xác định giai đoạn hình thành và khảo sát sự biệt hóa của nguyên bào sụn trên giá thể pla

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  LÊ MINH DUY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VÀ KHẢO SÁT SỰ BIỆT HÓA CỦA NGUYÊN BÀO SỤN TRÊN GIÁ THỂ PLA Chuy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



LÊ MINH DUY

Tên đề tài:

XÁC ĐỊNH GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VÀ KHẢO SÁT

SỰ BIỆT HÓA CỦA NGUYÊN BÀO SỤN

TRÊN GIÁ THỂ PLA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Cán bộ hướng dẫn : TS Trần Lê Bảo hà

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ MINH DUY

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tên đề tài: Xác định giai đoạn hình thành và khảo sát sự biệt hóa của nguyên bào sụn trên giá thể PLA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 62420201

Chương trình: Phương thức 2

Xác nhận của cán bộ hướng dẫn (Ký tên và ghi rõ họ tên)

TS Trần Lê Bảo Hà

Tp HCM, tháng 1 năm 2015

1

1 Giới thiệu tổng quát

Tế bào bào gốc trưởng thành hoặc tế bào gốc sinh dưỡng đều có những tiềm năng đầy hướng hẹn trong sự tái tạo mô cơ thể Hiện nay, việc nghiên cứu sinh học cơ bản và ứng dụng trị liệu của tế bào gốc trung mô đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell, ASC) đã được phân lập và nghiên cứu từ nhiều nguồn mô khác nhau trong cơ thể như tủy xương, dây cuống rốn, não, biểu mô, tủy răng

và gần đây nhát là mô mỡ Mặc dù tế bào gốc trưởng thành còn hạn chế trong khả năng biệt hóa thành các mô cơ quan khác nhau nhưng chúng vẫn đảm nhiệm vai trò duy trì tính nội cân bằng mô trong cơ thể bằng cách phục hồi các tế bào bị mất do tuổi tác hoặc bị tổn thương Điều đó cho thấy chức năng tái tạo mô đầy triển vọng của các loại tế bào gốc này Một trong số các ASC được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất đó là tế bào gốc trung

mô (Mesenchymal stem cell, MSC) và nồi bật là tế bào gốc mô mỡ Tế bào gốc mô mỡ (Adipose tissue-derived stem cell, ADSC) không những có chung các đặc điểm của tế bào gốc trung mô tủy xương mà còn mang các ưu điểm nổi bật khác tiêu biểu như việc thu nhận dễ dàng hơn khi không cần quá trình phẫu thuật phức tạp Hơn thế nữa, tế bào gốc mô mỡ còn có tiềm năng biệt hóa thành các tế bào trung mô như tế bào mỡ, tế bào xương, cơ xương và tế bào sụn, cũng như các tế bào không phải trung mô như tế bào gan,

tế bào nội tiết tuyến tụy, tế bào thần kinh, tế bào cơ tim và tế bào nội mô mạch máu [8] Hiện nay, ứng dụng của tế bào bào gốc mô mỡ ngày càng phát triển đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ tái tạo mô Công nghệ này nghiên cứu và sử dụng các vật liệu sinh học để tạo ra các mô mới có đặc điểm chức năng tương tự trong cơ thể nằm thay thế các mô cơ quan bị mất hoặc tổn thương Một ví dụ tiêu biểu trong lĩnh vực này đó là công nghệ tái tạo mô sụn Mô sụn khớp khi trưởng thành không có khả năng tự sửa chữa một cách hiệu quả khi bị tổn thương hoặc bị lão hóa Việc sử dụng các tế bào gốc mô mỡ đã được kích hoạt biệt hóa sụn nhằm thay thế các mô sụn đã mất cho các bệnh nhân thoái hóa sụn khớp đang được ứng dụng rộng rãi ở các bệnh viện và đã gặt hái được các thành công nhất định Bên cạnh việc ứng dụng điều trị bệnh về sụn khớp, công nghệ tái tạo mô sụn còn

mở ra một hướng đi mới đầy hứa hẹn cho lĩnh vực phẫu thuật thẩm mỹ như nâng mũi và

2

tái tạo khuôn mặt [7] Với đặc điểm sống mũi không cao và chóp mũi tẹt ở hầu hết các

phụ nữ châu Á, nhu cầu chỉnh sửa nâng mũi ngày càng lớn kéo theo các công nghệ phẫu

thuật ngày cang phát triên Cho đến nay có ba phương pháp nâng mũi được sử dụng phổ

biến là nâng mũi bằng silicon, chất làm dầy và sụn Trong đó, phương pháp nâng mũi

bằng sụn được ưa chuộng nhất do sỡ hữu các ưu điểm nổi bật so với hai phương pháp còn

lại như ít biến chứng, khối sụn sẽ dần đồng nhất với cơ thể và tồn tại vĩnh viễn mà không

cần tái phẫu thuật Nâng mũi bằng sụn là phương pháp đặt thêm một miếng sụn dưới da,

dọc theo sống mũi để kéo dài, làm thẳng hoặc tạo hình thẩm mỹ phù hợp cho chiếc mũi

Miếng sụn có thể là sụn nhân tạo hay sụn tự thân Trong đó, sụn tự thân được thu nhận

thông thương từ sụn sườn, sụn vành hoặc sụn vách ngăn của chính người cần phẫu thuật

Hiện nay, các bác sĩ phẫu thuật đã phát triển thêm bước bọc một miếng sụn ở chóp mũi

Miếng sụn nhỏ này được lấy từ sụn vành tai với đường mổ khoảng 1 – 2 cm Việc này

giúp cho sống mũi nhân tạo không bị tụ, đầu mũi không bị biến chứng Tuy nhiên,

phương pháp nâng mũi bằng sụn hiện nay đòi hỏi phải phẫu thuật lấy sụn từ nhiều vị trí

trên cơ thể nhưng vẫn không đảm bảo được lượng sụn cần thiết để nâng sống mũi Việc

sử dụng sụn nhân tạo là các giá thể 3D rỗng có cấu trúc tương tự sụn có thể gây biến

chứng và cần tái phẫu thuật sau một thời gian nhất định Vì vậy, công nghệ tạo mô sụn từ

tế bào gốc mô mỡ của chính bệnh nhân là giải pháp đầy triển vọng cho vấn đề này

Để có thể thu nhận mô sụn với kích thước mong muốn tạo thẩm mỹ cho sống mũi, quá

trình biệt hóa sụn cần được diễn ra trên một giá thể phù hợp Một giá thể lý tưởng trong

tái tạo mô phải bao gồm ít nhất ba đặc điểm: tạo điều kiện thuận lợi cho các tế bào bám

dính và phát triển, dễ dàng được gia công thành cách hình dạng cụ thể và có đủ độ bền để

duy trì hình dạng đó Giá thể polylactic acid (PLA) được xem là một trong các giá thể

được ứng dụng thành công nhất trong công nghệ tái tạo mô sụn do mô sụn được biệt hóa

trên giá thể PLA có cấu trúc tương tự như mô sụn tự nhiên PLA với cấu trúc phân tử

(C3H4O2)n là một polyester nhiệt dẻo có khả năng phân hủy sinh học Ngày nay, các thiết

bị hiện đại giúp gia công các sợi PLA thành các giá thể có hình dạng chính xác với sống

mũi người từ đó miếng sụn được tạo ra đạt kích thước lý tưởng cho phẫu thuật nâng mũi

3

Với các ưu điểm của giá thể PLA, nhiều công trình nghiên cứu đã thực hiện quá trình biệt hóa tế bào gốc mô mỡ trên giá thể này và khảo sát sự biệt hóa hình thành nên mô sụn Tuy nhiên, phương pháp biệt hóa tế bào gốc mô mỡ ngay trên giá thể PLA không kiểm soát được tỷ lệ biệt hóa sụn cũng như không đảm bảo được chất lượng miếng mô sụn được tạo ra Trong đề tài này sẽ đưa ra một hướng giải quyết đó là sử dụng nguyên bào sụn, một giai đoạn trung gian trong quá trình biệt hóa sụn và có tỷ lệ hình thành sụn cao hơn, để nuôi cấy biệt hóa trên giá thể PLA Điều này đỏi hỏi phải xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn và khảo sát sự tăng trưởng biệt hóa của nguyên bào sụn này trên giá thể PLA Kết quả của đề tài được ứng dụng trong việc tối ưu khả năng biệt hóa sụn từ tế bào gốc mô mỡ có sử dụng giá thể PLA, từ đó đảm bảo chất lượng của miếng sụn trong phẫu thuật thẩm mỹ nâng mũi hoặc tái tạo khuôn mặt Bên cạnh đó, phương pháp sử dụng nguyên bào sụn để biệt hóa thành tế bào sụn với hiệu suất biệt hóa cao hơn

sẽ mở ra một hướng đi mới trong việc điều trị các bệnh về sụn khớp

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước:

Cho đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều các đề tài nghiên cứu thức hiện quá trình biệt

hóa sụn từ tế bào gốc trung mô hay tế bào gốc mô mỡ in vitro và cả in vivo Một số đề tài

còn khảo sát sự biệt hóa sụn của tế bào gốc mô mỡ trên các loại giá thế có thành phần khác nhau Tuy nhiên, đối với giai đoạn nguyên bào sụn thì chưa có một đề tài nghiên cứu nào xác dịnh thời gian biệt hóa thành nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ cũng như các marker bề mặt đặc trưng cho giai đoạn này Do đó, việc khảo sát sự biệt hóa của nguyên bào sụn trên giá thể cũng chưa được nghiên cứu

Gần đây, việc trị bệnh thoái hóa khớp bằng tế bào gốc mô mỡ tự thân đã được ứng dụng

ở các bệnh viện lớn trong nước ta Trong năm 2012, bệnh viện Đại học Y dược đã áp dụng cho hơn 20 trường hợp, tất cả điều cho kết quả tốt, bệnh nhân phục hồi chức năng khớp gối đạt 80-90% so với bình thường Nhiều bệnh viện lớn trong nước đã sử dụng kỹ thuật phân tách tế bào gốc mô mỡ tự thân mà đã được nghiên cứu, thực hiện tại nhiều nước trên thế giới trong việc điều trị thoái hóa khớp gối Hiện nay, nước ta cũng có những nghiên cứu lâm sàng điều trị thoái hóa khớp gối bằng cách sử dụng tế bào gốc mỡ

4

tự thân Điều này cho thấy ứng dụng quá trình biệt hóa sụn từ tế bào gốc mô mỡ ngày trong trị liệu ở nước ta càng phổ biến và được quan tâm nghiên cứu Đối với phẫu thuật thẩm mỹ đặc biệt là trong phẫu thuật nâng mũi, nước ta đã áp dụng thành công các công nghệ và phương pháp tiên tiến chuyển giao từ nước ngoài và thu được lợi nhuận to lớn Tuy nhiên các phương pháp phẫu thuật nâng mũi hiện vẫn còn những hạn chế nhất định Nội dung đề tài này phần nào đưa ra một hướng đi mới, một phương pháp mới hoàn thiện hơn trong phẫu thuật thẩm mỹ nâng mũi nói riêng và công nghệ tái tạo mô sụn nói chung

2 Mục tiêu của đề tài

Đề tài bao gồm hai mục tiêu chính:

- Xác định giai đoạn nguyên bào sụn trong quá trình biệt hóa sụn từ tế bào gốc mô mỡ

- Khảo sát sự tăng trưởng của nguyên bào sụn trên giá thể PLA

3 Đối tƣợng nghiên cứu

Nghiên cứu này tiến hành trên đối tượng là mẫu mô mỡ bụng của người trưởng thành

4 Nội dung nghiên cứu

4.1 Xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ

Trong quá trình biệt hóa từ tế bào gốc trung mô thành tế bào sụn trải qua các giai đọan

cơ bản như: (1) Tế bào gốc trung mô; (2) tế bào tiền sụn; (3) Nguyên bào sụn; (4) tế bào sụn chưa trương phồng; (5) tế bào sụn trương phồng Ở mỗi giai đoạn biệt hóa đều được đặc trưng bởi một số gen mõa hóa cho chất nền ngoại bào sụn Do đó, để xác định được giai đoạn hình thành nguyên bào sụn, phương pháp RT-PCR là công cụ đắc lực để phát hiện sự bắt đầu biểu hiện của các gen đặc trưng cho từng giai đoạn Khi tế bào đi vào giai

đoạn nguyên bào sụn sẽ kích hoạt biểu hiện các gen Collagen IIa1 (Col2a1), aggrecan (Acan) và COMP (Cartilage oligomeric matrix protein) Khi tế bào bước sang giai đoạn

tế bào bào sẽ bắt đầu kích hoạt biểu hiện gen Collagen Xa1 (Col10a1) [6] Như vậy có

thể sử dụng thông tin này để xác định khoảng thời gian nguyên bào sụn hình thành bằng cách thu hẹp dần dần các mốc thời gian kiểm tra sự biển hiện các gen đặc trưng trên

5

đồng thời kết hợp với khảo sát hiệu suất biệt hóa bằng phương pháp nhuộm đặc trưng chất nền tế bào sụn (Toluidine Blue)

Giai đoạn

biệt hóa

Các marker chất nền

Các marker điều hòa

Hình dạng

tế bào

Các nhân tố tăng trường và biệt hóa

Tế bào trung mô

tạo sụn Col1a1 Sox9, Runx2 Shh, TGF-β

Tiền nguyên bào sụn Col2a1, Acan,

Crtl

Sox9, Sox5, Sox6

TGF-β, Wnt-3A, Wnt7A

FGF-2,4,8,10 BMP-2,4,7

Nguyên bào sụn

Col2a1, Acan, Crtl1, Comp, Crtm

Sox9, Sox5, Sox6

IGF-1 FGF-2/FGFR2 BMP-2,4,7,14

Tiền tế bào sụn

Col2a1, Acan,Crtl1, Comp, Crtm

BMP-2,7

Tế bào sụn Col10a1 Runx2, Runx3

VEGF FGF-2, FGF-R1 Wnt14/β-catenin

Các giai đoạn của quá trình biệt hóa sụn và các gen biểu hiện đặc trưng [6]

4.1.1 Biệt hóa nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ bằng nuôi cấy vón cục

Không giống với quá trình biệt hóa mỡ và biệt hóa xương, các yếu tố vật lý của vi môi trường tạo sụn đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành sụn Theo một số công trình nghiên cứu, các tương tác không gian ba chiều, sự tiếp xúc bề mặt của các tế bào gốc trung mô là điều cần thiết cho sự biệt hóa sụn Khi các tế bào gốc dược nuôi cấy theo phương pháp tếbào đơn sẽ không có kết quả biệt hóa thành sụn cho dù được nuôi trong môi trường có bổ sung nhân tố biệt hóa sụn Chỉ khi được biệt hóa trong vi môi trường ba chiều phù hợp, các tế bào sẽ biểu hiện proteoglycan, collagen isoform và chất nền sụn hình thành [1] Vì thế, các phương pháp

nuôi cấy phổ biến được sử dụng trong quá trình biệt hóa sụn in vitro nhằm thiết lập môi

trường giúp các tế bào gốc có thể tương tác với nhau như: nuôi cấy micromass,

6

nuôi cấy trong gel alginate và nuôi cấy vón cục Nuôi cấy vón cục là phương pháp được

sử dụng trong đề tài này

Sau khi thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ từ tế bào mỡ, các tế bào ADSC được nuôi cấy vón cục để biệt hóa thành nguyên bào sụn Ở các mốc thời gian sau khi bắt đầu

kích hoạt biệt hóa 1, 2, 3 và 4 tuần sẽ thực hiện RT-PCR cho các gen Aggrecan, COMP, Col2a1, Col10a1 và nhuộm Toluidine blue để xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn

4.1.1 Biệt hóa nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ bằng nuôi cấy tế bào đơn

Phương pháp nuôi cấy vón cục có một hạn chế đó là các tế bào biệt hóa không đồng đều

do các tế bào bên ngoài tiếp xúc với môi trường biệt hóa nhiều hơn là các tế bào nằm bên trong lõi của cục vón Một số nghiên cứu đã công bố, khi các tế bào gốc mô mỡ được kích hoạt biệt hóa trong điều kiện nuôi cấy tế bào đơn, những tế bào này vẫn diễn ra quá trình biệt hóa sụn cho dù không có sự tương tác giữa tế bào với tế bào Điều này cho thấy mặc dù điều kiện vi môi trường 3D giúp các tế bào tương tác với nhau thúc đẩy sự biệt hóa sụn hơn nuôi cấy tế bào đơn nhưng điều kiện này không phải là bắt buộc của quá trỉnh biệt hóa sụn từ tế bào gốc mô mỡ Vì thế cần thử nghiệm song song hai phương pháp biệt hóa sụn là nuôi cấy vón cục và nuôi cấy bám dính để có thể lựa chọn nguyên bào sụn được tạo ra từ phương pháp nào là tốt nhất [9]

Sau khi thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ từ tế bào mỡ, các tế bào ADSC được nuôi cấy tế bào đơn biệt hóa thành nguyên bào sụn Ở các mốc thời gian sau khi bắt đầu

kích hoạt biệt hóa 1, 2, 3 và 4 tuần sẽ thực hiện RT-PCR cho các gen Aggrecan, COMP, Col2a1, Col10a1 và nhuộm Toluidine blue để xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn

4.2 Tiếp tục biệt hóa sụn từ nguyên bào sụn trên giá thể PLA

Nguyên bào sụn được đưa lên giá thể PLA và tiếp tục được nuôi cấy trong môi trường biệt hóa sụn trong vòng 2 tuần Sau đó sẽ tiến hành các thử nghiệm RT-PCR cho gen

Col2a1 và Col10a1, nhuộm tế bào bằng Toluidine Blue, chụp SEM (Scanning electron

microscope) và flow cytometry cho marker CD10/14/26/151 để xác định tế bào sụn đã được hình thành [5]

7

4.3 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

5 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

- Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ

- Nuôi cấy bám dính, nuôi cấy vón cục

- Biệt hóa sụn trên giá thể 3D

- Nhuộm Toluidine, RT-PCR, chụp SEM, flow cytometry

5.1 Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ [1]

Môi trường tách chiết:

• HBSS

• Betadine iodine

• Collagenase type I

• PBS

Tế bào gốc mô mỡ ADSC

Xác định giai đoạn nguyên bào sụn

Khảo sát sự tăng trưởng nguyên bào sụn trên giá thể PLA

Nuôi cấy vón cục Nuôi cấy bám dính

Cấy nguyên bào sụn lên giá thể PLA

RT-PCR Nhuộm Toluidine Blue

RT-PCR Nhuộm Toluidine Blue Chụp SEM

Flow cytometry

8

Môi trường nuôi cấy và cấy chuyển:

• DMEM

• 10% FBS

• 1% Penicillin 100 U/mL + Streptomycin 100 µg/mL

• Trypsin/EDTA

• Gentamycin

• PBSA

• IMDM

Cách thực hiện:

• Mô mỡ được cắt nhỏ và rửa bằng HBSS, betadine

• Bổ sung collagenase, đặt trong bể ổn nhiệt 37o

C trong 60p

• Ly tâm thu cặn Huyền phù tế bào bằng PBS rồi tiếp tục ly tâm

• Huyền phù cằn với môi trường nuôi cấy Ủ ở 37o

C, 5% CO2

• Thay môi trường 2 lần 1 tuần

• Khi tế bào phát triển 70 – 80% diện tích bình nuôi thì cấy chuyển

5.2 Phương pháp nuôi cấy vón cục [2]

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp ly tâm với tốc độ hợp lý sẽ làm các tế bào tụ lại với

nhau nhằm tạo điệu kiện môi trường tương tác giữa tế bào với tề bào Sự tương tác này tương tự như cấu trúc mô sụn tự nhiên, giúp thúc đẩy sự biệt hóa sụn của tế bào gốc

Môi trường biệt hóa sụn:

 DMEM HG (Dulbecco‟s Modified Eagles Medium – High glucose)

 Dexamethasone 100 nM

 Penicillin/Streptomycin (100 μg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin)

 ITS + (bovine insulin, transferrin, selenous acid, linoleic acid, BSA)

 L-Ascorbic acid 2-phosphate 50mg/mL

 FBS 10% + TGF-β1 10 ng/ml