mô tả một số yếu tố liên quan đến phân bố chlamydia trachomatis ,human papillomavirus,đến kháng thuộc của vi khuẩn lậu trên bệnh nhân std tại miền trung tây nguyên năm 2010 2012

BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: “MÔ TẢ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN PHÂN BỐ CHLAMYDIA TRACHOMATIS , HUMAN PAPILLOMAVIRUS, ĐẾN KHÁNG THUỐC CỦA VI

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO

KẾT QUẢ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Tên đề tài:

“MÔ TẢ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN PHÂN BỐ CHLAMYDIA TRACHOMATIS , HUMAN PAPILLOMAVIRUS,

ĐẾN KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LẬU TRÊN BỆNH NHÂN STD

TẠI MIỀN TRUNG TÂY NGUYÊN NĂM 2010 - 2012”

Cơ quan chủ trì đề tài: Bệnh Viện Phong – Da Liễu Trung Ương Quy Hồ Chủ Nhiệm đề tài: BSCKII Nguyễn Thanh Tân

Bình Định, năm 2013

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục (STIs) vẫn còn là vấn đề y tế công cộng quan trọng WHO ước tính hàng năm có hơn 390 triệu trường hợp STIs mắc mới có thể điều trị khỏi (không kể số nhiễm HIV, HPV và các nhiễm virus viêm gan…), cao nhất là vùng Đông nam Á và khu vực châu Á - Thái Bình Dương Biến chứng viêm tiểu khung do lậu và chlamydia trachomatis (CT)

sinh dục chiếm 40%, một phần tư số có biến chứng này dẫn đến vô sinh Hàng năm có khoảng 4000 trẻ sơ sinh bị mù do người mẹ có thai mắc lậu và

CT sinh dục không được điều trị, 500.000 trường hợp ung thư cổ tử cung (CTC) do HPV, 240.000 trường hợp chết do ung thư CTC, chủ yếu ở các nước nghèo Trong những năm gần đây, tỷ lệ bệnh lậu kháng thuốc đang gia tăng, những trị liệu mới cho bệnh lậu kháng thuốc tốn gấp 10 lần so với penicillin [52],[78], [170],[178]

Ở Việt Nam, theo ước tính của các chuyên gia, hàng năm có gần một triệu trường hợp STIs mắc mới, trong đó có khoảng 150.000 trường hợp lậu, 500.000 trường hợp nhiễm CT sinh dục và có hơn 200.000 trường hợp HPV Năm 2011, tại khu vực Miền Trung Tây Nguyên Việt Nam, theo báo cáo gửi về từ các tỉnh, số trường hợp bệnh lậu là 455, CT là 266 và sùi mào

gà sinh dục (SMG) là 610 trường hợp Chín tháng đầu năm 2012, có 275 trường hợp bệnh lậu, có 126 trường hợp CT và có 446 trường hợp sùi mào

gà [2],[3] Tình hình, phân bố và một số yếu tố liên quan đến nhiễm

Chlamydia Trachomatis và HPV cũng như kháng thuốc của vi khuẩn lậu tại

khu vực Miền Trung Tây Nguyên vẫn chưa được biết nên quá trình điều trị, quản lý, kiểm soát và dự báo bệnh còn gặp khó khăn

Xác định tình hình bệnh, một số yếu tố liên quan đến nhiễm

Chlamydia Trachomatis, HPV cũng như tình hình và đặc điểm kháng

thuốc của vi khuẩn lậu nhằm góp phần kiểm soát tốt STD tại khu vực

Miền Trung Tây Nguyên chúng tôi tiến hành đề tài: “Mô tả một số yếu tố

liên quan đến phân bố Chlamydia trachomatis, Human Papillomavirus, đến kháng thuốc của vi khuẩn lậu trên bệnh nhân STD tại Miền Trung- Tây nguyên năm 2010-2012” với những mục tiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ, phân bố các serovar Chlamydia trachomatis và các

type Human Papillomavirus trên bệnh nhân STD tại Miền Trung - Tây nguyên năm 2010-2012

2 Mô tả một số yếu tố liên quan đến sự phân bố các serovar

Chlamydia trachomatis và các type Human Papillomavirus trên bệnh nhân

STD tại địa điểm nghiên cứu

3 Xác định tỷ lệ kháng thuốc và đột biến liên quan kháng thuốc quinolon và betalactamin của vi khuẩn lậu

4 Mô tả một số yếu tố liên quan đến kháng thuốc của vi khuẩn lậu

tại địa điểm nghiên cứu

CHƯƠNG I ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Biểu hiện tiết dịch âm đạo (nữ): tiết dịch bất thường, ngứa khó chịu

âm hộ, tiểu buốt, tiểu rát, có hoặc không có viêm đau bụng dưới

- Với các triệu chứng trên cả nam và nữ có hoặc không có kèm theo biểu hiện sùi mào gà

1.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân không hợp tác với nghiên cứu của chúng tôi (áp dụng cho 4 mục tiêu)

- Bệnh nhân đang dùng kháng sinh và dùng kháng sinh một tuần trước khi đến khám (áp dụng cho mục tiêu 3 và 4)

1.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu ngang mô tả

1.2.2 Cỡ mẫu

1.2.2.1 Cở mẫu cho mục tiêu 1 và 2

- Cỡ mẫu : áp dụng công thức cho nghiên cứu ngang mô tả

2

2 /

+ Hệ số tin cậy: 1 -  = 0,95 tương ứng có giá trị Z1- /2 = 1,96

+ Tỷ lệ p = 0,15 (nghiên cứu trước)

+ Sai số ước lượng d = 0,04

+ Áp dụng công thức tính, n = 306, ước 5% mất mẫu

+ Cỡ mẫu nghiên cứu là: 320 bệnh nhân

1.2.2.2 Cở mẫu cho mục tiêu 3 và 4

Mẫu xét nghiệm nuôi cấy định danh là vi khuẩn lậu được chọn cho

nghiên cứu Lấy mẫu trong 2 năm, ước khoảng là 50 mẫu

1.2.3 Phương pháp chọn mẫu:

1.2.3.1 Chọn mẫu cho mục tiêu 1 và 2

- Lấy mẫu liên tục kể từ khi bắt đầu cho đến khi đủ cỡ mẫu, nếu đủ

mẫu chúng tôi vẫn lấy mẫu liên tục trong một năm, nếu mẫu trong một năm

không đủ chúng tôi lấy mẫu qua năm tiếp theo cho đến khi đủ mẫu, cách lấy

mẫu được chia làm hai giai đoạn

+ Bước 1: Chọn ngẫu nhiên trong 11 tỉnh Miền Trung Tây Nguyên ra

5 tỉnh là Đà Nẵng, Bình Định, Khánh Hòa, Đắc Lắc và Gia Lai Dựa vào số

bệnh nhân của các tỉnh đó trong năm 2009 để chọn bước tiếp theo (bước 2)

+ Bước 2: Chọn mẫu theo tỷ lệ như sau

TT Tỉnh Năm 2009 Tỷ lệ Số mẫu cần cho nghiên cứu

1.2.3.2 Chọn mẫu cho mục tiêu 3 và 4:

Tất cả bệnh nhân nuôi cấy lậu dương tính được chọn để thực hiện kháng sinh đồ và thực hiện phản ứng PCR để phát hiện kháng thuốc Lấy mẫu trong 2 năm, ước khoảng 50 mẫu

1.2.4 Các biến số trong nghiên cứu:

1.2.4.1 Nhóm biến số về dân số, xã hội học:

Quan hệ: sinh dục- sinh dục; sinh dục- miệng; sinh dục- hậu môn

 Số lượng bạn tình trong 6 tháng gần : một, hai, trên hai bạn tình

 Tiền sử mắc bệnh lậu, STD trong 6 tháng gần

 Thuốc điều trị (quinolone hoặc betalactamin) ở những lần mắc lậu trong 6 tháng gần

 Biểu hiện lâm sàng:

+ Dịch tiết niệu đạo, âm đạo bất thường hay dịch trong + Viêm niệu đạo, viêm âm đạo

+ Viêm tinh hoàn, viêm cổ tử cung + Đau buốt niệu đạo, đau bụng dưới + Ngứa niệu đạo, ngứa âm hộ

+ Sùi sinh dục 1.3 QUY TRÌNH THỰC HIỆN VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

1.3.1 Quy trình thực hiện:

1.3.1.1 Khám lâm sàng và làm bệnh án: theo mẫu ở phần phụ lục 1

1.3.1.2 Thu thập mẫu và xử lý mẫu

- Cách lấy bệnh phẩm:

 Bệnh nhân nam: vị trí lấy bệnh phẩm là niệu đạo; dụng cụ là tăm bông vô khuẩn, lấy dịch tiết hoặc mủ, đưa tăm bông sâu trong niệu đạo 1,5 cm

 Bệnh nhân nữ: vị trí lấy bệnh phẩm là niệu đạo và CTC, ngoài ra còn lấy ở hai tuyến Skene và hai tuyến Bartholin khi cần thiết; dụng cụ là tăm bông vô khuẩn, lấy dịch hoặc mủ, đưa tăm bông sâu trong niệu đạo, CTC 1,5cm

 Bệnh phẩm trên bệnh nhân có u nhú sinh dục: lấy u nhú bằng kim lancet hoặc dao mổ như kỹ thuật cắt sinh thiết

 Bệnh phẩm được thu thập tại khoa Sinh học Phân tử và khoa Xét nghiệm, các trung tâm Da liễu tuyến tỉnh Bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản trong cồn 70%, vận chuyển đến Bệnh viện Phong

Da liễu TW Quy hòa

- Bảo quản và vận chuyển:

 Bảo quản bệnh phẩm: ở điều kiện vô trùng, giữ –20oC, hoặc trong cồn 70% cho đến khi sử dụng để chiết tách DNA

 Một phần bệnh phẩm là dịch niệu đạo và dịch CTC sẽ được nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy lậu (đối với bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Phong Da liễu TW Quy Hòa)

 Một phần bệnh phẩm là dịch niệu đạo và dịch CTC được sử dụng

để chiết tách DNA, làm phản ứng PCR, giải trình tự tìm gen đột biến thuốc của vi khuẩn lậu và định genotype CT

 Bệnh phẩm là u nhú sinh dục được bảo quản trong cồn 70% trong quá trình vận chuyển để chiết tách DNA sau đó

- Li trích DNA các tác nhân vi sinh vật có trong bệnh phẩm

 DNA trong tế bào vi khuẩn được chiết tách bằng bộ hoá chất DNAeasy của hãng QIAgen theo quy trình của nhà sản xuất dùng cho bệnh phẩm là dịch cơ thể

 DNA tổng số sau khi được chiết tách bảo quản –20o C cho đến khi sử dụng

1.3.2 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

1.3.2.1 Kỹ thuật chẩn đoán và xác định serovar Chlamydia Trachomatis

- PCR phát hiện phân đoạn Cryptic plasmid pLGV440 xác định

nhiễm Chlamydia Trachomatis

PCR phát hiện 1 phân đoạn trên Cryptic plasmid pLGV440 và PCR phát hiện gen ompA xác định nhiễm CT

Xác định nhiễm CT bằng 2 PCR với 2 trình tự đích khác nhau trên

Cryptic plasmid pLGV440 và Gen ompA của CT Sản phẩm DNA của gen

ompA sử dụng cho phản ứng RFLP xác định serovar CT

PCR được thực hiện trên máy GeneAmp PCR system 9700

 Chu kỳ nhiệt: 95o C - 5 phút

 Giai đoạn biến tính 95o C-30 giây

 Giai đoạn bắt cặp 60o C-30 giây

 Giai đoạn kéo dài 72o C-1 phút

 Thực hiện trong 35 chu kỳ

 Giữ 72o C-5 phút trước khi kết thúc

Thành phần phản ứng PCR:

 Nước tinh khiết 15l

 Dung dịch đệm X10 (TaKaRa) chứa Mg2+(20mM) 2,5l

 Hỗn hợp dNTP 2,5mM mỗi loại (TaKaRa) 2,5l

 Men chịu nhiệt (Taq-Polymerase- TaKaRa) 1 đơn vị

 Mồi xuôi (10pmol) 1l, mồi ngược (10pmol) 1l

 DNA li trích từ mẫu lâm sàng 3l

Mồi KL1 và KL2, có trình tự KL1-5'TCCGGAGCGAGTTACGAAGA 3'; KL2 -5’AATCAATGCCCGGGATTGGT 3 khuếch đại 1 đoạn trình tự

241 bp trong trình tự đích của cryptic plasmid (hình 4)

Phản ứng PCR có độ nhạy tương ứng 2 copies có trong 10l mẫu bệnh phẩm

PCR 2 sử dụng cặp mồi omp1 và omp2, (OMP1: 5’ATG AAA AAA

CTC TTG AAA; OMP2: 5’AGA AGC GGA ATT GTG CAT TTA CG)

khuếch đại một trình tự hoàn chỉnh gen ompA (Major outer membrane

protein A) cho sản phẩm PCR có độ dài 1180-1190 bp

Phản ứng PCR2 có độ nhạy tương ứng 10 pg DNA CT (hình 5)

- ỹ th ật RF P-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism – PRC) xác định o Chlamydia Trachomatis ( ỹ th ật xâ ựn th o

n hiên c củ I h t M) [84].

Sản phẩm PCR là toàn bộ trình tự gen ompA được sử dụng cho phản ứng thủy giải với các en yme giới hạn đã lựa chọn là HindIII, HhaI và BstI

để phân biệt các serovar CT

Thành phần cho phản ứng thủy giải:

 Nước tinh khiết: 16,3ul

hình chính được xác định sau ần cắt th nhất bằng men HindIII (có trình tự

nhận biết là: 5’AAGCTT 3” và 3’ TTCGA A 5’) [124]

Mô hình 1: Vị trí cắt ở nucleotide 479-520 nếu là các serovar H, L2,

L3, I và hình ảnh RFLP-PCR sẽ có 2 vạch DNA kích thước trung bình 497-520 bp và 671-697bp

Mô hình 2: Vị trí cắt ở nucleotide 885-888 nếu là các serovar L1, D,

I, , F và G hình ảnh RFLP-PRC sẽ có 2 vạch DNA kích thước trung bình 885-888 bp và 297-300 bp

Mô hình 3: HindIII không cắt sản phẩm PCR nếu là serovar K và E

Hình ảnh RFLP-PRC sẽ có 1 vạch DNA kích thước từ 1180-1190 bp

ần cắt th II ới HhaI có thể phân biệt được tất cả các Serovar ngoại

trừ I hoặc

HhaI có trình tự nhận biết là: 5’…GCG C…3” và 3’…C GCG…5’

Phối hợp với đặc điểm mô hình RFLP-PCR ở lần cắt với HindII, lần cắt 2 với HhaI mô hình RFLP-PCR có thể xác định được 11 serovar của CT Sau lần cắt thứ II nếu xác định được type - I phải xác định ở lần cắt 3 với BtsI

để phân biệt serovar I và

ần cắt th III ới BtsI phân biệt được serovar I và

Sự khác biệt về chiều dài và số lượng sản phẩm RFLP có thể phân biệt và xác định các serovar (phụ lục 2)

1.3.2.2 Kỹ thuật chẩn đoán và xác định type Human Papillomavirus

- PCR phát hiện phân đoạn n đ ch xác định nhiễm PV:

PCR được thực hiện trên máy Gene Amp PCR system 9700

 Chu kỳ nhiệt: 95o C - 5 phút

 Giai đoạn biến tính 95o C-30 giây

 Giai đoạn bắt cặp 60o C-30 giây

 Giai đoạn kéo dài 72o C-1 phút

 Thực hiện trong 35 chu kỳ, giữ 72o C-5 phút trước khi kết thúc Thành phần phản ứng PCR:

 Nước tinh khiết 15l

 Dung dịch đệm X10 (TaKaRa) chứa Mg2+(20mM) 2,5l

 Hỗn hợp dNTP 2,5mM mỗi loại (TaKaRa) 2,5l

 Men chịu nhiệt (Taq-Polymerase- TaKaRa) 1 đơn vị

 Mồi xuôi (10pmol) 1l, mồi ngược (10pmol) 1l

 DNA li trích từ mẫu lâm sàng 3l

Sử dụng cặp mồi chung cho HPV (consensus primers) là MY09 và MY11 có trình tự: (5’-GCG ACC CAA TGC AAA TTG GT- 3’) và (5’-

GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3’), khuếch đại 1 đoạn DNA đích có

và 68 Các type được gọi là nguy cơ thấp là: HPV type 6-11

PCR được thực hiện trên máy GeneAmp PCR system 9700

 Chu kỳ nhiệt: Biến tính 94oC-5 phút

 10 chu kỳ thăm dò nhiệt độ bắt mồi gồm biến tính 94oC- 30 giây, bắt mồi 65oC- 30 giây và giảm dần 1oC

 Mỗi chu kỳ, kéo dài 72oC- 30 giây

 30 chu kỳ tiếp theo mỗi chu kỳ gồm: thời gian biến tính 94oC-30 giây, bắt mồi 55oC- 30 giây và kéo dài 72oC- 30 giây

 Giai đoạn hoàn thành 72oC- 7 phút

Thành phần phản ứng PCR:

 Nước tinh khiết thêm vào vừa đủ 25l;

 Dung dịch đệm X10 (TaKaRa) chứa Mg2+(20mM) 2.5l

 Hỗn hợp dNTP 2.5mM mỗi loại (TaKaRa) 2.5l

 Men chịu nhiệt (Taq-Polymerase- TaKaRa) 1 đơn vị

 Mồi xuôi (10pmol) 1l, mồi ngược (10pmol) 1l

 Mỗi hỗn hợp PCR dùng 3-4 cặp mồi

 DNA li trích từ mẫu lâm sàng 3l (hình 6 và hình 7)

Hình 6 Trình tự các mồi đặc hiệu type được sử dụng trong nghiên cứu

Hình 7 Kết quả Multiplex-PCR xác định type HPV, theo kết quả của Sotlar

1.3.2.3 Kỹ thuật chẩn đoán và xác định đột biến liên quan đến kháng thuốc của vi khuẩn lậu

 Kỹ thuật nuôi cấy và thử nghiệm kháng sinh với vi khuẩn lậu

 PCR phát hiện phân đoạn gen đích cppB xác định vi khuẩn lậu

 RFLP-PCR xác định đột biến gen liên quan đến kháng thuốc của

vi khuẩn lậu tại vị trí 91 và 95 trên gen gyrA và tại vị trí 86, 87, 91 trên gen parC

 Realtime PCR phát hiện các đột biến tại vị trí 421 trên gen ponA

 Có 40% số mẫu DNA vi khuẩn lậu được giải trình tự trên các phân đoạn có chứa đột biến cần khảo sát để so sánh kết quả

ỹ th ật n ôi cấ à th n hiệm hán inh ới i h n ậ [99]

Bệnh phẩm dịch âm đạo, CTC hoặc niệu đạo sau khi lấy phải cấy ngay lên thạch sôcôla hoặc được chuyển ngay về phòng thí nghiệm để nuôi cấy trong vòng một giờ

Tiê ch n xác định i h n ậ

- Đặc điểm khuẩn lạc: tròn vồng nhẹ, xám nhạt không có mùi đặc biệt, không gây tan huyết môi trường nuôi cấy Lậu cầu phát triển được trên

cả thạch máu (cừu hay thỏ) 5% và thạch sôcôla

- Hình thể vi khuẩn: ở dạng song cầu hình hạt đậu hay hạt cà phê xếp

úp vào nhau, bắt màu Gram âm

- Thử nghiệm Oxidase: dương tính

- Thử nghiệm phản ứng sinh hoá 4 loại đường (vi khuẩn sử dụng carbohydrate sinh axit, đỏ phenol là chỉ thị màu):

* Glucose (+),màu vàng

* Lactose (-), Sucrose (-), Maltose (-): màu đỏ

hán inh đ th o ỹ th ật ho nh iấ hán inh (th o Whon t )

Cefotaxim (CTX) (30μg/ml)

Ceftazidim (CAZ) (30μg/ml)

Ceftriaxone (CRO) (30μg/ml)

Penicillin (PEN) (10UI/ml)

PCR phát hiện đ t iến iên q n hán th ốc củ i h n ậ

Sử dụng mồi H01 – H03, gen đích 4.2 kb cryptic plasmid trên gen

cppB, sản phẩm PCR có độ dài 390bp Kỹ thuật xây dựng trên cơ sở nghiên

cứu của B S W Ho, W G Feng [51]

 Giai đoạn biến tính 95o C-30 giây

 Giai đoạn bắt cặp 60o C-30 giây

 Giai đoạn kéo dài 72o C-1 phút; thực hiện trong 35 chu kỳ, giữ 72o C-5 phút trước khi kết thúc

 Men chịu nhiệt (Taq-Polymerase- TaKaRa) 1 đơn vị

 Mồi xuôi (10pmol) 1l, mồi ngược (10pmol) 1l; DNA li trích từ mẫu lâm sàng 3l

RFLP-PCR phát hiện đi m đ t iến iên q n hán q ino on tại 86

87 và 91 trên n p C: ỹ th ật xâ ựn th o n hiên c củ T hi Deguchi [63],[161]

PCR khuếch đại phân đoạn gen có vị trí 86, 87 và 91 trên gen parC

sử dụng các mồi có trình tự và vị trí trên gen parC theo tác giả Takashi Deguchi (hình 8)

Hình 8 Trình tự các mồi sử dụng cho các vị trí 86, 87 và 91 trên gen parC

Sản phẩm PCR được sử dụng cho phản ứng thủy giải với các en yme giới hạn đã lựa chọn nói trên với thành phần cho phản ứng thủy giải như

sau: Nước tinh khiết: 16,3ul; RE X10 buffer: 2l (Toyobo); Acetylate BSA

10g/ul: 0,2l(Toyobo); DNA 1g/l: 1l; trộn hỗn hợp trên với RE enzyme 10U/l: 0,5l (5U) (Toyobo); tổng thể tích là 20l, ủ 37oC từ 1-4 giờ

Kết quả: Mẫu chứa đột biến, sản phẩm RFLP-PCR sau phản ứng thủy giải sẽ không bị cắt bởi các RE, mẫu có chứa đột biến sau phản ứng thủy giải sẽ bị cắt bởi các RE tạo thành 2 đoạn DNA có thể phân biệt được trên

gel điện di theo tác giả Takashi Deguchi (hình 9, hình 10, hình 11)

Hình 9 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn

DNA 132bp có chứa điểm 86 gen parC

Sau phản ứng RFLP với men SalI có thể phân biệt được có hay không có đột biến xảy ra

Hình 10 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn

DNA 123bp có chứa điểm 87 gen parC

Sau phản ứng RFLP với men PstI có thể phân biệt được có hay không có đột biến xảy ra

Hình 11 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn

DNA 103bp có chứa điểm 91 gen parC

Sau phản ứng RFLP với men HinfI có thể phân biệt được có hay không có đột biến xảy ra

R tim PCR n m i ẹp t c ( i pin p im ) xác định đ t iến tại ị t 9 à 9 t ên n A iên q n hán F o oq ino on à xác định đ t iến tại ị t t ên n ponA iên q n hán nh m

t ct min củ i h n ậ

Đối với gen gyrA, tại 2 vị trí 91 và 95:

Tại vị trí 91 trên gen gyrA của vi khuẩn lậu, có trình tự là TCC mã

hóa acid amin Serine đột biến thành TTC hoặc TAC mã hóa cho Phenylalanine hoặc Tyrosine Thiết kế mồi HP trong vị trí này là để phát hiện alen đột biến từ C thành T hoặc A Trình tự mồi HP sử dụng trong nghiên cứu

Tại vị trí 95 trên gen gyrA của vi khuẩn lậu, có trình tự là GAC mã

hóa acid amin Aspartic đột biến thành GCC hoặc GGC mã hóa cho Alanine hoặc Glycine Thiết kế mồi HP trong vị trí này là để phát hiện alen đột biến

Đối với gen ponA tại vị trí 421, có trình tự là ctg mã hóa acid amin

Leucine đột biến thành ccg mã hóa cho Proline Thiết kế mồi HP trong vị trí này là để phát hiện alen đột biến T thành C

Chu kỳ nhiệt cho Realtime-PCR: 94oC- 10 phút và 70oC- 30 giây (giai đoạn 1), 72oC- 30 giây, 95oC- 20 giây, 69oC- 30 giây lặp lại 10 chu kỳ (giai đoạn 2); 72oC- 30 giây, 95oC- 20 giây và 60oC- 30 giây trong 40 chu

kỳ (giai đoạn 3)

Bàn luận kết quả trên sự khác nhau của các chu kỳ ngưỡng Ct giữa các mồi HP trên mỗi mẫu DNA, nhận định kết quả trên đường cong realtime PCR theo nguyên tắc: Sự bắt mồi bổ sung tuyệt đối một cách chính xác sẽ thể hiện biểu đồ realtime xuất hiện trước ít nhất là 3 chu kỳ so với các mồi còn lại có trình tự bắt mồi không hoàn toàn (hình 12, hình 13)

Hình 12 R tim PCR phát hiện đ t iến tại ị t

Hình 13 R tim PCR phát hiện đ t iến tại ị t

421 ponA không c đ t iến m i P c đầ ám

m i 3' ắt c p ổ n t ệt đối ới SNP wi t p

nh nh ch n cạnh t nh à h ếch đại n ph m

nh nh h n các m i P hác c ị t hôn ổ n hoàn toàn tại ị t cần xác định Sự hác iệt Ct

t on t ờn hợp nà à 6 ch ỳ

1.4 HÓA CHẤT SINH PHẨM SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

 Các mẫu DNA chứng: gồm CT serovar D và L2 trên được cung

cấp từ Trung tâm nghiên cứu Phong, Viện Quốc gia các bệnh

nhiễm khuẩn, Nhật Bản

 Hoá chất li trích DNA, hỗn hợp PCR, các men giới hạn các cặp

mồi đặc hiệu được đặt hàng theo yêu cầu từ hãng TAKARA,

1.5 MÁY MÓC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

 Tủ ấm SANYO có CO2 (Nhật)

 Tủ an toàn sinh học Giouan (Pháp)

 Tủ ấm có sàn lắc Stuart (Đức)

 Máy luân nhiệt Perkin-Elmer 9700 (USA),

 Bồn ủ nhiệt nhân Grant (Đức),

 Máy lọc nước siêu sạch Milipore (Pháp),

 Máy li tâm lạnh (Đức),

 Các bộ pipettes tự động Efpendorf (Đức)

 Máy điện di và nguồn điện di Bio-rad (MỸ),

 Hệ thống chụp ảnh Geldoc Bio-rad (Mỹ)

1.6 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

1.6.1 Địa điểm nghiên cứu

 Các cơ sở khám chữa bệnh Da liễu tuyến tỉnh của 5 tỉnh Miền Trung Tây Nguyên, tổ chức chọn mẫu, phỏng vấn, khám bệnh và

lấy mẫu cho mục tiêu 1 và 2

 Bệnh viện Phong Da liễu Trung ương Quy Hòa tổ chức khám

bệnh và lấy mẫu cho cả 4 mục tiêu

 Công việc nuôi cấy kháng sinh đồ, xử lý bệnh phẩm từ các nơi chuyển đến, thực hiện các kỹ thuật SHPT và phân tích số liệu

được thực hiện tại Bệnh viện Phong Da liễu TW Quy Hoà

1.6.2 Thời gian nghiên cứu: hai năm (từ tháng 12/2010 đến tháng

12/2012)

1.7 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Tỷ lệ, phân bố, liên quan: tính p, sự khác biệt hai tỷ lệ được phân

tích bằng test χ 2 và giá trị p <0,05 được xem là khác biệt có ý nghĩa thống

kê

- Mối liên quan kháng thuốc của vi khuẩn lậu trên kháng sinh đồ và đột biến liên quan kháng thuốc của vi khuẩn lậu trên PCR: dựa vào chỉ số Kappa được tính như sau:

Phù hợp thực tại = Phù hợp quan sát - phù hợp ngẫu nhiên

Phù hợp tiềm ẩn (không do ngẫu nhiên): (100% - phù hợp ngẫu nhiên)

- Số liệu xử lý theo chương trình Epi info 6.04

1.8 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được thực hiện bởi các nghiên cứu viên đủ năng lực, có kiến thức và kinh nghiệm phù hợp trong lĩnh vực nghiên cứu

Đề tài tuân thủ đầy đủ các quy định về khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu y sinh học:

- Đảm bảo quyền lợi, tính bảo mật, sự an toàn và tình nguyện tham gia của đối tượng tham gia nghiên cứu;

- Đảm bảo tính khoa học, tính khả thi của nghiên cứu, sự an toàn cho nghiên cứu viên và cộng đồng

CHƯƠNG II KẾT QUẢ

2.1 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ, PHÂN BỐ CÁC SEROVAR CHLAMYDIA TRACHOMATIS VÀ CÁC TYPE HUMAN PAPILLOMAVIRUS TRÊN BỆNH NHÂN STD TẠI MIỀN TRUNG TÂY NGUYÊN NĂM 2010-2012

2.1.1 Đặc điểm của mẫu nghiên cứu

Trong 513 bệnh nhân (BN) thu thập theo mẫu nghiên cứu của 5 tỉnh,

Đà nẵng có 100, Bình định có 213, Khánh hòa có 100, Gia lai có 41, Daklak

có 59 trường hợp Đặc điểm mẫu nghiên cứu như sau:

Bảng 2.1 Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo nhóm tuổi và giới

Bảng 2.2 Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo nghề nghiệp và địa dư

Địa dư

Nghề nghiệp

Nông thôn n(%)

Thành thị n%)

Tổng n(%)

Bệnh nhân ở nông thôn (34,30%), thành thị (65,69%)

Bảng 2.3 Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo đối tượng nghiên cứu và trình độ học vấn

Nhận xét:

Bệnh nhân có trình độ dưới phổ thông và phổ thông (82,85%), trình

độ đại học và trên đại học (17,15%)

2.1.2 Xác định tỷ lệ nhiễm, phân bố Chlamydia Trachomatis và Human

Papillomavirus trên bệnh nhân STD

Bảng 2.4 Tỷ lệ nhiễm, phân bố Chlamydia Trachomatis và Human Papillomavirus theo hội chứng bệnh

151 (85,31)

26 (14,69)

(16,24)

165 (83,76)

9 (4,57)

188 (95,43)

(19,42)

112 (80,58)

43 (30,93)

96 (69,07)

(13,85)

442 (86,15)

203 (39,57)

310 (60,43)

Nhận xét: Trong tổng mẫu nghiên cứu, tỷ lệ nhiễm CT là 13,85% và HPV

là 39,57% Tỷ lệ nhiễm CT ở bệnh nhân HCTDÂĐ cao hơn HCTDNĐ và SMG có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 Tỷ lệ HPV dương tính ở HCTDÂĐ

30,93% và HCTDNĐ 4,57% có ý nghĩa thống kê với p < 0,0001

2.1.3 Phân bố nhiễm các serovar Chlamydia Trachomatis và các type

Human Papillomavirus

2.1.3.1 Phân bố nhiễm các serovar Chlamydia Trachomatis

Bảng 2.5 Phân bố các serovars Chlamydia Trachomatis theo hội chứng

Serovar E cao trong SMG (50,00%) và HCTDNĐ (34,37%), serovar

F cao trong HCTDÂĐ với tỷ lệ 29,63%

Bảng 2.6 Phân bố các serovars Chlamydia Trachomatis theo căn nguyên

3 (13,64)

4 (18,18)

4 (18,18)

>0,05

(22,54) (50,00) 8

2 (12,50) (6,25) 1 (18,75) 3

2 (12,50)

CT không đồng

nhiễm với lậu,

HPV

33 (46,48)

9 (27,27)

9 (27,27)

3 (9,09)

0 (0,00)

12 (36,36)

1 (8,33)

0 (0,00) 2 (16,67)

1 (8,33)

1 (8,33)

(45,07) 7 (21,87)

11 (34,37)

6 (18,75) 2 (6,25) 1 (3,13) 1 (3,13) 4 (12,50)

(38,03) 3 (11,11) 7 (25,92) 8 (29,63)

5 (18,52)

1 (3,70) 1 (3,70) 2 (7,40)

(100)

11 (15,49)

24 (33,80)

15 (21,12)

7 (9,85)

4 (5,63)

3 (4,22)

7 (9,85)

Nhận xét:

Serovar E chiếm tỷ lệ cao trong nhiễm HPV (50%) nhưng không có ý nghĩa thống kê Các serovar CT phân bố khác nhau trên bệnh nhân lậu và HPV không có ý nghĩa với p>0,05

2.1.3.2 Xác định tỷ lệ và phân bố các type Human Papillomavirus

Bảng 2.7 Tỷ lệ và phân bố các Human Papillomavirus đơn type trong số dương tính và trong tổng mẫu nghiên cứu

Type HPV Số lượng nhiễm

% trong nhóm dương tính (203)

% trong mẫu (513 )

Tính theo tổng mẫu 513, tỷ lệ nhiễm đơn type HPV là 8,78%, trong

đó type 11 nhiều nhất 2,33%, sau đó là type 6 là 2,14% Type 16 và 18 có tỷ

lệ ngang nhau 0,58% Như vậy phân bố trong đơn type thì type nguy cơ thấp (type 11, type 6) chiếm tỷ lệ cao hơn các type nguy cơ cao (type 16, type 18)

Bảng 2.8 Tỷ lệ và phân bố các Human Papillomavirus đa type trong số

dương tính và trong tổng mẫu nghiên cứu

Type HPV

Số lượng nhiễm

% trong nhóm dương tính (203)

% trong mẫu (513)

Type HPV lượng Số

nhiễm

% trong nhóm dương tính (203)

% trong mẫu (513)

Tính theo tổng mẫu 513, kết quả nhiễm đa type (30,79%)

Phân bố tập trung nổi bật là nhiễm phối hợp vừa type nguy cơ cao với type nguy cơ thấp là cao nhất (phối hợp type 11, 58 (4,48%), type 11, 39 (3,50%), type 6,31; type 6, 51; type 11, 33 (3,11%), type 11,33,51 (2,34%), Nhiễm phối hợp hai type nguy cơ cao với nhau chiếm tỷ lệ thấp hơn (type

39, 51 (1,55%)

Bảng 2.9 Phân bố nhiễm phối hợp các type Human Papillomavirus trong số dương tính và trong tổng mẫu nghiên cứu

Type HPV phối

hợp theo số type Số lượng nhiễm

% trong nhóm dương tính (203)

% trong mẫu (513)

% trong nhóm dương tính (203)

% trong mẫu (513)

Nhận xét: Nhiễm HPV cả hai nhóm nguy cơ cao và nguy cơ thấp chiếm tỷ

lệ (27,09%) cao hơn chỉ nhiễm một nhóm nguy cơ cao (7,01%) hoặc nguy

cơ thấp (5,45%)

Bảng 2.11 Phân bố các type Human Papillomavirus theo đơn và phối hợp

đa type trong số dương tính và trong tổng mẫu nghiên cứu

Type HPV Số lượng nhiễm

% trong nhóm dương tính (203 mẫu)

Nhận xét: Type 11 có mặt nhiều nhất trong đơn và đa type với tỷ lệ

20,08%, kế tiếp là type 6 (12,67%), tiếp theo type 33 (11,32%) và type 58 (10,38%) so với số dương tính

2.2 MÔ TẢ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN PHÂN BỐ CÁC SEROVAR CHLAMYDIA TRACHOMATIS VÀ CÁC TYPE HUMAN PAPILLOMAVIUS TRÊN BỆNH NHÂN STD TẠI ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mô tả một số yếu tố liên quan đến phân bố Chlamydia

Trachomatis và Human Papillomavirus trên bệnh nhân STD

Bảng 2.12 Một số đặc điểm dân số, xã hội học liên quan với nhiễm

Chlamydia Trachomatis và Human Papillomavirus

Đặc điểm dân số, xã

hội học

Tổng mẫu 513

CT

71 n(%

< 0,05

(13,88)

74 (35,41)

(12,44)

74 (38,34)

(12,36)

36 (40,44)

(31,50)

56 (76,71)

(9,65) < 0,05

50 (28,40)

Nhiễm HPV, nữ mắc cao hơn nam có ý nghĩa p < 0,001 Nhóm tuổi 15-25 mắc cao hơn nhóm tuổi 36-49 và nhóm tuổi 26-35 có ý nghĩa p < 0,05 Nghề nghiệp là buôn bán cao hơn nghề tự do có ý nghĩa p < 0,0001 Trình độ học vấn không khác biệt Thành thị nhiễm nhiều hơn nông thôn với p<0,001

Bảng 2.13 Liên quan về số bạn tình, hành vi, thực hành tình dục và tiền sử

mắc bệnh STD với nhiễm Chlamydia Trachomatis và Human

Papillomavirus

Một số yếu tố liên

quan

Tổng mẫu

<0,0000

(24,88)

154 (68,44)

>0,05 SD-HM

(0,00)

3 (50,00)

(14,00)

197 (39,40)

16 (20,77) <0,001

69 (39,65) >0,05

(16,52)

134 (39,52)

Nhận xét:

Nhiễm CT, bệnh nhân có hai bạn tình trở lên có tỷ lệ nhiễm cao hơn bệnh nhân có một bạn tình có ý nghĩa với p<0,000 Hành vi quan hệ tình

dục không liên quan đến mắc bệnh Bệnh nhân không mang bao cao su có

tỷ lệ nhiễm cao hơn có mang bao cao su trong quan hệ tình dục có ý nghĩa với p<0,05 Không có tiền sử mắc bệnh STD trong 6 tháng gần có tỷ lệ bệnh nhiều hơn người có tiền sử có ý nghĩa với p<0,05

Nhiễm HPV, bệnh nhân có hai bạn tình trở lên có tỷ lệ nhiễm cao hơn bệnh nhân có một bạn tình có ý nghĩa với p<0,000 Hành vi quan hệ tình dục không liên quan đến mắc bệnh Bệnh nhân không mang bao cao su có

tỷ lệ nhiễm cao hơn có mang bao cao su trong quan hệ tình dục có ý nghĩa với p<0,001 Không có tiền sử mắc bệnh STD trong 6 tháng gần không liên quan đến mắc bệnh

Bảng 2.14 Liên quan về biểu hiện lâm sàng người bệnh nam với nhiễm

Chlamydia Trachomatis và Human Papillomavirus

Biểu hiện lâm sàng

Tổng mẫu

>0,05

9 (6,57)

Không

(8,39)

52 (34,66) Đau buốt

4 (4,71) <0,001

Không

(13,26)

62 (34,25) Ngứa niệu

(11,64) Sùi sinh

67 (91,78)

Nhận xét:

Nhiễm CT ở bệnh nam có viêm niệu đạo, viêm tinh hoàn, ngứa niệu đạo là triệu chứng liên quan đến nhiễm bệnh có ý nghĩa thống kê Đặc điểm dịch tiết, đau buốt niệu đạo và sùi sinh dục không phải là triệu chứng liên quan đến bệnh

Nhiễm HPV ở bệnh nam có dịch tiết niệu đạo, viêm niệu đạo, viêm tinh hoàn, đau buốt niệu đạo, ngứa niệu đạo không phải là triệu chứng của bệnh nhiễm HPV Triệu chứng sùi sinh dục liên quan đến nhiễm bệnh có ý nghĩa với p<0,001

Bảng 2.15 Liên quan về biểu hiện lâm sàng người bệnh nữ với nhiễm

Chlamydia Trachomatis và Human Papillomavirus

Biểu hiện lâm sàng

Tổng mẫu

<0,01

(9,90)

66 (65,35) Viêm cổ

tử cung

(19,42) <0,05

71 (51,08) >0,05

(8,33)

66 (61,11) Đau bụng

Nhận xét:

Nhiễm CT ở bệnh nữ, triệu chứng viêm cổ tử cung và đau bụng dưới

là triệu chứng liên quan đến bệnh có ý nghĩa Triệu chứng tiết dịch bất thường, ngứa sinh dục và sùi sinh dục không liên quan đến bệnh

Nhiễm HPV ở bệnh nhân nữ, tiết dịch bất thường, viêm cổ tử cung, đau bụng dưới, ngứa sinh dục không phải là triệu chứng liên quan đến bệnh Triệu chứng sùi sinh dục là triệu chứng của bệnh

2.2.2 Mô tả một số yếu tố liên quan đến phân bố serovar Chlamydia

Trachomatis và các type Human Papillomavirus trên bệnh nhân STD

Bảng 2.16 Liên quan giữa một số yếu tố xã hội học đến phân bố serovar

Chlamydia Trachomatis

Yếu tố xã hội học

Tổng mẫu

Nam 266 4

(1,50)

12 (4,51)

7 (2,63)

5 (1,87)

2 (0,75)

1 (0,37)

4 (1,50)

(2,83)

12 (4,85)

8 (3,23)

2 (0,80)

2 (0,80)

2 (0,80)

3 (1,21)

Nhóm tuổi 15-25

(3,6)

4 (3,6)

5 (4,5)

3 (2,7)

1 (0,9)

1 (0,9)

0 (0,00)

(1,43)

12 (5,74)

7 (3,34)

2 (0,95)

1 (0,47)

1 (0,47)

3 (1,43)

(2,07) 8 (4,14) 3 (1,55) 2 (1,03) 2 (1,03) 1 (0,51) 4 (2,07)

Nghề nghiệp

Nông dân

(2,08) 2 (4,16) 2 (4,16) 2 (4,16) 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00)

Công nhân

(1,77)

8 (4,73)

7 (4,14)

3 (1,77)

2 (1,18)

1 (0,59)

5 (2,95)

Cán bộ

(3,37)

4 (4,49)

1 (1,12)

0 (0,00)

2 (2,24)

0 (0,00)

1 (1,12)

Buôn bán

(2,73)

4 (5,47)

4 (5,47)

2 (2,73)

0 (0,00)

1 (1,36)

0 (0,00)

Nghề khác

(1,49)

6 (4,47)

1 (0,74)

0 (0,00)

0 (0,00)

1 (0,74)

1 (0,74)

(2,67)

16 (4,74)

9 (2,67)

2 (0,59)

3 (0,89)

2 (0,59)

6 (1,78)

Nhận xét: Phân bố các serovar CT theo giới tính, nhóm tuổi, nghề nghiệp,

trình độ văn hóa và địa dư không có sự khác biệt với p>0,05

Bảng 2.17 Liên quan giữa một số biểu hiện lâm sàng đến phân bố các

serovar Chlamydia Trachomatis

Triệu chứng lâm

sàng

Tổng mẫu

(3,53)

16 (5,65)

9 (3,18)

6 (2,12)

3 (1,06)

2 (0,7) (2,47) 7

Trong 230 1

(0,43)

8 (3,47) (2,60) 6 (0,43) 1 (0,43) 1 (0,43) 1 (0,00) 0

8 (3,08)

4 (1,54)

4 (1,54)

2 (0,77)

5 (1,93)

Không 254 3

(1,18)

8 (3,14)

7 (2,75)

3 (1,18)

0 (0,00)

1 (0,39)

2 (0,78)

Không 366 9

(2,45)

20 (5,46)

10 (2,72) (0,27) 1

3 (0,81)

3 (0,81)

6 (1,63)

Bảng 2.18 Liên quan giữa một số đặc điểm dân số, xã hội học với nhóm type Human Papillomavirus nguy cơ cao và nguy cơ thấp

Đặc điểm dân số, xã

hội học

Tổng mẫu

203

Nhóm nguy cơ thấp

28

n (%)

p

Nhóm nguy cơ cao

40

n (%)

p

Nhiễm cả hai nhóm nguy cơ cao và thấp

(10,91)

>0,05

8 (14,54)

<0,05

37 (67,27)

>0,05

(16,23)

22 (29,72)

47 (63,51)

(13,51)

10 (13,51)

51 (68,92)

Đặc điểm dân số, xã

hội học

Tổng mẫu

203

Nhóm nguy cơ thấp

28

n (%)

p

Nhóm nguy cơ cao

40

n (%)

p

Nhiễm cả hai nhóm nguy cơ cao và thấp

>0,05

18 (78,26)

26 (72,22) Buôn

bán

(12,50)

4 (25,00)

10 (62,50) Nghề

khác

(14,75)

11 (18,03)

41 (67,22) Trình độ

thị

(13,17)

26 (20,16)

84 (65,11)

Nhận xét:

Giới nam liên quan với nhiễm nhóm nguy cơ thấp, nữ liên quan với nhiễm nhóm nguy cơ cao Nhóm tuổi 25-36 liên quan nhiễm nhóm nguy cơ cao Nghề nghiệp, trình độ văn hóa và địa dư không liên quan với nhiễm các nhóm nguy cơ của HPV

2.3 TỶ LỆ KHÁNG THUỐC VÀ CÁC ĐỘT BIẾN LIÊN QUAN ĐẾN

KHÁNG QUINOLONE VÀ BETALACTAMIN CỦA VI KHUẨN LẬU 2.3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu theo kháng sinh đồ

2.3.1.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu theo kháng sinh đồ

Bảng 2.19 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu theo kháng sinh đồ

Ba KS (PEN + CIP + CRO)

Bốn KS (4 trong

5 kháng sinh)

Năm KS ( cả 5 kháng sinh)

Tổng

n

(%)

2 (3,77)

43 (81,13)

3 (5,66)

3 5,66)

2 (3,77)

53 (100)

Nhận xét

Kháng một kháng sinh đơn thuần (PEN) 3,77%, kháng phối hợp hai kháng sinh (PEN, CIP) 81,13%, kháng phối hợp 3 kháng sinh (PEN, CIP, CRO) 5,66%, kháng phối hợp (4 trong 5 loại kháng sinh PEN, CIP, CRO, CAZ, CTX) 5,66% và kháng phối hợp 5 kháng sinh (PEN, CIP, CRO, CAZ, CTX) 3,77%

Bảng 2.21 Kết quả kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu theo kháng sinh đồ

Stt Mã nuôi cấy CIP

(51)

CTX (5)

CAZ (3)

CRO (7)

PEN (53)

Số loại kháng sinh kháng phối hợp

Stt Mã nuôi cấy CIP

(51)

CTX (5)

CAZ (3)

CRO (7)

PEN (53)

Số loại kháng sinh kháng phối hợp

2.3.2 Tỷ lệ và mô tả đột biến liên quan đến kháng thuốc của vi khuẩn lậu

2.3.2.1 Phân tích đột biến trên gen gyrA

Bảng 2.22 Số lượng, tỷ lệ đột biến tại vị trí 91 và 95 trên gen gyrA

Vị trí Loại đột biến Thay đổi

axit amin

Số mẫu phân tích

Số mẫu đột biến

Tỷ lệ (%)

Nhận xét

Tỷ lệ đột biến tại vị trí 91 trên gen gyrA là 98,1% bao gồm kiểu đột

biến thay thế nucleotide tại vị trí thứ hai của codon 91 làm đổi mã codon TCC thành TTC thay đổi acide amin Serin thành Phenylalanin có 51 chủng (96,22%), và kiểu đột biến thay thế nucleotide tại vị trí thứ hai của codon 91 làm đổi mã codon TCC thành TAC thay đổi acide amin Serin thành Tyrosin

có 1 chủng (1,88%)

Tỷ lệ đột biến tại vị trí 95 trên gen gyrA là 100%, trong đó có 3 kiểu

đột biến thay thế nucleotide làm đổi mã codon GAC thành GCC, thay đổi acide amin Aspartic thành Alanin có 33/53 (62,27%); đổi mã codon GAC thành GGC, thay đổi acide amin Aspartic thành Glycin có 19/53 (35,85%),

và đổi mã codon GAC thành AAC, thay đổi acide amin Aspartic thành Asparagin có 1/53 (1,88%)

Chọn 15/53 mẫu ngẫu nhiên giải trình tự trên phân đoạn gen gyrA có

chứa các vị trí đột biến cần khảo sát để giải trình tự, so sánh đối chiếu kết quả, sử dụng phầm mềm Clustal Omega cho thấy phù hợp 100% (15/15)