Khảo sát tình hình nhiễm nấm mốc aspergillus ở một số nguồn dược liệu làm thực phẩm chức năng

Ý nghĩa khoa học đề tài góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về tình hình nhiễm nấm trên một số loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược.. Tình hình sử dụng dược liệu làm thực phẩm chứ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự quan tâm, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi từ các thầy

cô, gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo, người ñã tận tình dìu dắt, dạy bảo và tạo mọi ñiều kiện tốt nhất ñể tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin cảm ơn sự nhiệt tình chỉ bảo, giúp ñỡ của các anh chị, các bạn Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã dành cho tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài

Tôi xin cảm ơn sự quan tâm, giúp ñỡ của các lãnh ñạo, các anh chị và các bạn Trạm kiểm ñịnh chất lượng Nông lâm sản và thủy sản Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi và giúp ñỡ tôi thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến gia ñình cùng toàn thể bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Lê Thị Ngọc Thúy

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

1 MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu nghiên cứu 2

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng và một số loại thực phẩm chức năng chứa thành phần dược liệu 3

2.1.1 Khái niệm thực phẩm chức năng 3

2.2.2 Tình hình sử dụng dược liệu làm thực phẩm chức năng tại Việt Nam 3

2.2 Tình hình nhiễm nấm mốc trên dược liệu 7

2.2.1 Nguyên nhân 7

2.2.2 Thực trạng 8

2.2.3 Tác hại 10

2.3 Phát hiện và ñịnh danh nấm mốc Aspergillus 11

2.3.1 Một số ñặc ñiểm của nấm mốc Aspergillus 11

2.3.2 ðịnh danh nấm mốc Aspergillus spp 15

2.4 Phương pháp thu thập và lấy mẫu chuẩn 20

2.4.1 Quy ñịnh chung 20

2.4.2 Kỹ thuật lấy mẫu 21

3 VẬT LIỆU Ờ NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Vật liệu nghiên cứu 23

3.2 Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu 23

3.3 Nội dung nghiên cứu 23

3.4 Phương pháp nghiên cứu 24

3.4.1 Thu thập mẫu dược liệu 24

3.4.2 Xác ựịnh ựộ ẩm trong mẫu dược liệu 27

3.4.3 Phát hiện nấm mốc bằng phương pháp thường quy (52 TCN-TQTP 0001:2003 và 52 TCN-TQTP 0009:2004) 28

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Thu thập mẫu 37

4.1.1 Thu thập mẫu dược liệu 37

4.1.2 Xác ựịnh ựộ ẩm của dược liệu 40

4.1.3 Thu thập mẫu thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược 42

4.2 đánh giá nhiễm nấm mốc Aspergillus spp ở các mẫu dược liệu bằng phương pháp thường quy 48

4.3 đánh giá nhiễm nấm mốc Aspergillus spp ở các mẫu sản phẩm thực phẩm chức năng bằng phương pháp thường quy 60

5 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 75

5.1 Kết luận 75

5.2 đề nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 APA : Aflatoxin production agar

2 A.flavus Aspergillus flavus

3 A.niger Aspergillus niger

4 A.fumigatus Aspergillus fumigates

5 A.parasiticus Aspergillus parasiticus

6 A.versicolor Aspergillus versicolor

7 CYA : Czapek yeast extract

8 DNA : Deoxyribose nucleic acid

9 ELISA : Enzyme – Link Immuno Sorbent Assay

(Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme)

10 GACP-WHO : World Health organization guidelines on Good

Agricultural and Collection Practices for medicinal plants

(Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc)

11 MEA : Malt extract agar

12 PCR : Polymerase Chain Reaction

13 PDA : Potato dextro agar

14 PE : Polyetylen

15 RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA

16 RELP : Restriction Fragmen Length Polymorphism

17 TCN : Tiêu chuẩn ngành

18 TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

19 TPCN : Thực phẩm chức năng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các loại thực phẩm chức năng phổ biến……… 5

Bảng 2.2: Các loài nấm Aspergillus sinh ñộc tố……… 15

Bảng 3.1: Thành phần Thạch Sabouraud……… 29

Bảng 3.2: Thành phần thạch Czapek……… 30

Bảng 3.3: Thành phần dung dịch Lactofenol Amann……… 30

Bảng 3.4: ðặc ñiểm hình thái các loài nấm Aspergillus……… 34

Bảng 4.1: Danh sách, ñịa ñiểm lấy mẫu nguyên liệu……… 37

Bảng 4.2: ðộ ẩm của mẫu dược liệu……… 41

Bảng 4.3: Mẫu thực phẩm chức năng thu thập ñược……… 42

Bảng 4.4: ðặc ñiểm hình thái Aspergillus spp trên mồi trường Sabouraud (sau 5 ngày nuôi cấy) 49

Bảng 4.5: Kết quả phân lập nấm mốc Aspergillus trên mẫu dược liệu… 53

Bảng 4.6: Hình thái khuẩn lạc nấm mốc Aspergillus của các mẫu dược liệu Phân lập ñược từ các mẫu dược liệu trên môi trường Czapek (sau 5 ngày nuôi cấy) 56

Bảng 4.7: Tổng hợp kết quả các loài nấm mốc Aspergillus bị nhiễm trên dược liệu……… 59

Bảng 4.8 ðặc ñiểm hình thái Aspergillus spp trên mồi trường Sabouraud (sau 5 ngày nuôi cấy) 61

Bảng 4.9 ðặc ñiểm hình thái của Aspergillus spp Phân lập ñược từ các mẫu thực phẩm chức năng trên môi trường Czapek (sau 5 ngày nuôi cấy) 66

Bảng 4.10: Tổng hợp kết quả các loài nấm mốc Aspergillus bị nhiễm trên mẫu thực phẩm chức năng……… 72

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 : Cấu tạo sợi nấm……… 13

Hình 4.1: Giảo cổ lam……… 38

Hình 4.2: Diệp hạ châu……… 39

Hình 4.3: Hoa hòe……… 39

Hình 4.4: Mẫu Atiso……… 39

Hình 4.5: Mẫu cúc hoa……… 40

Hình 4.6: Thực phẩm chức năng dạng siro……… 46

Hình 4.7: Thực phẩm chức năng dạng viên nén……… 46

Hình 4.8: Thực phẩm chức năng dạng viên sủi……… 46

Hình 4.9: Thực phẩm chức năng dạng viên nang mềm………… 47

Hình 4.10: Thực phẩm chức năng dạng viên nang cứng………… 47

Hình 4.11: Thực phẩm chức năng dạng trà túi lọc……… 47

Hình 4.12: Thực phẩm chức năng dạng nước giải khát………… 48

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và ña dạng Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện ñã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo Trong ñó có nhiều loài làm thuốc Tổng sản lượng dược liệu ở Việt Nam hàng năm ước tính khoảng từ 3-5 nghìn tấn Một số dược liệu quý ñã ñược thế giới công nhận và có tiềm năng phát triển rất lớn như: hồi, trinh nữ hoàng cung, atiso, sâm Ngọc Linh, tràm, hoa hòe

Ngày nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao ñể làm thực phẩm chức năng là một xu thế ñược rất nhiều các nhà khoa học quan tâm Việt Nam là một trong những quốc gia thuộc các vùng nhiệt ñới – nơi chứa ñựng giá trị ña dạng sinh học cao chưa ñược khám phá Bên cạnh ñó, cộng ñồng các dân tộc ở nước ta cũng có vốn tri thức bản ñịa sử dụng các loài ñộng vật, thực vật và khoáng vật làm thuốc Hai lĩnh vực này ñược các nhà khoa học coi là một tiềm năng, trong việc tìm kiếm nghiên cứu tạo ra những loại thực phẩm chức năng mới,

có hiệu lực hỗ trợ ñiều trị cao các bệnh mãn tính, tăng cường sức khoẻ …trong tương lai

Tuy nhiên, hiện nay nguồn dược liệu làm thực phẩm chức năng vẫn chưa ñược kiểm soát chặt chẽ Nhiều loại nguyên liệu ẩn chứa nhiều nguy cơ gây hại ñối với sức khoẻ như chứa ñộc tố, chứa chất kích thích hay nhiễm nấm men nấm mốc

mà không ñược theo dõi trước khi chế biến thực phẩm chức năng bán ra thị trường Nếu như trong quá trình chế biến không tiêu diệt ñược nấm men, nấm mốc thì tác hại của chúng ñối với sức khoẻ là rất lớn

Từ những ñánh giá trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Khảo sát

tình hình nhiễm nấm mốc Aspergillus spp ở một số nguồn dược liệu làm thực phẩm chức năng"

1.2 Mục ựắch và yêu cầu nghiên cứu

- Phân lập các loài nấm mốc Aspergillus spp nhiễm trên các nguồn mẫu và

sản phẩm thực phẩm chức năng

- đánh giá mức ựộ nhiễm nấm mốc ở các dạng nguồn dược liệu khác nhau

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

đề tài góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về tình hình nhiễm nấm trên một số loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược đây là nguồn tài liệu có giá trị tham khảo tốt về hiệu quả sử dụng phương pháp thường qui theo TCVN hiện hành cũng như là cơ sở cho việc ựề xuất phát triển các phương pháp chẩn ựoán mới, nhanh và chắnh xác, bổ sung vào các phương pháp qui chuẩn hiện hành

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Dữ liệu cung cấp bởi nghiên cứu sẽ giúp các nhà quản lý ựưa ra các biện pháp quản lý phù hợp về vệ sinh an toàn dược liệu đồng thời kết quả nghiên cứu cũng góp phần nâng cao nhận thức của cộng ựồng về chất lượng và an toàn thực phẩm ựặc biệt ựối với các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu từ ựó có lựa chọn phù hợp ựối với các sản phẩm thực phẩm chức năng này

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng và một số loại thực phẩm chức năng chứa thành phần dược liệu

2.1.1 Khái niệm thực phẩm chức năng

Thực phẩm chức năng (Functional foods) ñược người Nhật sử dụng ñầu

tiên trong những năm 1980 ñể chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khoẻ cho người sử

dụng Theo Viện Khoa học và ðời sống quốc tế (International Life Science Institute

- ILSI) thì "thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi cho một hay nhiều hoạt ñộng

của cơ thể như cải thiện tình trạng sức khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là

so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại" Theo IFIC, thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần của chế ñộ ăn có thể ñem lại lợi ích cho sức khoẻ

nhiều hơn giá trị dinh dưỡng cơ bản

Bộ Y tế Việt Nam ñịnh nghĩa thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng ñể hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho

cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức ñề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh Tuỳ theo công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn

có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, sản phẩm dinh dưỡng y học.[5]

2.2.2 Tình hình sử dụng dược liệu làm thực phẩm chức năng tại Việt Nam

Với xu hướng “Trở về thiên nhiên”, nhu cầu sử dụng dược liệu trong sản xuất thuốc cũng như các ñồ uống mang tính chất của thực phẩm chức năng ngày càng tăng, nhất là ở các quốc gia ñang phát triển Con người bắt ñầu sử dụng nhiều các loại thuốc chữa bệnh và bồi dưỡng sức khỏe có nguồn gốc từ thảo dược hơn là

sử dụng thuốc tân dược vì nó ít ñộc hại hơn và ít tác dụng phụ hơn, phù hợp hơn với sinh lý con người Hơn nữa hiện còn nhiều triệu chứng và bệnh hiểm nghèo chưa có thuốc ñặc hiệu ñể chữa trị, người ta hi vọng rằng từ nguồn thực vật tự nhiên hoặc từ

vốn trí tuệ bản ñịa của các cộng ñồng, qua nghiên cứu sàng lọc có thể cung cấp cho nhân loại những hợp chất có hoạt tính sinh học cao ñể làm ra các loại thuốc mới có hiệu quả chữa bệnh như mong muốn Nghiên cứu sàng lọc cây thuốc hiện cũng ñược chú trọng ở nhiều quốc gia, nhiều lĩnh vực như dược liệu, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm

Theo Cục Quản lý y dược cổ truyền - Bộ Y tế, Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú và ña dạng với khoảng 4.000 loài thực vật ñược dùng làm thuốc Hằng năm, Việt Nam khai thác và sử dụng 50.000 - 70.000 tấn dược liệu, trong ñó gần 90% có nguồn gốc nhập khẩu Nguồn dược liệu nhập khẩu chủ yếu từ Trung Quốc, trong ñó nhập khẩu qua ñường tiểu ngạch chiếm tỷ trọng lớn [24]

Hiện nay, các Viện nghiên cứu và Công ty dược trong cả nước ñã ñầu tư nghiên cứu nhiều sản phẩm là thực phẩm chức năng và thuốc từ dược liệu, cụ thể

như: nghiên cứu thuốc Eupolin chữa bỏng từ cây Cỏ lào (Eupatorium odoratum)

của Viện Bỏng quốc gia Lê Hữu Trác; nghiên cứu ñiều chế thuốc tiêm rotundin

sulfat từ củ Bình vôi (Stephania spp.) của Học viện Quân y; sản xuất viên nang ñiều trị phì ñại lành tính tuyến tiền liệt từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) của

Công ty Dược liệu TW II; sản xuất Embin làm thuốc tẩy sán từ loài Chua ngút

(Embelia scanden) và Ampelop từ Chè dây (Ampelopsis cantonensis) ñiều trị viêm

loét dạ dày – hành tá tràng của Công ty cổ phần Traphaco; sản xuất thuốc tiêm Artesunat làm thuốc sốt rét của Trường ðại học Dược Hà Nội; sản xuất viên nang

Uphamorin từ rễ và thân cây Nhàu (Morinda citrifolia) làm thuốc tăng cường miễn

dịch và sức ñề kháng của Trường ðại học Y Hà Nội; sản xuất thuốc nhỏ mũi

Agerhinin từ cây Ngũ sắc (Ageratum conyzoides) ñiều trị viêm xoang; nghiên cứu thuốc chữa u xơ tuyến tiền liệt từ Náng hoa trắng (Crinum asiaticum), thuốc hỗ trợ ñiều trị ung thư từ nấm Cổ linh chi (Ganoderma applanatum); thuốc ñiều trị thương hàn và lị trực khuẩn Geravina từ Lão quan thảo (Genanium nepalense var thunbergiii); thuốc ñiều trị thiểu năng tuần hoàn não Ligustan từ Xuyên khung (Ligusticum wallichii), ðương quy (Angeliaca sinensis) và Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis); Abivina từ Bồ bồ của Viện Dược liệu; Kim tiền thảo của Công ty OPC [8]

Từ những số liệu trong 10 năm trở lại ñây, thị trường thực phẩm chức năng Việt Nam ñã có sự tăng trưởng ñáng kể cả về chất và lượng Tính ñến nay, số lượng sản phẩm sản xuất trong nước là trên 2300 chiếm khoảng 40% tổng số sản phẩm lưu hành Với năng lực sản xuất ñó, hàng năm nhu cầu về nguyên liệu là khoảng từ 50.000 ñến 70.000 tấn Theo thống kê, hiện nước ta có khoảng 3948 loài thực vật,

408 loài ñộng vật, 75 loại khoáng vật và trên 50 loại tảo có khả năng làm thuốc và hoàn toàn có thể ñáp ứng ñược nhiều hơn cho sản xuất Nghịch lý ở chỗ, trên 80% sản lượng và gần 500 danh mục dược liệu lại là nhập khẩu[6] Nguy hiểm hơn, các nguồn nguyên liệu nhập khẩu cũng chưa phải là nguyên liệu sạch và ñảm bảo cho sản xuất thực phẩm chức năng Kết quả từ một ñợt tổng kiểm tra của Viện Kiểm nghiệm của Bộ Y tế cho thấy, trong số 60 mẫu ñược kiểm tra thì có tới 60% không ñạt tiêu chuẩn Như vậy, về nguyên liệu, chúng ta không những chưa sử dụng ñược ñúng mực tiềm năng nguồn thảo dược của Việt Nam mà còn khó ñảm bảo ñược chất lượng nguồn nguyên liệu nhập ñể có sản phẩm chất lượng tốt nhất

Ngoài ra, ñã có hàng nghìn sản phẩm là thực phẩm chức năng ñược nghiên cứu và sản xuất ñáp ứng nhu cầu thị trường có nguồn gốc dược liệu dưới dạng chè nhúng, chè tan, viên nang, cao siro, nước giải khát, nước tăng lực như trong bảng tóm tắt dưới ñây:

Bảng 2.1 Các loại thực phẩm chức năng phổ biến Sản phẩm Thành phần dược liệu ðơn vị sản xuất Dạng sử dụng

Công ty TNHH MTV trà Tâm Lan Trà túi lọc

Trà túi lọc

cây xạ ñen Xạ ñen Cơ sở Thịnh Thiên Trà túi lọc

Trà Ruton Rau dấp cá, nụ hòe Công ty Cổ phần

dược phẩm OPC Trà túi lọc

Trà Thiên

Phúc

Kim Ngân Hoa, Cây Lược vàng, Cây Hoàn Ngọc, Cúc hoa, Cam

Doanh nghiệp Trà Hoàn Ngọc Trà túi lọc

Trà artiso Artiso, cúc hoa Công ty Cổ phần

dược phẩm OPC Trà túi lọc

Trà Giảo

cổ lam Giảo cổ lam

Trung tâm ứng dụng Tiến bộ khoa học &

Công ty Cổ phần dược phẩm OPC Cốm hòa tan

Gibefido

Hoàng kỳ, bạch truật, gừng, cam thảo, ựại

táo

Công ty cổ phần dược phẩm ựông dược 5 Ờ Fidopharm

Bột hòa tan

Trinh Nữ

Hoàng Cung

- OP.Crilati

Trinh nữ hoàng cung Công ty Cổ phần

dược phẩm OPC Viên nang

OPTribeca

p Bạch tật lê

Công ty Cổ phần dược phẩm OPC Viên nang

Hoạt Mạch

Kiện Não

Hoàng kỳ, đương quy, Xắch thược, đơn sâm, đào nhân, Hồng hoa, địa long, Bạch quả, Xuyên khung, Quế chi, Ngưu tất

Công ty cổ phần dược phẩm ựông dược 5 Ờ Fidopharm

Hạ khô thảo, Cam thảo, Hoàng cầm, Cúc hoa, Bồ công anh, Xuyên tâm liên

Công ty cổ phần dược phẩm ựông dược 5 Ờ Fidopharm

khớp bì chân chim, Quế chi,

ðộc hoạt, Phòng kỷ, Tần giao, Uy linh tiên, Tang ký sinh, Câu ñằng

Fidopharm

Calidah

Nấm Linh chi, Câu kỷ

tử, ðương quy, ðan

sâm

Công ty cổ phần dược phẩm ñông dược 5 – Fidopharm

Viên nang

Sáng mắt

Fido

Bạch cúc hoa, Phục linh, Thục ñịa, Câu kỷ

tử, Sơn dược, Trạch

tả, ðan bì

Công ty cổ phần dược phẩm ñông dược 5 – Fidopharm

Viên nang

Vietbone

ðỗ trọng, Mộc qua, Ngưu tất, ðương quy, Hoàng kỳ, Quế chi, Bạch thược, Thục ñịa, Bạch truật, Cẩu tích

Công ty cổ phần dược phẩm ñông dược 5 – Fidopharm

“Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc” theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), nên chưa kiểm soát ñược nguồn gốc cũng như chất lượng dược liệu [7]

Mặt khác, Việt Nam với khí hậu nóng, ẩm và mưa nhiều làm cho hàm lượng nước trong không khí cao, cộng với dược liệu phần lớn có nguồn gốc thực vật (lá, thân, rễ, hoa, quả, hạt), rất dễ hút ẩm và là thành phần dinh dưỡng thích hợp cho vi khuẩn, nấm mốc, côn trùng phát triển

Thêm vào ñó, các hình thức và phương pháp bảo quản không hợp lý làm cho các loại dược liệu dễ bị mốc, mọt, giảm chất lượng Hầu hết dược liệu ñược bảo quản ở các kho trong khu vực sinh hoạt của các gia ñình, thậm chí nhiều cơ sở

không có kho riêng, dược liệu ñược bảo quản cùng với các sản phẩm khác như thức

ăn gia súc, công cụ nông nghiệp, không có các thiết bị hỗ trợ như quạt thông gió, hệ thống giá ñể dược liệu, hình thức bảo quản chất ñống, phủ bạt là phổ biến ở các cơ

sở sản xuất, chế biến

2.2.2 Thực trạng

2.2.2.1 Tình hình nhiễm nấm mốc trên dược liệu trên thế giới

Theo nghiên cứu của Aziz và cs (1998)[14], hầu hết mẫu dược liệu khảo sát

tại thành phố Cairo, Hy Lạp nhập khẩu từ Ấn ðộ bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus, A.niger, Fusarium oxyporum và Penicillium viridicatum với

ñộc tố sản sinh ra chủ yếu là aflatoxin B1 và ochratoxin A Nhóm nghiên cứu ñã thu thập 84 mẫu của 14 loài cây thuốc, gia vị và tiến hành phân lập các chủng nấm dựa

vào ñặc ñiểm hình thái sử dụng các môi trường nuôi cấy như Aspergillus flavus và parasiticus agar (AFPA), aflatoxin production agar (APA), phân tích ñộc tố

mycotoxin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Cũng bằng phương pháp phân tích hình thái khuẩn lạc trên môi trường potato dextro agar (PDA), malt extract agar (MEA), Czapek yeast extract (CYA)…, Tournas và cs., 2006 [21]ñã tiến hành kiểm tra sự nhiễm nấm trong 46 mẫu nhân sâm có nguồn gốc từ Siberia, Trung Quốc và Mỹ ñược thu thập tại Philadenphia,

Mỹ Kết quả cho thấy 100% mẫu nhân sâm từ Siberia, 78% mẫu nhân sâm từ Trung

Quốc nhiễm nấm Các loại nấm nhiễm phổ biến là Alternaria alternata, Aspergillus niger, Aspergillus spp., Cladosporium spp., E chevalieri, Penicillium spp and Rhizopus spp., Penicillium spp., Eurotium rubrum, E chevalieri và Rhizopus spp

Kết quả nghiên cứu trên 152 mẫu dược liệu và hương liệu khô của nhóm

nghiên cứu Rizzo và cs (2004)[20]cho thấy 52% mẫu bị nhiễm nấm Aspergillus, 27% mẫu nhiễm nấm Flavi, 25 % mẫu nhiễm nấm Circumdati và 16% mẫu nhiễm nấm Fusarium Môi trường nuôi cấy ñể phân lập các chủng nấm mốc ñược nhóm

nghiên cứu sử dụng là Dichloran Rose Bengal Chloranphenicol Agar (DRBCA) và PDA

Bugno và cs (2006)[16] thu thập 91 mẫu dược liệu sử dụng phổ biến tại Saox Paulo, Brazil ñể kiểm tra tình hình nhiễm nấm trên các mẫu dược liệu này, sử dụng phương pháp ñịnh danh nấm qua phân tích hình thái sử dụng môi trường Sabouraud agar, PDA, Coconut agar medium Kết quả của nhóm nghiên cứu ñã chỉ

ra có ñến 90.1% mẫu dược liệu bị nhiễm nấm Asperigus và 39.6% mẫu nhiễm nấm Penicillium, trong ñó Aspergillus flavus, Aspergillus niger và Penicillium citrinum

là các loài nhiễm phổ biến trên các mẫu dược liệu nghiên cứu, theo sau là

Aspergillus ochraceus, Penicillium chrysogenum và Aspergillus parasiticus

Theo nghiên cứu của Pathanadech và Petcharat (2005)[18] thu thập ñược 50 mẫu dược liệu phơi khô ñược lấy từ các cửa hàng thuốc thuộc tỉnh Songkhla – Thái

Lan ñể nghiên cứu các loài Aspergillus sinh ñộc tố Aflatoxin B1 Trong 50 mẫu nghiên cứu có 9 mẫu không phát hiện ñược Aspergillus Nhóm nghiên cứu ñã phát hiện ñược 25 chủng Aspergillus trên 41 mẫu dược liệu trong ñó các loài phổ biến là Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus

Qua việc sử dụng kỹ thuật Elisa ñể phát hiện Aflatoxin kết quả cho thấy việc sản

xuất aflatoxin ñược giới hạn trong 1 loài Aspergillus flavus

2.2.2.2 Tình hình nhiễm nấm mốc trên dược liệu ở trong nước

Theo thống kê, tỷ lệ số dược liệu bị mốc mọt 15-20%, tỷ lệ khối lượng dược liệu bị nấm mốc 12-28% Gần ñây theo một nhóm nghiên cứu công bố tại hội nghị khoa học và ñào tạo chuyên ngành ký sinh trùng toàn quốc, tổ chức tại thành phố

Hồ Chí Minh ngày 29/3/2012 thì nhiều mẫu dược liệu bị nhiễm nấm men, nấm mốc Sau khi lấy 141 mẫu thuộc 7 loại dược liệu phổ biến tại một số cửa hàng dược liệu ở thành phố Hồ Chí Minh, nhóm nghiên cứu ñã phân tích và thu ñược kết quả: 66 mẫu (chiếm 46.81%) vượt quá giới hạn ñộ ẩm cho phép của Dược ñiển Việt Nam Những mẫu có ñộ ẩm cao rơi vào các loại dược liệu dạng quả, củ, vỏ quả (như câu

kỷ tử, trần bì, táo Tàu…) Báo cáo cho biết trên 60% mẫu dược liệu khảo sát có mức ñộ nhiễm nấm mốc, nấm men vượt quá giới hạn cho phép Những dược liệu có

tỉ lệ nhiễm cao là diệp hạ châu (93.3%), hạt sen (65.6%), táo Tàu (53.3%), trần bì

(73.3%), ý dĩ (76.5%)… Có trên 1400 chủng nấm mốc thuộc 43 loài có mặt trong

35 loài dược liệu khảo sát [25]

Theo thống kê, hiện nay nước ta có khoảng 3.948 loài thực vật, 408 loài ñộng vật, 75 loại khoáng vật và trên 50 loại tảo có khả năng làm thuốc và hoàn toàn

có thể ñáp ứng ñược nhiều hơn cho sản xuất Nghịch lý ở chỗ, trên 80% sản lượng

và gần 500 danh mục dược liệu lại là nhập khẩu Nguy hiểm hơn, các nguồn nguyên liệu nhập khẩu cũng chưa phải là nguyên liệu sạch và ñảm bảo cho sản xuất thực phẩm chức năng Kết quả từ một ñợt tổng kiểm tra của Viện Kiểm nghiệm của Bộ

Y Tế cho thấy, trong số 60 mẫu ñược kiểm tra thì có tới 60% không ñạt tiêu chuẩn Như vậy, về nguyên liệu, chúng ta không những chưa sử dụng ñược ñúng mực tiềm năng nguồn thảo dược của Việt Nam mà còn khó ñảm bảo ñược chất lượng nguồn nguyên liệu nhập ñể có các sản phẩm chất lượng tốt nhất

Trong khi ñó, thị trường thực phẩm chức năng ñang có những bước tăng trưởng ngoạn mục cả về số lượng ñơn vị sản xuất, nhập khẩu (từ 13 ñơn vị kinh doanh sản xuất thực phẩm chức năng năm 2000 lên 1.552 cơ sở năm 2012) và số lượng sản phẩm chức năng (từ 63 sản phẩm năm 2000 lên 5.514 sản phẩm năm 2012) nhưng các tiêu chuẩn, quy chuẩn và nhãn mác ñối với dòng thực phẩm này còn chưa ñầy ñủ.[26]

Như vậy có thể thấy, nấm mốc nhiễm trên dược liệu thuộc rất nhiều chi khác

nhau nhưng trong ñó chủ yếu thuộc 3 chi là Aspergillus, Penicillium và Fusarium

Hơn nữa các loài nhiễm trên dược liệu thuộc 3 chi này hầu hết là các loài có khả năng sinh ñộc tố aflatoxin, ochratoxin

2.2.3 Tác hại

Nấm Aspergillus sinh ñộc tố Aflatoxin và Ochratoxin có phổ hoạt ñộng rất

rộng, lây nhiễm trên nhiều loại nông sản ñặc biệt là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, ñậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu ñen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt ñiều, dẻ, cà phê dừa…Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của ñộng vật ñược cho ăn bằng

thức ăn nhiễm aflatoxin ðộc tố aflatoxin sinh ra bởi các loài nấm mốc này là một trong các ñộc tố nguy hiểm nhất, gây ñộc cho người và gia súc Các triệu chứng gây ñộc trên nguời có thể kể ñến như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây ñột biến,thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong Ochratoxin, ñặc biệt là ochratoxinA (OTA) có ñộc tính cao ðây là hợp chất không mùi, kết tinh, hòa tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicabonat, hòa tan hạn chế trong nước ðối với người, OTA gây chứng bệnh suy thận Những trường hợp nhiễm ñộc OTA cấp tính có thể bị tử vong OTA ñược xếp vào nhóm những ñộc chất có khả năng gây ung thư….Nhiễm Aflatoxin gây ra các bệnh trên gia cầm, gia súc, ảnh hưởng ñến sức khỏe, năng suất và chất lượng sản phẩm của chúng.[12]

Aspergillus nhiễm trong các nguyên liệu thảo dược bị nhiễm nấm mốc làm giảm chất lượng dược liệu, các ñộc tố do Aspergillus tiết ra gây ảnh hưởng lớn ñến

sức khỏe con người khi sử dụng

2.3 Phát hiện và ñịnh danh nấm mốc Aspergillus

2.3.1 Một số ñặc ñiểm của nấm mốc Aspergillus

2.3.1.1 ðặc tính chung của nấm mốc Aspergillus

Họ nấm Aspergillus có thể lên ñến 200 loài, trong ñó có khoảng 20 loài gây

hại cho con người

Aspergillus thuộc nhóm vi nấm, không có chất diệp lục vì vậy chúng không

thể tổng hợp ñược các chất dinh dưỡng cho bản thân mà phải lấy từ các chất hữu cơ

có sẵn trong môi trường ñể sinh trưởng và phát triển

Khuẩn ty có vách ngăn, phân nhánh không màu, màu nhạt hoặc trở nâu hay

màu sẫm khác ở các vùng nhất ñịnh của khuẩn lạc Aspergillus hoàn toàn hiếu khí,

chúng phát triển mạnh trong ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới và cận nhiệt ñới Tương tự

như các loài nấm mốc nói chung, Aspergillus chịu ñược ñiều kiện nhiệt ñộ, ñộ acid

và hoạt ñộ nước thấp hơn các loài vi sinh vật khác Về sinh sản, Aspergillus sinh sản

bằng hình thức vô tính ñó là cách sinh sản bằng mẫu sợi - một ñoạn sợi nấm rơi vào

cơ chất sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới Ngoài sinh sản bằng mấu sợi, nấm mốc còn sinh sản bằng bào tử ñính (conidia) ñây là hình thức sinh sản phổ biến ở nấm mốc, khi ñó các sợi khuẩn ty khí sinh hình thành một dạng tế bào ñặc biệt hình chai

và ñầu các tế bào này sinh ra các bào tử còn gọi là bào tử ñính hay bào tử trần, màu sắc của bào tử ñặc trưng cho nấm mốc ở tuổi trưởng thành

Các giống Aspergillus phân bố rất rộng rãi Chúng có thể ñược phân lập từ

ñất, ngô, ñậu phộng, thóc, gạo, ngô, dược liệu

Một số giống Aspegillus ñược sử dụng trong công nghệ lên men (sản xuất

enzyme amylase, protease), acid hữu cơ (acid citri, acid glucomic) Một số loài lại

tạo thành mycotoxin có khả năng gây ung thư (Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus, Aspergillus versicolor…)

2.3.1.2 Cấu tạo sợi nấm và hệ sợi nấm

Sợi nấm là một ống hình trụ dài, có vách ngăn ngang Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài, vừa phân nhánh và tạo thành các vách ngăn Các nhánh lại tiếp tục phân nhánh liên tiếp Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một tế bào nấm mốc trên môi trường nuôi cấy hoặc trong một số cơ chất tự nhiên gọi là hệ sợi nấm, hệ sợi nấm phát triển thành khối có hình dạng nhất ñịnh thường là tròn hoặc gần tròn gọi là khuẩn lạc (Bùi Xuân ðồng, 2004)[4]

Về nguyên tắc cấu tạo tế bào nấm mốc không khác tế bào vi khuẩn và nấm men, trong tế bào chất thường tạo thành một số không bào chứa ñầy dịch bào Các chuỗi tế bào ñược ngăn cách và nối tiếp nhau tạo thành khuẩn ty

Hệ sợi nấm mốc có một số sợi ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh Từ khuẩn ty khí sinh sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản ñặc biệt mang bào tử và màu sắc của bào tử sẽ ñặc trưng cho màu sắc của nấm mốc khi già.[11]

Hình 2.1 : Cấu tạo sợi nấm

Nguồn: Bùi Xuân ðồng, 2004 2.3.1.3 Hình thái nấm mốc

Giống Aspergillus sinh sản bằng bào tử ñính Bào tử ñính phát triển từ thành

tế bào rất dày bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào chân ñế Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là bọng (túi) Xung quanh bọng là một hoặc hai bộ cuống ñể ñính bào tử gọi là cuống ñính bào tử hay thể bình Từ bộ cuống ñính bào tử ngoài cùng, bào tử ñược sinh ra gọi là bào tử ñính Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử ñính tương tự (Nguyễn ðức Lượng, 2004)[7]

Một số loài Aspergillus thường gặp:

- Aspergillus flavus

Khi phát triển trên môi trường thạch Czapek, thạch malt và PDA bề mặt khuẩn lạc có màu vàng lục, do bào tử ñính màu này ñược tạo ra rất nhiều Hệ bào tử

ñính thường có sợi cuống với vỏ cuống xù xì, có hai bộ cuống ñính bào tử và tạo bào tử ñính có gai Loại này có thể tạo aflatoxin và có khả năng gây bệnh

- Aspergillus parasiticus

Loài này tương tự như loài Aspergillus flavus, chỉ có hai ñiểm khác là chúng

chỉ có một bộ cuống ñính bào tử và bề mặt cuống nhẵn hoặc xù xì Chúng cũng có thể tạo aflatoxin và gây bệnh

- Aspergillus niger

Nhóm này gồm có trên dưới 10 loài Chúng có màu ñen khi quan sát bằng mắt thường do chúng tạo bào tử ñính màu ñen, nhưng lại có màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có ñộ phóng ñại thấp Chúng có 2 bộ cuống ñính bào tử và tạo bào

tử ñính màu nâu hơi ñen và có gai Bọng và sợi cuống thường có màu nâu bóng Một số loài của nhóm này có khả năng gây bệnh

- Aspergillus fumigatus

Loài này có hệ bào tử ñính chỉ có một bộ cuống ñính bào tử Cuống ñính bào

tử, túi và sợi cuống có màu lục hơi xanh Bào tử ñính có gai Khuẩn lạc có màu nâu hơi xanh ðây là loài có khả năng gây bệnh cho người và ñộng vật, thường lây nhiễm qua con ñường hô hấp Chúng phát triển mạnh ở vùng có khí hậu nhiệt ñới và cận nhiệt ñới (Nguyễn ðức Lượng et al, 2003).[8]

Bảng 2.2: Các loài nấm Aspergillus sinh ñộc tố

Loài nấm Mycotoxin

Aspergillus flavus Aflatoxin, acid koji, acid

nitro-propionic, acid Aspergillic

A.fumigatus Aflatoxin, fumigacillin, gliotoxin

A.versicolor Versicolorin A,B,C; aversin,

ðây ñược xem là kỹ thuật ñịnh danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và ñược

sử dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, ñịnh danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây bệnh

Việc ñịnh danh nấm mốc Aspergillus có thể dựa vào ñặc ñiểm hình thái nếu

phân biệt ñến chi thường rất dễ nhận biết dựa vào cuống ñính bào tử, nhưng ñể phân biệt ñến loài thì phức tạp, thường dựa vào ñặc ñiểm ñại thể như hình dạng, kích thước, màu sắc, dạng mặt, dạng mép khuẩn lạc,…và ñặc ñiểm vi thể như sự sắp xếp, hình dạng và kích thước bào tử, hình thái cuống và hình thái của nang bào

tử (Klich và cs., 2009).[18]

Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Aspergillus là môi

trường thạch Sabouraud Khi ủ ở nhiệt ñộ thích hợp 28oC mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái ñặc trưng cho loài ðặc ñiểm sợi nấm, hình dạng bọng hoặc khả năng hình thành bộ phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường nuôi cấy là ñặc ñiểm quan trọng ñể phát

hiện Aspergillus

Các ñặc ñiểm của khuẩn lạc cần quan sát:

- Hình dạng (thường là tròn, gần tròn)

- Kích thước (ñường kính, chiều dày)

- Dạng mặt (mượt, mịn, len, xốp, dạng hạt, lồi lõm, )

- Màu sắc mặt trên

- Màu sắc mặt dưới

- Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…)

- Giọt tiết (nhiều, ít, màu sắc…)

- Sắc tố hoà tan ra môi trường (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có

Các ñặc ñiểm vi học cần khảo sát:

- Bào tử: typ phát sinh bào tử, hình dạng, kích thước, bề mặt, màu sắc

- Bộ máy mang bào tử trần, gồm:

Giá bào tử trần (conidiophore): kích thước (ñường kính, chiều dài), bề mặt (nhẵn, có gai), màu sắc, có vách ngăn hay không, và các ñặc ñiểm khác

Tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell): typ tế bào sinh bào tử trần (thể bình, dạng sinh bào tử trần ñồng thời hay không ñồng thời, dạng sinh bào tử trần qua lỗ ñể lại sẹo), hình dạng , kích thước, màu sắc, cách sắp xếp, vị trí (ở ñỉnh giá, nhánh)

- Sợi nấm: có vách ngăn hay không, ñường kính, màu sắc, bề mặt , có hoặc không có các hình thái ñặc biệt như bó sợi, bó giá, hạch nấm

Tuy nhiên, đối với phương pháp định danh dựa vào hình thái và màu sắc địi hỏi nhiều thời gian, cơng sức Nĩ khơng phải là giải pháp tốt cho những kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn Hiện nay cĩ một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và định danh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (Jame C.Correl Genetic, Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi)[17]

2.3.2.2 Kỹ thuật điện di protein

ðiện di protein trong ứng dụng ở cấp độ lồi và dưới lồi Kỹ thuật này bao gồm ly trích protein tổng số từ sợi nấm và bào tử đính, phân tách trên gel polyacrylamide bằng điện di, nhuộm màu để kiểm tra sản phẩm protein phân tách [9]

2.3.2.3 Isozymes

Trong phân tách Isozyme, nhiều enzyme cĩ thể khơng kiểm tra được trong các mẫu đã định Các enzyme cắt này được xác định cĩ thể ở dạng đơn hình trong khi cĩ rất ít sự khác nhau giữa các lồi, dưới lồi hoặc chúng cĩ sự đa hình rất cao Các enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacrylamide hoặc màng cellulose acetate cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic Phản ứng giữa enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh

sự hiện diện của enzyme Sự khác nhau nhỏ trong cấu hình acid amino cĩ thể thay đổi trong cấu trúc hay vật mang của protein Sự xác định và tính biến động của những enzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau bao gồm những điều kiện trên sinh vật như tốc độ tăng trưởng, pH, dịng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch nhuộm và chuẩn bị mẫu

Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nĩ hạn chế thấp nhất thời gian chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột

2.3.2.4 Huyết thanh học và kit chuẩn đốn

Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh cĩ nguồn gốc từ đất đã ra đời 5-10 năm trước Nhiều phương pháp thường được sử dụng để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà

khơng cần phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các protein hịa tan…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dịng đặc biệt Vấn

đề gặp phải với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền là mơ cây hay đất

Kháng thể đơn dịng được chấp nhận như một dụng cụ chuẩn đốn và phát hiện ở mức độ lồi và dưới lồi Kháng thể đơn dịng cĩ thể ở cấp độ giống, lồi hay các chủng đặc biệt

Các kit chuẩn đốn thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh dựa vào kỹ thuật kháng thể đơn dịng hay đa dịng Những kit này cĩ thể chứng minh rằng sự cần thiết của các chuẩn đốn nhanh và chính xác Những phát hiện nhanh thường cần thiết khi điều đĩ cần được cung cấp lời giải thích cho việc sử dụng các loại thuốc diệt nấm Các kit chuẩn đốn thơng thường nhằm cung cấp 2 mục đích: chuẩn đốn và nghiên cứu

2.3.2.5 Phân tích đa hình về chiều dài của các đoạn DNA được cắt bằng enzyme giới hạn (RFLP)

Phân tích RFLP (Restriction Fragmen Length Polymorphism) được dùng để xác định mối quan hệ phân lồi của nấm Phản ứng RFLP bao gồm nhiều bước sau:

ly trích và tinh sạch DNA từ cơ quan hay genome, sử dụng enzyme cắt để phân cắt các đoạn DNA, điện di phân tích các đoạn DNA trên gel agarose, thu hình các đoạn DNA bằng cách nhuộm với ethidium bromide hoặc chuyển các đoạn DNA sang màng nitrocellulose hay màng nylon (kỹ thuật Southern blot) và đánh dấu với các probe cĩ đánh dấu hay khơng đánh dấu phĩng xạ lai với các đoạn DNA Blot sau khi lai được chuyển qua phim rửa hay giấy nhạy cảm với hĩa chất Sự khác nhau về kích cỡ các đoạn đa dạng là sự đa dạng di truyền (sự mất đoạn cắt, lặp lại đoạn hay thêm đoạn DNA)

Giá để thực hiện phản ứng RFLP cao nhưng ứng dụng của phản ứng này sẽ tăng khi thay thế các đoạn probe đánh dấu phĩng xạ thành các probe khơng đánh

dấu Phân tách RFLP thường dùng ñể nghiên cứu ña dạng di truyền trên DNA ribosome (rDNA) và DNA ti thể ở mức ñộ loài hay dưới loài

2.3.2.6 Kỹ thuật dùng các mẫu dò là acid nucleic, DNA fingeprinting và Molecular karyotyping

DNA như các mẫu dò (probe) phân tử có thể ñược sử dụng ñể xác ñịnh các loài nấm bệnh Một ñoạn DNA ñặc thù ñược nhân dòng và ñược dùng ñể xác ñịnh ở

cấp ñộ loài nấm P.parasitica (Goodwin và cộng sự, 1989)[27] Hiệu quả của các

mẫu dò DNA khi xác ñịnh các loài nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức ñộ ña dạng di truyền hiện diện trong các loài ñã biết

Một ứng dụng khác của các mẫu dò DNA gần ñây là việc sử dụng các probe DNA minisatellite trong kỹ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cộng sự, 1985)[29] Các probe rất nhỏ ñược sử dụng trên nhiều sinh vật ñể xác ñịnh cá thể và theo dõi phả hệ, chúng chỉ hiện diện ñể xác ñịnh ñộ ña dạng di truyền trên nấm Các mẫu dò Minisatellite có thể ñược ứng dụng cho cấp ñộ loài, dưới loài (Rodriguez, 1989).[28]

2.3.2.7 Kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân ñoạn DNA dựa vào sự tương ñồng của 2 cặp mồi với hai ñầu của trình tự cần nhân bản Kỹ thuật này thường dùng ñể xác ñịnh mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học ðể xác ñịnh loài, có thể dùng PCR ñể khuếch ñại vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) trong RNA ribosome, vùng này

có giá trị thay ñổi giữa các loài nấm và do ñó có thể xác ñịnh mối quan hệ giữa các loài Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức ñộ cao của các loài và các chủng có thể ñược so sánh PCR rất có giá trị trong việc xác ñịnh ở mức ñộ loài và chủng

Trình tự mục tiêu ñược sử dụng ñể phân biệt các loài Aspergillus spp là gen

18S rDNA và vùng ITS Bằng việc nhân trình tự ITS1-5.8S-ITS2 kết hợp với

phương pháp RFLP, Amaia và cs (2005) ñã ñịnh danh ñược các loài A.niger, A.tubingensis, A.jabonicus, A.elipticus, A.carbonarius và A.ochraceus

ðể phân biệt các chủng nấm sinh ñộc tố và không sinh ñộc tố, các gen liên quan ñến quá trình ñiều hòa và gen cấu trúc trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin, ochartoxin ñược sử dụng như marker phân tử Shapira và cs (1996) sử dụng 3 cặp mồi ñặc hiệu ñể nhân 3 gen apa-2, ver-1 và omt-1 ñóng vai trò quan trọng trong con ñường sinh tổng hợp ñộc tố aflatoxin Kết quả cho thấy chỉ có 2 loài nấm mốc sinh

ñộc tố aflatoxin là Aspergillus parasiticus và Aspergillus flavus cho kết qủa dương

tính với 3 gen này, trong khi 3 gen này không ñược nhân lên ở các loài nấm khác

thuộc chi Penicillium, Fusarium hay các loài Aspergillus không sinh ñộc tố

aflatoxin khác Dao và cs (2005) ñã thiết kế 2 cặp mồi PCR ñặc hiệu ñể phát hiện

một số chủng nấm sinh ochratoxin, trong ñó có loài Asperillus ochraceus

2.4 Phương pháp thu thập và lấy mẫu chuẩn trong phân tích thực phẩm

theo TCVN 4886-1989 “Trình tự lấy mẫu ñể phân tích vi sinh vật"

a) Bằng hơi bão hòa trong 30 phút trong nồi hấp ở nhiệt ñộ 120 ± 10C;

b) Bằng khí nóng trong tủ sấy với sự lưu thông cưỡng bức không khí ở nhiệt

ñộ từ 170 ñến 1750C trong 60 phút;

- Không có sự lưu thông cưỡng bức của không khí, với nhiệt ñộ từ 180 ñến

1850C trong 15 phút và với nhiệt ñộ từ 160 ñến 1650C thì trong 120 phút;

c) Bằng tia phóng xạ;

d) Bằng oxit êtilen (C2H4O)

- đối với các dụng cụ dùng ựể mở bao bì, bao gói, hoặc dùng ựể lấy mẫu của các sản phẩm chưa thanh trùng, cho phép xử lý bằng cách ngâm trong cồn (êtanol), sau ựó hơ lửa

2.4.2 Kỹ thuật lấy mẫu

2.4.2.1 Mẫu nguyên liệu

a Thiết bị và dụng cụ

- đèn cồn hay ựèn khắ;

- Thìa, môi, panh kéo làm từ thép không gỉ;

- Dụng cụ lấy mẫu chuyên dùng;

- Giấy bạc hay giấy tráng kim loại khác;

- Hộp Petri;

- Túi PE vô trùng;

- Bông;

- Cồn (etanol) (CH3CH2OH) 96 và 70%

- Găng tay vô trùng

- Khẩu trang than hoạt tắnh

b Cách lấy mẫu

- Kiểm tra ựối chiếu tên và nguồn gốc nguyên liệu

- Kiểm tra sự nguyên vẹn và ghi chép ựiều kiện môi trường xung quanh, bao

bì hoặc dụng cụ chứa nguyên liệu

- Các dụng cụ bằng kim loại ựược ngâm trong cồn etanol 96% sau ựó hơ lửa

- Dùng môi hay thìa lấy từ các vị trắ khác nhau một lượng sản phẩm cần thiết

cho vào túi PE vô trùng ựã chuẩn bị trước

- để lấy mẫu của sản phẩm trong bao gói to hay không bao gói (ựể rời trong

khác nhau và từ các ñộ sâu khác nhau Ngoài ra, cần lấy mẫu ở lớp bề mặt, riêng ñối với sản phẩm ñược bao gói thì lấy từ các lớp tiếp xúc với bao gói

- Ghi kí hiệu mã mẫu và vận chuyển về phòng thí nghiệm

- Mẫu thử phải ñược vận chuyển trong những ñiều kiện ñảm bảo tránh ñược

sự hư hại bao bì, sự nhiễm bẩn, cũng như tác hại của ñiều kiện môi trường

- Lấy mỗi loại thực phẩm chức năng 4 mẫu làm lặp lại 4 lần

- Ghi kí hiệu và mã mẫu ứng với từng loại thực phẩm chức năng

3 VẬT LIỆU – NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu trên 5 loại thảo dược (Hòe, Atiso, Giảo cổ lam, Diệp

hạ châu, Cúc hoa) và các sản phẩm thực phẩm chức năng ở các dạng viên nang, túi lọc, cao siro, nước giải khác, nước tăng lực có nguồn gốc từ các loại thảo dược trên như Hoạt huyết dưỡng não, Hoạt huyết Traly, Giải ñộc gan Tuệ Linh, Bổ gan Abipha, Diệp Bình Can, Atiso plus, Viên kim tiền thảo, Traly Atiso, Viên kim tiền thảo, trà túi lọc Thiên Phúc, trà Giảo cổ lam, trà Trinh nữ hoàng cung, Trà xanh không ñộ, trà thanh nhiệt Dr Thanh

3.2 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

- ðịa ñiểm nghiên cứu: Trạm kiểm ñịnh chất lượng Nông Lâm sản và thủy sản Hà Nội

Kỹ thuật phân lập nấm mốc Aspergillus spp ñược thực hiện tại phòng kiểm

nghiệm vi sinh vật thuộc Trạm kiểm ñịnh chất lượng Nông Lâm sản và thuỷ sản Hà Nội bao gồm phòng pha chế môi trường, phòng chuẩn bị dụng cụ, phòng phân tích mẫu và phòng nuôi cấy mẫu Phòng thí nghiệm vô trùng với các ñiều kiện nhiệt ñộ 22-25oC, ñộ ẩm 60-70%

- Thời gian tiến hành: từ tháng 1/2013 ñến tháng 11/2013

3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập mẫu

Tiến hành thu thập 5 loại thảo dược sử dụng trong thực phẩm chức năng: Hòe, Atiso, Giảo cổ lam, Diệp hạ châu và Cúc hoa Các mẫu dược liệu này ñược thu thập ở dạng ñã ñược sơ chế bằng cách phơi khô hoặc sấy khô

Tiến hành thu thập một số mẫu thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ các loại thảo mộc trên: trà Giảo cổ lam, trà Atiso, trà Trinh nữ hoàng cung, trà Thiên

Phúc, Hoạt huyết dưỡng não, Hoạt huyết Traly, Bổ gan Abipha, Giải ựộc gan Tuệ Linh, Kim tiền thảo, trà xanh không ựộ, trà thảo mộc Dr Thanh

Quy trình lấy mẫu ựược thực hiện theo TCVN 4886-1989 ỘTrình tự lấy mẫu

ựể phân tắch vi sinh vật"

Xác ựịnh ựộ ẩm trong mẫu dược liệu: áp dụng phương pháp sấy khô ựến khối lượng không ựổi 10g mẫu dược liệu ựược sấy ở nhiệt ựộ cao (100 Ờ 1050C) ựể làm bay hết hơi nước trong mẫu trong 6 Ờ 8 h Cân trọng lượng mẫu dược liệu sau khi sấy, từ ựó tắnh ra phần trăm nước có trong dược liệu

Nội dung 2: đánh giá nhiễm nấm mốc Aspergillus spp bằng phương pháp thường quy

1 đánh giá sự nhiễm nấm mốc trên các mẫu thảo dược

Mẫu phân tắch là các loại mẫu ựã ựược thu thập ở nội dung 1 và ựược bảo quản trong túi PE vô trùng ở nhiệt ựộ thường Khối lượng 25g/mẫu

định danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus theo ỘThường quy kỹ thuật ựịnh danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong thực phẩmỘ do Bộ Y tế ban hành[1]

Tiêu chuẩn ngành: 52 TCN-TQTP 0001:2003, có hiệu lực từ ngày 25 tháng 3 năm

2003 và 52 TCN-TQTP 0009:2004 Ộ Thường quy kỹ thuật ựịnh danh nấm mốc

Aspergillus parasiticus, Aspergillus vesicolor trong thực phẩmỢ.[2]

2 đánh giá sự nhiễm nấm mốc ở các thực phẩm chức năng

Quy trình ựịnh danh nấm mốc có mặt trong các mẫu thực phẩm chức năng ựược tiến hành bằng phương pháp thường quy tương tự như ựối với các mẫu dược liệu

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Thu thập mẫu dược liệu

Mẫu ựược thu thập dưới các dạng sau:

- Mẫu sau thu hoạch ựược bảo quản tại các hộ nông dân/ cơ sở sản xuất

- Mẫu dược liệu từ các chợ ñầu mối

- Thành phẩm thương mại (thực phẩm chức năng)

a Mẫu nguyên liệu

ðịa ñiểm thu thập mẫu: chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở 15 ñịa ñiểm khác nhau ñại diện cho dược liệu như tại các hộ nông dân/ cơ sở sản xuất, chợ ñầu mối chuyên

cung cấp dược liệu trên ñịa bàn Quy trình lấy mẫu ñược tuân thủ theo TCVN

4886-1989 “Trình tự lấy mẫu phân tích vi sinh vật”

- Khối lượng mẫu lấy: 500g/mẫu

- Mẫu dược liệu sau khi thu thập ñược bảo quản ở nhiệt ñộ phòng trong túi

PE vô trùng cho ñến khi phân tích

ñó rất dễ lây nhiễm nấm mốc từ môi trường xung quanh

ðiều kiện vệ sinh của nhiều cửa hàng cũng không ñảm bảo, xung quanh là các rãnh nước thải, môi trường ở các chợ ñều ẩm thấp, có những cửa hàng là những cái lều dựng tạm ñể buôn bán nên ñiều kiện vệ sinh không sạch sẽ, khô ráo ðây chính là môi trường thuận lợi cho nấm mốc sinh trưởng và phát triển

+ ðiều kiện vệ sinh môi trường, quy trình sơ chế, bảo quản dược liệu ở các

Sau khi sơ chế xong dược liệu ñược ñóng vào các bao tải rồi xếp vào trong kho ðiều kiện vệ sinh trong kho cũng không ñược bảo ñảm, môi trường xung quanh ẩm thấp, bụi bẩn ðây cũng là nguyên nhân khiến các mẫu dược liệu bị nhiễm nấm mốc

- Số lần lặp lại: 4 mẫu mỗi dạng thực phẩm chức năng ñược thu thập từ 7 -

10 công ty sản xuất, kinh doanh sản phẩm thực phẩm chức năng

- Quy trình lấy mẫu ñược thực hiện theo “Trình tự lấy mẫu ñể phân tích vi sinh vật“ theo TCVN 4886-1989

+ Lượng mẫu:

• Thực phẩm chức năng chè nhúng, chè tan: 10 – 25 g/mẫu

• Thực phẩm chức năng dạng viên nang cứng, viên nang mềm và cao:

+ Ghi nhãn tương ứng với mã số của lô mẫu kiểm tra và ñánh số thứ tự

3.4.2 Xác ñịnh ñộ ẩm trong mẫu dược liệu theo TCVN 1867-2001 – Xác ñịnh ñộ

ẩm – Phương pháp xấy khô

Cân chính xác 10g mẫu vào cốc cân ñã biết trọng lượng (cốc ñã ñược sấy) Cốc cần có kích thước thích hợp ñể lớp dược liệu cho vào dày không quá 5mm Cho cốc chứa dược liệu có ñậy nắp vào tủ sấy ñã cài ở nhiệt ñộ 100-105oC trong 2 giờ, sau ñó lấy ra ñặt vào bình hút ẩm chân không ñể làm nguội trong 30 phút và ñem cân lại Làm lại nhiều lần ñến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0.5mg

ðộ ẩm (%) trong các mẫu dược liệu ñược tính theo công thức:

G2 – G3

N =

G2 – G1 × 100

G1: Khối lượng của cốc cân không có mẫu (g)

G2: G1+ khối lượng sản phẩm trước khi sấy (g)

G3: G1+ khối lượng của sản phẩm khô sau khi sấy

3.4.3 Phát hiện nấm mốc bằng phương pháp thường quy (52 TCN-TQTP 0001:2003 và 52 TCN-TQTP 0009:2004)

3.4.3.1 Nguyên lý phương pháp

Sử dụng kỹ thuật ñổ ñĩa, ñếm khóm nấm trên môi trường thạch Sabouraud sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt ñộ 28 ± 1o C trong thời gian 5 ngày Số lượng bào tử nấm mốc có trong 1g(1ml) mẫu kiểm tra ñược tính từ số khóm nấm ñếm ñược từ các ñĩa nuôi cấy theo các ñậm ñộ pha loãng

Sau ñó, ñể xác ñịnh tên (ñịnh danh) nấm mốc (ñến nhóm) phải tiến hành qua nhận xét ñại thể về ñặc ñiểm khuẩn lạc nấm mốc (colony characters) và nhận xét vi thể về hình thái học của khuẩn lạc nấm mốc (morphology)

3.4.3.2 Dụng cụ, môi trường và dung dịch cần thiết

- Que cấy ñầu nhọn

- ðĩa petri ñã sấy ở nhiệt ñộ …

- Nước thạch 10/00

- Dung dịch Lactofenol Amann

c Chuẩn bị môi trường và mẫu thử

● Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy, nước thạch và dung dịch cần thiết ñược ñiều chế theo công thức Các môi trường ñược ñóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và ñược hấp tiệt trùng (110 oC/30 phút hoặc 121 oC/15 phút)

● Pha chế môi trường

18 mỗi ống 9 ml môi trường Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt ñộ 120oC/15 phút

Môi trường ñược bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ñộ từ 0 ñến 5oC không quá

Pha chế: ðun nhỏ lửa, quấy ñều ñến khi sôi ñể hoà tan các chất Rót vào bình cầu có dung tích 250 ml mỗi bình 150 ml môi trường Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt ñộ 110oC/30 phút

Nếu môi trường sử dụng ngay, ñể nguội ñến 45 ± 1oC ở nồi cách thuỷ, nếu chưa sử dụng thì bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ñộ từ 0 ñến 5oC không quá 30 ngày

* Thạch Czapek

Bảng 3.2: Thành phần thạch Czapek

NaN0 3 3,5g

K 2 HP0 4 1,5g MgS0 4 0,5g

FeS0 4 0,1g ðường kính 30g

15 ngày

* Dung dịch Lactofenol Amann

Bảng 3.3: Thành phần dung dịch Lactofenol Amann

Axít fenic tinh khiết 10g Axít lactic 10g

Pha chế: Các thành phần trên ñều cân chứ không ñong Trộn ñều và lắc kỹ 3 chất axít lactic, glyxerin, nước cất, rồi cho axít fenic vào lắc ñều Sau ñó ñựng hỗn hợp dung dịch trên trong lọ thuỷ tinh có nút mài tối màu, bảo quản nơi khô ráo, trong bóng tối ở nhiệt ñộ phòng Dung dịch Lactofenol Amann khi mới pha thì không màu, nhưng ñể lâu dung dịch chuyển sang màu nâu nhưng vẫn dùng ñược

● Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử

- Chuẩn bị mẫu

Mẫu thực phẩm ñược cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong ñiều kiện vô trùng cho tới khi ñược thể ñồng nhất

- Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1

Cân chính xác 25g thực phẩm ñã ñược chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 225ml nước thạch 10 / 00 Lắc ñều 2-3 phút, thu ñược dung dịch mẫu thử 10-1

- Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2 , 10-3, 10-4…

Hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9

ml nước thạch 10 / 00 Lắc ñều trong 2-3 phút, thu ñược dung dịch 10-2 Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu ñược các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3 , 10-4 …