nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng

Trên cơ sở đó, được sự đồng ý của Bộ NN & PTNT, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng” thuộc Chương t

ViÖn Thæ nh−ìng N«ng hãa

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI:

Nghiªn cøu s¶n xuÊt chÕ phÈm vi sinh vËt

sö dông trong phßng trõ bÖnh hÐo xanh

l¹c vµ võng

CNĐT: Lª Nh− KiÓu

8862

HÀ NỘI - 2010

BÁO CÁO TỔNG KẾT

I MỞ ĐẦU

Cây vừng có tên khoa học là Sesaum indicum L, được trồng chủ yếu vào

mùa Hè (trồng tháng 6 thu hoạch tháng 9) là cây lấy dầu với bộ phận thu hoạch chủ yếu là hạt Nguồn gốc tự nhiên chính xác của cây vừng vẫn chưa được xác định, dù nhiều loài cây trong hoang dã có liên quan đã hiện diện ở châu Phi và một

số nhỏ hơn ở Ấn Độ Đây là một cây được thuần hóa ở các vùng nhiệt đới khắp Thế giới và được trồng để lấy hạt ăn do hạt có hàm lượng chất béo và chất đạm cao Hạt vừng có hàm lượng dầu rất cao (từ 38 – 50 % tuỳ thuộc vào từng giống vừng), giá trị sử dụng chủ yếu là làm thực phẩm, kể cả ở dạng dầu tinh khiết cũng như ở dạng hạt thô Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, cây vừng còn là loại cây chịu hạn, có thể trồng ở các vùng đất nghèo dinh dưỡng như đất pha cát, đất cát Bên cạnh đó vừng là loại cây nhiệt đới có thể chịu được nhiệt độ từ 25-

320C, vì vậy chúng được trồng khá rộng rãi ở các tỉnh miền Trung và nam Trung Bộ Vòng đời sinh trưởng của vừng khá ngắn chỉ vào khoảng từ 60 đến

90 ngày nên lợi ích do phát triển trồng vừng đem lại là rất cao Hiện nay, diện tích trồng vừng trên Thế giới tương đối lớn, sản lượng hàng năm 2 triệu tấn, chủ yếu ở Châu Á (55 – 60 %), Châu Mỹ (18 – 20 %), Châu Phi (18 – 20 %), ngoài ra châu Âu, châu Đại Dương trồng không nhiều và rải rác Các quốc gia trồng vừng trên Thế giới là Ấn Độ 400.000 tấn/năm, Trung Quốc 320.000 tấn/năm, Su Đăng 200.000 tấn/năm, Mêxicô 180.000 tấn/năm Tại Việt Nam vừng được trồng nhiều tại các tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Quảng Bình và một số ít tại vùng Bắc Bộ

Vừng thường bị một số sâu bệnh hại như: Sâu khoang: Sâu ăn trụi lá,

cắn đứt ngang cây Thời kỳ ra hoa làm quả thì làm rụng hoa, đục khoét quả làm

ảnh hưởng tới năng suất Sâu cuốn lá: Sâu thường tập trung ở trên lá ngọn và

nhả tơ cuốn hai mép lá vừng vào nhau để sinh sống, sâu ăn biểu bì làm hỏng lá,

ảnh hưởng đến quang hợp của cây, làm giảm năng suất Rệp hại vừng: Rệp

sống tập trung từng đàn trên thân, lá ở phần ngọn, quả non Rệp chích hút nhựa cây làm cho cây kém phát triển, lá ngọn xoắn lại, hoa ít, quả nhỏ ảnh hưởng tới

năng suất Bệnh chết thối do nấm (bệnh thán thư): Bệnh gây héo lá nhưng

không đột ngột, khi bị nặng làm cho cây vừng bị khô, các bó mạch và phần trong thân không chuyển màu nâu, bóp cây không có dịch nhầy Bệnh phát triển

mạnh ở những ruộng bón phân không cân đối, độ ẩm đất cao Bệnh héo xanh

vi khuẩn do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra làm cho vừng bị héo xanh

đột ngột, lá vẫn giữ màu xanh, cắt ngang cây thấy bó mạch có màu nâu sẫm, rễ

bị đen và thối, bóp nhẹ chỗ bị thối có dịch nhầy trắng tiết ra Bệnh gây hại từ lúc cây con đến khi thu hoạch, vi khuẩn thường ký chủ trên nhiều loại cây nhất

là cây họ đậu, họ cà

Cây lạc (Arachis hypogaea) cũng là cây lấy dầu và cho hiệu quả kinh tế

cao, đem lại kinh tế cho nhiều vùng sản xuất Lạc không yêu cầu khắt khe về độ phì của đất Do đặc điểm sinh lý của lạc, đất trồng lạc phải đảm bảo cao ráo, thoát nước nhanh khi có mưa to Thành phần cơ giới của đất trồng lạc tốt nhất

là loại đất thịt nhẹ, cát pha, để đất luôn tơi, xốp và có độ pH từ 5,5-7; Nhiệt độ

là yếu tố ngoại cảnh chủ yếu có ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của lạc Nhiệt độ trung bình thích hợp cho suốt đời sống cây lạc là khoảng 25-300C và thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng của cây; Nước là yếu tố ngoại cảnh có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất lạc Tuy lạc được coi là cây trồng chịu hạn, song thực ra lạc chỉ chịu hạn ở một giai đoạn nhất định Độ ẩm đất trong suốt thời gian sinh trưởng của lạc yêu cầu khoảng 70-80 % độ ẩm giới hạn đồng ruộng Yêu cầu này có cao hơn một chút ở thời kỳ ra hoa, kết quả (80 – 85 %) và giảm

ở thời kỳ chín của hạt Lạc được trồng chủ yếu vào các thời vụ sau:

Vụ Xuân: Thời gian gieo từ 20/1-25/2 hàng năm, tập trung chủ yếu từ 01-15/2 Riêng khu vực trung du và miền núi gieo sớm hơn 7-10 ngày

Vụ Hè - Thu: Gieo tốt nhất từ 1/6-15/6 và gieo ngay sau khi thu hoạch cây trồng vụ Xuân càng sớm càng tốt

Vụ Thu - đông: Thời gian gieo từ 25/8-25/9

So với cây lương thực và nhiều loại cây khác, cây lạc và cây vừng là những cây có giá trị kinh tế cao trên một đơn vị diện tích gieo trồng Do vậy, phát triển trồng lạc và vừng không chỉ thúc đẩy chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp mà còn nâng cao thu nhập cho người sản xuất

Thực tế trồng lạc ở các nước trên Thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng gặp rất nhiều khó khăn, do xuất hiện nhiều loại sâu bệnh gây hại chủ yếu

như: Sâu hại cây con: Sâu xám, phá hại khi cây mới mọc đến 2 - 3 lá, sâu cắn ngang thân cây Sâu làm giảm mật độ cây trên đồng ruộng Sâu hại lá: Có rất nhiều (sâu xanh, sâu khoang, sâu cuốn lá, sâu đo, sâu róm, rệp ) Sâu đục quả: Quả lạc ở dưới đất, nên sâu đục quả ít, thường gặp là “sùng trắng” (sâu non của bọ cánh cứng - bọ hung, xén tóc, cánh cam) Bệnh lở cổ rễ: Bệnh do

nấm phá hại cây non (từ khi mọc đến 3 lá) Nấm bệnh (nấm trắng và nấm đen) phá huỷ mạch dẫn vùng cổ rễ khiến cho cây lạc bị chết do không hút được nước

và dinh dưỡng Bệnh hại nặng khi đất bị quá ẩm, dí đất Vì vậy, cần tạo điều

kiện cho đất thông thoáng, độ ầm đất khoảng 70 – 75 % là thích hợp Bệnh đốm lá gồm 2 loại nấm gây bệnh đốm đen và đốm nâu Bệnh thường xuất hiện

sau khi lạc ra hoa và phá hại vào cuối thời kì sinh trưởng (từ ra hoa đến chín) Bệnh thường không làm chết cây, nhưng làm giảm năng suất do làm giảm số

quả và trọng lượng quả Bệnh héo xanh vi khuẩn là bệnh phổ biến và gây hại

nghiêm trọng cho lạc xuân ở các tỉnh miền Trung Bệnh thường xuất hiện từ khi cây có 5 lá thật đến thời kì quả phát triển Bệnh gây chết cây, có khi chết từng vạt, ảnh hưởng xấu đến năng suất do làm giảm số cây thu hoạch, bệnh nặng có thể làm giảm tới 80 % năng suất Bệnh đặc biệt phát triển nhanh trong mùa gió Lào Hiện chưa có thuốc đặc trị bệnh này Bệnh héo xanh vi khuẩn đã phát sinh

ở hầu hết các tỉnh, thành phố: Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Thái Nguyên,

Thanh Hoá, Nghệ An đã gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người nông dân,

có nơi có lúc bệnh đã gây thiệt hại nặng tới mức gây chết 80-100 % cây trồng Bệnh gây nghiêm trọng không chỉ ở những vùng chuyên trồng lạc mà còn ở cả những vùng mới trồng Bệnh tăng rất nhanh ở những vùng trồng lạc truyền thống và trồng liên tục từ năm này sang năm khác Tình hình gây hại là như vậy nhưng cho tới nay những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc và vừng chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân bố của bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống lạc và vừng hiện có Trong thời gian gần đây đã có phân hữu cơ vi sinh đa chức năng

có khả năng hạn chế bệnh héo xanh trên lạc từ 15-20 %

Tuy nhiên do bản chất kháng bệnh và sự biến đổi đặc tính độc của các chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên toàn Thế giới, cho nên các biện pháp phòng trừ bệnh này càng trở nên phức tạp và khó khăn Đặc biệt sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã không mang lại hiệu quả như mong muốn mà còn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường Ngày nay, các biện pháp phòng chống thay thế bằng phòng trừ sinh học đang thu hút được sự quan tâm của nhiều phòng thí nghiệm trên Thế giới và trong nước, kết quả cho thấy nhiều hứa hẹn và đây cũng sẽ là biện pháp rất cần thiết để thay thế các loại thuốc bảo

vệ thực vật hoá học trong tương lai Trên cơ sở đó, được sự đồng ý của Bộ NN

& PTNT, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh

vật sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng” thuộc Chương trình

CNSH Nông nghiệp, bắt đầu từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 12 năm 2009

1.1 MỤC TIÊU

Mục tiêu chung: Tạo được chế phẩm sinh học có hiệu lực và an toàn sinh học

phục vụ phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn trên lạc và vừng

Mục tiêu cụ thể:

- Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng cao với các chủng

vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên lạc và vừng

- Sản xuất được chế phẩm sinh học phục vụ phòng chống bệnh héo xanh lạc và vừng

1.2 Đối tượng nghiên cứu:

- Bệnh héo xanh vi khuẩn do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra,

- Vi khuẩn Ralstonia solanacearum,

- Vi khuẩn đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum,

- Cây lạc và vừng

1.3 Phạm vi nghiên cứu

- Trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và các thí nghiệm ngoài đồng ruộng tại Hà Nội, Nghệ An

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Kết quả của đề tài đã làm sáng tỏ hơn nữa khả năng ứng dụng các chủng vi sinh vật đối kháng trong công tác bảo vệ thực vật, đây là vấn đề có ý nghĩa khoa học cao, từ những kết quả này sẽ mở ra hướng ứng dụng rỗng rãi hơn nữa các vi sinh vật đối kháng trong nông nghiệp trên các đối tượng cây trồng khác nhau

- Về thực tiễn: các kết quả đã minh chứng rõ nét hiệu quả của sản phẩm đề tài, cụ thể sản phẩm đã được ứng dụng để phòng chống bệnh héo trong sản xuất lạc và vừng hiện nay, đã mang lại hiệu quả kinh tế và môi trường

1.5 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

Trong bối cảnh vấn đề dịch bệnh đối với cây trồng và vật nuôi đang diễn biến rất phức tạp, đây là hiện tượng báo hiệu một sự kháng thuốc của nhiều chủng

vi sinh vật gây bệnh, nhiều loại kháng sinh đã không còn tác dụng trong việc phòng chống một số bệnh nguy hiểm Đối với cây trồng đã xuất hiện hàng loạt các loại sâu bệnh như: đạo ôn, khô vằn, đốm nâu, rầy nâu, héo xanh, thối thân, thối quả…v….v… rất khó phòng trừ bằng thuốc hóa học Do đó, việc tìm giải pháp để

giải quyết vấn đề trên là cần thiết và cấp bách, trong đó Công nghệ sinh học Nông nghiệp đóng vai trò quan trọng

* Bệnh héo xanh vi khuẩn

Bệnh héo xanh cây trồng do Ralstonia solanacearum gây ra, là một loại

bệnh có nguồn gốc từ đất rất phổ biến trên Thế giới

Từ năm 1965, Kelman và Sequeira đã tìm ra được một số cơ chế phát sinh của bệnh Nhờ khả năng thiết lập một quần thể động trong quản bào và mạch gỗ của cây, nó khác biệt với phần lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa và gây khối u Ngày nay, nhiều công trình nghiên cứu về bệnh héo xanh cây trồng đã đưa ra những bằng chứng khoa học và kết luận có giá trị làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

Bệnh héo xanh vừng:

Cây vừng (Sesaum indicum L) là cây lấy hạt Hạt vừng có hàm lượng dầu

rất cao, giá trị sử dụng chủ yếu là làm thực phẩm, kể cả ở dạng dầu tinh khiết cũng như hạt thô Sản lượng vừng trên Thế giới là rất lớn khoảng 2 triệu tấn/năm, chủ yếu ở Châu Á (55 - 60%), Châu Mỹ (18 - 20%), Châu Phi (18 - 20%), ngoài ra còn có ở Châu Âu, Châu Đại Dương nhưng không nhiều Các quốc gia trồng nhiều vừng trên Thế giới là Ấn Độ (400.000 tấn/năm), Trung Quốc (320.000 tấn/năm),

Su Đăng (200.000 tấn/năm), Mêxicô (180.000 tấn/năm)

Cây vừng thường gặp bệnh héo do vi khuẩn R solanacearum gây nên, nhiều

lúc, nhiều nơi đã trở thành những dịch bệnh làm chết cây hàng loạt Bệnh đã làm tăng

tỉ lệ cây chết có khi đến 70-80%, làm thất thoát đáng kể năng suất cây vừng

Bệnh héo xanh lạc

Cây lạc (Arachis hypogaea) được trồng chủ yếu vào mùa Xuân (từ tháng 2

tới tháng 6) Mặc dù điều kiện và môi trường thuận lợi cho trồng lạc nhưng năng

suất vẫn ở mức thấp (1.09 tấn/ha) Bệnh héo xanh ở lạc gây nên bởi Ralstonia

solanacearum là loại bệnh chính phổ biến rộng rãi và gây nên nhiều thiệt hại cho

người trồng trọt, thậm chí có những vùng thiệt hại tới 70-80% Bệnh gây nghiêm trọng không chỉ ở những vùng chuyên trồng lạc mà còn ở cả những vùng mới trồng Bệnh tăng rất nhanh ở những vùng trồng lạc truyền thống và trồng liên tục

từ năm này sang năm khác

* Vi sinh vật đối kháng

Vi sinh vật (VSV) trong tự nhiên như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, vi-rút có mặt ở khắp mọi nơi nhưng đất là môi trường thích hợp nhất Do đặc điểm sinh sống của chúng có thể chia thành ba nhóm: có ích, gây bệnh và đối kháng VSV đối kháng có khả năng khống chế sinh học, tác động đối kháng lên nhóm VSV gây bệnh, tiêu diệt hoặc hạn chế quá trình sống của chúng Vì vậy, VSV đối kháng rất

có lợi cho việc bảo vệ cây trồng khỏi bị sâu bệnh tấn công [17]

Trong quần thể vi sinh vật, mỗi loài đều phải đấu tranh sinh tồn suốt cả quá trình tiến hóa dưới các hình thức khác nhau và rất linh hoạt Vi sinh vật có thể thay thế các tác nhân cạnh tranh của chúng bằng cách nhân lên với số lượng lớn, hoặc có thể hình thành các chất đặc hiệu hay không đặc hiệu trong quá trình chuyển hoá vật chất, nhằm ức chế sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật khác Các chất không đặc hiệu có thể là các axít hữu cơ, rượu, hoặc các hợp chất khác Đặc biệt ở một số loài vi khuẩn và nấm đã sử dụng cơ chế siderophores

Sử dụng vi sinh vật đối kháng đã được sự quan tâm và đầu tư rất lớn của nhiều phòng thí nghiệm trên Thế giới trong nhiều thập kỷ qua

Chae Gun Phae đã cho rằng, chủng Bacillus subtilis NB22 có thể tiết vào

đất chất iturin, chất này có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

gây bệnh héo xanh Trigalet, Frey và Demery đã đưa ra một bức tranh toàn cảnh gồm các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả về biện pháp phòng trừ sinh học

bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum như sau:

Khi sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đều cho thấy mức độ giảm

quần thể R solanacearum một cách hiệu quả, mặc dù hầu hết các kết quả đều ở

phạm vi phòng thí nghiệm, nhà kính và quy mô nhỏ ngoài đồng ruộng [18] Các

chất giống như kháng sinh sinh ra bởi Pseudomonas cepacia và Pseudomonas

glumae, cần được nghiên cứu kỹ hơn để đánh giá vai trò tiềm tàng của chúng

trong việc phòng chống R solanacearum ở trên đồng ruộng [16], [26]

Trong hầu hết các trường hợp thì các thực nghiệm trên đồng ruộng vẫn còn nhiều hạn chế, có thể do sự xâm nhiễm của các nhân tố phòng trừ sinh học vào trong rễ cây còn quá yếu, hoặc do sự phụ thuộc quá nhiều vào các điều kiện tự nhiên [12], [23]

* Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở ngoài nước:

Vi sinh vật đối kháng với một số bệnh cây trồng đã được các nhà khoa học trên Thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX [28], [30], [31], [32]

- Năm 1924, Porter đã xử lý hạt lúa mì với những thể vi khuẩn đối kháng, rồi

nhiễm với nấm Helminthosporium Kết quả những hạt đã nảy mầm bình thường

hoặc không bị nhiễm bệnh, hoặc bị nhiễm rất nhẹ

- Năm 1939, Cholonyi quan sát thấy độc tính của dịch chiết khoai tây có khả năng giết chết vi khuẩn và tính độc của dịch chiết tăng khi củ đã nẩy mầm

- Năm 1940, 1948, Weindling đã sử dụng nấm Trichoderma lignorum để bảo

vệ những cây cam con khỏi bệnh do Rhizoctonia gây ra Theo nhiều tác giả loài

nấm này cũng bảo vệ cả dưa chuột và quả lê

- Năm 1952, Gregory nuôi cấy Bacillus sp B-6, Actinomycetes No 67, nấm

Pecillium patulum và quan sát sự hình thành những chất kháng khuẩn trong đất

- Năm 1953, Petrusheva sử dụng dịch nuôi cấy của Actinomycetes như là một chất đối kháng với bệnh thối hạt thuốc lá gây nên bởi nấm Thielaviopsis basicola

Khi đất được xử lý với dịch vi khuẩn đối kháng thì cây phát triển bình thường, khi không có dịch đối kháng trong đất thì tỉ lệ cây chết là 70%

- Năm 1953, Gurinovich đã sử dụng dịch nuôi cấy của Actinomycetes và

những thể đối kháng vi khuẩn để chống lại bệnh thối của bắp cải, gây nên bởi vi

khuẩn không hình thành bào tử Pseudomonas campestris khi những thể đối kháng

được đưa vào đất thì cây vẫn phát triển bình thường

- Năm 1955, Kuzina sử dụng vi khuẩn đối kháng bệnh héo của bông gây nên

bởi Verticillum Tác giả đã xử lý hạt bông với vi khuẩn trước khi gieo Kết quả tỉ

lệ cây chết ở phần đối chứng là 54%, sau khi được xử lý với vi khuẩn đối kháng tỉ

lệ này là 8% - 9%

- Năm 1978, Cuppels và cs đã kết luận rằng, nhiều chủng vi khuẩn có khả

năng sản sinh bacteriocin và một số chủng sinh bacteriocin không độc có khả

năng giảm bệnh héo xanh của cà chua

- Năm 1986, Aspiras R.B và Cruz A R cho rằng Bacillus polymyxa và P

fluorescens có khả năng giảm bệnh héo xanh cà chua ở điều kiện nhà kính

- Năm 1990, Tanaka và cs đã phát hiện được các thực khuẩn thể không độc có

vai trò tiềm tàng trong phòng trừ sinh học đối với R solanacearum

- Năm 1993, Hsu đã cho rằng cải tạo đất bằng một hỗn hợp theo công thức ammonium sulphat, bột xương, bột hải ly, cua, glixerin, sỉ silic và valin đã làm

tăng tần xuất tạo khuẩn lạc của các chủng P fluorescens ở đầu rễ, chính vì vậy đã

làm tăng khả năng phòng chống bệnh héo xanh cho cây trồng ở các thực nghiệm trong chậu

- Năm 1993, Elphinstone và Aley đã chỉ ra một loài khác là P cepacia được

phân lập từ rễ ngô có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh trong phòng thí nghiệm và trong chậu

- Jaime R Montealegre đã sử dụng chủng vi khuẩn đối kháng trong kiểm soát

bệnh do Rhizoctonia solani gây ở cà chua [24], [21]

- Karden Mulya đã công bố kết quả việc sử dụng phương pháp nhúng rễ cây

cà chua non trong dung dịch nuôi cấy P fluorescens PfG32 trước khi trồng, P

fluorescens PfG32 được phân lập từ vùng rễ cây hành

- A Muslim đã công bố khả năng kiểm soát bệnh do nấm Fusarium

oxysporum f spp spinaciae (FOS) của 4 chủng Rhizoctonia (G1, L2, W1 và W7)

đạt 77% - 97%

- Nobutaka đã công bố chủng Serratia marcescens B2 được phân lập từ vùng

rễ cây cà chua, có khả năng ức chế sự phát triển của một vài loại nấm gây bệnh và

mốc xám ở cây hoa anh thảo gây nên bởi Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum f.spp cyclaminis S marcescens B2 có tạo ra enzym phân giải như chitinaza

- Nhiều tác giả đã đưa ra cơ chế siderophores và kháng sinh như là những nhân tố đối kháng nấm và vi khuẩn rất hiệu quả [19], [20, [25]

- B.F Hu đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas spp (P751) và Bacillus cereus (B752) từ lá thông Chúng có khả năng ức chế sinh

trưởng và phát triển của 9 loài nấm và côn trùng, 2 chủng này an toàn đối với người, thực vật và động vật, ức chế bệnh và tăng năng suất cây trồng như lúa, lúa

mì, thuốc lá, vải, trà, rau và cỏ

- Ciampi-Panno đã tách được chủng P fluorescens BC8 có thể ức chế mạnh vi

khuẩn gây bệnh héo xanh ở khoai tây, đặc biệt khi hạt được bao bọc một lớp vỏ vi

khuẩn P fluorescens BC8 Dường như vi khuẩn này có thể xâm nhập được vào

cây chủ qua hệ thống rễ, song hiệu quả kháng bệnh chưa cao, thực tế sự nhiễm bệnh ở củ vẫn xảy ra

- Hiện nay, nhiều loại chế phẩm phòng trừ sinh học có nguồn gốc sinh học khác nhau đã được lưu hành trên Thế giới như: Xentari 35 WDG là sản phẩm của

hãng Abbott, thành phần chính gồm Bacillus thuringensis var aizawai 3500

BIU/mg Delfin WG 32 BIU là sản phẩm của hãng Sandoz Agro, Thụy Sĩ, thành

phần chính gồm Bacillus thuringensis var kurstaki 32 BIU/kg

- MVP 10 FS là sản phẩm của Mỹ MVP 10 FS được đặc chế bằng công

nghệ biến nạp gen cao cấp của Mỹ, chứa độc tố Bacillus thuringensis var kurstaki, được bảo quản bằng màng tế bào cứng của vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens, thành phần gồm độc tố delta-endotoxin của Bacillus thuringensis var

kurstaki, nước và các phụ gia [27] VBt là sản phẩm của Viện Công nghệ Sinh học Hải Nam- Trung Quốc Aztron 7000DBMU là sản phẩm của hãng Abbott, Mỹ

Tập kỳ 1.8EC là sản phẩm của xạ khuẩn Streptomyces avermitilis v v

- Một số tác giả đã phát hiện được một số chủng vi sinh vật có khả năng đối

kháng với R solanacearum như: Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas

glumae; Pseudomonas cepacia; Bacillus sp.; Erwinia sp và các thể đột biến của

R solanacearum không độc

Theo nhà nghiên cứu bệnh học thực vật David Schisler thuộc sở Nông

nghiệp Hoa Kỳ (ARS), vi khuẩn phát sinh tự nhiên có thể cạnh tranh với vi nấm F

graminearum về chất dinh dưỡng tiết ra từ các bao phấn của cây lúa mì Trong các

cuộc thử nghiệm, các công thức phun xịt vi khuẩn có lợi trên các miếng đất trồng hai loại cây lúa thương mại đã làm giảm đi tính khắc nghiệt của bệnh vảy nấm được 63% Kết quả là các dòng trao đổi chất choline (CM) có thể tham gia vào các

vi khuẩn đối kháng chống bệnh vảy nấm khác mà nhóm của Schisler đã nghiên cứu được, trong đó có men và vi khuẩn tiết chất kháng sinh Schisler hình dung sẽ kết hợp các vi khuẩn đối kháng này lại trong một công thức trừ sâu sinh học để các nông dân có thể xịt lên lúa mì, bổ sung vào phương pháp bảo đảm chống lại bệnh vảy nấm

Tóm lại, vi sinh vật đối kháng đã được nhiều nhà khoa học trên Thế giới nghiên cứu và đã đưa vào sản xuất nhiều loại chế phẩm Tuy nhiên, hiệu quả trong lĩnh vực phòng chống bệnh héo xanh cây trồng nói chung, lạc và vừng nói riêng còn nhiều hạn chế, vì phải phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: kỹ thuật thâm canh, tiểu vùng khí hậu, giống cây trồng, nhiệt độ, thời vụ canh tác và chính bản thân của chế phẩm .v v

* Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong nước

Xuất phát từ thực tế về bệnh héo xanh cây trồng ở Việt Nam, các biện pháp phòng trừ sinh học bệnh này đã và đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như nhiều phòng thí nghiệm ở nước ta trong nhiều thập kỷ qua

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nghiên cứu khả năng sinh kháng

sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh của Streptomyces arabicuss 112 và chế phẩm sinh học Fluorecent từ Pseudomonas fluorescens Sản phẩm có khả năng

phòng trừ bệnh thối thân, thối rễ và vàng lá ở một số loài cây nhất định [15]

Trường Đại học Sư phạm I - Hà Nội đã nghiên cứu chủng xạ khuẩn

Streptomyces V6 có khả năng sinh kháng sinh chống nấm và vi khuẩn R solanacearum [1]

Viện Công nghệ Sinh học cũng đã sản xuất các chế phẩm Bt và một số chế phẩm sinh học khác có nguồn gốc từ vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm v v… Các chế phẩm này đã có tác dụng trong phòng chống một số sâu và bệnh hại cây trồng

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (cũ) đã nghiên cứu tạo chế phẩm phân bón vi sinh trên cơ sở một tập hợp đa chủng vi sinh vật, trong đó có vi khuẩn đối kháng, sản phẩm được sử dụng trong trồng trọt vừa có tác dụng kích thích sinh trưởng của cây, vừa có khả năng ức chế một số bệnh thực vật gây ra bởi

vi khuẩn hoặc nấm [14]

Viện Bảo vệ thực vật cũng đã sử dụng một số chế phẩm sinh học có nguồn

gốc từ nấm Metarhizium ansopliae có độc tính cao đối với bọ dừa, Bt (Bacillus

thuringensis) và NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) có tác dụng trong phòng trừ

một số sâu hại rau Nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh

cây trồng

Bacterin BT là chế phẩm của Liên hiệp Khoa học sản xuất hoá chất, Tổng công ty Hoá chất công nghiệp và tiêu dùng, Bộ Công nghiệp nặng, thành phần

chính gồm Bacillus thuringensis var kurstaki

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã

cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng

Bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ Các nghiên cứu cho thấy nấm

Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên

cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác

như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani

Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hoá và phòng Di truyền và Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp đã phân lập được một số chủng

vi khuẩn đối kháng có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của R

solanacearum [10], [11]

Các nghiên cứu đã đưa ra được các chế phẩm vi sinh đối kháng để phòng trừ một số bệnh cây trồng, nhưng đối với bệnh héo xanh thì cho đến nay các sản phẩm có giá trị cao (khả năng hạn chế bệnh cao – khoảng hơn 60%) thì hầu như chưa có Do đó, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng có khả năng phòng bệnh héo xanh cây trồng nói chung và cây lạc, vừng nói riêng (đạt trên 60%) là rất cần thiết và cấp bách, sản phẩm không những chỉ hạn chế bệnh héo xanh mà còn mang lại lợi ích kinh tế, xã hội và bảo vệ môi trường sâu sắc

II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 Vật liệu nghiên cứu

2 1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cây lạc, vừng, vi khuẩn R solanacearum và vi sinh vật đối kháng

- Mẫu đất, cây được thu từ đất trồng lạc, vừng và các cây lạc, vừng có biểu

hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh điển hình ở một số tỉnh như: Hà Nội,

Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tây, để phân lập vi khuẩn R solanacearum

- Mẫu đất, cây được thu từ đất trồng lạc, vừng và các cây lạc, vừng, cỏ, ớt,

hành và cà chua khỏe để phân lập vi sinh vật đối kháng

- Các môi trường phân lập vi khuẩn:

+ Môi trường TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R solanacearum

(Kelman, 1954): pepton 10g; cazein hydrolyzat 1g; glucoza 5 g; thạch 20 g; nước

cất 1 lần 1000ml; pH = 7,0 Khử trùng ở 0,5 at, 1210C, 20 phút, làm lạnh đến 600C

và thêm 5 ml 2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1 %

+ Môi trường 523: Để nuôi cấy R.solanacearum: MgSO4.7H2O (6,25%) 5 ml; K2HPO4 12,5 %) 16,3 ml; yeast extract 4 g; casein hydrolyzat 8 g; sacaroza 10 g; agar 18 g; nước cất 1000 ml; pH = 7,0

+ Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối kháng: Yeast extract 5 g; pepton 20 g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5 %) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25 %) 25 ml; nước cất 1000 ml; pH = 7,0

+ Môi trường LB: Để nuôi cấy vi khuẩn đối kháng (Luria Broth: Difco Bacto): tryptone 10 g; yeast extract 5 g; NaCl 5 g; nước cất 1000 ml; pH = 7,0

- Các môi trường phân lập nấm:

+ Môi trường PDA: Glucoza 20 g; Khoai tây 200 g; Thạch 15 g; nước cất

- Các dung dịch đệm chủ yếu để tách ADN vi sinh vật

+ Đệm CTAB: 100 mM Tris HCl, pH = 9,0; 20 mM NaEDTA, pH = 8,0; 1,4M NaCl; 2 % Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB); 0,2% β- mercapto ethanol

+ Đệm gây tan tế bào “Lysis”: 50 mM Tris - HCl; 50 mM EDTA; 3

% SDS; 1% 2 - mercapto ethanol; chloroform; TE : saturated phenol (1/1 phenol bão hoà trong TE); TE: 10 mM Tris - HCl (pH = 8,0); 1 mM EDTA; 3M NaOAc (pH = 8,0); isopropanol, ethanol 70 %

+ Dung dịch mẹ:

* Dung dịch phenol bão hoà TE

* Dung dịch chloroform: isomylacohol (24/1)

* Dung dịch TE (10 mM Tris - HCl pH = 8,0; 1 mM EDTA)

+ Dung dịch đệm điện di 10xTBE: Tris Base: 108 g; boric acid 55 g; 0,5M EDTA (pH = 8,0) 40 ml; nước 1000 ml

- Các vật tư khác để sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng: Than bùn, gỉ

đường, N,P,K, khoáng chất vi lượng khác, phụ gia, v v

- Các thiết bị, hoá chất của Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông

hóa

2 1.2 Địa điểm nghiên cứu

Các nội dung cần giải quyết để thực hiện mục tiêu của đề tài sẽ được tiến hành tại các cơ sở nghiên cứu có uy tín như: Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia

Hà Nội), Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Sinh học và Môi trường Thực nghiệm tại: Vĩnh Phúc, Hà Nội và Nghệ An

2 1.3 Thời gian nghiên cứu

3 năm (từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 12 năm 2009)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung I: Khảo sát, điều tra tình hình bệnh héo xanh cây lạc, vừng và

phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.1 Khảo sát, điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum trên

cây lạc và vừng ở miền Trung và miền Bắc Việt Nam; (Điều tra tình hình gieo trồng, bệnh héo xanh lạc vừng ở vùng nghiên cứu, biện pháp phòng trừ bệnh héo xanh)

1.2 Phân lập và tuyển chọn một bộ sưu tập đa dạng các chủng vi khuẩn R

solanacearum có tính độc cao gây bệnh héo xanh trên cây lạc và vừng; (tuyển

chọn được các chủng vi khuẩn R solanacearum có tính độc cao, có thể gây chết

cây từ 60 - 85 %, để làm vật liệu nghiên cứu)

Nội dung II Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng vi

khuẩn Ralstonia solanacearum

2.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với R

solanacearum từ những mẫu đất và những cây lạc và vừng ở nhiều vùng sinh thái

khác nhau;

2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học các chủng vi sinh vật đối kháng;

2.3 Đánh giá độc tính của các chủng vi sinh vật đối kháng;

2.4 Đánh giá hoạt tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật đối kháng đến loài;

2.5 Lựa chọn các chủng vi sinh vật đối kháng điển hình để sử dụng sản xuất chế phẩm vi sinh;

Nội dung III Nghiên cứu quy trình sản xuất, ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phòng chống bệnh héo xanh cây lạc và vừng

3.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng bệnh héo xanh cây lạc và vừng trong phòng thí nghiệm;

3.2 Thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật đối kháng bệnh héo xanh cây lạc và vừng trong phòng thí nghiệm và nhà kính;

3.3 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng để sử dụng thử nghiệm trên diện hẹp ngoài cánh đồng;

3.4 Đánh giá mức độ sống sót của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm;

3.5 Nghiên cứu sự tương tác giữa các chủng vi sinh vật trong chế phẩm;

3.6 Đánh giá hiệu quả kinh tế và môi trường của chế phẩm;

3.7 Xây dựng quy trình sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh vật đối kháng tại hai cơ sở sản xuất (mỗi cơ sở có 10.000m2/một loại cây trồng); huyện Mê Linh-Vĩnh Phúc và Sóc Sơn-Hà Nội

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp điều tra, phân lập vi khuẩn R solanacearum

- Phương pháp điều tra: điều tra diện tích trồng lạc và vừng ở các địa

phương thuộc miền Trung và miền Bắc Việt Nam Điều tra tình hình bệnh héo

xanh do vi khuẩn R solanacearum và F oxysporum ở các tỉnh [2, 9, 16]

Xác định tỷ lệ % cây bị bệnh héo xanh tại một số ruộng đại diện để có số liệu

về mức độ thiệt hại do bệnh héo xanh gây ra được tính theo công thức [3]:

Tỷ lệ cây nhiễm bệnh = Tổng số cây điều tra x 100% Số cây bị bệnh

- Phương pháp thu mẫu cây bệnh héo xanh: chỉ thu mẫu ở những cây mới bị

bệnh Mỗi thửa ruộng (khoảng 200 m2) thu 2 ÷ 5 đoạn thân sát gốc có kích thước 3cm, giữ trong túi polyetilen Ghi thời gian thu mẫu (ngày, tháng, năm), địa điểm, giống cây, Sau mỗi lần cắt, dụng cụ cắt phải được tẩy trùng bằng cồn 70 % để tránh làm lây lan mầm bệnh giữa các mẫu với nhau

- Phương pháp xử lý mẫu: Sau khi được rửa sạch bằng nước máy và sát

trùng bề mặt bằng cồn 70 %, các mẫu bệnh được bổ dọc và cắt những phần bị nhiễm bệnh (có màu nâu nhạt), ngâm trong ống eppendorf chứa 1 ml nước cất vô trùng, để ở nhiệt độ phòng Sau 5 ÷ 10 phút có thể quan sát thấy một dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa thôi ra từ mẫu bệnh Sau 20 phút loại bỏ đoạn thân nhiễm bệnh ra khỏi ống dịch thôi vi khuẩn Những ống dịch này được bảo quản ở nhiệt

độ 200C

- Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R.solanacearum: pha

loãng dịch thôi vi khuẩn sao cho có thể thu được các khuẩn lạc riêng biệt sau khi

cấy gạt trên môi trường TTC, ủ ở nhiệt độ 280C ± 20C Theo dõi và ghi kết quả sau

24, 48 và 72 giờ Từ mỗi nhóm hình thái khuẩn lạc tiến hành chọn 3 đến 5 khuẩn lạc để cấy vạch trên môi trường 523 Sau 24 ÷ 48 giờ ủ ở nhiệt độ 280C ± 20C, tiến hành chọn những khuẩn lạc có kiểu hình thái điển hình của loài vi khuẩn và giữ trong nước cất vô trùng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo [6, 7, 8]

- Phương pháp đánh giá tính độc của R solanacearum: sử dụng phương

pháp cắm tăm để gây độc nhân tạo, kiểm tra số cây chết và sống sót theo thời gian,

dựa vào kết quả để đánh giá tính độc của vi khuẩn R solanacearum theo 5 mức độ

khác nhau theo Winstead và Kelman

Mức độ độc Triệu chứng của cây

0 Không có triệu chứng

1 Một lá héo hoặc héo từng phần

2 Hai tới ba lá héo hoặc héo từng phần

2.3.2 Phương pháp thu mẫu và phân lập nấm F oxysporum

Mẫu bệnh nấm F oxysporum được thu từ các thân cây và mẫu đất đã bị nhiễm

bệnh Phân lập từ thân cây: cắt một phần nhỏ thân cây đã bị nhiễm, sát trùng bề mặt bằng dung dịch chất tẩy 10 % trong 5 phút, để khô trên giấy thấm, cắt từng mảnh nhỏ dày khoảng 2-4 mm, đặt 5-6 mảnh trên đĩa môi trường PDA, ủ dưới ánh sáng huỳnh quang Các sợi nấm sẽ phát triển từ những mảnh thân cây, chuyển

những isolates sang đĩa môi trường PDA mới, ủ những đĩa này trong 10-14 ngày,

những khuẩn lạc của F oxysporum có mầu tím đỏ và được bao phủ bởi một hệ sợi

trắng hồng [4, 5]

Phân lập từ đất theo phương pháp của Komada: hòa loãng mẫu đất thành các nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ được cấy trên môi trường chọn lọc Các bước tiếp theo được tiến hành như trên

2.3.3 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng R solanacearum và F oxysporum

- Thu mẫu: mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây lạc và

vừng khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm ÷ 20

cm, mỗi điểm thu 100g đất, mẫu được đựng trong từng túi polyetilen riêng biệt,

ghi ngày tháng năm và địa điểm thu mẫu

- Phân lập và tuyển chọn: (theo Geels và Schippers -1983) [22]

10g đất được khuấy đều trong 90 ml nước cất khử trùng, lắc 30 phút, để lắng tự nhiên, lấy phần dịch trong để phân lập vi khuẩn đối kháng Mẫu thu từ các cây được nghiền trong cối sứ có chứa 1 ml nước cất khử trùng, bỏ cặn, sử dụng phần dịch để phân lập vi khuẩn đối kháng

Bước 1: Mỗi mẫu dịch trên được pha loãng đến nồng độ nhất định, sao cho

khi dùng 0,1 ml trải đều trên bề mặt môi trường KB hoặc PDA, ủ ở nhiệt độ

280C÷300C trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt

Bước 2: Những khuẩn lạc có sắc tố vàng, nâu hoặc xanh nhạt được hoà

loãng trong các ống eppendorf riêng biệt, dùng 100µl dung dịch trải đều trên bề mặt đĩa môi trường KB hoặc PDA (mật độ tế bào trong dung dịch sao cho sau khi

ủ ở 280C ÷ 300C trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt)

Bước 3: Phun dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh phủ lên bề mặt môi trường,

ủ ở nhiệt độ 280C ÷ 300C trong 24 ÷ 48 giờ

Bước 4: Quan sát các đĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế

(vòng vô khuẩn), nghĩa là có vi khuẩn đối kháng tại điểm đó

Bước 5: Những tế bào vi khuẩn đối kháng được làm sạch và giữ trong nước

cất khử trùng hoặc glyxerol 30 % ở - 800C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

- Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng

- Chủng vi khuẩn đối kháng cần kiểm tra được cấy bằng tăm vô trùng lên điểm giữa của bề mặt môi trường KB (môi trường đặc), để vi khuẩn phát triển ở

280C ÷ 300C trong 24 ÷ 48 giờ, các tế bào phát triển thành cụm khuẩn lạc hình tròn

- Dùng bông vô trùng loại bỏ các tế bào trong cụm khuẩn lạc

- Xử lý những tế bào còn sống sót bằng cách xông hơi chloroform từ 45 đến

2.3.4 Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp Sequence

- Phương pháp nhân bản gen - PCR

Hỗn hợp phản ứng gồm: H2O cất khử trùng 22,3 µl, đệm 10xPCR 2 µl, dNTPs 1,6 µl, MgCl2 0,6 µl, primer fD1 (fD1 có trình tự: 5’- agagtttgatcctggctcag -3’) 1µl, primer rP2 (rP2 có trình tự: 5’- cggctaccttgttacgactt- 3’) 1µl, Taq-DNA polymeraza 0,5 µl và ADN khuôn 1 µl (10ng) Phản ứng nhân bản gen được thực hiện trên máy Temp Control System PC- 800 và sử dụng chương trình chu kỳ nhiệt như sau: bước 1: 940C 2 phút; bước 2 gồm 30 chu kỳ: 940C 1 phút; 500C 1

phút và 720C 1,5 phút; bước 3: 720C 5 phút Sản phẩm PCR được làm sạch theo protocol QIA quick PCR Purification và phân tích trên gel agaroza 1%

- Phương pháp Sequence

Sản phẩm PCR gen 16S rARN của vi khuẩn được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp primer có ký hiệu: fD1 và rP2 được tinh sạch bằng kít QIAquick PCR Purification (QIAGEN Inc.) và gắn vào vector pGEM®-T (Promega Corp., Madison, Wis.), theo quy trình của nhà cung cấp kít Vector tái tổ hợp được biến

nạp vào chủng vi khuẩn E coli DH5α và nuôi cấy trên môi trường LB, mỗi đĩa

môi trường được bổ sung 20 µl IPTG 100 mM, 20 µl XGal 40 ng/ml và 40 µl ampicillin 25 ng/ml), ủ ở nhiệt độ 370C trong 18 ÷ 24 giờ Những khuẩn lạc có màu trắng (đã gắn gen tái tổ hợp) được sử dụng để tách plasmid tái tổ hợp, những plasmid này sau khi nhân bản và tinh sạch bằng kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN Inc.) được dùng để sequence Quá trình sequence được tiến hành với bộ hoá chất FS - DNA sequencing kit, theo qui trình của nhà sản xuất và giải trình tự bằng máy tự động ABI 377 PRISM (Perkin Elmer)

Sử dụng chương trình BLASTN để phát hiện những trình tự tương đồng với các trình tự nghiên cứu đã được công bố trong ngân hàng gen, nhằm xác nhận trình tự đích và chọn một số trình tự có độ tương đồng cao để so sánh và phân tích Sử dụng chương trình phần mềm máy tính MEGA2 để đối chiếu Phân tích

và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tối thiểu (Maximum Parsimony (MP) method) và phương pháp tiến hoá tối thiểu (Minimum Evolution (ME) method) trên cơ sở khoảng cách di truyền theo mô hình Kimura Giá trị bootstrap của cây phát sinh chủng loại ME và MP được tính với 1000 lần lấy mẫu thử (resampling), dựa vào cây phả hệ người ta xác định được mối quan hệ của các chủng vi khuẩn cần kiểm tra

2.3.5 Phương pháp đánh giá độc tính của chủng vi khuẩn đối kháng trên cây trồng

Phương pháp đánh giá tính độc của các chủng vi khuẩn sử dụng theo 10TCN: 216-1995 (216-2003) Thí nghiệm chia thành 6 công thức: CT1: công

thức đối chứng là đất không nhiễm sinh khối vi khuẩn; CT2: đất nhiễm R

solanacearum (104-105cfu/g); CT3: đất nhiễm F oxysporum (104-105bt/g); CT4:

đất nhiễm hỗn hợp các chủng vi khuẩn đối kháng; CT5: gồm CT2+hỗn hợp vi khuẩn đối kháng; CT6: gồm CT3+hỗn hợp vi khuẩn đối kháng Mỗi công thức trồng 6 cây

2.3.6 Phương pháp đánh giá độc tính của chủng vi khuẩn đối kháng trên chuột bạch

Phương pháp đánh giá độc tính của vi khuẩn đối kháng trên chuột bạch: theo phương pháp LD50 oral (liều gây chết trung bình 50 % cá thể chuột khi thuốc xâm nhập qua đường miệng) của NIAST, 2003 Chuột bạch có trọng lượng 18 g/con được nuôi ổn định trong 3 ngày, sau đó phân thành các công thức tương ứng

với số lượng chủng vi khuẩn đối kháng thí nghiệm và chủng B subtilis trong men tiêu hóa làm đối chứng dương, mỗi chủng vi khuẩn kiểm định được tiến hành trên

15 con và chia thành 3 lô, mỗi lô được bố trí ăn thức ăn đã được trộn với dịch vi khuẩn đối kháng tương ứng với các nồng độ 2.107; 2.108 và 2.109 tb/g thức ăn Theo dõi các triệu chứng bất thường của chuột trong vòng 24 giờ để đánh giá mức

độ gây độc cấp tính và theo dõi khả năng gây độc bán trường diễn trong 30 ngày của các chủng vi khuẩn đối kháng Nếu có chuột chết thì mổ ra quan sát tổng thể phủ tạng, tính tỷ lệ chuột chết và xác định LD50 theo công thức Karber-Behrens :

LD50 = Df - Sab/n

Df : Liều làm chết 100% súc vật

a : Trị số trung hình của tổng số súc vật chết ở 2 liều kế tiếp

b : Hiệu số giữa 2 liều kế tiếp

n : Số súc vật chết ở mỗi liều hoặc số trung bình các lô

2.3.7 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng

- Đánh giá khả năng tương tác của các chủng VSV đối kháng tuyển chọn ở

điều kiện hỗn hợp trong chế phẩm dạng lỏng và bột, thông qua việc xác định mật

độ tế bào VSV và hoạt tính sinh học của chúng ở dạng đơn lẻ và dạng hỗn hợp

trong chế phẩm

+ Các chủng VSV lựa chọn sau thời gian nuôi cấy 48 h được nhiễm vào chất mang dạng lỏng (môi trường dinh dưỡng tự nhiên hoặc nhân tạo, đảm bảo mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn 108- 109CFU/ml(g)); hoặc dạng bột (than bùn) với mật độ tương đương nhau Kiểm tra xác định mật độ tế bào VSV và hoạt tính sinh học của chúng bằng cách nêu trên sau các thời gian khác nhau

+ Phương pháp Koch: để xác định mật độ tế bào VSV (đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa môi trường để xác định đơn vị hình thành khuẩn lạc: CFU/ml)

- Nghiên cứu sản xuất sinh khối VSV hữu hiệu

+ Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho từng chủng VSV: nguồn dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, kiểu nuôi cấy, chế độ cấp khí, thời gian nuôi cấy

+ Lựa chọn môi trường nhân sinh khối VSV từ các nguồn vật liệu rẻ tiền, dễ kiếm song phải đảm bảo cho VSV sinh trưởng phát triển tốt

+ Lên men thử nghiệm, xác định các thông số kỹ thuật cho nhân sinh khối VSV trên thiết bị lên men chìm qui mô 3lít/mẻ

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm

+ Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất gồm: Nghiên cứu tỉ lệ phối trộn

sinh khối vi sinh vật, các chất khoáng và nguyên liệu hữu cơ khác nhau như: than bùn, gỉ đường và phụ gia để chọn quy trình phù hợp

+ Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm: Chế phẩm tạo ra sẽ được bảo

quản bằng các phương pháp khác nhau: giữ ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ lạnh 40C,

bổ sung chất bảo quản ; kiểm tra sự sống sót và hoạt tính sinh học của các chủng VSV sau các thời gian bảo quản từ 1- 6 tháng

2.3.8 Đánh giá hiệu quả hạn chế bệnh của chế phẩm vi sinh đối kháng

- Phân bón cho các thí nghiệm:

+ Cho lạc (1 ha): 25 kg N, 70 kg P2O5, 60 kg K2O, 400kg vôi, 8 tấn phân chuồng

+ Cho vừng (1ha): 57,5 kg N, 85 kg P2O5, 55 kg K2O, 300kg vôi, 4 tấn phân chuồng

- Phương pháp thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến bệnh héo xanh và năng suất cây lạc [13]

* Thí nghiệm nhà lưới: thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên (Phạm Chí Thành, 1972), 3 công thức, mỗi công thức 6 xô, 6 cây/xô, lặp lại 3 lần

CT1 (đối chứng): Đất nhiễm R.solanacearum; CT2: Đất nhiễm R solanacearum + chế phẩm VSV1; CT3: Đất nhiễm R solanacearum + chế phẩm L1 Cách xử lý

chế phẩm: Hạt lạc được ủ ẩm qua đêm (đã nứt nanh) rồi ngâm trong chế phẩm VSV1, L1 trước khi gieo 30 phút Bổ sung 5-10 ml dịch chế phẩm với mật độ 108 cfu/ml/hốc đất trước gieo hạt Theo dõi tỷ lệ bệnh héo xanh sau 10, 20, 30 và 40 ngày Đo các chỉ tiêu sinh trưởng như chiều cao cây, trọng lượng tươi, khô và năng suất

* Thí nghiệm ngoài đồng: diện tích 500 m2 chia thành 3 công thức: CT1 (Đối chứng): không nhiễm chế phẩm vi sinh vật; CT2: nhiễm chế phẩm VSV1; CT3: nhiễm chế phẩm L1 Cách xử lý chế phẩm lần 1: Hạt lạc được ủ ẩm qua đêm (đã nứt nanh) rồi trộn đều trong chế phẩm VSV1, L1 (với mật độ khoảng 108 CFU/g) trước khi gieo 30 phút Chế phẩm được rải đều trên mặt rãnh, gieo hạt theo tỉ lệ nhất định, lấp nhẹ một lớp đất lên trên Cách xử lý chế phẩm lần 2: chế phẩm được bổ sung vào quanh gốc khi cây ở giai đoạn chuẩn bị vun Theo dõi tỷ

lệ bệnh héo xanh sau 24, 31, 38 và 45 ngày Đo các chỉ tiêu sinh trưởng như thí nghiệm trong nhà lưới

* Xây dựng mô hình: Mô hình được xây dựng trên diện tích 10.000 m2; trong đó 5.000 m2 đối chứng (gieo trồng theo nông dân); 5.000 m2 thí nghiệm (có

bổ sung chế phẩm vi sinh đối kháng Cách xử lý chế phẩm lần 1: Hạt lạc được ủ

ẩm qua đêm (đã nứt nanh) trộn đều trong chế phẩm VSV1 (với mật độ khoảng 109 CFU/g) trước khi gieo 30 phút Chế phẩm được rải đều trên mặt rãnh, hoặc trộn đều và gieo cùng với hạt lạc), gieo hạt theo tỉ lệ nhất định, lấp nhẹ một lớp đất lên trên Cách xử lý chế phẩm lần 2: chế phẩm được bổ sung vào quanh gốc khi cây ở giai đoạn chuẩn bị vun

Đánh giá tỷ lệ bệnh héo xanh trên cả hai lô thí nghiệm và đối chứng theo các giai đoạn phát triển của cây trồng: cây non; khi có nụ hoa và trước khi thu hoạch Đo các chỉ tiêu sinh trưởng như thí nghiệm trong nhà lưới và đánh giá sản lượng thu hoạch

- Phương pháp thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến bệnh héo xanh và năng suất cây vừng

* Thí nghiệm nhà lưới: Thí nghiệm trên 4 công thức, mỗi công thức 6 xô, 6

cây/xô, lặp lại 3 lần CT1 (đối chứng): Đất nhiễm R solanacearum; CT2: Đất nhiễm R solanacearum + chế phẩm V1; CT3: Đất nhiễm R solanacearum + chế phẩm V2; CT4: Đất nhiễm R solanacearum + chế phẩm VSV2 Chế phẩm được

rắc vào từng hốc, sau đó hạt vừng được gieo theo mật độ nhất định, phủ một lớp đất mỏng lên trên Theo dõi tỉ lệ bệnh ở các giai đoạn nụ-hoa; quả non và trước thu hoạch và các chỉ tiêu sinh trưởng như đối với lạc

* Thí nghiệm ngoài đồng: Chế phẩm được rắc vào rãnh, sau đó hạt vừng được gieo theo mật độ nhất định, phủ một lớp đất mỏng lên trên Theo dõi tỉ lệ bệnh ở các giai đoạn nụ-hoa; quả non và trước thu hoạch và các chỉ tiêu sinh trưởng như đối với lạc

* Xây dựng mô hình: Mô hình được xây dựng trên diện tích 10.000 m2; trong đó 5.000 m2 đối chứng (gieo trồng theo nông dân); 5.000 m2 thí nghiệm (có

bổ sung chế phẩm vi sinh đối kháng Cách xử lý chế phẩm lần 1: Một phần chế phẩm được rải đều trên mặt đất, sau khi lên luống xong, trộn chế phẩm với vừng

và tro bếp hoặc đất bột rải đều trên mặt luống, sau đó dùng cành cây kéo qua hoặc bừa lướt nhẹ, để lấp hạt vừng 1-2cm

Đánh giá tỷ lệ bệnh héo xanh trên cả hai lô thí nghiệm và đối chứng theo các giai đoạn phát triển của cây trồng: cây non; khi có nụ hoa và trước khi thu hoạch Đo các chỉ tiêu sinh trưởng như thí nghiệm trong nhà lưới và đánh giá sản lượng thu hoạch

- Đánh giá hiệu quả kinh tế, kỹ thuật của mô hình ứng dụng chế phẩm

+ Kiểm tra, giám sát và đánh giá ưu, nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm Đánh giá hiệu quả và tính khả thi của việc sử dụng chế phẩm trong thực tiễn sản xuất

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu:

Xử lý số liệu bằng chương trình Excel

2.3.10 Xây dựng quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh đối kháng

+ Xác định liều lượng và cách sử dụng chế phẩm đạt hiệu quả cao nhất thông qua các kết quả thí nghiệm và thử nghiệm đồng ruộng để xây dựng quy trình sử dụng

+ Dựa trên các kết quả về khả năng hạn chế bệnh và năng suất để xây dựng tài liệu về chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm

2.3.11 Hội thảo nông dân về tác dụng, quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh đối kháng

Tổ chức hội thảo, hội nghị, tập huấn: “Giới thiệu qui trình sản xuất chế

phẩm vi sinh đối kháng”; “thành phần và tác dụng của chế phẩm vi sinh đối kháng”; “hướng dẫn qui trình sử dụng chế phẩm vi sinh đối kháng”

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Khảo sát, điều tra tình hình bệnh héo xanh cây lạc, vừng do vi khuẩn

Ralstonia solanacearum và nấm Fusarium oxysporum

3.1.1 Khảo sát, điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum và nấm F oxysporum trên cây lạc và vừng ở Việt Nam

A Tình hình canh tác vừng trong nước và Thế giới

Trên Thế giới, vừng được trồng phổ biến ở nhiều Quốc gia, nhất là Ấn Độ (400.000 tấn/năm), Trung Quốc (320.000 tấn/năm), Su Đăng (200.000 tấn/năm), Mêxicô (180.000 tấn/năm) Sản lượng vừng trên Thế giới là khác nhau giữa các vùng, sản lượng hàng năm trung bình khoảng 2 triệu tấn, tập trung chủ yếu ở Châu

Á (55 – 60 %), Châu Mỹ (18 – 20 %), Châu Phi (18 – 20 %), ngoài ra còn có ở Châu Âu, Châu Đại Dương nhưng diện tích rất ít

Trước đây ở Việt Nam phổ biến nhiều loại vừng mang tính chất địa phương như: vừng đen, vừng trắng Ngày nay, giống vừng được trồng chủ yếu là giống vừng V6 (vừng trắng) của Nhật Bản được nhập vào Việt Nam cách đây khoảng 10 năm và được công nhận là giống chuẩn quốc gia vào năm 2000 Năng suất trung bình đạt 1,2 tấn/ha Vừng không kén đất nên có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên nhiều loại đất khác nhau Cây vừng có khả năng chịu hạn tốt nhưng khả năng chịu úng kém nên vừng phải được trồng trên các chân đất có khả năng dễ thoát nước Cây vừng

dễ trồng, không đòi hỏi vốn đầu tư lớn, nhưng mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người nông dân

Ở Việt Nam, vừng được trồng nhiều tại Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Quảng Bình và một diện tích nhỏ ở miền Bắc Thời vụ gieo trồng vừng thường có hai vụ:

+ Vụ Xuân gieo từ tháng 3 đến tháng 5 thu hoạch từ tháng 6 đến tháng 9 Các tỉnh Nam Trung Bộ và Nam Bộ có thể gieo trồng sớm vào tháng 1-2 để thu hoạch trước khi mưa to Vụ Hè Thu gieo từ tháng 7 đến tháng 9 thu hoạch từ

tháng 10 đến tháng 12 Vùng Bắc Trung Bộ gieo cuối tháng 5 đầu tháng 6, muộn nhất vào 15/6 thu hoạch tháng 9 đến tháng 10

+ Vụ Hè Thu: từ 10 tháng 5 đến 5 tháng 6 (tuỳ điều kiện canh tác)

B Điều tra tình hình bệnh héo xanh vừng

Vừng được trồng tập trung chủ yếu vào vụ hè thu các tỉnh miền Trung như: Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa Đặc biệt ở Nghệ An diện tích vừng đến 5.580

ha

Trước năm 2006, tại Nghệ An các huyện Nghi Lộc, Diễn Châu, Quỳnh Lưu trồng chủ yếu giống vừng trắng (V6) Đây là giống có nguồn gốc từ Nhật Bản nhưng nhiễm nặng với bệnh héo xanh Chính vì vậy, mà hàng ngàn ha vừng đã bị mất trắng do bị bệnh héo xanh Cho đến nay nông dân đã quay trở lại trồng giống vừng đen địa phương – giống này được đánh giá là giống kháng vừa với bệnh héo xanh thay thế giống vừng V6 Vụ Xuân toàn tỉnh gieo trồng 5.580 ha, nếu chỉ tính riêng huyện Nghi Lộc thì tổng diện tích vừng hè thu lên tới 3.500 ha

Dựa vào số liệu điều tra tình hình bệnh héo xanh vừng toàn huyện Nghi Lộc (vùng vừng trọng điểm của Nghệ An) tỷ lệ héo xanh năm 2007 từ 5-15 %, xã bị hại nặng nhất là Nghi Lâm 15 % do vi khuẩn, 10 % do nấm tiếp đến Nghi Thịnh, Nghi Long, Nghi Khánh (10 % do vi khuẩn, 5 % do nấm), các xã còn lại tỷ lệ bệnh từ 5-7 % Nguyên nhân khách quan là do thời tiết khu vực Nghi Lộc năm nay

có hạn song mực nước ngầm cao do vậy mà bệnh diễn biến chưa thật nghiêm trọng

Cùng với Nghệ An, Thanh Hoá là một trong những vùng trọng điểm trồng vừng với tổng diện tính ước tính lên tới gần 2.298 ha Các huyện trồng nhiều là Yên Định 150 ha, Vĩnh Lộc 245 ha, Thọ Xuân 560 ha, Thạch Thành 185 ha, Tĩnh Gia 64 ha Các giống vừng chủ yếu được trồng là giống nhập nội V6 và một diện tích nhỏ là giống vừng đen VĐ10 Số liệu điều tra được đánh giá và thu thập chủ yếu ở hai huyện Thạch Thành với mức độ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn

khoảng 25 % và do nấm 7 % và huyện Tĩnh Gia có tỷ lệ héo xanh do vi khuẩn khoảng 20 % và do nấm 12 %

Hà Tĩnh là tỉnh có tổng diện tích vừng đứng thứ 3 sau Nghệ An và Thanh Hoá Vụ Hè Thu 2007 toàn tỉnh đạt 1.198 ha vừng, chủ yếu là giống vừng trắng V6 Các huyện có diện tích canh tác lớn là Thạch Hà và Can Lộc Thời vụ gieo trồng từ trung tuần tháng 2 (khoảng 15-20/2) trên các chân đất trồng lạc, đậu tương để tận dụng dinh dưỡng của vụ trước Do cấu trúc đất canh tác đa phần thuộc loại đất cát và đất xói mòn có tỷ lệ sỏi đá bao phủ ở bề mặt cao nên mật độ canh tác cao khoảng 50-60 cây/m2 nhằm chống đổ và giữ ẩm, bởi vậy tỷ lệ bệnh héo xanh do nấm cao hơn các vùng khác cụ thể huyện Thạch Hà có tỷ lệ héo xanh

do vi khuẩn phổ biến ở mức 19 % và héo xanh do nấm 9 % và ở huyện Can Lộc tỷ

lệ này lần lượt là 17 % và 11 %

Hầu hết các tỉnh trọng điểm canh tác vừng đều sử dụng giống vừng V6 có năng suất cao 3,5 – 5,0 tạ/ ha, hàm lượng dầu cao 50-54 % thích hợp cho sản suất dầu thực vật và là cây xoá đói giảm nghèo Riêng vụ hè thu năm 2007 của huyện Diễn Châu, tỉnh Nghệ An vừa được mùa, vừa được giá Mỗi kg bán 15-16 ngàn đồng, thu nhập mỗi ha vừng Hè Thu đạt 15 triệu đồng

Hình 1 Ruộng vừng bị nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum

Tuy nhiên, do có tính mẫn cảm cao với một số loại bệnh như thối rễ, thối thân mà đặc biệt là bệnh héo xanh và cơ cấu canh tác luân canh với cây lạc nên mức độ thiệt hại ngày càng cao tuỳ vào các điều kiện về thổ nhưỡng và khí hậu

Bảng 1 Tình hình bệnh chết héo cây vừng ở một số tỉnh miền Bắc

và miền Trung Việt Nam

Tỷ lệ bệnh (%)

thu mẫu Héo xanh do

6 Xã Hải Châu - Tĩnh Gia - Thanh Hóa 13/04/07 20 12

Hình 2 Cây vừng bị chết héo xanh do vi khuẩn R solanacearum

Tất cả những cây mắc bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum, có thể

quan sát thấy những vệt màu nâu hoặc đỏ sậm ở vùng hệ mạch khi bổ dọc thân cây gần phần cổ rễ (hình 3)

C Điều tra tình hình gieo trồng và bệnh héo xanh lạc

Trên Thế giới có hơn 100 nước trồng lạc với diện tích khoảng 20.573.000

ha, năng suất đạt trung bình khoảng 28 – 33 tạ/ha Năm 2007, Việt Nam có diện tích trồng lạc khoảng 290.000 ha, năng suất bình quân đạt 26,5 – 27,0 tạ/ha và thường sử dụng một số giống mới có triển vọng và cho năng suất cao như: Giống lạc MD7 và MD9: cây cao trung bình từ 35 – 50 cm chịu hạn khá, năng suất trung bình 33 – 35 tạ/ha Tỷ lệ nhân từ 68 – 70% Đặc biệt giống MD7 có khả năng kháng được bệnh héo xanh vi khuẩn Giống L14: Giống chịu thâm canh có tiềm năng năng suất cao, từ 38 – 40 tạ/ha Tỷ lệ nhân cao 70–72% Giống TQ6: Là giống thấp cây, chống đổ tốt, chịu hạn khá, năng suất trung bình từ 28 – 30 tạ/ha Giống SĐ1: Là giống mới được nhập nội từ Trung Quốc, có tiềm năng năng suất

Hình 3 Lát cắt dọc đoạn thân sát cổ rễ cây bị bệnh héo xanh

do vi khuẩn R solanacearum

cao 40 – 42 tạ/ha, giống có thời gian sinh trưởng 130 – 140 ngày vụ Xuân, từ 110 – 115 ngày vụ Thu Đông, tỷ lệ nhân 70 – 72%

Nghệ An có diện tích trồng lạc lớn nhất cả nước, toàn tỉnh trồng khoảng 26.989 ha; là vùng trọng điểm trồng lạc của cả nước, bình quân mỗi năm cả 3 vụ sản xuất (Đông, Hè Thu, Xuân) cung cấp cho thị trường trên 3.300 tấn lạc nhân

Vụ Đông năm 2007, Nghệ An sẽ gieo 3.000 ha lạc (hơn vụ Đông năm 2006 là 542 ha), phấn đấu năng suất bình quân đạt 20 tạ/ha (cao hơn vụ Đông năm 2006 là 3 tạ/ha) Tỉnh có chủ trương phát triển cây lạc trên diện tích đất cát ven biển, thoát nước tốt và những vùng bãi cao ven sông Giống lạc được sử dụng trong vụ Đông

là L14

Các huyện có diện tích trồng lạc cao nhất gồm Nghi Lộc có 4.800 ha, với tổng sản lượng 12,947 tấn Các xã có năng suất cao nhất trong tỉnh như: Nghi Phong đạt năng suất trung bình 27,05 tạ/ha, Nghi Liên đạt 27,1 tạ/ha, Nghi Trung

là 27,5 tạ/ha…, các xã có diện tích lớn phải nói đến các xã miền núi như: Nghi Lâm 250 ha, năng suất trung bình 25 tạ/ha, Nghi Văn 360 ha năng suất trung bình 26,5 tạ/ha, Nghi Hưng 250 ha, đạt 27 tạ/ha

Thanh Hóa là tỉnh có diện tích sản xuất lạc khoảng 21,652 ha (sau Nghệ An), chỉ tính riêng vụ xuân toàn tỉnh đã gieo trồng khoảng 15,000- 16,000 ha; tập trung chủ yếu ở các huyện: Yên Định 575 ha, Vĩnh Lộc 350 ha, Thọ Xuân 570 ha, Tĩnh Gia 550 ha, Phú Lộc 470 ha, Thạch Thành 420 ha…Đặc biệt huyện Tĩnh Gia có trên 50 ha lạc siêu nguyên chủng L12, L14 là nguồn giống cho 500 ha của tỉnh cho các vụ sau

Hà Tĩnh là tỉnh có diện tích trồng lạc cao thứ 3 ở vùng Bắc Trung bộ, có tổng diện tích trồng lạc khoảng 21,169 ha, trong đó riêng vụ đông 2007 toàn tỉnh tâp trung gieo trồng khoảng 6,000 ha lạc, chủ yếu là các giống L14, L17, QĐ 12

và được trồng nhiều ở các huyện Hương Sơn, Đức Thọ, Thạch Hà, Lộc Hà, Can Lộc Một số xã đã hình thành vùng lạc vụ Thu Đông tập trung qui mô từ 300 ha đến 500 ha Ở vùng biển ngang huyện Lộc Hà trồng được gần 800 ha Trong đó

các xã như Thạch Châu 600 ha, Thạch Mỹ 450 ha, Thụ Lộc 480 ha, với tổng diện tích tăng hơn năm 2006 từ 30 - 40 %

Ngoài ra một số tỉnh thành khác có diện tích trồng lạc như: Hà Tây (cũ) 4.800 ha, Hà Nội khoảng 3.200 ha, Vĩnh Phúc 4.766 ha, Ninh Bình 5.466 ha v.v

Tình hình sâu, bệnh hại lạc có rất nhiều loại: sâu cuốn lá, sâu keo da láng, rệp, bệnh gỉ sắt lạc, thối ngọn lạc, bệnh mốc vàng, bệnh thối tia, thối củ lạc, bệnh thối gốc có hạch lạc, bệnh đốm lá lạc, bệnh thối đen, bệnh đốm vòng lạc, chết

vàng, héo do F oxysporum, bệnh héo xanh do R solanacearum, bệnh lở cổ rễ lạc,

bệnh thán thư lạc, bệnh đốm muối tiêu & xám lá, sùng trắng, chùn ngọn lạc do virus (PCV), bệnh hoa lở lạc Trong đó, bệnh héo xanh do vi khuẩn và nấm là gây thiệt hại nặng nề nhất

Theo điều tra năm 2007 của chúng tôi ở Nghệ An (vùng thâm canh lạc trọng điểm của Nghệ An như Nghi Lộc, Yên Thành, Diễn Châu), tại một số xã trọng điểm trồng lạc như xã Nghi Lâm huyện Nghi Lộc thì tỷ lệ héo xanh do vi khuẩn chiếm 14 % và héo do nấm chiếm 10 % Nghi Thịnh 15 % do vi khuẩn, 12 % do nấm

Nguyên nhân khách quan là do thời tiết khu vực Nghi Lộc năm 2007 có hạn, do vậy mà bệnh diễn biến chưa thật nghiêm trọng, đồng thời các chân ruộng lạc của huyện lại tập trung phần lớn ở các vùng cát ven biển thoát nước tốt nên cũng hạn chế phần nào tác hại của bệnh héo xanh

Khác với Nghi Lộc, huyện Yên Thành diện tích lạc lại tập trung nhiều ở vùng đồng bằng nên khả năng giữ nước tốt, do vậy ẩm độ tại những chân ruộng cao là điều kiện thích hợp cho bệnh héo xanh phát triển, điển hình tỷ lệ cây lạc chết héo do vi khuẩn ở xã Minh Thành lên tới 24 % và tỷ lệ chết héo do nấm khoảng 8 - 10 %

Hình 4 Cây lạc bị chết do bệnh héo xanh

Một số vùng chuyên canh lạc của tỉnh Thanh Hóa do địa hình phức tạp nên

sự phân bố diện tích trồng lạc cũng khá đa dạng Huyện Thạch Thành nằm trên vùng địa hình đồi núi thấp, có điều kiện thổ nhưỡng, nông hóa rất thích hợp cho nhiều loại cây công nghiệp như cây lạc, do có địa hình dốc, đất thoát nước tốt, tiêu úng nhanh nên tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn trung bình khoảng 15 % và

8 % do nấm

Hình 5 Ruộng lạc bị bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearrum

Khác với Thạch Thành, huyện Tĩnh Gia thuộc vùng đất cát ven biển nên khả năng điều thoát nước tốt, ẩm độ thấp hơn do đất giữ nước kém nên khả năng bùng phát bệnh héo xanh thành dịch lớn ít xảy ra, cụ thể ở xã Hải Hòa tỷ lệ nhiễm

bệnh héo xanh do vi khuẩn chỉ khoảng 10 - 12 % và bệnh héo do nấm là 10 %

Bảng 2 Tình hình bệnh chết héo cây lạc ở một số tỉnh miền Bắc và

miền Trung Việt Nam

Bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum gây ra còn gọi là bệnh "chết

ẻo" hoặc "chết rũ" đây là một loại bệnh hại phổ biến trên cây lạc và vừng ở nhiều địa phương của nước ta Bệnh gây hại nặng nhất trên đất đồi, đất bãi ven sông và đất chuyên màu không luân canh với lúa nước Tỷ lệ cây chết do bệnh trên đồng ruộng thường chiếm 25 - 30 %, cá biệt có những ruộng có trên 80 % cây chết Trên đất trồng lạc và vừng có luân canh lúa nước thì bệnh phát triển ở mức độ nhẹ hơn

Tỷ lệ bệnh (%)

thu mẫu Héo xanh do

R.solanacearum

Héo vàng do

F.oxysporum

1 Xã Thạch An-Thạch Thành-Thanh Hóa 15/01/07 15 8

3 Xã Nghi Lâm - Nghi Lộc-Nghệ An 17/01/07 14 10

6 Xã Minh Thành-Yên Thành-Nghệ An 17/01/07 24 8

7 Xã Vĩnh Quỳnh-Thanh Trì-Hà Nội 05/02/07 7 < 1

9 Xã Tiền Phong-Mê Linh-Vĩnh Phúc 27/02/07 15 10

Triệu chứng ban đầu của bệnh là các lá non trên phần ngọn cây héo rũ xuống khi trời nắng Ban đêm hoặc khi trời mát cây có thể phục hồi không biểu hiện triệu chứng này Dần dần, hiện tượng héo tiếp tục phát triển đến các lá phía dưới, cuối cùng toàn bộ tán lá héo và cây chết hàng loạt

Có thể tóm tắt một số giai đoạn và cơ chế phát sinh bệnh héo xanh do R

solanacearum gây ra ở lạc và vừng như sau:

- Đầu tiên là sự xâm nhập của một số ít tế bào vi khuẩn gây bệnh vào tiểu phần mô gỗ

- Vi khuẩn nhân lên ở vùng mạch dẫn và lan truyền đến vùng mô mềm cận

gỗ hoặc các tế bào libe

- Tiết polysacharit ngoại bào với số lượng lớn đã làm tắc các bó mạch, nước không được vận chuyển lên nuôi cây, dẫn đến toàn bộ cây bị héo rất nhanh

- Phát triển và phá huỷ thành tế bào và các tế bào nhu mô kế cận

- Xuất hiện những biến đổi bệnh lý ở phần lớn những thành phần của nhu

mô, dẫn đến suy yếu nghiêm trọng sự dẫn nước trong cây và xuất hiện hiện tượng héo xanh

Ở thời kỳ bắt đầu đâm nụ và hoa nở rộ cây có sự biến đổi sinh lý và người nông dân cũng chăm sóc cây nhiều hơn như: nhổ cỏ, tưới phân, vun gốc, tỉa lá, bấm ngọn, thụ phấn v v nên hệ rễ và thân cây không thể tránh khỏi những tổn thương cơ học và thông qua đó vi khuẩn gây bệnh tiềm ẩn trong đất dễ dàng xâm nhập vào cây

Quan sát dọc theo phần gỗ phía trong thân cây bệnh cho thấy, càng lên cao dọc theo thân những vết này càng mỏng và có mầu sáng hơn (hình 4) Khi nhúng đoạn thân có vết bệnh vào một cốc nước và bóp mạnh ta sẽ thấy một dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa thôi ra

3.1.2 Phân lập và tuyển chọn một bộ sưu tập đa dạng các chủng vi khuẩn R

solanacearum và nấm F oxysporum có độc tính cao gây bệnh héo trên cây lạc

và vừng

A Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R solanacearum

Để phân lập chính xác vi khuẩn gây bệnh héo xanh chỉ nên thu thập những cây mới thể hiện triệu chứng bệnh (có 3 đến 4 lá trên ngọn bị héo xanh) Bởi vì những cây trồng ngoài đồng đã bị nhiễm bệnh lâu ngày thường khó hoặc không thể phân lập được vi khuẩn gây bệnh đích thực, vì nó thường bị tạp nhiễm thêm nhiều loại vi sinh vật hoại sinh khác

Đã thu thập được 28 mẫu cây lạc và 24 mẫu cây vừng bị bệnh ở các tỉnh Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Thanh Hoá, Nghệ An Mẫu thu ngày nào thì được

xử lý ngay ngày hôm đó để tránh làm giảm sức sống của vi khuẩn gây bệnh Không thể chỉ dựa vào các biểu hiện triệu chứng bệnh mà nhận biết được loài vi khuẩn gây bệnh Vì cùng một loại triệu chứng hoặc những triệu chứng giống nhau lại có thể do những loài vi khuẩn khác nhau gây ra Do đó, khi chẩn đoán bệnh và xác định loài vi khuẩn gây bệnh chỉ căn cứ vào triệu chứng là chưa đủ Cần thiết phải phân lập, xác định tác nhân gây bệnh và khẳng định tính gây bệnh của vi khuẩn phân lập được

Từ mỗi mẫu cây bệnh thu một ống dịch vi khuẩn, dịch này được cấy trên môi trường nhận biết TTC và nuôi ở nhiệt độ 28 0C ÷ 30 0C, sau 48 giờ sẽ chọn ra

những dạng hình thái khuẩn lạc đặc trưng - màu trắng kem hoặc trắng sữa, thể chảy lỏng, khoanh tròn không chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm Đại diện của mỗi dạng khuẩn lạc được giữ trong dung dịch bảo quản để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Các chủng vi khuẩn này đã được làm thuần bằng cách cấy truyền các khuẩn lạc tách rời nhau khi phát triển trên môi trường TTC Sau 3 lần cấy truyền liên tiếp

từ 1 khuẩn lạc thu được chủng vi khuẩn thuần Đại diện của mỗi dạng hình thái

khuẩn lạc của chủng thuần được giữ trong nước cất vô trùng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Kết quả thu được 30 chủng vi khuẩn thuần khác nhau

Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của 30 chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh

trên lạc và vừng bằng cặp mồi AU.P759/760 trên gel Agaroza 1% đều xuất hiện

một vạch có kích thước xấp xỉ 300 bp tương đương với sản phẩm PCR của chủng

R solanacearum PSS4 trên hình 6 , Theo Opi và cộng sự [29] có thể khẳng định

30 chủng vi khuẩn gây bệnh nghiên cứu đều thuộc loài R solanacearum gây bệnh

héo xanh điển hình

bằng PCR

Tỷ lệ (%) gây chết cây

Hình 6 Sản phẩm PCR đại diện của một số chủng R solanacearum với

cặp mồi AU P.759/760

5 SS1 Nam Sơn - Sóc Sơn

-Hà Nội

Lạc Dạng chảy lỏng, hồng

nhày ở tâm

+ 100

6 SS2 Nam Sơn - Sóc Sơn

-Hà Nội Lạc Dạng chảy lỏng, đỏ đậm ở tâm + 70

Lạc Dạng chảy lỏng màu

trắng sữa, hồng nhạt ở tâm

19 NA1 Nghi Long, Nghi

Lộc, Nghệ An Lạc Dạng chảy lỏng, màu trắng kem 100

20 NA2 Tân Thành - Yên

Thành - Nghệ An Lạc Khuẩn lạc tròn nhỏ, dạng vòm lồi nhày

chấm đổ nhỏ ở tâm

100

21 NA3 Nghi Lâm - Nghi

Lộc - Nghệ An Lạc Dạng chảy lỏng, màu trắng kem 100

22 NA4 Thọ Hợp, Quỳ Hợp,

Nghệ An

Lạc Khuẩn lạc tròn nhỏ,

dạng vòm lồi nhày chấm đổ nhỏ ở tâm

100

23 HTV1 Tân Lộc - Can Lộc - Vừng Khuẩn lạc chảy lỏng, + 100