Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen cystatin liên quan đến khả năng kháng mọt ở ngô

Có nhiều công trình nghiên cứu đến khả năng kháng mọt của ngô, là kết quả nghiên cứu thành phần sâu mọt hại ngô bảo quản, đặc điểm sinh thái học của loài mọt ngô, đánh giá giống ngô nhiệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HỢP

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

MANG CẤU TRÚC GEN CYSTATIN LIÊN QUAN

ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HỢP

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

MANG CẤU TRÚC GEN CYSTATIN LIÊN QUAN

ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở NGÔ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

THÁI NGUYÊN - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Thái Nguyên, ngày 16 tháng 09 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Thi Hợp

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp

và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Thái Nguyên, ngày 16 tháng 09 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hợp

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 NGÔ (ZEA MAY L.) 3

1.2 MỌT HẠI NGÔ Sitophyllus zeamais 9

1.3 PROTEINASE VÀ CYSTATIN 12

1.3.1 Proteinase và các loại proteinase 12

1.3.2 Proteinase inhibitor 14

1.4 CHUYỂN GEN THỰC VẬT 17

1.4.1 Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 17

20

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 23

2.1.1 Vật liệu 23

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 24

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Phân lập gen 25

2.2.2 Phản ứng lai ghép gen Cystatin2 (Cys2) với vector pENTRTM/D-TOPO® 31

2.2.3 Phương pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen Cys2 bằng kỹ thuật Gateway 33

2.2.4 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 35

2.2.4.1 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A tumefaciens 35

2.2.4.2 Phương pháp tái sinh cây thuốc lá 35

2.2.4.3 Phương pháp tách DNA từ cây thuốc lá 36

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 PHÂN LẬP GEN CYSTATIN2 TỪ GIỐNG NGÔ CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT SL 38

3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN Cys2 43

3.3 TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN pPhaso-Cys2 47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 58

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

6 DNA Deoxyribose nucleic acid

Môi trường nuôi cấy mô

cơ bản theo Murashige

và Skoog

16 mRNA messenger ribonucleic acid

18

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng

hợp

21 SDS Sodium dodecyl sulfate

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1: Sản xuất ngô trên thế giới giai đoạn 1961 - 2012 7

Bảng 1.2: Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô của Việt Nam từ 2007 - 2013 9

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.2: Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 26

Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng PCR nhân gen Cys2 26

Bảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen Cys2 27

Bảng 2.5: Thành phần gắn gen Cystatin vào vector tách dòng pBT 27

Bảng 2.6: Thành phần của phản ứng colony - PCR 30

Bảng 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR 30

Bảng 2.8: Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 30

Bảng 2.9: Thành phần phản ứng ghép nối gen Cys2 với vector pENTRTM/D-TOPO® 32

Bảng 2.10: Thành phần phản ứng LR 34

Bảng 2.11: Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 36

Bảng 2.12: Thành phần chạy phản ứng PCR nhân gen Cys2 t 37

Bảng 3.1: Cys2 38130 42

Bảng 3.2: Sự sai khác giữa trình tự amino acid của giống SL và trình tự có mã số D38130 43

Bảng 3.3: Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen Cys2 49

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1: Mọt ngô Sitophilus zeamais 10

Hình 2.1: Ảnh của giống ngô SL 23

Hình 2.2: Sơ đồ minh họa phản ứng LR giữa pENTR- Cys2 33

Hình 3.1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hóa gen Cys2 38

Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen Cys2 39

Hình 3.3: Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cys2 40

Hình 3.4: Cystatin 2 của giống ngô SL và D38130 41

Hình 3.5: Hình ảnh t Cys2 38130 42

Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR t p p plasmid pENTR-Cys2 44

Hình 3.7: Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pPhaso-Cys2 45

Hình 3.8: A.tumefaciens 46

Hình 3.9: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR t h trong chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58 47

Hình 3.10: 48

Hình 3.11: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá; 49

Hình 3.12: Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Cys2 từ thuốc lá 50

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cây ngô là một trong những cây lương thực quan trọng trong nền kinh tế nông nghiệp thế giới cũng như ở Việt Nam Trên thế giới, ngô được xếp thứ 3 về diện tích, thứ 2 về sản lượng và thứ nhất về năng suất Trong hạt ngô chứa khá đầy đủ các chất dinh dưỡng cho người và gia súc Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngô nói chung đều

sử dụng ngô làm nguồn dinh dưỡng với các mức độ và cách chế biến khác nhau Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho con người, đặc biệt các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng 85% sản lượng ngô làm lương thực Ở Việt Nam, ngô là loại cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa Ngô được trồng khắp nơi, từ đồng bằng đến trung du và khá nhiều ở miền núi Có nhiều loại ngô, thường được xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất

và công dụng như ngô , ngô đường và ngô rau

Ở nước ta hiện nay, ngô là một trong những cây trồng đang được coi trọng để phát triển cả diện tích cũng như năng suất và chất lượng Tuy nhiên,

do điều kiện khí hậu, thời tiết nước ta rất phức tạp, vấn đề bảo quản ngô sau thu hoạch chưa được chú trọng, tạo điều kiện cho loài mọt hại ngô có cơ hội phát triển dẫn đến chất lượng của hạt ngô giảm Vấn đề đặt ra là cần tạo giống ngô mới có khả năng kháng mọt cao, chất lượng Có nhiều công trình nghiên cứu đến khả năng kháng mọt của ngô, là kết quả nghiên cứu thành phần sâu mọt hại ngô bảo quản, đặc điểm sinh thái học của loài mọt

ngô, đánh giá giống ngô nhiệt đới kháng mọt Sitophilus zeamais [40], đánh

giá giống ngô kháng mọt [42], nghiên cứu đánh giá cải thiện giống ngô lai với mức độ kháng khác nhau với mọt ngô [46], đánh giá biểu hiện của một gen

cystatin lúa mạch trong ngô tăng cường sức đề kháng [23] Các nghiên cứu

đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt của cây ngô do nhiều gen quyết định,

trong đó có gen Cystatin Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo

giống ngô theo hướng nâng cao khả năng kháng mọt, chúng tôi đã tiến hành

đề tài nghiên cứu “Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen cystatin

liên quan đến khả năng kháng mọt ở ngô”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chính gen cystatin liên quan

đến khả năng kháng mọt giống ngô địa phương Sơn La

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và xác định được trình tự gen cystatin ở

- Thiết kế vector mang cấu trúc gen cystatin

- vector chuyển gen gen cystatin vào cây thuốc lá

phản ứng PCR

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., do nhà thực vật học Thụy Điển

Linnaeus đặt tên theo hệ thống tên kép Hy Lạp- La Tinh: Zea- từ Hy Lạp để chỉ cây ngũ cốc và mays là từ ―Maya‖- tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất

xứ của cây ngô [12], là một loại cây lương thực thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo (Gramineae), bộ hòa thảo (Graminales) Căn cứ vào kết quả nghiên cứu khảo cổ

học, tế bào học, di truyền học…cho thấy cây ngô có nguồn gốc từ Châu Mỹ, ngô lan truyền sang Châu Âu và phần còn lại của thế giới sau khi có sự tiếp xúc của người Châu Âu với Châu Mỹ Ở Việt Nam ngô được trồng vào thế kỷ thứ XVII

Ngô có rễ tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo Tuy nhiên, ngô có bộ rễ phát triển rất mạnh, nên có khả năng hút nước rất khỏe, hơn nhiều loài cây trồng khác rễ của cây ngô hoàn chỉnh chia thành 3 nhóm: rễ mầm, rễ đốt, rễ chân kiềng Rễ mầm mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nước,

Rễ đốt mọc vòng quanh các đốt thấp của thân Rễ chân kiềng mọc quanh các đốt thấp sát mặt đất Rễ này giúp cây chống đỡ và bám chặt vào đất, chúng cũng tham gia hút nước và Số lượng rễ, số lông rễ và độ dài

rễ khác nhau ở mỗi giống

Thân ngô đặc, đường kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m Thân ngô trưởng thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ Thân ngô ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận chuyển chất hữu

cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ

Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau Các bộ phận của lá bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa lìa Theo hình thái và vị trí trên thân, lá ngô được chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá bẹ, lá bi Số lá, độ lớn của lá phụ thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số lá ngô thường biến động từ 15 - 20 lá Đặc điểm nổi bật là lá ngô có rất nhiều khí khổng Trung

bình một lá ngô có từ 2 - 6 triệu khí khổng, trên 1mm2 lá có từ 500 - 900 khí khổng Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ tới điều kiện hạn hán Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dưỡng…

Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc Cơ quan sinh sản đực (bông cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau Hoa đực nằm ở đỉnh cây Hoa cái phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách nhiều nhưng chỉ có từ 1 - 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp Số bắp trên cây phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ và phân bón

Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi, nội nhũ và chân hạt Vỏ hạt bao xung quanh hạt là một màng nhẵn Lớp alơrôn nằm dưới vỏ hạt Nội nhũ là phần chính của hạt chứa 70 - 78% khối lượng hạt với giá trị dinh dưỡng khá cao so với các loại hạt ngũ cốc khác Phôi ngô

: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm

Quá trình sinh trưởng, phát triển của cây ngô được chia thành hai giai đoạn: giai đoạn sinh dưỡng và giai đoạn sinh thực Giai đoạn sinh dưỡng được tính từ khi gieo đến trỗ cờ Giai đoạn sinh thực được tính từ trỗ cờ đến chín hoàn toàn Căn cứ vào đặc điểm quá trình sinh trưởng phát triển có thể chia ra các giai đoạn sinh trưởng phát triển quan trọng sau đây: giai đoạn hạt nảy mầm và mọc; giai đoạn từ mọc đến 3 lá; giai đoạn từ 3 lá đến 7 lá; giai đoạn từ 7 lá đến trổ cờ; giai đoạn từ trỗ cờ đến tung phấn, phun râu; giai đoạn từ thụ phấn đến chín [9]

Đặc điểm hóa sinh hạt ngô

Thành phần hydratcacbon ở ngô chủ yếu là tinh bột (60 - 70%), lipid chủ yếu là acid béo, protein, hàm lượng đường khoảng 3,5%, lượng tro khoảng 1 - 2,4%, chất khoáng chiếm trên 60% khối lượng của phôi [9]

Tỷ lệ protein trong hạt ngô 8 - 12% Protein chính của ngô là zein, một loại prolamin, gần như không có lysine và tryptophan Protein của ngô được chia thành 3 loại chính: protein hoạt tính (enzyme), protein cấu tạo và protein dự

trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất Hàm lượng protein cũng như các thành phần amino acid bị thay đổi bởi những tác động của các yếu tố di truyền (giống) và môi trường, kỹ thuật canh tác

Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm Ngô cũng có nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6 ) Vitamin PP hơi thấp cộng với thiếu tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP Riêng ngô vàng chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [8]

Tỷ lệ chất béo trong hạt ngô tương đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung trong mầm ngô Trong chất béo của ngô có 50

panmitic và 3% là stearic Hàm lượng lipid là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt [7]

Đặc điểm di truyền học của cây ngô

Chi Zea có một loài duy nhất zeamays nhưng có rất nhiều giống, hàng

ngàn giống được phân chia thành nhiều loài phụ khác nhau dựa vào đặc điểm

cấu trúc hạt Ngô gồm có chín loài phụ như sau: Ngô răng ngựa ( Zea mays

var.indentata Sturt.), ngô đá (Zea mays var.indurata Sturt.), ngô nổ (Zea mays var.everta Sturt.), ngô bột (Zea mays var.amylacea Sturt.), ngô đường (Zea mays var.saccharata Sturt.), ngô bọc (Zea mays var.tunicata Sturt.), ngô nếp

(Zea mays var.ceratina Kulesh.), ngô đường bột (Zea mays var.amylacea

saccharata Sturt.), ngô bán răng ngựa (Zea mays var.semiindentata Kulesh.)

Ngô có 10 nhiễm sắc thể (n=10) Chiều dài tổng cộng của các nhiễm sắc thể là 1.500 cM Một số nhiễm sắc thể của ngô có cái mà người ta gọi là "bướu nhiễm sắc thể": các vùng tạp sắc lặp đi lặp lại cao với vết màu sẫm Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minh thuyết transposon của bà

về các "gen thay đổi đột ngột", và với công trình này bà đã đoạt giải Nobel năm

1983 trong lĩnh vực sinh lý học và y học Ngô vẫn còn là sinh vật mẫu quan trọng cho di truyền học và sinh học phát triển ngày nay [61]

Tại Hoa Kỳ có một kho trung tâm các đột biến ở ngô, The Maize Genetics

Cooperation — Stock Center, do Cục Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông

nghiệp Hoa Kỳ (USDA) thành lập và nằm tại Khoa các khoa học cây trồng của Đại học Illinois tại Urbana-Champaign Tổng cộng bộ sưu tập có gần 80.000 mẫu Bộ sưu tập này bao gồm vài trăm gen đã đặt tên, cộng với các tổ hợp gen

bổ sung và các biến thể có thể di truyền khác Ở đây có khoảng 1000 sai lệch nhiễm sắc thể (chẳng hạn các hoán vị hay nghịch đảo) và các nguồn với số nhiễm sắc thể bất thường (như các dạng tứ bội) Dữ liệu di truyền miêu tả các nguồn đột biến ở ngô cũng như vô số các dữ liệu khác về di truyền học của ngô

có thể truy cập tại MaizeGDB (Maize Genetics and Genomics Database: Cơ sở

dữ liệu di truyền học và bộ gen ngô)

Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa

Kỳ và Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (DOE) đã thành lập một côngxoocxiom để xác định trình tự chuỗi bộ gencủa ngô Dữ liệu về chuối AND trong kết quả đã được đưa ngay vào Ngân hàng gen, kho chứa công cộng của các dữ liệu chuỗi gen Việc thiết lập trình tự chuỗi cho bộ gen ngô là khá khó khăn do kích thước lớn

và các sắp xếp phức tạp Bộ gen ngô có 50000–60000 gen nằm rải rác trong 2,5

tỷ bazơ – các phân tử tạo ra ADN – mỗi gen lại có 10 nhiễm sắc thể (Để so sánh, bộ gen người chứa khoảng 2,9 tỷ bazơ và 26.000 gen.) [61]

Giá trị kinh tế của cây ngô

Ngô là loại cây lương thực chính được trồng rộng rãi trên toàn thế giới 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp cho gia súc là ngô; ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho đại gia súc đặc biệt là bò sữa Gần đây cây ngô còn là cây thực phẩm; người ta dùng bắp ngô bao t làm rau cao cấp vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao; ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm quả ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu Ngoài việc cung cấp lương thực cho con người và vật nuôi, nhiều nước đang tiến hành

sử dụng ngô để chế biến ethanol- năng lượng sạch cho tương lai [8], [12]

Chính vì tầm quan trọng của nó trong nền kinh tế như vậy, cho nên cây ngô đã được toàn thế giới gieo trồng và hình thành 4 vùng sinh thái cây ngô

chính là: vùng ôn đới, vùng cận nhiệt đới, vùng nhiệt đới cao và vùng nhiệt đới thấp Việt Nam nằm trong vùng sinh thái nhiệt đới thấp; cây ngô đã được đưa vào sản xuất cách đây 300 năm

Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau Cây ngô không chỉ cung cấp lương thực cho người, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn [1]

Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam

* Tình hình trên thế giới

Năm 1961, diện tích ngô toàn thế giới đạt 105,5 triệu ha, năng suất 19,4 tạ/ha, sản lượng 205 triệu tấn, đến năm 2009, diện tích trồng ngô thế giới đạt khoảng 159,5 triệu ha, năng suất bình quân 51,3 tạ/ha, sản lượng 817,1 triệu tấn Sản lượng ngô thế giới năm 2013 đạt khoảng 963 triệu tấn, tăng 10% so với năm

2012 Trong đó Hoa Kỳ, Trung Quốc, Brazil là những nước đứng đầu về diện tích và sản lượng (Hoa kỳ đạt khoảng 340 triệu tấn, Trung Quốc đạt khoảng 214 triệu tấn, Brazil đạt 77,8 triệu tấn) được thể hiện ở trong ng 1.1 [54], [60]

Bảng 1.1 Sản xuất ngô trên thế giới giai đoạn 1961 - 2012

(triệu ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Năng suất (tạ/ha)

Trên thế giới, Mỹ là nước có diện tích, năng suất, sản lượng ngô lớn nhất thế giới Kết quả trên có được, trước hết là nhờ sự đầu tư cho nghành nông nghiệp, không ngừng cải thiện các kỹ thuật canh tác, đồng thời ứng dụng công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống đã góp phần đưa năng suất và sản lượng ngô của nước này cao hơn các nước khác Các giống cây trồng chuyển gen được tạo ra nhờ công nghệ sinh học đã được trồng phổ biến, đem lại lợi nhuận nông nghiệp cao, trong đó nước Mỹ tập trung vào các cây mũi nhọn là bông, đậu tương và ngô

Có thể nói Mỹ và Trung Quốc là hai nước có diện tích trồng ngô lớn nhất

và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác Mỹ và Trung Quốc, cùng với Ấn

Độ là những nước xuất khẩu ngô lớn, các nước nhập khẩu ngô chính là Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malaysia, Mexico, châu Phi…[8]

* Tình hình tại Việt Nam

Trước đây sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ, phân tán, mặt khác do kĩ thuật canh tác kém và chất lượng giống kém dẫn đến năng suất rất thấp Từ đầu những năm 1990 đến nay, khi tiến hành mở rộng diện tích trồng kết hợp với các giống ngô lai cùng với việc cải thiện các kĩ thuật canh tác nhằm đáp ứng yêu cầu của giống mới đã tạo ra những bước tiến nhảy vọt trong ngành sản xuất ngô Tình hình sản xuất ngô được thể hiện ở bảng 1.1 dưới đây

Bảng 1.2: Diện tích, năng suất, sản lượng ngô của Việt Nam từ 2007 - 2013

Năm (triệu ha) Diện tích Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (1000 tấn)

Từ năm 2007 tới nay, năng suất và sản lượng ngô của Việt Nam đã có những bước nhảy vọt Tốc độ tăng trưởng diện tích, năng suất và sản lượng ngô của Việt Nam cao hơn nhiều lần, lợi nhuận trồng ngô lai cao hơn hẳn so với các loại cây trồng khác Năm 2007, diện tích trồng ngô của cả nước (trong đó diện tích trồng ngô lai chiếm ưu thế) đạt trên 1 triệu ha, tổng sản lượng gần 4 triệu tấn Năm 2008, diện tích trồng ngô tăng lên 1,4 triệu ha, tổng sản lượng lên tới hơn 4,5 triệu tấn Năm 2013 là năm tạo dấu ấn ấn tượng của ngô Việt Nam, đạt mức sản lượng cao nhất từ trước đến nay với 5,19 triệu tấn và năng suất 44,31 tạ/ha [55] Có được thành tựu này là do việc tạo ra các giống ngô lai mới, đồng thời mở rộng diện tích trồng ngô lai trong sản xuất, kết hợp các biện pháp kĩ thuật canh tác hiện đại

Những vùng trồng ngô lớn ở Việt Nam là khu vực Đông Nam Bộ, Tây Nguyên, trung du miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng và duyên hải miền Trung [1] Trong đó, khu vực miền núi phía Bắc trồng chủ yếu là các giống ngô địa phương Năng suất của các giống ngô địa phương thường thấp, tuy nhiên các giống ngô địa phương vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu vì các ưu điểm như khả năng chịu hạn, kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau

1.2 MỌT HẠI NGÔ Sitophyllus zeamais

Mọt ngô có tên khoa học là Sitophyllus zeamais Motsch, thuộc bộ

Coleoptera, họ Curculionidae Mọt ngô là loại đa thực, chúng có thể ăn được hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác Thức ăn thích hợp nhất với nó là ngô hạt Mọt này có phổ biến ở hầu hết khắp các nước trên thế giới, nhất là ở châu Á, vùng Địa Trung Hải (Châu Âu) và Bắc Mỹ Ở nước ta trong các kho lương thực, nhất là kho bảo quản ngô, gạo thường gặp loài mọt này Mọt có thể đẻ trứng ở ngoài đồng và cả trong kho Nó thuộc loại phá hoại nghiêm trọng [38], [53]

Hình 1.1: Mọt ngô Sitophilus zeamais

Mọt gây hại trên bắp và hạt ngô ngay giai đoạn ngô chín sáp ngoài đồng, chúng theo ngô vào kho và gây hại liên tục trong suốt quá trình bảo quản Trong kho mọt hoạt động nhanh nhẹn, hay bay bò và có tính giả chết, chúng thích bò lên các vị trí cao trong đống hạt Khi gặp điều kiện độ nhiệt cao, mọt thường tập trung vào kẽ kho, mép bao… để ẩn nấp

Đặc điểm hình thái của mọt ngô

Giai đoạn trưởng thành mọt ngô rất giống mọt gạo, vì thế trong phân loại trước đây, có nhiều ý kiến khác nhau Có người cho rằng mọt ngô và mọt gạo là cùng loài nhưng khác tên, nhiều người khác cho rằng mọt ngô và mọt gạo là 2 loài độc lập với nhau [35] Cho đến nay, mọt ngô được xem như một loài riêng biệt, rất gần với mọt gạo Về hình dạng ngoài, mọt ngô rất giống mọt gạo, nhưng kích thước cơ thể lớn hơn (3,5- 5mm) Cánh trước trơn bóng và các điểm màu đỏ tròn cánh khá rõ Các lỗ chấm trên tấm lưng ngực trước thô và dày ở phía trước Do đó việc phân biệt chủ yếu dựa vào dạng cơ quan sinh dục đực (penis) ở mọt gạo có hình bán nguyệt, còn ở mọt ngô là hình 3 góc Bề mặt phía trên của penis ở mọt gạo đơn giản, không có lông dài, còn ở mọt ngô thì có

2 lông dài Đầu máng đẻ trứng của con cái mọt gạo có hình chữ Y, còn của mọt ngô là hình móc nhọn

Các lỗ chấm ở ngực trước khá trơn và không có vùng lỗ chấm lộn xộn ở giữa Chấm lõm trên đầu rất rõ ràng Đoạn trước trán rất bằng dẹt, phần gốc vòi

có 3 chiếc máng, dọc theo viền mép ngực trước còn có một dảy chấm lõm Chấm lõm trên mảnh lưng ngực trước hình tròn, ở khu giữa chấm lõm rất dày, chấm lõm

ở 2 cạnh gần như hỗn hợp lại Cánh cứng có 2 vệt chấm màu trắng đỏ, một ở bên vai, một ở gần đoạn cuối Chấm lõm ở mặt bụng thân mình dày hơn Cánh sau phát triển và có thể bay được Cánh màu nâu đen bóng Các điểm vá màu vàng đỏ hình bán nguyệt rất rõ Trên mặt ngoài của gai giao cấu (Aedeagus) con đực có các rãnh chạy dọc; các con cái đầu nhánh rẽ hình chữ Y hóa cứng mạnh nên nhọn

Giai đoạn trứng có đặc điểm: dài 0,5-0,7mm, rộng 0,25- 0,3mm, hình bầu dục hơi dài màu trắng sữa Giai đoạn sâu non: Khi đã lớn dài 3-3,2 mm, rất mập, lưng cong lại như hình bán nguyệt, mặt bụng tương đối bằng Toàn thân màu sữa đến màu nâu nhạt Giai đoạn nhộng: dài 3-4 mm, hình bầu dục, cân đối 2 đầu, lúc đầu màu vàng sữa sau chuyển sang màu vàng nâu

Cũng như mọt gạo, mọt ngô có thể bay được, nó còn bay mạnh hơn mọt gạo cho nên mọt ngô đã gây hại ngay từ ngoài đồng Trên các ruộng ngô ở Tây Nguyên, mọt ngô thường xuất hiện và phát triển vào thời kỳ chuẩn bị thu hoạch [6], [27]

Đặc điểm về chu kì sống

Khả năng sinh trưởng và phát triển của mọt ngô trong ngô hạt là lớn nhất, sau đó mới đến thóc và các ngũ cốc khác Kết quả nghiên cứu ở Nhật Bản xác nhận mọt ngô chịu lạnh tốt hơn mọt gạo [27]

Toàn bộ thời gian phát triển cho vòng đời của S zeamais trung bình 36 ngày Thời gian phát triển này là gần giống như S oryzae và nhanh hơn so với S

granarius khoảng 7 ngày trong điều kiện tương tự Hầu hết trứng được lắng

đọng trong nội nhũ Tốc độ sinh sản tối đa 6,7/

, thời gian phát triển và số lượng các thế hệ con cháu sản xuất là tối

ưu ở 30ºC và 75% [53], [59]

Khi đẻ trứng, mọt dùng i đẻ trứng vào những lỗ này, sau đó tiết ra một thứ dịch nhầy để bít kín lỗ đó lại Sâu non nở ra

ăn hại ngay trong hạt và lớn lên Khi ăn hạt, nó thường ăn phôi trước, sau đó mới đến nội nhũ và các bộ phận khác làm hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng, nhìn

bề ngoài dễ lẫn với hạt còn nguyên vẹn Khi đẫy sức, sâu non đục những lỗ nhỏ

lộ rõ trên mặt hạt để vũ hoá bay ra ngoài Tùy theo điều kiện mà mọt đẻ ít hay nhiều, nhiều nhất mỗi con cái có thể đẻ được 384 trứng [52]

Thức ăn có ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của mọt, trong cùng một điều kiện độ nhiệt và độ ẩm như nhau, nuôi mọt ngô bằng thức ăn khác nhau đã thu được kết quả như sau: Khi nuôi bằng ngô hạt, thời gian vòng đời của mọt là 34 ngày; khi thay bằng loại thức ăn khác là gạo, thời gian vòng đời sẽ là 47 ngày; thóc là 53 ngày

Ở nhiệt độ 0ºC, mọt có thể sống được 37 ngày, ở -5ºC mọt chết sau 23 ngày, còn

ở -10ºC tất cả các giai đoạn phát triển của mọt chết sau 13 ngày Ở 55ºC, mọt chết sau 6 giờ, ở 60ºC chết sau 2 giờ Trong điều kiện độ nhiệt 25ºC mọt có thể sống không có thức ăn 18 - 26 ngày [33], [52]

1.3 PROTEINASE VÀ CYSTATIN

1.3.1 Proteinase và các loại proteinase

Quá trình phân giải protein có sự tham gia của các loại enzyme thủy phân protein, trong đó có proteinase Proteinase là một nhóm các enzyme phá vỡ các phân tử chuỗi dài của các protein thành các đoạn ngắn hơn (peptide) và cuối cùng là thành phần các amino acid Proteinase có liên quan đến quá trình tiêu hóa, hoạt hóa tiền enzyme, giải phóng các peptide hoạt động sinh lí, hoạt hóa bổ sung và các quá trình viêm

Người ta phân loại proteinase làm bốn nhóm dựa vào gốc amino acid thiết yếu ở vị trí trung tâm hoạt động, sự thay đổi hoạt động ở pH tối ưu, sự tương đồng của trình tự amino acid và sự tương đồng về các chất ức chế Bốn nhóm

proteinae bao gồm: serin-, cysteine-, aspartic- và metallo-proteinase Trong bốn nhóm này, một lượng lớn chất ức chế của serine- và cysteine- proteinase đã được nghiên cứu nhiều [43]

Trong động vật có xương sống, các proteinases cysteine được tham gia vào hệ thống phân hủy protein lysosome Trong động vật không có xương sống như giun tròn, proteinases cysteine là một trong các enzym tiêu hóa [41] Trong động vật chân đốt như tôm hùm, đóng vai trò tiêu hóa, nhưng cũng có liên quan trong hệ thống thần kinh [21] Trong côn trùng, chúng được sử dụng trong quá trình tiêu hóa nhưng được tìm thấy trong nhiều mô khác [41] Các nghiên cứu về sự phụ thuộc độ pH của hoạt động proteinase cysteine trong chiết xuất dầu thô của ấu trùng côn trùng đã chỉ ra rằng, chúng hoạt động chủ yếu trong phạm vi pH kiềm [22], đó là độ pH cho các hoạt động của proteinases cysteine [19], [43]

Cysteine proteinase hoạt động bằng cách loại bỏ đoạn amino tận cùng trong chuỗi polypeptide để tạo ra các enzyme hoạt động Vùng amino tận (hay còn gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của enzyme mà còn giúp các protein mới được tổng hợp cuộn xoắn chính xác và bảo

vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh Về phương diện proregion, các enzyme giống Cathepsin L và giống Cathepsin B là các phân họ của papain Chúng hình thành nên 2 nhóm enzyme khác biệt: vùng proregion của Cathepsin

L (với xấp xỉ 60 gốc amino acid) ngắn hơn proregion của Cathepsin B (với xấp

xỉ 100 gốc amino acid) Vị trí hoạt động của Cathepsin B khác so với các Cathepsin khác ở chỗ nó có vùng móc, vùng này có chức năng nhất định trong hoạt tính exopeptidase của protein này Người ta đã quan sát được hai vùng khác biệt trong cấu trúc không gian ba chiều của các thành viên thuộc họ papain Vùng amino tận cùng có cấu trúc xoắn anpha trong khi vùng cacboxyl tận có chứa chủ yếu cấu trúc gấp nếp beta Vị trí hoạt động có chứa gốc Cys 25 và His

159, chúng được bổ sung nhờ Asn 175 liên kết với His 159 và Gln 19 Các nhà

khoa học cũng đã tìm ra các hoạt tính khác biệt của các enzyme họ papain bao gồm endopeptidase, aminopeptidase, carboxylpeptidase Cũng có sự khác biệt trong hoạt động phân giải protein của các Cathepsin ở các pI và pH tối ưu khác nhau như: Cathepsin B (pI= 4,5-5,5, pH=6), Cathepsin H (pI= 6,0-7,1, pH=6,8), Cathepsin L (pI= 5,5-6,1, pH=5,5) [19], [43]

1.3.2 Proteinase inhibitor

Các chất ức chế proteinase (PI) thực vật nói chung là protein nhỏ mà chủ yếu

đ trữ, chẳng hạn như các loại củ và hạt, nhưng cũng đã được tìm thấy trong các bộ phận trên không của cây, thường gây ra

để đáp ứng với chấn thương hoặc tấn công của côn trùng hoặc các mầm bệnh

Các hoạt động của proteinases cysteine được kiểm soát bởi protein ức chế

tự nhiên như α2-macroglobulin và cystatins Cystatin là một thuật ngữ đề cập

đến các loại protein có khả năng ức chế đặc hiệu hoạt động của papain và các enzyme phân hủy cysteine như Cathepsin B, H, và L, ficin và Bromelain Sự tồn tại của chúng trong cơ thể vi sinh vật, động vật, và các loài thực vật rất phổ biến

[10] Các nghiên cứu gần đây bàn luận nhiều về mối liên quan giữa cystatin với

hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh Protein này có mối quan hệ về mặt cấu trúc và chức năng với chất ức chế của cysteine proteinase, nó được mô tả lần đầu tiên ở lòng trắng trứng gà và sau

Cystatin họ 1, được biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc các

nhóm carbohydrate, nó có trọng lượng phân tử khoảng 11kDa, gồm 100 gốc amino acid

Cystatin họ 2, là protein có 2 liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu

carbon cuối cùng và được glycosyl hóa, có trọng lượng phân tử khoảng 13-24 kDa với 115 amino acid

Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết tương,

nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết các phức hợp phân tử

cystatin có trọng lượng phân tử cao (60-120 kDa) với khoảng 355 gốc amino

acid có chứa các liên kết disulfide Các kininogen giữ vai trò quan trọng trong quá trình đông máu

Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động vật

và thực vật, người ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [33], gồm hầu hết các

chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với hầu

hết các cystatin họ I và II Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt gạo là

chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên được nghiên cứu Nó có mối liên hệ về

mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng gà Oryzacystatin cũng được xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng mặt của liên kết disulfide, chuỗi

pentapeptide cũng được tạo thành bởi Gln-Val-Val-Ala-Gly (gốc thứ 57 - 61) và khối lượng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với 102 gốc amino acid Trình tự amino

acid của oryzacystatin giống 30% với cystatin họ II, nó có vùng trình tự

Phe-Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try (gốc thứ 83 - 84), điều đó chứng tỏ

oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm cystatin họ II

Gen cystatin được phân lập đầu tiên từ mRNA của cây lúa, ký hiệu là

OC1 có đoạn mã hóa dài 309 nucleotide, mã hóa phân tử protein dài 102 amino

acid [18] Ở cây đậu xanh, gen cystatin được Kang và cs phân lập, đọc trình tự

từ mRNA và công bố tại ngân hàng gen Quốc tế có mã số D38130 với kích thước 304 nucleotide, đoạn mã hóa gồm 267 nucleotide mã hóa 88 amino acid

[56] Cũng thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen cystatin ở cây đậu tương khá lớn, có

kích thước 5863bp trên đó có 4 exon và 3 intron được Misaka phân lập năm

2000 [54] Ở cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy cũng đã phân lập được đoạn gen cystatin

có chiều dài 461bp với 2 exon và 1 intron; Protein do gen mã hóa có 98 amino

acid [15] So với gen cystatin phân lập từ DNA hệ gen, gen cystatin phân lập từ

mRNA chiếm số lượng lớn hơn

Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen

ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và

CC10 [37] Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen được phân lập từ mRNA,

chỉ có gen CC1 phân lập từ DNA Kích thước gen CC1 chứa 2024bp, trong

đó có 3 exon và 2 intron, 3 exon mã hóa phân tử protein dài 134 amino acid

56] Sự biểu hiện của gen cystatin là khác nhau ở các thời kỳ phát triển khác nhau của cây ngô Trong 10 gen cystatin ở ngô, CC1 ưu tiên biểu hiện trong

cờ non, hai gen CC8, CC10 biểu hiện trong việc phát triển hạt, 7 gen CC còn

lại biểu hiện trong hai hoặc nhiều mô khác nhau Riêng trong điều kiện chịu ảnh hưởng của sự thiếu hụt nước có tới 5 gen cùng biểu hiện, đó là các gen

CC2, CC3, CC4, CC5 và CC9 [37]

Chức năng của cystatin

Chức năng của hầu hết các cystatin thực vật là khả năng ức chế enzyme phân hủy protein Cys như papain, cấu trúc bảo thủ bậc 3 của chúng và kiểu ức

chế protease, khả năng phân bố phổ biến trong thực vật chứng tỏ vai trò điều

tiết protease quan trọng của những protein này trong thực vật Phytocystatin có

rất nhiều các chức năng sinh học: Các chức năng sinh lý hoạt động của enzyme proteinase trong hạt trong suốt quá trình hạt chín; Sự đóng góp của các chất gây ức chế đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại sự tấn công của côn trùng, giun tròn mà nhìn chung có chứa cysteine proteinase bên trong ruột của chúng [11], [19]

Những ảnh hưởng của chất ức chế proteinase đến sinh lý tiêu hóa của côn trùng đã được nghiên cứu trong kiểm soát côn trùng gây hại Nghiên cứu liên quan ảnh hưởng của chất ức chế proteinase trên chế độ ăn côn trùng đã được phát triển từ lâu Gần đây, một số nghiên cứu đã báo cáo những hậu quả của sự kết hợp của các

chất ức chế proteinase trong chế độ ăn của côn trùng Các chất ức chế proteinase, khi có mặt trong chế độ ăn uống, dẫn đến tỷ lệ tử vong tăng lên, giảm tăng cân, giảm khả năng sinh sản và trong một số trường hợp cơ thể chết [19]

1.4 CHUYỂN GEN THỰC VẬT

Chuyển gen thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen Nó còn mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế cho cây trồng

1.4.1 Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

Hiện nay, có nhiều phương pháp chuyển gen được các nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào thực vật như: phương pháp gián tiếp sử dụng

Agrobacterium tumefaciens, phương pháp trực tiếp sử dụng xung điện, vi tiêm,

xử lý polyethylene glycol (PEG) và dùng súng bắn gen Mỗi phương pháp chuyển gen đều có những ưu, nhược điểm riêng tùy vào từng loài cây khác nhau

Trong đó phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens đem lại hiệu

quả cao và ít tốn kém nhất

Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) được chuyển vào

thực vật nhờ A tumefaciens, tuy nhiên T-DNA vẫn chưa được thay đổi

Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và đưa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng sinh Ngoài ra, các gen tạo khối u được cắt ra DNA ngoại lai cùng với phần còn lại được chuyển vào thực vật và được biến nạp Thành công này nhờ nghiên cứu chính xác con

đường lây nhiễm của A tumefaciens trước đó và khả năng của hệ thống chọn

lọc đối với thực vật

Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn A.tumefaciens

ban đầu không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm Tuy nhiên, đã

có nhiều cố gắng trong việc cải tiến khả năng tái sinh đối với các cây một lá

mầm, những callus lây nhiễm với A.tumefaciens được sinh ra từ mô rễ [24]

và phôi chưa trưởng thành [25] đã được sử dụng

Chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens là bước đột phá của công nghệ gen Đây là kỹ thuật chuyển gen

được ưa chuộng nhất vì có nhiều ưu điểm so với chuyển gen bằng phương pháp bắn gen, như cho nhiều sự kiện chuyển gen ổn định, ít bản sao, thể hiện đúng, tăng tần số đồng biểu hiện và ít có sự tái sắp xếp gen chuyển nạp Đến nay, các quy trình chuyển gen hiệu quả đã được xây dựng cho các cây một lá mầm như lúa [24], [30], lúa mì [26] Chuyển gen vào phôi non ngô dòng A188 thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [30] Năm 2002, Frame và cs đã chuyển

gen vào phôi non dòng ngô Hi II [28]

Cây chuyển gen đầu tiên đã được tạo ra năm 1983 vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Đây là loại vi khuẩn sống trong đất, gây bệnh cho

cây bằng cách gắn các đoạn gen vào hệ gen của tế bào chủ và sinh ra u nhờ một loại plasmid Ti Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D

Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là DNA Vùng B có liên quan đến sự tái sinh Vùng C có liên quan đến sự tiếp

T-hợp Vùng D là vùng độc có chứa các gen vir, giữ vai trò quan trong trong việc

chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của tế bào thực vật

Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bị tổn thương Khi tế bào bị tổn thương, chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringon), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và sự gắn kết

giữa vi khuẩn và tế bào thực vật A.tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ một chất nhận, được mã hóa bằng một gen ở vùng vir Sự nhận biết của chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả các gen vir

Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A tumefaciens là

hệ thống vector liên hợp và hệ thống vector nhị thể [13]

Vector liên hợp (cointegrate)

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T - DNA lên một vector nhỏ hơn Điều

này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ

Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên hợp Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T - DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh) Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và

chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm bảo cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A.tumefaciens [10], [17]

Vector nhị thể (binary vector)

Vector nhị thể bao gồm hai vector (một là plasmid tách dòng từ E.coli

trong đó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị

và vùng gắn gen cần chuyển; plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmid này được gọi là plasmid hỗ trợ) Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ

chế chuyển gen của vi khuẩn đất A.tumefaciens một cách rất hữu hiệu Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A.tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết

kế bao gồm các phần như sau:

i) Vị trí ghép nối đa điểm;

ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E coli và A.tumefaciens;

iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật;

iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp;

v) Đoạn T - DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T - DNA

Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản Loại vector vận tải mang đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI) giữa đoạn ngoại

biên của T - DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận

chuyển vào tế bào thực vật Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [10], [17]

1.4.2

Đối với cây ngô, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển

gen thông qua Agrobacterium tumefaciens vào mô sẹo dạng I từ đoạn cây con

[44], phôi non [28], [29], [32], [49], [50], phôi non và phôi từ mô sẹo [40] Phôi ngô được sử dụng nhiều và cho hiệu quả chuyển nạp gen khá cao Nghiên cứu chuyển gen thành công vào phôi non các dòng ngô A634, H99, W117 sử dụng vi

khuẩn A tumefaciens với tỷ lệ thành công khoảng 15%, riêng dòng A188 cho tỷ

lệ cao nhất 50% [32] Wang và cs (2007) cũng chuyển vector pCABIA3301 mang gen glgC vào phôi non của dòng ngô Zong3, sau 3 thế hệ cho thấy hàm

lượng tinh bột trong hạt đã tăng từ 13 đến 25% [50] Vega và cs (2008) đã

chuyển thành công vector pCABIA3301 và pZY101 vào phôi non dòng ngô Hi-II

sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens, tỷ lệ chuyển gen thành công trong nghiên cứu

này vào khoảng 12%, cao nhất có dòng đạt được 18% [49] Li và cs (2010) đã

nghiên cứu chuyển gen Bt2 và Sh2 vào mô phân sinh cây ngô non của dòng ngô DH4866 sử dụng vi khuẩn A tumefaciens đã đem lại hiệu quả khá cao, khoảng

10% các cây non xử lý được chuyển gen [36] Năm 2012, Wang và cs đã sử dụng mô phân sinh chồi của hai dòng ngô cận giao Tian Tawu và 7922 để

chuyển gen mã hóa phytoene synthase (psy) thông qua A tumefsciens [51]

Phương pháp này làm giảm thời gian trong nuôi cấy mô truyền thống và đã chứng tỏ đây là phương pháp chuyển gen đơn giản

Năm 2009, Kim và cs đã sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua A

tumefaciens vào phôi non để tạo cây ngô chuyển gen kháng chất điệt cỏ [34]

Với việc áp dụng kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens, Trương Thu Hằng đã chọn tạo thành công dòng ngô HR9 có mang

gen kháng sâu CryIAc Khi phân tích biểu hiện của gen kháng sâu (CryIAc) ở

thế hệ T1, đã chỉ ra rằng trong số hơn 1500 cá thể thuộc 10 dòng HR9 thế hệ T0

mang gen CryIAc có khoảng hơn 100 cá thể thuộc 10 dòng T0 nói trên mang

gen kháng sâu đục thân cao [5]

Takava và cs (2010) đã chuyển vector pCABIA3301 vào 4 dòng ngô thuần S61, B73, Mo17, A188 và 2 dòng ngô lai HiIIB và HiIIC thông qua vi khuẩn A

tumefaciens LBA4404 Các tác giả đã lấy phôi có kích thước trung bình từ 1,5

đến 2 mm đồng nuôi cấy với vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 trong 72 giờ (3

ngày) và sử dụng MES, timentin và PPT để diệt và chọn lọc mẫu được gây nhiễm, tạo callus và tái sinh cây Hai dòng S61 và A188 cho kết quả tái sinh cao

nhất PCR để phát hiện gen gus và bar trong hệ gen của cây tái sinh Tần số xuất

hiện hai gen này là 6,45% đối với dòng S61 [45]

Năm 2010, Anima và cs cũng chuyển hai vector pXBb7-SI-UBIL và pBbm42GW7_GUS vào phôi non của 3 dòng ngô TL26, CML216 và CML244 với môi trường đồng nuôi cấy có nồng độ cao hơn các nghiên cứu khác (200 µM acetosyringone) và cũng tạo ra được cây chuyển và và đời con lai của các dòng chuyển gen trên [20]

Ở Việt Nam hiện nay đã sử dụng rộng rãi phương pháp biến nạp gen vào

vi khuẩn A tumefaciens để chuyển vào cây trồng rất nhiều và đem lại các thành tựu đáng kể như: đã chuyển được gen cryIA kháng sâu xanh Heliothis armigera vào cây hông và cây cải ngọt thông qua vi khuẩn A tumefacien EHA 105 [2] đã

chuyển được gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng chích hút vào cây

thuốc lá nhờ vi khuẩn A.tumefacien LBA 4404 [3]

Các nghiên cứu về chuyển gen ngô nhờ vi khuẩn A.tumefaciens đã được

thực hiện chủ yếu với mục đích kháng sâu bệnh và thuốc trừ cỏ Theo báo cáo khoa học của Viện Di truyền nông nghiệp đã tạo được 6 dòng ngô GA35 mang

gen nptII bằng phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens [4] Chưa có

kết quả nghiên cứu nào về việc sử dụng kỹ thuật gen làm tăng năng suất ngô thông qua tăng chất lượng cũng như trữ lượng tinh bột Phạm Thị Lý Thu (2007) đã nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô ở hai dòng ngô HR8 và HR9, tác giả nhận định rằng chuyển gen bằng súng bắn gen có hiệu quả cao nhất đối với hai dòng ngô nghiên cứu [14]

Đinh Văn Trình và cs sử dụng A.tumefaciens EHA105 chứa vector

pBiG.ubi mang gen chịu hạn - ZmDREB2A và gen kháng hygromycin hpt

Nhóm tác giả sử dụng râu ngô đã được cách ly tiếp xúc với dịch huyền phù vi khuẩn trước khi thụ phấn của cùng dòng 135 bắp (13145 hạt thế hệ đầu tiên T0)

đã thu được trong vụ đông xuân năm 2006 - 2007 Cây con chuyển gen giai đoạn 2 -3 lá được sàng lọc bằng điều kiện khô hạn Phép thử tính kháng hygromycin và phân tích PCR trên 59 cây T0 sau xử lý hạn cho thấy hiệu quả chuyển gen ở thế hệ T0 đạt 0,023% [16]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1: Ảnh của giống ngô SL

Giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 do phòng Công nghệ tế

vật, phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

Các vector và chủng vi khuẩn sử dụng

Vector pBT; vector pPhasonin, pENTRTM/D-TOPO® do phòng Công nghệ ADN và ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

Chủng vi khuẩn E.coli DH5α và A tumefaciens CV58, do phòng Công

ng vật của Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

Cặp mồi: CYS-F/R được thiết kế dựa trên sự phân tích trình tự gen

cystatin2 của giống ngô được công bố tại GenBank - NCBI với mã số D38130:

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Các loại kháng sinh: kanamycine 50mg/l, rifamycin3 50mg/l, spectinomycine 100mg/l, cefotaxime 400mg/l, Carbenicillin 50mg/l

Môi trường nuôi cấy: LB (đặc, lỏng), MS đặc, MS lỏng không đường,

GM, RM Các chất điều tiết sinh trưởng: BAP

Thiết bị

Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ), máy PCR System

9700 (Applied Biosytem Mỹ), máy li tâm lạnh Hittich (Đức), lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), tủ lạnh -20°C(Sanyo, Nhật Bản), tủ lạnh -800

C (Super Freezer Eco130 - Ficchetti - Ý), máy đo quang phổ định lượng (nanoDrop Lite Spectophotometer - Mỹ), bể ổn nhiệt (BW- 0,5G Jeiotech - Hàn Quốc), pipetman, giá đổ điện di, cối chày sứ, bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy vortex (Mimeshaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed -Vac 110A (Savant, Mỹ), máy sung điện Gen Plulser Đây là các thiết bị của phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng công nghệ DNA và ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp