẩy rửa 9

2.2.6 Cơ chất của enzyme amylase 9

2.2.6.1 Tinh bột 9

Tinh bột là một chất bột vô định hình, màu trắng, không tan trong nước lạnh nhưng khi đun nóng sẽ có khả năng tan trong nước Tinh bột là carbonhydrate ở thực vật chủ yếu trong các loại củ như khoai mì, khoai tây, khoai lang , và là chất dự trữ năng lượng quan trọng 9

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của amylose (Wikipedia.com) 10

2.2.6.2 Glycogen 11

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử glycogen (Wikipedia.com) 11

2.3 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger và Mucor 12

2.3.1 Nấm mốc Aspergillus niger 12

2.3.2 Nấm mốc Mucor 13

2.4 Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp amylase 14

2.4.1 Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 14

2.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase 14

2.4.2.1 Nguồn carbon 14

2.4.2.2 Nguồn Nitơ 14

2.4.2.3 Các nguyên tố khoáng 15

2.4.2.4 Nhiệt độ nuôi cấy 16

2.4.2.5 pH ban đầu 16

2.4.2.6 Độ ẩm 16

2.4.2.7 Môi trường không khí 16

2.5 Môi trường lên men bán rắn 17

2.5.1 Cám gạo 17

2.6 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sản xuất enzyme 18

2.6.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 18

2.6.2 Phương pháp nuôi cấy chìm 19

2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình li trích 20

Chương 3 21

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 21

3.2 Vật liệu thí nghiệm 21

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 21

3.2.2 Cơ chất 21

3.3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1 Phương pháp cấy truyền 21

3.3.2 Phương pháp nhân giống cấp 2 (giữ giống trên môi trường lúa) 22

3.3.3 Phương pháp mô tả hình thái A niger và Mucor 23

3.3.3.1 Quan sát hình thái đại thể 23

3.3.4 Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu 23

3.3.6 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme amylase 25

3.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng amylase 26

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc thử Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thụ cực đại ở 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein Đặc biệt nếu có mặt các acid amin nhân thơm sẽ bắt màu mạnh hơn Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian

26

Bảng 3.1 Các bước tiến hành tạo dung dịch albumin chuẩn 27

3.3.8 Phương pháp xác định hoạt tính amylase 28

Enzyme amylase là enzyme thủy phân tinh bột Nó phân cắt amylose và amylopectin của tinh bột thành các loại đường maltose, glucose,…Hoạt tính của enzyme amylase được xác định dựa trên sự thay đổi màu sắc của phức hợp tinh bột – iod trước và sau khi thủy phân Mật độ quang của phức hợp tinh bột – iod sẽ được đo ở bước sóng 595 nm trên máy đo quang phổ 28 Hóa chất cần thiết cho thí nghiệm này bao gồm dung dịch Lugol, dung dịch đệm Na-acetate 50 mM ở pH 5, dung dịch hồ tinh bột 1% Dung dịch này được pha bằng cách

cân 1 g tinh bột tan cho vào berche đựng 100 ml dung dịch đệm, đun cách thủy cho sôi

trong 5 phút, khuấy đều cho tan 28

3.3.9 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 29

3.3.10 Phương pháp bố trí và xử lí số liệu thí nghiệm 29

Chương 4 30

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn 30

4.1.1 Nấm mốc A niger 30

Hình 4.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của A niger (a)hình ảnh đại thể, (b) hình ảnh vi thể 30

4.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu 30

Đồ thị 4.1 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy A niger với các tỷ lệ cơ chất khác nhau 31

4.1.3 Ảnh hưởng của pH 32

Đồ thị 4.2 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ môi trường nuôi cấy A niger với các pH môi trường ban đầu khác nhau 33

4.1.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 34

Đồ thị 4.3 Biểu diễn hoạt tính enzyme và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy A niger với các mốc thời gian thu nhận khác nhau 34

4.1.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 35

th 4.4 Bi u di n ho t tính amylase và hàm l ng protein t canh tr ng nuôi Đồ ị ể ễ ạ ượ ừ ườ c y A niger v i các nhi t đ nuôi c y khác nhau ấ ớ ệ ộ ấ 36

4.1.6 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu 37

Đồ thị 4.5 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy A niger với các độ ẩm môi trường ban đầu khác nhau 37

4.1.7 Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng 38

4.1.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống 39

4.2 Khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc Mucor trên môi trường lên men bán rắn 41

4.2.1 Nấm mốc Mucor 41

Hình 4.2 Hình ảnh đại thể của Mucor (a)hình ảnh đại thể, (b) hình ảnh vi thể 42

Hình ảnh vi thể quan sát được cho thấy Mucor có cuống bào tử phân nhánh và mọc lên

ở bất kì chỗ nào của sợi nấm, bào tử đính nằm trong bọc bào tử Bọc bào tử dạng tròn hoặc hình quả lê, chứa nhiều bào tử ở phía trong 42 4.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu 42 4.2.3 Ảnh hưởng của pH 43

Đồ thị 4.9 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy Mucor với các pH môi trường khác nhau 44 4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 47

Đồ thị 4.11 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy Mucor với các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau 47 4.2.6 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu 48 4.2.7 Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng 49

Đồ thị 4.13 Biểu diễn hoạt tính amylse và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy Mucor với các nồng độ dinh dưỡng trong môi trường khác nhau 50 Nồng độ dinh dưỡng X3 là thích hợp nhất cho sự tổng hợp enzyme amylase Ở nồng

độ dinh dưỡng này, hàm lượng protein và hoạt tính amylase thu được đều cao nhất (43,391 mg và 488,279 UI/g CT) Sau đó thì hàm lượng và hoạt tính đều giảm dần, có thể là do nông độ thẩm thấu của môi trường ảnh hưởng lên Mucor 50 4.2.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống 51 4.3 Qui hoạch thực nghiệm 53 4.3.1 Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase của A niger và Mucor 53 4.3.1.2 Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase của Mucor 58 Bảng 4.4 Mã hóa các biến số các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase của Mucor 58 Bảng 4.5 Ma trận kế hoạch hóa đối với TĐY-24 58 Bảng 4.6 Hoạt lực amylase của Mucor theo thực nghiệm và theo phương trình hồi qui 59

Vì t13, t124 và t1234 đều nhỏ hơn 4,3 (t(0,05;2)) nên b13, b124 và b1234 bị loại ra khỏi phương trình hồi qui do không có ý nghĩa 61 Chương 5 63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

5.1 Kết luận 63

5.2 Đề nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

UI : Unit International, đơn vị quốc tế

One-Way ANOVA : Phân tích phương sai một yếu tố

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của amylose Error: Reference source not foundHình 2.2 Cấu trúc phân tử của amylopectin Error: Reference source not foundHình 2.3 Cấu trúc phân tử glycogen Error: Reference source not found

Hình 4.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của A niger. Error: Reference source notfound

Hình 4.2 Hình ảnh đại thể và vi thể của Mucor. Error: Reference source not found

Đồ thị 4.1 Hoạt tính và hàm lượng theo tỷ lệ cơ chất của A niger. Error: Referencesource not found

Đồ thị 4.2 Hoạt tính và hàm lượng theo pH của A niger. Error: Reference sourcenot found

Đồ thị 4.3 Hoạt tính và hàm lượng theo thời gian của A nigerError: Reference sourcenot found

Đồ thị 4.4 Hoạt tính và hàm lượng theo nhiệt độ của A nigerError: Reference sourcenot found

Đồ thị 4.5 Hoạt tính và hàm lượng theo độ ẩm của A niger. Error: Reference sourcenot found

Đồ thị 4.6 Hoạt tính và hàm lượng theo nồng độ dinh dưỡng của A niger. Error:Reference source not found

Đồ thị 4.7 Hoạt tính và hàm lượng theo tỷ lệ giống của A niger. Error: Referencesource not found

Đồ thị 4.8 Hoạt tính và hàm lượng thteo tỷ lệ cơ chất của Mucor. Error: Referencesource not found

Đồ thị 4.9 Hoạt tính và hàm lượng theo pH của Mucor.Error: Reference source notfound

Đồ thị 4.10 Hoạt tính và hàm lượng theo thời gian của Mucor Error: Reference sourcenot found

Đồ thị 4.11 Hoạt tính và hàm lượng thteo nhiệt độ của Mucor.Error: Reference sourcenot found

Đồ thị 4.12 Hoạt tính và hàm lượng theo độ ẩm cuả Mucor. Error: Reference sourcenot found

Đồ thị 4.13 Hoạt tính và hàm lượng theo các nồng độ dinh dưỡng của Mucor.

Error: Reference source not found

Đồ thị 4.14 Hoạt tính và hàm lượng theo các nồng độ giống của Mucor .Error:Reference source not found

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo Error: Reference source not foundBảng 3.1 Các bước tiến hành tạo dung dịch albumin chuẩn Error: Reference sourcenot found

Bảng 4.1 Mã hóa các biến số các yếu tố ảnh hưởng đến A niger Error: Referencesource not found

Bảng 4.2 Ma trận kế hoạch hóa đối với TĐY-24 của A niger Error: Reference sourcenot found

Bảng 4.3 Hoạt lực amylase của A niger theo thực nghiệm và pt hồi qui Error:Reference source not found

Bảng 4.4 Mã hóa các biến số các yếu tố ảnh hưởng đến Mucor Error: Referencesource not found

Bảng 4.5 Ma trận kế hoạch hóa đối với TĐY-24 của Mucor Error: Reference sourcenot found

Bảng 4.6 Hoạt lực amylase của Mucor theo thực nghiệm và pt hồi qui Error:Reference source not found

Chương 1

MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Enzyme là một loại protein đặc biệt được sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng sinh học, là thành phần không thể thiếu trong mọi tế bào sinh vật Chúng đóng vai trò quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi trường sống

Enzyme amylase có vai trò rất quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp và chữa trị bệnh, như công nghiệp thực phẩm, dệt, tẩy rửa, chữa bệnh kém tiêu hóa ở người và trong ngành chế biến thức ăn gia súc…

Cuối thế kỉ 19 và suốt thế kỉ 20, ngành công nghiệp sản xuất enzyme đã rất phát triển, ngày càng thiên về xu hướng sản xuất enzyme dựa vào hoạt động sống của vi sinh vật vì nhiều lợi ích thiết thực Công nghệ sản xuất enzyme đã và đang mang lại những nguồn lợi lớn cho nhiều quốc gia trên thế giới

Hiện nay, doanh thu từ việc sản xuất enzyme lên đến hơn 1,7 tỷ USD, trong đó góp phần không nhỏ là lợi nhuận thu được từ enzyme amylase Thị trường enzyme công nghệ sẽ còn tiếp tục gia tăng trong tương lai đến Ở nước ta, nhu cầu sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có amylase trong chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc và trong các ngành công nghiệp khác ngày càng nhiều Vì vậy, hằng năm, nước ta phải nhập khẩu lượng lớn những nguồn enzyme này

Ngày nay, việc tận dụng phế liệu trong công, nông nghiệp làm nguồn carbon để sản xuất amylase bởi vi sinh vật bằng phương pháp lên men chìm và lên men bán rắn rất được quan tâm ở nước ta và nhiều nước trên thế giới Việt Nam là một nước nhiệt đới có nền nông nghiệp lâu đời và đa dạng, đang trên đà phát triển Vì vậy lượng phế phẩm nông nghiệp thải ra ngày càng gia tăng, như cám gạo, bã đậu nành… là nguồn cung cấp carbon thích hợp để cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp amylase bằng phương pháp lên men bám rắn Mặc khác, đây là cơ chất khá rẻ tiền và ổn định có tiềm năng

sử dụng để sản xuất amylase ở qui mô lớn

Hiện nay, viện công nghệ sinh học nhiệt đới có một số chủng nấm mốc có khả

năng sinh tổng hợp enzyme amylase khá cao, trong đó có chủng Aspergillus niger và Mucor Tuy nhiên, để thu được enzyme amylase có hiệu suất cao chỉ cần chủng vi sinh

vật có khả năng tạo ezyme amylase cao là chưa đủ Các vi sinh vật đó cần phải được

nuôi trên môi trường cơ chất thích hợp có khả năng cảm ứng kích thích chúng sinh amylase Môi trường nuôi cấy cần được bổ sung thêm những nồng độ dinh dưỡng và các vi sinh vật phải được nuôi ở nhiệt độ thích hợp Cuối cùng, thời gian thu nhận dịch chiết enzyme từ canh trường nuôi cấy cũng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng và hoạt tính amylase thu được.

Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến

khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger và Mucor trên

môi trường lên men bán rắn” nhằm xây dựng điều kiện môi trường tối ưu cho hai chủng nghiên cứu tạo enzyme nhiều và có hoạt tính cao cũng như điều kiện để thu nhận enzyme tốt nhất Đề tài đã được thực hiện tại phòng các chất có hoạt tính sinh học - viện Sinh Học Nhiệt Đới, thành phố Hồ Chí Minh

- Khảo sát khả năng tổng hợp amylase của hai chủng thí nghiệm

- Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, nhiệt

độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH môi trường ban đầu, nồng độ dinh dưỡng,

và tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp amylase của hai chủng thí nghiệm

- Tối ưu hóa các yếu tố trên bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường tối ưu cho hai chủng trên sinh ra lượng amylase cao

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Giới thiệu sơ lược về enzyme

2.1.1 Khái niệm chung về enzyme

Enzyme là một chất xúc tác sinh học chỉ được tạo ra trong tế bào sinh vật, và đóng vai trò quan trọng không thể thiếu được trong quá trình trao đổi chất của cơ thể sinh vật Tất cả các phản ứng chuyển hóa các chất trong cơ thể sinh vật đều có sự tham gia xúc tác của enzyme Enzyme không chỉ tham gia xúc tác các phản ứng trong tế bào

mà ngay cả ngoài tế bào của vi sinh vật Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng enzyme vào nhiều lĩnh vực khác nhau của công nghiệp và đời sống

Enzyme có bản chất là protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học và làm chất xúc tác sinh học Dưới tác dụng của enzyme các phản ứng hóa sinh trong cơ thể sinh vật xảy ra rất nhanh, không cần những điều kiện về nhiệt độ, áp suất, nồng độ các chất một cách quá khắc nghiệt Tên enzyme được bắt nguồn từ chữ

Hy Lạp có nghĩa là “chất trong con men” Tất cả quá trình biến đổi hóa sinh đều xảy ra dưới tác dụng của hệ men

Nếu cơ thể thiếu enzyme thì các quá trình chuyển hóa hóa sinh sẽ bị đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh trưởng, phát triển và sinh sản bình thường Sự sống của sinh vật sẽ không tồn tại

Ngày nay, enzyme còn đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động sản xuất công nghiệp và ngày càng có nhiều những nghiên cứu và ứng dụng enzyme vào trong các lĩnh vực khoa học, công nghiệp, kinh tế quốc dân, vân vân

2.1.2 Tính chất ưu việt của enzyme

Thứ nhất, enzyme có thể thu nhận được từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật, và vi sinh vật, và hầu như các enzyme không có tính chất độc hại

Thứ hai, chúng có thể hoạt động xúc tác phản ứng trong điều kiện nhiệt độ bình thường, áp suất thường, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính

Thứ ba, tính đặc hiệu của enzyme cao hơn hẳn các xúc tác khác, và chỉ có tác dụng lên những cơ chất nhất định và theo một kiểu phản ứng nhất định

Thứ tư, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể dễ dàng điều chỉnh thậm chí ngừng phản ứng bằng cách tác động vào các yếu tố như: nhiệt độ, pH, các chất kiềm hãm, chất hoạt hóa, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, vân vân (Lê Ngọc Tú, 2002).

Cuối cùng, cường lực xúc tác của enzyme cao hơn hẳn các chất xúc tác thông thường, nên chỉ cần một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất trong thời gian ngắn Đây là điều các chất xúc tác hóa học khó có thể làm được

2.2 Tổng quan về enzyme amylase

2.2.1 Amylase

Amylase là enzyme được dùng rất thông dụng trong các ngành sản xuất, chế biến, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm Enzyme này cũng rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme amylase đều thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải các liên kết nội phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước

R.R’ + H-OH  RH + R’OHAmylase thủy phân tinh bột, glycogen, và dextrin thành glucose, maltose và dextrin giới hạn Hệ enzyme này có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người, động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Amylase bao gồm nhiều enzyme khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng lên tinh bột (cắt tinh bột tại những vị trí khác nhau trên mạch tinh bột)

2.2.2 Phân loại

Hiện nay, amylase được phân thành 6 loại, gồm có α-amylase, β-amylase, amylase hay glucoamylase (thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột và các polysaccharide đồng loại), dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase

γ-và oligodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinnase thủy phân các liên kết oligodextrin α-1,6-glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối)

2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của 3 loại amylase thông dụng

2.2.3.1 α-amylase

amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng Protein của amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globuline Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2 – 5,7 α-amylase là một metaloenzym, chứa từ 1 đến 30 nguyên tử gam Ca/mol Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-amylase bền với nhiệt độ hơn so với các amylase khác Độ bền với tác

α-dụng acid thì α-amylase của nấm mốc bền vững hơn so với α-amylase của malt và vi khuẩn Tất cả α-amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại nặng (Cu2+, Ag+, Hg2+, vân vân)

Cơ chế tác dụng của α-amylase là phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside ở bất kì

vị trí nào trong phân tử tinh bột, glycogen và các polysaccharide Dưới tác dụng của enzyme α-amylase tinh bột có thể chuyển hóa thành maltose, glucose và các dextrin có phân tử lượng thấp, nhưng thông thường thì α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin có phân tử lượng thấp, maltose và một ít glucose (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Do vậy α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột rất mạnh (dịch hóa)

Sơ đồ thủy phân tinh bột bằng α-amylase:

β-Enzyme này xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, glycogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải

54 - 58% amylopectin thành maltose Quá trình thủy phân được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng Mỗi nhánh ngoài cùng có từ 20 – 26 gốc glucose nên tạo được từ 10 – 12 phân tử maltose Khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β-amylase ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside cho màu tím đỏ với iodine Độ nhớt của dung dịch giảm chậm

Tác dụng của β-amylase lên tinh bột có thể được diễn tả theo sơ đồ sau:

β-amylase

Tinh bôt (glycogen) -> maltose (54 – 58%) + β-dextrin (42- 46%)

Nếu cho đồng thời cả α-amylase và β-amylase cùng tác dụng lên tinh bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95% (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.3.3 γ-amylase (hay gluoamylase hoặc α-1,4 glucan-glucanhydrolase)

γ-amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các enzyme amylase khác γ-amylase là enzyme ngoại bào, có nhiều tên gọi khác nhau: glucoamylase, amyloglucozidase, taka-amylase B, maltulase…Đa số γ-amylase đều thuộc loại enzyme “acid” γ-amylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH từ 3,5 – 5,5

và nhiệt độ 500C γ-amylase bền với acid hơn α-amylase, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo vệ bằng Ca2+

. Glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết kết α-1,2 và liên kết α-1,3 glucoside Điểm đẳng điện của γ-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid”, thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH từ 3,5 đến 5,5 So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn, nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu và aceton do không được bảo vệ bởi Ca2+

Dây là enzyme thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside Khi thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong chuỗi polysaccharide, γ-amylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” mà không phải theo cơ chế “đơn mạch”

Fukumoto đề nghị chia γ-amylase của vi sinh vật làm hai loại theo khả năng

thủy phân tinh bột của chúng Đó là enzyme kiểu Rhizopus delemar và enzyme kiểu Aspergillus niger (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Sơ đồ thủy phân glucid bởi glucoamylase:

phẩm hỗn hợp bột enzyme để bổ sung vào chế phẩm bột dinh dưỡng dành cho trẻ em, người già và những người bị suy tiêu hóa Ở thực vật, nguồn amylase được thu nhận từ những hạt nảy mầm, đặc biệt là ở hạt ngũ cốc nảy mầm.

2.2.4.2 Vi sinh vật

Ngày nay, do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo Hiện nay, có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp được enzyme amylase đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất Những chủng vi sinh vật này thường được phân lập từ tự nhiên Những chủng tạo amylase nhiều hơn cả là nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn

Để thu nhận enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi

Aspergillus, Rhizopus Nhiều loài thuộc giống này (A orizae, A niger, A usamii) và một số loài của Neurospora và Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ loại enzyme này.

Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomysec Endomycopis, Endomyces cũng tạo nên nhiều enzyme amylase.

Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn amylase như Bac Polymyxa, Phytomonas dptructans, Bact casavanum,… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh

trưởng nhanh gấp 4 - 6 lần vi khuẩn ưa ẩm và sinh trưởng tốt nhất từ 650 - 700C, và tạo amylase mạnh nhất ở 500C Vì vậy mà loại vi khuẩn này thường được nuôi cấy ở 700C

để làm giống và nuôi thu enzyme ở 500C

Trong xạ khuẩn hiếm gặp loài nào có khả năng sinh tổng hợp amylase mạnh

mẽ, tuy nhiên cũng có một số ít xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme này như

Micromonospora vulgaris

2.2.5 Ứng dụng

Chế phẩm amylase dạng thô hay tinh khiết được ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm (sản xuất rượu bia, bánh mì, bánh ngọt, đường mật tinh bột, vân vân)

2.2.5.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Trong công nghệ rượu bia việc sử dụng amylase từ vi sinh vật trong công nghiệp sản xuất rượu bia thay cho malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn nguyên liệu (đại mạch) loại tốt, giúp giảm giá thành và rút ngắn quy trình sản xuất, tiết kiệm công sức, tiền bạc Biện pháp thay enzyme chế phẩm cho malt có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Việc này giúp giảm giá thành mà chất lượng sản phẩm vẫn không bị thay đổi

Đặc biệt là đối với ngành công nghiệp bia của nước ta do hiện nay việc gieo trồng đại mạch trong nước chưa mang lại nhiều kết quả, nên nước ta vẫn phải nhập malt từ nước ngoài với giá thành cao Vì vậy nếu sử dụng enzyme amylase từ vi sinh vật sẽ góp phần làm giảm giá nguyên liệu và giảm sự phụ thuộc vào việc nhập khẩu malt.

Trong sản xuất bánh mì sử dụng enzyme amylase có tác dụng rút ngắn quá trình lên men, tăng nhanh thể tích bánh mì, làm tăng mùi thơm của bánh, màu sắc của bánh đẹp hơn và tăng độ xốp của bánh Trong sản xuất bánh ngọt, nếu thêm chế phẩm amylase vào bột sẽ xảy ra quá trình thủy phân bột thành đường, do đó giảm lượng nguyên liệu tiêu tốn cho sản xuất

Trong sản xuất mật, tinh bột, maltose, glucose nhu cầu sử dụng enzyme amylase cũng ngày càng cao Ban đầu các sản phẩm mật, tinh bột thường được sản xuất theo phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid hoặc malt Ngày này, qui trình này được thực hiện nhờ chế phẩm amylase Chế phẩm enzyme amylase ứng dụng rất hiệu quả trong sản xuất tinh bột, glucose, và các loại mật tinh bột Khi thủy phân tinh bột bằng acid không cho phép sản xuất các loại đường mật theo ý muốn, bởi vì khi đó phân tử tinh bột bị thủy phân vô trật tự và không thể điều chỉnh được tỷ lượng của các cấu tử của dịch thủy phân Phẩm chất của đường mật, tính chất hóa lí … của chúng lại phụ thuộc vào tỷ lượng của các cấu tử chính này Khi thủy phân tinh bột bằng chế phẩm enzyme sẽ không giống như thủy phân bằng acid, không xảy ra sự thủy phân các hợp chất lẫn trong tinh bột nên làm dịch thủy phân tốt hơn, dễ dàng tinh chế hơn

2.2.5.2 Trong công nghiệp dệt, giấy

Trong công nghiệp dệt, amylase được sử dụng để rũ hồ vải, tẩy lớp hồ bột trên vải làm vải mịn, mềm, dễ tẩy trắng và dễ bắt màu khi nhuộm Xử lí vải bằng phương pháp ezyme tốt hơn rất nhiều so với việc xử lí bằng các chất hóa học Xử lí vải bằng enzyme không chỉ nhanh mà còn giữ được độ bền, độ dai, không hại vải, độ mao dẫn tốt và đảm bảo vệ sinh Do vậy tăng được năng suất lao động

2.2.5.3 Trong y học

Amylase được dùng phối hợp với các coenzyme A, cytocrom C, carbonxydase

để chế thuốc điều trị các bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa Ngoài ra chế phẩm enzyme amylase dùng

để điều chế môi trường nuôi vi sinh vật phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học cũng như chẩn trị bệnh

2.2.5.4 Trong nông nghiệp

Chế phẩm enzyme amylase được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với các enzyme khác như protease, hemicellulase, cellulase, vân vân để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hóa, hấp thu trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, đặc biệt là gia súc non

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm enzyme amylase vào Enzyme amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn Sử dụng thức ăn có bổ sung chế phẩm enzyme sẽ làm tăng khả năng hấp thu, tiêu hóa, do đó làm giảm lượng thức ăn, tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinh sản, chống bệnh tật, vân vân

Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme amylase để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt là các phế phẩm nông nghiệp, cải tạo đất phục vụ nông nghiệp Đây cũng là hướng mới trong nghiên cứu và ứng dụng tại nhiều quốc gia

2.2.5.5 Trong công nghệ tẩy rửa

Enzyme α-amylase của vi khuẩn là những enzyme không bền nhiệt và pH kiềm trong thời gian lâu nên chúng thường được bao lại rồi trộn chung với các thành phần của chất tẩy rửa để bảo quản lâu và tăng khả năng hoạt động của chúng Các enzyme

vi khuẩn sẽ làm cho các vết bẩn carbonhydrate trong quần áo dễ phân giải hơn Thường những enzyme này được lấy từ vi khuẩn do chúng có khả năng chịu được nhiệt độ cao và pH kiềm lâu hơn

2.2.6 Cơ chất của enzyme amylase

2.2.6.1 Tinh bột

Tinh bột là một chất bột vô định hình, màu trắng, không tan trong nước lạnh nhưng khi đun nóng sẽ có khả n ng tan trong nă ước Tinh bột là carbonhydrate ở thực vật chủ yếu trong các loại củ như khoai mì, khoai tây, khoai lang , và là chất dự trữ n ng lă ượng quan trọng

Mặc dù tinh bột lấy từ các nguồn khác nhau không hoàn toàn giống nhau, song

từ năm 1940, Meyer đã biết rằng tinh bột mọi nguồn đều có cấu tạo từ amylose và amylopectin

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt Khi tác dụng với iod tinh bột cho màu tím xanh đặc trưng.

Cấu tạo của tinh bột là polysaccharide bậc hai, đồng thể (homopolysaccharide hay homoglucan) Công thức tổng quát là (C6H10O5)n, cấu tạo từ những đơn vị cơ sở là α-D-glucose Liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glucoside và liên kết 1,6 glucoside Tinh bột tồn tại hai cấu tử: amylose và amylopectin có cấu tạo và tính chất khác nhau Tuy nhiên đa phần tinh bột đều có khoảng 20 - 30% amylose và phần còn lại là amylopectin

Amylose

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của amylose (Wikipedia.com).

Có trọng lượng phân tử khoảng 50.000 đến 160.000 dalton, được cấu tạo từ khoảng 200 - 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4 glucoside (carbon ở vị trí thứ nhất của glucose sẽ liên kết với carbon ở vị trí thứ 4 của glucose kế cận), tạo thành 1 chuỗi mạch thẳng Vì vậy amylase còn được gọi là tinh bột mạch thẳng Do cấu tạo nên cấu hình không gian của amylose sẽ cuộn lại thành vòng xoắn

ốc, mỗi xoắn ốc sẽ gồm có 6 đơn vị glucose, khi cho dung dịch iod vào trong tinh bột thị iod sẽ chiếm vị trí trung tâm của xoắn ốc tạo thành phức chất có màu xanh, đây là phản ứng đặc trưng của amylose Khi đun nóng thì mạch amylose nhận thêm một năng lượng nên duỗi thẳng ra không còn xoắn ốc nên phức chất tinh bột iod không còn nữa

và màu xanh sẽ biến mất

Amylopectin

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử của amylopectin (Wikipedia.com.).

Có trọng lượng phân tử khoảng vài triệu dalton, được cấu tạo từ khoảng 600 đến 6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4 glucoside và liên kết α-1,6 glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh

Amylopectin cho màu tím đỏ với iod, hòa tan trong nước nóng cho dung dịch

có độ nhớt cao Thủy phân tinh bột nhẹ nhàng với amylase, hay acid loãng thời gian ngắn sẽ tạo thành dextrin, một ít maltose, glucose Thủy phân thời gian lâu hơn với acid hoặc enzyme với nhiệt độ cao hơn sẽ tạo nhiều maltose và glucose hơn

2.2.6.2 Glycogen

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử glycogen (Wikipedia.com).

Glycogen là một loại carbonhydrate dự trữ ở cơ thể động vật và được cơ thể động vật chuyển hóa từ từ để sử dụng Amylase có vai trò quan trọng trong chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật Glycogen có cấu tạo tương tự như amylopectin nhưng có mạch nhánh nhiều hơn, phân tử lượng khoảng 2 triệu đến 3 triệu dalton Glycogen dễ tan trong nước Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở gan và bắp thịt

2.3 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger và Mucor

2.3.1 Nấm mốc Aspergillus niger

Aspergillus niger cấu tạo dạng sợi, sinh bào tử (bào tử hở / bào tử ngoại sinh)

và không có diệp lục, sử dụng nguồn hữu cơ có sẵn để sinh sống Aspergillus niger có

trong đất, xác bã thực vật và hoa quả vùng nhiệt đới Van Tieghem là người đầu tiên

phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger từ quả, hạt, đặc biệt là hạt đậu

phộng, bồ đào, dừa…( Lương Đức Phẩm, 2004)

Vị trí phân loại của A niger

A niger thuộc loại nấm sợi đa bào Đầu sợi nấm sinh sản phình to ra tạo thành

tế bào hình chai và các chuỗi đỉnh bào tử Cuống của đỉnh bào tử đơn bào, tế bào hình chai và chuỗi đỉnh bào tử toả đều trên đầu sợi nấm sinh sản như những tia nước đi từ

xa vào vòi tưới Cuống sinh bào tử được sinh ra từ khuẩn ty khí sinh, có chiều dài từ 1 đến 3 mm, có vách tế bào trơn bóng và trong suốt Đỉnh cuống phình ra có dạng hình cầu được gọi là bọng, có đường kính từ 50 – 75 µm, sinh ra hai lớp thể bình Lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai Bào tử hình cầu, dạng bào tử đính

có đường kính 4 – 5 µm, có màu nâu đen, vách bào tử đính có dạng xù xì

Loài nấm sợi này sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu là 6 - 8oC, tối đa là 45 - 470C, tối ưu là 30 - 370C, sinh trưởng trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23% Độ ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn là 50 - 65%, chỉ sinh trưởng và phát triển trong sự có mặt của O2 và pH tối ưu từ 4 - 6,5 A niger là nấm sợi chịu khô, bào tử

đính có thể nảy mầm trong điều kiện môi trường có thế nước 0,77 ở 350C A niger có

thể sinh trưởng ở pH 2 trong điều kiện có thế nước cao

A niger được xem là nấm sợi không sinh độc tố và được sử dụng rộng rãi trong

chế biến thực phẩm Các enzyme thuỷ phân thu nhận từ chủng này không gây đột biến

vi khuẩn và các mô của chuột Tuy nhiên, theo thông tin gần đây, có 2 trong số 19

chủng A nger được phân lập sinh ra ochratoxin A (Abraca, 1994).

Loài nấm này chiếm ưu thế ở vùng khí hậu nhiệt đới Bào tử đính màu đen nên

không chịu ảnh hưởng từ mặt trời và tia UV A niger thường được phân lập từ các

thực phẩm phơi nắng như cá, cây gia vị…

2.3.2 Nấm mốc Mucor

Nấm mốc Mucor là nấm đơn bào cấu tạo dạng sợi, sinh bào tử Bào tử được tạo

thành trong các túi (bào tử nang) và thuộc loại bào tử nội sinh Cuống bào tử nang có phân nhánh và mọc lên từ bất kì chỗ nào của sợi nấm (Lương Đức Phẩm, 2004)

Vị trí phân loại của nấm Mucor

Lớp : Zygomycetes

Bộ : Mucorales

Họ : Mucoraceace Giống: Mucor

Mucor là giống lớn nhất trong bộ Mucorales Chúng bao gồm các loài: M mucedo, M cremois, M rouxii, M hiemalis, M silvaticus, M subtilis,… Mucor là

một loại nấm phát triển rộng rãi, thường tìm thấy trong đất, phân bón, trái cây, bánh

mì, và những thực phẩm giàu tinh bột khác Chúng phát triển tốt trong điều kiện hiếu

khí Ở điều kiện yếm khí Mucor sppr phân tách thành những sợi nấm nhỏ hình tròn

hay hình bầu dục và nảy chồi, vì thế người ta hay gọi loài này là men của nấm mốc

Chúng có khả năng sử dụng một cách hiếu khí nhiều nguồn carbon, lên men

carbonhydrate, có thể sử dụng ammoniac hay nitơ hữu cơ cho quá trình sinh trưởng, và còn có thể phát triển trên một thang nhiệt độ rộng Vì thế chúng có mặt trên nhiều loại môi trường, bao gồm nhiều loại thức ăn khác nhau

Nấm Mucor có thể được phân biệt với các loại nấm khác qua các điểm đặc biệt

của khuẩn ty (không có vách ngăn), nang bào tử (hình thành trên tất cả các bộ phận khí sinh của nấm), nang trụ hình nón, trụ, hoặc hình quả lê, bào tử đều, bóng loáng, không

có thân bò và rễ giả

Mucor spp có vai trò quan trọng trong một số quy trình sản xuất công nghệ

thực phẩm, chúng thúc đẩy quá trình chín của phomai hoặc một số thực phẩm Á Đông như chao, tương, đường hoá các giai đoạn đầu của quá trình lên men bia, rượu

2.4 Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp amylase

2.4.1 Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng

Một quá trình sinh tổng hợp enzyme được gọi là cảm ứng nếu nó chỉ xảy ra ở mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này hoặc các chất có cấu trúc tương tự cơ chất Các cơ chất này được gọi là các chất cảm ứng, và enzyme chỉ được tạo ra khi có chất cảm ứng gọi là enzyme cảm ứng Amylase cũng là một enzyme thuộc hệ enzyme cảm ứng Enzym amylase chỉ được sinh ra khi nấm mốc sinh trưởng trên môi trường có chứa tinh bột

2.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase

2.4.2.1 Nguồn carbon

Để vi sinh vật tổng hợp enzyme amylase, trong môi trường nhất thiết phải có chất cảm ứng là tinh bột Tinh bột trong môi trường có thể là cám gạo, cám mì,…Những loài sinh vật khác nhau sẽ có những nguồn cảm ứng khác nhau Từ những chất cảm ứng đó vi sinh vật sẽ tạo ra enzyme có hoạt tính khác nhau

Các nguồn carbon khác như Glucose, Cellobiose, Acetat, Citrat, Oxalate, Succinat và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs, nếu trong môi trường có

ở nồng độ rất ít sẽ kích thích vi sinh vật phát triển và tạo enzyme Nhưng nếu ở nồng

độ cao sẽ có tác dụng ngược lại, kìm hãm sự tạo thành amylase

2.4.2.2 Nguồn Nitơ

Hoạt tính của enzyme sẽ thay đổi rất nhiều nếu ta thay đổi các thành phần chính của môi trường, đặc biệt là nguồn nitơ Nitrat là nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật NaNO3 là nguồn nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo amylase, ngoài ra còn có các muối khác như NH4NO3, Mg(NO3)2, (NH4)2SO4 Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế

tổng hợp amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường sẽ chuyển dịch mạnh

về phía tổng hợp glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase

Sự tạo amylase cực đại thường thấy ở các nồng độ nitơ cao (0,25 – 0,4 %) Khi làm môi trường nuôi cấy nấm mốc tạo amylase thường dùng NaNO3 là tốt nhất Cũng

có thể bổ sung nitơ hữu cơ (gelatin, casein, nước chiết ngô) để nấm sinh trưởng tốt, nhưng lại không có tác dụng kích thích tạo amylase Thêm nước chiết mầm mạch hay nước chiết ngô cũng như các amino acid riêng rẽ sẽ làm tăng sinh tổng hợp α-amylase ngoại bào, song hiệu quả không bằng NaNO3 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành amylase Chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết thì vi sinh vật mới có khả năng tích lũy amylase cực lớn Sự thiếu hụt cấu tử này không thể bù đắp bằng sự thừa cấu tử kia Thông thường, tỉ lệ carbon gấp từ 1 đến 40 lần hàm lượng nitơ trong môi trường là thích hợp nhất Trong môi trường Zapeck thì tỉ lệ này là 18 : 1

2.4.2.3 Các nguyên tố khoáng

Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng

và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật Và các nguyên tố khoáng này cần được bổ sung vào môi trường theo tỷ lệ thích hợp để kích thích sự sinh tổng hợp amylase Nếu môi trường thiếu hoặc thừa khoáng đều có ảnh hưởng đến sự tạo enzyme của các vi sinh vật

Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp enzyme amylase của nấm sợi Khi đó sự tổng hợp α-amylase sẽ bị ức chế hoàn toàn, còn lượng γ-amylase sẽ bị giảm hàng chục lần ( Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu khoảng 0,05% Tuy nhiên, muối này không ảnh hưởng đến sự tạo oligo-1,6-glucosidase (Silova, 1967)

Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất và nhiều coenzyme, đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi cũng như các vi sinh vật khác, vì vậy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme của chúng Nhiều nhà nghiên cứu cho biết nếu thêm phospho hữu cơ (như dạng fitin) vào môi trường sẽ làm tăng sự tổng hợp amylase lên 2 – 3 lần

Canxi cần cho sự tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu của enzyme này Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khoải tác động của proteinase (Hsiu, 1964) Lượng Canxi cần thiết chiếm khoảng 0,01 – 0,05 %.

Nhiều nguyên tố vi lượng cũng có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme amylase như coban, mangan, đồng, thủy ngân, vân vân Chúng có thể có khả năng kích thích tạo amylase như coban, Ca, nitơ, hoặc cũng có thể có tác dụng kìm hãm sự tổng hợp enzyme này như thủy ngân

2.4.2.4 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Hoạt động của các loài vi sinh vật dựa trên sự chuyển hoá của hàng loạt các phản ứng dựa theo những trình tự xác định Khi nhiệt độ tăng sẽ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật vì thế nó có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme của chúng

2.4.2.5 pH ban đầu

pH của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp amylase từ vi sinh vật pH của môi trường có những ảnh hưởng rất khác nhau đối với các chủng vi sinh vật khác nhau Nhiều loài nấm phát triển và phân giải tinh bột mạnh ở pH 4 - 6 Sự sinh trưởng của vi sinh vật có thể làm thay đổi đáng kể

pH trong cơ chất Sự thay đổi này phụ thuộc chủ yếu vào sự trao đổi chất của vi sinh vật và khả năng đệm của cơ chất rắn Trong môi trường lên men bán rắn rất khó để điều chỉnh và kiểm soát pH Tuy nhiên nếu nuôi cấy bằng phương pháp lên men bán rắn thì pH môi trường sẽ có ít ảnh hưởng hơn so với phương pháp nuôi cấy chìm do môi trường của phương pháp nuôi cấy bề mặt sẽ có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp nên pH không thay đổi nhiều trong quá trình nuôi

2.4.2.6 Độ ẩm

Độ ẩm không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật

mà còn ảnh hưởng đáng kể đến đặc tính lý hoá của cơ chất Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau Do đó, quá trình lên men bán rắn được thực hiện với hàm lượng nước trong cơ chất khác nhau từ 30 - 80%

2.4.2.7 Môi trường không khí

Vi sinh vật hiếu khí thì môi trường nuôi cấy phải đảm bảo cung cấp đủ oxi để vi sinh vật sinh trưởng và phát triển Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng thường để trên

máy lắc, môi trường bán rắn thì cơ chất phải có độ xốp tạo sự thông thoáng giữa các tiểu phần cơ chất Ngược lại vi sinh vật kị khí chỉ phát triển trên môi trường không có

sự hiện diện của oxi Ngoài ra cũng có vi khuẩn sống được ở cả hai điều kiện trên

2.5 Môi trường lên men bán rắn

2.5.1 Cám gạo

Cám gạo là sản phẩm phụ của quá trình xay xát và chế biến gạo Cám gạo có giá trị dinh dưỡng khá cao Cám được thu hồi dưới 2 dạng là cám thô và cám ướt Chúng thường có dạng bột, màu hơi vàng, mềm và mịn, chiếm khoảng 10-12% khối lượng lúa chưa xay xát Trong 100 g cám gạo có khoảng 28 g tinh bột, vì vậy đây là nguồn cơ chất khá lí tưởng để dùng trong lên men bán rắn thu nhận amylase từ các vi sinh vật do nguồ cung ổn định, giá thành rẻ và có lượng tinh bột khá cạo

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo

Tuy nhiên cám thường được cho các loại gia súc và thủy sản ăn chứ không cho người Nguyên nhân là do cám có một số enzyme (chất men) nội tại hoạt động rất mạnh sẽ oxy hóa các nhóm béo chưa no của cám rất nhanh chỉ vài giờ sau khi chế biến tạo mùi hôi khó chịu Thêm vào đó do công nghệ xay xát gạo chưa cao, lại ít được đầu

tư theo hướng thu cám sạch nên cám thường lẫn rất nhiều loại tạp chất (vỏ trấu, sạn đá vân vân) Vì lý do đó mà hầu hết lượng cám thu được thường được bà con nông dân dùng nuôi các loại gia súc, gia cầm Hàng năm trên thế giới có khoảng 40 – 45 triệu tấn cám được sản suất và 90% là nằm ở châu Á (http://www.bannhanong.com/, xử lý cám gạo để thay thế ngũ cốc).

2.5.2 Bã đậu nành

Bã đậu nành có hàm lượng xơ cao, bao gồm chất xơ hoà tan và chất xơ không hoà tan Chất xơ không hoà tan có tác động chống táo bón, ngăn ngừa ung thư ruột kết, ung thư đại tràng, giảm nguy cơ trĩ, chống béo phì và bệnh tiểu đường

Chất xơ hoà tan có khả năng tan trong nước thành dung dịch keo Khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thụ một số chất có hại như cholesterol vào máu Ngoài ra, trong bã đậu nành còn có chất isoflavones có khả năng phòng chống nhiều loại bệnh ung thư và bệnh tim mạch Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), lượng chất xơ sử dụng mỗi ngày nên đảm bảo 27 – 40 g xơ tổng, 16 – 27 g xơ không hoà tan

Tuy nhiên, trong thực tế bã đậu nành khó xay mịn và có cấu trúc nhám, rời rạc nên không thể dùng trong chế biến thực phẩm Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã dùng phương pháp vi sinh để xử lý bã đậu nành Họ đã dùng hai loại enzyme (men) có tên là Pectinase và Cellulase với tỷ lệ thích hợp để thủy phân bã đậu nành Nhờ đó, đã giúp

bã đậu nành qua xử lý trở nên mịn và làm thay đổi hàm lượng các hợp chất xơ trong bã đậu nành theo cách có lợi nhất (http:// www.Vietnamnet.com)

2.6 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sản xuất enzyme

Hiện nay trên thế giới chủ yếu áp dụng hai phương pháp sản xuất enzyme là nuôi cấy bề mặt (lên men bán rắn) và nuôi cấy chìm

2.6.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Là phương pháp nuôi cấy mà vi sinh vật sẽ mọc trên bề mặt môi trường Trong nuôi cấy bề mặt vi sinh vật sẽ được nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường đặc

(còn gọi là môi trường len men bán rắn), nhưng chủ yếu vẫn là nuôi cấy trên môi trường đặc Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme thường sử dụng môi trường đặc để nuôi cấy thu nhận enzyme từ vi sinh vật

Môi trường lên men bán rắn thường dùng nguyên liệu tự nhiên như cám gạo, cám mì, bã đậu nành, ngô mảnh,… Tùy theo đối tượng vi sinh vật và mục đích nuôi cấy khác nhau mà bổ sung thêm các chất khác nhau và một số thành phần khác cho thích hợp

Khi nuôi cấy theo phương pháp lên men bán rắn, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường, rồi sinh tổng hợp ra enzyme ngoại bào và nội bào Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật

Phương pháp này có ưu điểm là hàm lượng và hoạt tính enzyme cao, chế phẩm

dễ sấy khô, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng, không cần sử dụng những thiết bị đặc biệt, tiêu thụ năng lượng ít nên có thể áp dụng ở nhiều địa phương Tuy nhiên nhược điểm của nó là tốn diện tích mặt bằng và đòi hỏi lượng nhân công lớn, khó cơ giớ hóa trong sản xuất

Ưu điểm khác của phương pháp này là dễ thực hiện và khi bị nhiễm bởi các vi sinh vật khác, thường chỉ xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ nên dễ xử lí Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích và khó cơ giới hóa, tự động hóa

2.6.2 Phương pháp nuôi cấy chìm

Còn gọi là phương pháp nuôi cấy bề sâu Phương pháp này vi sinh vật được nuôi trong môi trường lỏng và được nuôi trong các thùng lên men Các thiết bị lên men được lắp đặt hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp õi, hệ thống điều chỉnh pH và nông độ các chất dinh dưỡng Trong đó hệ thống điều hòa không khí và

hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Tùy theo chủng loại vi sinh vật mà thành phần của môi trường lỏng sẽ được thay đổi cho thích hợp

Phương pháp này được dùng phổ biến trong lên men qui mô công nghiệp So với phương pháp nuôi cấy bề mặt, phương pháp nuôi cấy chìm ít choáng diện tích bề mặt, dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình theo dõi Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi đầu tư nhiều chi phí cho trang thiết bị

Phương pháp này có ưu điểm là dễ dàng cơ giới hóa, tự động hóa, ít tốn diện tích, song chúng đòi hỏi sự đầu tư lớn, khó được thực hiện ở nhiều nơi, và sẽ rất khó khăn trong việc xử lí sự xâm nhập của các vi sinh vật lạ

2.7 Thu nhận enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt

2.7.1 Trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt

Enzyme ngoại bào sẽ tồn tại trong tế bào vi sinh vật với hàm lượng rất thấp so với các thành phần khác Khi chiết rút enzyme từ canh trường ta thu được không chỉ enzyme hòa tan trong nước mà còn thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ chất môt trường và các chất do nấm mốc tạo ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển

Các enzyme thường là những chất hữu cơ không bền dễ bị biến tính khi bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Do đó, việc tách và thu nhận enzyme là điều không dễ

Để chiết rút enzyme từ môi trường bán rắn, ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính hay các dung dịch đệm thích hợp Trong đó, nước thường được dùng nhiều nhất vì sự thuận tiện và cho kết quả cao Enzyme từ môi trường khuếch tán vào nước do sự chênh lệch nồng độ Nước có thể chiết tách 90 – 95% enzyme trong canh trường Nước thường dùng chiết tách có nhiệt độ 25 - 280C

Trong quá trình nấm mốc sinh trưởng trên môi trường bán rắn, các vật chất khô trong môi trường sẽ bị hòa tan thủy phân khoảng 33 - 35%, tinh bột sẽ bị thủy phân hoàn toàn và trong môi trường sẽ còn lại phần đường mà sinh vật chưa sử dụng hết

2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình li trích

Tỉ lệ nước có ảnh hưởng rất lớn đến sự thu nhận ezyme từ canh trường nuôi cấy

vi sinh vật Canh trường khô cần nhiều nước để trích li enzyme hơn canh trường ẩm Với các tỉ lệ nước: canh trường nuôi cấy khác nhau ta sẽ thu được những lượng enzyme khác nhau Thường lượng nước dùng li trích gấp 3 – 3,5 lần so với lượng canh trường nuôi cấy nấm mốc

Tiếp đến là sự ảnh hưởng của thời gian li trích Enzyme thủy phân dễ dàng hòa tan vào nước, thời gian trích li càng lâu càng có khả năng trích li được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng hàm lượng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính enzyme

Khi nhiệt độ trích li càng tăng thì vận tốc trích li cũng tăng theo nhưng cũng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết làm giảm hiệu suất trích enzyme và giảm hoạt tính của enzyme Nhiệt độ trích li tối thích là từ 28 – 300C Trong công nghiệp nước máy với pH 7 thường được dùng để li trích enzyme

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2009, tại phòng các chất có hoạt tính sinh học – Viện sinh học nhiệt đới

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Nấm mốc Aspergillus niger và Mucor do Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp

được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng trên môi trường PGA ở nhiệt độ thường là 300C trong thời gian 2 - 3 ngày, sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ 40C

, 900, tinh bột tan và dung dịch đệm Na-acetate 50 mM ở pH 5

3.2.3.2 Thiết bị

Các thiết bị gồm có cân phân tích, bể ổn nhiệt, phòng đếm hồng cầu, kính hiển

vi quang học Olympus, nồi hấp Tommy-SS-325, máy xay sinh tố, máy khuấy từ, tủ lạnh, máy đo pH, máy đo quang phổ UV-Vis cùng các dụng cụ phòng thí nghiệm như que cấy, pipet, pipetman, ống nghiệm, ống đong, becher, erlen, vân vân

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp cấy truyền

Do cả hai loại nấm trên đều sinh sản bằng bào tử nên ta sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, bằng cách cấy theo đường dích dắc Khi

khuẩn lạc mọc đều sẽ cho vào tủ lạnh giữ ở nhiệt độ 5 - 90C để tránh nấm mốc bị già làm ảnh hưởng đến các thí nghiệm sau.

Đầu tiên, cân 50g khoai tây, 5 g agar, 5 g glucose Khoai tây rửa sạch gọt vỏ, cắt lát mỏng đem cân, cho vào nồi đun sôi với 250 ml nước cất trong khoảng 30 phút Tiến hành lọc qua vải lọc, lấy phần nước trong, cho thêm nước cất vừa đủ 250 ml, cho agar và glucose vào đun sôi đến khi tan hết

Sau đó tiến hành tạo môi trường thạch nghiêng Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, khoảng 1/4 chiều cao ống nghiệm Làm nút bông và bao gói hấp khử trùng ở 1210C và 1 atm, trong 15 phút Sau khi hấp khử trùng xong, thạch trong ống nghiệm còn lỏng ta để ống thạch ở vị trí nghiêng thích hợp cho đến khi thạch đông đặc hoàn toàn Vị trí nghiêng phải để đầu trên của mặt nghiêng không vượt qua 2/3 chiều dài ống nghiệm, không được để thạch chạm vào nút bông, mặt thạch bằng phẳng, không bị đứt, chiều dài vừa phải không quá ngắn hoặc quá dài

Tiếp theo sẽ thực hiện việc cấy giữ giống trên môi trường thạch nghiêng Dùng que cấy móc đã khử trùng cấy truyền giống từ ống giống sang các ống nghiệm đã chuẩn bị ở trên Động tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Sau đó để bào tử phát triển ở nhiệt độ phòng khoảng 2 ngày, bào tử mọc đều, rồi chuyển vào tủ lạnh trữ

ở nhiệt độ 5 - 90C để dùng cho các thí nghiệm sau

3.3.2 Phương pháp nhân giống cấp 2 (giữ giống trên môi trường lúa)

Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm và pha môi trường dinh dưỡng, cồn và các

ống nghiệm giống A niger và Mucor Dụng cụ thí nghiệm cần thiết cho các thí nghiệm

này bao gồm becher, ống đong, ống nghiệm, đũa khuấy, que cấy và pipet đã khử trùng, erlen Từ các dung dịch stock tiến hành pha dung dịch môi trường dinh dưỡng gồm có môi trường Mandel và Czapeck, chỉnh về pH 6 Thêm nước cất với tỉ lệ thích hợp để môi trường nhân giống đạt độ ẩm 55%

Tiến hành cân 20g lúa cho vào 4 erlen, bổ sung thành phần khoáng đã chuẩn bị

ở trên Dùng đũa thủy tinh đánh tơi môi trường Sau đó đem các erlen hấp khử trùng ở

1210C, 1atm trong 15 phút Để nguội Thực hiện cấy giống trong tủ vô trùng Dùng pipetman hút 1 ml nước cất đã được vô trùng cho vào ống nghiệm chứa giống, dùng que cấy vòng hòa bào tử nấm mốc trong nước Sau đó chuyển vào trong erlen Tiến hành tương tự cho cả 4 erlen Khuấy đều, đánh tơi bào tử của mốc giống vừa cấy vào môi trường bằng đũa thủy tinh vô trùng Đem ủ ở nhiệt độ phòng Sau 3 ngày quan sát

thấy lượng bào tử mọc nhiều, đem các erlen cho vào trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 -

90C để dùng cho các thí nghiệm sau

3.3.3 Phương pháp mô tả hình thái A niger và Mucor

3.3.3.1 Quan sát hình thái đại thể

Dùng que cấy móc (vô trùng) gạt nhẹ bào tử đính của nấm sợi, chuyển sang đĩa petri chứa môi trường PGA đã vô trùng và để nguội, cắm đầu móc xuống mặt thạch thành 3 điểm Các động tác trên được thực hiện trong tủ cấy Sau đó ủ đĩa petri ở nhiệt

độ phòng trong khoảng thời gian 2 ngày Quan sát khuẩn lạc của nấm sợi (hình dạng

và màu sắc)

3.3.3.2 Quan sát hình thái vi thể

Làm phòng ẩm để quan sát hình thái vi thể Lót giấy thấm ở đáy petri (đường kính 12 cm) rồi đặt vào miếng lame, gói giấy và đem khử trùng Nấu chảy môi trường PGA (vô trùng) rót chảy dọc theo nửa tấm lame và chờ đông lại, làm ẩm giấy thấm bằng nước cất vô trùng (vừa đủ ướt tờ giấy) Cấy một ít bào tử thành một hoặc hai điểm trên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng Sau 2 đến 3 ngày lấy miếng lame ra khỏi hộp petri và quan sát Quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại 40 và 100 lần) hình dạng vi thể của hai chủng thí nghiệm

Đầu tiên dùng que cấy hình móc câu một ít hệ sợi nấm dàn mỏng trên phiến kính Tiếp theo cho vài giọt cồn 95% để một lúc, dùng giấy thấm lau khô sau đó cho vài giọt NaOH 10% đậy lá kính lên, đem soi Hoặc cho vài giọt cồn 600 có vết amoniac, thấm khô rồi cho thêm vài giọt glycerin loãng lên tấm lame, đậy lá kính lên, đem soi Mục đích của các tác dụng trên là tăng cường khả năng thấm nước của sợi nấm, đuổi bọt khí trong sợi nấm, làm sợi nấm nở to ra để dễ quan sát

3.3.4 Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu

Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào

tử nấm mốc) Người ta thường dùng 2 loại buồng đếm hồng cầu; buồng đếm Thomas

và buồng đếm Goriep Nguyên tắc cấu tạo của 2 loại buông đếm này đều giống nhau Buồng đếm đều là 1 phiến kính hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng ngang Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông Mỗi ô vuông có diện tích là 1/25 mm2 lại được chia thành các ô nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao là 1/10

Như vậy V ô nhỏ = 1/400 mm2 x 0,1 mm = 1/4000 mm3 hay 1/4000000 ml

Tiến hành cân 1 g canh trường lấy từ canh trường nhân giống cấp 2 đã thực hiện trong mục 3.3.2 đem đi pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4… Sau đó tiến hành đếm trên phòng đếm.

Chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch sinh lí chứa Tween 80 0,1%

vô trùng và một số ống hút 1 ml vô trùng để tiến hành việc pha loãng mẫu Cân 1 g bào tử nấm sợi cho vào ống nghiệm số 1 chứa 9 ml dung dịch muối sinh lí chứa Tween

80 0,1% vô trùng, huyền phù đều Ta được độ pha loãng 1/10 hay 10-1 Sau đó lại hút 1

ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống số 2, trộn đều, ta được độ pha loãng 1/1000 hay10-2 Tiếp tục như vậy từ ống 2 sang ống 3, ống 3 sang ống 4 Ta sẽ được các độ pha loãng tương ứng 10-3, 10-4

Đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Lắc đều ống nghiệm pha loãng Đậy lá kính lên lưới đếm Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho vài giọt vào mép

lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm Chú ý không để hình thành bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3 - 5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử trong năm ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các bào tử nằm trong lòng ô nhỏ và những bào tử nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều Đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 16

Chú ý nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 bào tử Số bào tử đếm được trong 5 ô lớn phải lớn hơn 200 và phải đảm bảo được độ chính xác của phương pháp Sau khi sử dụng xong buồng đếm phải được rửa ngay và lau thật khô để bảo quản

Kết quả đếm được tính theo công thức như bên dưới

Công thức :

a*4000*103*n

b

N : số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù

a : số lượng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con)

b : số ô con trong năm ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô)

103 : số đổi mm3 thành ml (1000 mm3 = 1 ml)

n : độ pha loãng của mẫu

N =

A : khối lượng cơ chất có trong môi trường nuôi cấy (g).

B : độ ẩm muốn bổ sung vào môi trường (%)

C : độ ẩm trong cơ chất (%) ( với cơ chất là lúa, cám gạo, bã đậu nành, trấu thì

độ ẩm thông thường của chúng là 10%) (Trần Anh Tuấn, 2005)

100 : độ ẩm 100%

F : lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp (ml)

3.3.6 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme amylase

Phối trộn cám: trấu: bã đậu nành theo tỉ lệ (phụ thuộc vào từng giai đoạn của đề tài), cân 20g hỗn hợp cho vào mỗi erlen Từ những dung dịch stock tiến hành pha môi trường dinh dưỡng gồm cả môi trường Mandel và Zapeck Tiến hành điều chỉnh theo

độ ẩm, pH, nồng độ môi trường theo từng thí nghiệm Cho dung dịch dinh dưỡng vào các erlen chuẩn bị ở trên, đánh tơi Khử trùng môi trường ở 1210C trong 15 phút,sau

đó làm nguội môi trườn

Cân 1 g canh trường lúa từ các erlen trong mục 3.3.2, cho thêm 3 ml nước cất vào, khuấy bằng đũa khuấy vô trùng Tiến hành đếm bào tử, pha loãng để đạt được lượng bào tử mỗi loại là 0,8*108 bào tử/g canh trường

Chuyển huyền phù bào tử của nấm mốc trên vào các bình tam giác đã được chuẩn bị như trên, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp tùy theo từng thí nghiệm Để xác định thành phần môi trường và các điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng

và sinh tổng hợp enzyme, nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường có tỉ lệ bã đậu nành: cám mì: cám gạo khác nhau (1:2:1, 2:1:1, 1:1:2), độ ẩm môi trường (từ 40 - 75%), pH (từ 3 - 8), nồng độ dinh dưỡng (x1 - x8 hay từ 1 - 8lần), tỉ lệ giống (từ 0,8*108 đến