sử dụng chỉ thị ssr để phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng bệnh gỉ sắt khác nhau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ TRANG SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG THỊ TRANG

SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ

NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2014

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn chưa được ai công bố

Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Hoàng Thị Trang

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thanh Trà đã tạo mọi điều kiệ

ệm Tôi x Hoàng Phú Hiệp và các thầy,

cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, trường Đại học Sư phạm – Đại học

Th i Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ khoa Khoa học sự sống, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014

Tác giả

Hoàng Thị Trang

Trang 4

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤ viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 3

1.1.1 Cây đậu tương 3

1.1.2 Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 9

1.2 BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 10

1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 10

1.2.2 Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương 12

1.2.3 ở cây đậu tương 13

1.3 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 17

1.3.1 Chỉ thị hình thái 17

18

Trang 5

1.3.3.Chỉ thị phân tử 18

1.3.4 Bản đồ QTL 23

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25

2.1.1 Vật liệu 25

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Thiết bị và địa điểm nghiên cứu 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số 27

2.2.2 Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích mẫu 28

2.2.3 Phản ứng PCR-SSR 30

2.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 31

2.2.5 Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR 31

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR 32

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tương 32

3.1.2 Kết quả ằng phản ứng PCR- SSR 33

ỀN CỦA CÁC GIỐ TƯƠNG KHÁNG BỆ 41

44

KẾT LUẬ 49

1 Kết luận 49

2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Trang 6

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2-DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều

ABC ATP - binding cassette

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa dạng chiều dài các

phân đoạn được nhân bản

ASM Acibenzolar-S-methyl benzo-(1,2,3)- thiadiazole-7-carboxylic

acid S-methyl ester

AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center - Trung tâm phát

triển rau màu Châu Á, Đài Loan

AUDPC Area Under Disease Progress Curve

Bp Base pair

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

ĐVT Đơn vị tính

EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid

EtBr Ethidium bromide

FAO Food and Agriculture Organisation – Tổ chức Nông Lương thế giới ISSR Inter - Simple Sequence Repeat

kb Kilo base

MAS Marker Assisted Selection – Chỉ thị phân tử

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi tr ùng hợp polymerase QTL Quantitative Trait Loci - Bản đồ các locus kiểm soát tính trạng số lượng RAPD Random Amplified Polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân

bản ngẫu nhiên

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình về chiều dài

phân đoạn cắt hạn chế

Trang 7

SDS Sodium Đoecyl Sulphat

SNP Single nucleotide polymorphism

SSR Simple Sequence Repeats -trình tự lặp lại đơn giản

STSs Sequence Tagged Site

TAE Tris – Acetate – EDTA

Tris Trioxymetylaminometan

XK Xuất khẩu

USDA United State Department of Agriculture - Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ UPGMA Phương pháp phân nhóm

Trang 8

Bảng 1.1 Diện tích thu hoạch đậu tương một số nước trên thế giới 4

Bảng 1.2 Sản lượng sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 5

Bảng 1.3 Năng suất đậu tương một số nước trên thế giới 7

Bảng 1.4 Diện tích, năng suất, tổng sản lượng của đậu tương của nước ta

trong năm 2011, 2012, 2013 và dự báo trong các năm tiếp theo 2014 -2015 8

Bảng 2.1 Ký hiệu, xuất xứ và đặc điểm của các giống đậ 25

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 30

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR-SSR 31

Bảng 3.1 Số phân đoạn DNA được nhân bản bằng phản ứng PCR-SRR từ 5 cặp mồi SSR 39

Bảng 3.2 Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 5 cặp mồi SSR 40

SSR (%) 41

Trang 9

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015) …9 Hình 1.2 gỉ sắt 12

giống đậu tương nghiên cứu 32

ới cặp mồi F/Satt009-R 33

Satt009-ới cặp mồi Sat_640 –F /Sat_640-R 34

Trang 10

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá

trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau Hạt đậu tương chứa 30-55% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế, 12-25% lipid và các vitamin cần thiết cho cơ thể Các sản phầm từ đậu tương được sử dụng rộng rãi cho các mục đích khác nhau như làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn

có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R japonicum sống cộng sinh trên rễ cây

tạo thành các nốt sần, giúp cải tạo đất hiệu quả Do đó, cây đậu tương đã được quan tâm trồng và phát triển mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới Ở Việt Nam, đậu tương là nhóm cây trồng chính được ưu tiên khuyến khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc

Việt Nam từng là một nước xuất khẩu đậu tương vào những năm 1980, tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành nước nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn với hàng triệu tấn khô dầu đậu tương đang được nhập khẩu hàng năm Mặc

dù diện tích gieo trồng có tăng hàng năm những năng suất thấp và sản lượng đạt được không ổn định, khả năng chống chịu bệnh và các stress kém Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới diện tích gieo trồng và làm giảm năng suất, chất lượng hạt đậu tương, gây tổn thất lớn về kinh tế

Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra và đang

được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tương gây thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất lượng đậu tương ở nhiều nước

Trang 11

trên thế giới trong đó có Việt Nam

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trình phát triển bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài: “Sử

dụng chỉ thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của một số giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt khác nhau bằng chỉ thị SSR

3 Nội dung nghiên cứu

- Tách và nhân bản các phân đoạn SSR bằng phản ứng PCR - SSR

- Nghiên cứu, phân tích mức độ đa dạng di truyền của các giống đậu tương dựa trên chỉ thị SSR

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Cây đậu tương

Đậu tương hay đỗ tương, đậu tương (tên khoa học Glycine max) là loại cây họ Đậu (Fabaceae), là loài bản địa của Đông Á Cây đậu tương được thuần

hóa và trồng nhiều ở Trung Quốc vào khoảng thế kỷ XVII trước công nguyên Sau đó cây đậu tương được truyền bá và du nhập sang các nước Nhật Bản, Thái Lan, Philipppin, Việt Nam vài thế kỷ sau đó Cây đậu tương được trồng ở châu

Âu và ở Hoa Kỳ vào khoảng thế kỷ XVII và XVIII Loài này giàu hàm lượng chất đạm protein Hạt đậu tương có hàm lượng protein cao từ 20% – 45%

dễ tan và hầu hết chứa các loại axit amin, đặc biệt là các loại axit amin không thay thế, vitamin E, muối khoáng, lipid vì vậy người ta đã chế biến đậu tương thành hơn 600 sản phẩm dinh dưỡng có giá trị khác nhau Sản phẩm của đậu tương được dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cải tạo đất trồng rất tốt

Về đặc điểm hình thái, đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá mầm, lá nguyên và lá kép Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng cánh bướm Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông khi chín có màu nâu Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt có giá trị dinh dưỡng cao Về đặc điểm di truyền, đậu tương có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo Bộ gen đơn bội của đậu tương có từ 1,29 -1,8 x 109

bp Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm, chín trung bình và chín muộn

Trang 13

Trên thế giới cây đậu tương được coi là một trong những cây lương thực chiến lược của nhiều quốc gia như Mỹ, Brazil, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan do khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập chung nhiều tại Châu

Mỹ, sau đó là Châu Á Hoa Kỳ là nước có diện tích trồng cây đậu tương lớn nhất thế giới và được đầu tư sản xuất cây đậu tương với quy mô công nghiệp Diện tích đậu tương của các quốc gia những năm gần đây luôn biến động, các nước như Hoa Kỳ, Barazil, Argentina tăng theo từng năm, còn các nước thuộc lục địa Châu

Á lại giảm như Nhật Bản, Việt Nam, Trung Quốc lại giảm trong các năm gần đây được thể hiện qua bảng 1.1

Bảng 1.1 Diện tích thu hoạch đậu tương một số nước trên thế giới

Quốc gia Diện tích thu hoạch (Nghìn ha)

Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012 Năm 2013

Hoa kỳ 78849447 79260943 80359578 85632823 Brazil 23327296 23968663 24975258 27864915

Argentina 18130799 18746227 17577320 19418825

Ấn Độ 9554190 10180000 10840000 12200000 Trung Quốc 8516115 7889055 6750080 6600100

Trang 14

đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng suất và diện tích, tuy có biến động qua các năm Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới

Bảng 1.2 Sản lượng sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

Trang 15

tới năng suất và sản lượng đậu tương không nhỏ Năng suất đậu tương của các nước cũng biến động tăng giảm theo từng năm 1.3)

Trang 16

Bảng 1.3 Năng suất đậu tương một số nước trên thế giới

Quốc gia Năng suất (tấn/ha)

Năm 2010 Năm 21011 Năm 2012 Năm 2013

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp

quốc (FAO) (http://faostat.fao.org)

Ở Việt Nam, hiện nay đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [4] Cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển Tuy nhiên việc sản xuất đậu tương ở trong nước vẫn chưa được đầu tư cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông học của các giống địa phương và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phương pháp truyền thống kết hợp với hiện đại sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó cũng là chiến lược quan trọng về sự phát triển cây đậu đỗ ở nước ta

Trang 17

, giảm 3,7% so với năm trước nhưng tăng 145% so với năm 2011 Đế

tăng trường, lượng xuất khẩu đậu tương được dự đoán sẽ lên 600 nghìn tấn Cũng trong 2012/13, với sự phục hồi của ngành thức ăn sau suy thoái kinh tế, tổng lượng khô đậu tương nhập khẩu tăng trở lại đạt 2,97 triệu tấn, tăng 19% so với năm trước Đây là lĩnh vực tiếp tục được cải thiện và USDA

dự đoán sẽ tăng nhẹ, đạt 3,1 triệu tấn vào năm 2014 và 3,2 triệu tấn năm

2015 Sản lượng dầu đậ 2013 đã giảm 9,8% do nhu cầu thấp hơn so với dự kiến, lượng xuất khẩu cũng giảm xuống còn 13%

so với năm 2012 do sản lượng thấp

Bảng 1.4 Diện tích, năng suất, tổng sản lượng của đậu tương của nước ta

trong năm 2011, 2012, 2013 và dự báo trong các năm tiếp theo 2014 -2015

Trang 18

gieo trồng đậu tương năm 2013 và 2014 lần lượt đạt 120 nghìn và 130 nghìn héc-ta, với mức sản lượng tăng nhẹ khoảng 176 và 192 nghìn tấn Khả năng

héc-ta trồng đậu tương thấp hơn so với trồng ngô Khu vực trồng đậu tương

chính tập trung ở vùng Đồng bằng sông Hồng, miền Bắc nước ta

1.1: Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam

(2011-2015)

* Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo

Sự biến động sản lượng, năng suất hay diện tích đậu tương của nước ta

là không cao, dự kiến các năm tiếp theo 2014 và 2015 cũng tăng không đáng

kể, nguyên nhân là người dân và nhà nước vẫn chưa đầu tư sâu sắc tới cây đậu tương, bên cạnh đó bệnh dịch hại cây hay điều kiện khí hậu làm thiện hại đáng kể sản lượng đậu tương

1.1.2 Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương

Hạt đậu tương có thành phần chủ yếu là protein, lipid, glucid, các vitamin và các chất khoáng Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm

từ 30-55% Protein được dự trữ trong bào quan có chức năng cung cấp

Trang 19

nguồn amino acid và nitơ hoặc là các enzyme tham gia vào quá trình nảy mầm của hạt Loại potein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin

Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là vitamin E Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một

số chất khác như carbohydrade, muối khoáng, nucleic acid, kích thích sinh trưởng

Các protein của lá đậu tương chủ yếu là các protein liên quan đến quá trình trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng Đó là các protein có liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử, các enzyme, các protein dự trữ, hoặc các protein có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, stress Một số nghiên cứu phân tích hệ protin lá đậu tương đã đưa ra nhận xét rằng một số đoạn protein có chức năng bảo vệ, một số protein có liên quan đến tính khàng bệnh

gỉ sắt [17], [47]

Tóm lại, hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng rất cao, giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protien và lipid Trong đó do hàm lượng protein cao là yếu tố quan trọng làm cho cây đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người, động vật và ngoài ra cây đậu tương còn dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tương có mầu đen

1.2 BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương

Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng

Trang 20

kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương Hầu hết các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tương địa phương [50] Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt có thể gây thiệt hại nghiêm trọng trên cây đậu tương không được bảo vệ bằng thuốc trị nấm và ở một số vùng, bệnh

gỉ sắt là một yếu tố làm giới hạn việc sản xuất đậu tương vụ xuân Do sự thiếu thông tin về bệnh gỉ sắt đậu tương ở Tây Bán cầu và nguy cơ tiềm năng ảnh hưởng đến việc sản xuất đậu tương ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ, Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Bệnh Thực vật và Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Rau Châu Á (AVRDC) đã khởi động một dự án hợp tác vào năm 1978 để nghiên cứu dịch tể học của bệnh gỉ sắt đậu tương Dự án hợp tác này kéo dài đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương được tiếp tục tiến hành ở AVRDC cho đến năm 1992

Ngoài ra, FAO đã thiết lập một mạng lưới nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương liên kết các nước Châu Á Chương trình quốc gia của Thái Lan đã và đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương với các chương trình lai giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua [34] Ở Indonesia, bệnh gỉ sắt được xem là loại bệnh nghiêm trọng nhất trên cây đậu tương, xuất hiện cả ở mùa mưa và mùa khô Các hoạt động nghiên cứu ở Indonesia bao gồm cải thiện tính kháng , thử nghiệm thuốc trị nấm, sự tồn lưu của hạ bào tử trên đồng ruộng, quản lý bệnh gỉ sắt thông qua trồng thử nghiệm và các

nghiên cứu về sự phát tán bào tử

Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: là những chấm màu trong ở phiến lá, cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới kích thước từ 2-5mm với hình đa dạng, có góc cạnh Ở mặt dưới phiến lá xuất hiện lớp bột màu nâu

đó là các bào tử hạ của nấm, khi bệnh phát triển rộng ra trên các lá nó sẽ làm rách phiến lá, các bào tử được phát tán nhờ gió Ở điều kiện thích hợp (15-

Trang 21

300C), ẩm ướt nó sẽ nảy mầm và xâm nhập vào lá qua các lỗ khí khổng Vết bệnh có thể hình thành ở các bộ phận của cây Bệnh thường phát triển mạnh vào thời điểm cây đậu tương ra hoa, từ lá tầng thấp rồi lan lên lá tầng trên, làm lá vàng khô rồi rụng hàng loạt Bệnh này xảy ra quanh năm và gây thiệt hại tới 40-50% năng suất hạt

Hình 1.2

Quá trình nhiễm bệnh bắt đầu khi bào từ hạ nảy mầm để hình thành một ống mầm phát triển trên bề mặt lá (đường kính 5-400 µm) cho đến khi sợi áp hình thành Tùy vào điều kiện thời tiết mà thời gian lây nhiễm bệnh kéo dài theo từ 15 tuần tới 20 tuần

1.2.2 Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương

Tính chống chịu bệnh gỉ sắt là khả năng cho năng suất tương đối của cây dưới áp lực của bệnh gỉ sắt Để so sánh năng suất tương đối, người ta so sánh một dòng được trồng trên ô được và không được bảo vệ bằng thuốc trừ nấm Mặc dù cần có thêm diện tích ruộng, tính chống chịu cần được đánh giá vào mỗi mùa vụ chứ không giống như việc thu thập dữ liệu đường cong tiến triển bệnh, sự rụng lá và đếm nốt bệnh cho tính kháng gây giảm tốc độ phát bệnh

Trang 22

Sự tương tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo mô hình tương tác gen đối gen (gen for gen) Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy có năm gen

chính liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tương bao gồm: gen Rpp1, gen Rpp2; gen Rpp3; gen Rpp4; gen Rpp5 và gen Rpp6 Các nghiên cứu về gen cho thấy sáu gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 và Rpp6 đã được phát

hiện và mô tả có khả năng liên quan tới tính kháng đối với một số chủng nấm

P.pachyrhizi Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào công bố giống đậu tương nào kháng được với tất cả các chủng nấm P.pachyrhizi

đậu tương

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về gỉ sắt [35], [36], [37], [38], [39], [40], [43], [44] Ở các nước trên thế giới, bệnh gỉ sắt gây thiệt hại nghiêm trọng đến cây đậu tương và một số cây trồng khác, làm hạn chế năng suất đậu tương vụ xuân Vì vậy ở nhiều quốc gia trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khắc phục và chọn tạo nhiều giống đậu tương có tính kháng bệnh gỉ sắt cao và năng suất vợt trội như: giống Tainung 4 có sức kháng bệnh nhiều hơn các giống khác Các nước đã đầu tư rất nhiều kinh phí

và thời gian vào các dự án nghiên cứu, có dự án kéo đài tới chục năm như:

Mỹ, Brazil, Trung Quốc… Ở Đài Loan và Thái Lan, nhiều dòng đã được chọn

và sàng lọc thử nghiệm tính chống chịu bệnh gỉ sắt [34] Dựa trên phần trăm gia tăng năng suất khi so sánh giữa các dòng, người ta đã xác định được các dòng tính chống chịu cao hoặc có thể kháng một phần.Thiệt hại năng suất của các dòng chống chịu này thường ít hơn so với các dòng có năng suất cao khác Xu hướng tương tự cũng xảy ra ở những dòng bị giảm sút ở chỉ tiêu trọng lượng 100 hạt Các dòng mang khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt có diện tích lá bị bệnh nhỏ nhất hoặc có tính kháng một phần dựa trên số lượng vết

Trang 23

bệnh trên mắt lá Gần đây, cùng với mức độ phần trăm tăng năng suất thì chỉ tiêu chống chịu stress đã được áp dụng trong đánh giá tính chống chịu bệnh gỉ sắt bằng cách sử dụng các ô ba chiều để chia các nguyên liệu khảo nghiệm ra thành bốn nhóm Mặt phẳng X -Y (X: tính độc bệnh, Y: năng suất phần trăm) được chia thành bốn đoạn bằng cách vẽ các đường phần cắt tại điểm chính giữa của trục X và trục Y Trục Z thể hiện mức độ chống chịu stress mà một dòng có được ở bất kỳ nhóm nào trong bốn nhóm

Bằng kỹ thuật phân tử, những biến đổi ở mức độ alen và tính di truyền được tìm thấy ở đậu tương Verma và cộng sự (1996) đã công bố về những biến đổi alen của SSR ở mức độ cao trong sinh chất mầm đậu tương [41] Theo ông, có 28 alen SSR được nhắc lại trong nhóm 96 kiểu gen đậu tương Akkaya và cộng sự(1992) đã lập bản đồ 40 locus SSR ở đậu tương cùng với

118 chỉ thị RFLP và RAPD [20] Ngoài ra, Abe và cộng sự (2003) đã phân tích 20 locus SSR của 131 giống đậu tương từ 14 nước Châu Á và nhận thấy rằng trung bình trên mỗi locus SSR có đến 11,2 alen Họ cũng đã nhận ra sự khác nhau về nguồn gốc di truyền giữa tập đoàn giống đậu tương ở Nhật Bản

và Trung Quốc [21] Các phát hiện của của nhóm nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các giống đậu tương của các nước Đông Nam Á và Trung Á phần lớn bắt nguồn từ Trung Quốc Trong khi đó, Cregan và cộng sự (1999) đã sử dụng đồng thời các chỉ thị SSR, RAPD, AFLP và thiết lập được bản đồ gen với 20 nhóm gen liên kết ở đậu tương trên cơ sở ba quần lai của các trường đại học Iowa, Utah và Nebraska [25]

Hiện nay ở Việt Nam, mặc dù cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp và nền kinh tế quốc dân, nhưng diện tích trồng và sản lượng vẫn còn rất thấp so với các nước trên thế giới So với năm 2001, diện tích trồng đậu tương ở nước ta trong năm 2005

Trang 24

tăng 24,16%, sản lượng tăng 29,10% Nhưng đáng chú ý là năng suất đậu tương gần như không tăng hoặc tăng không đáng kể, do nhiều nguyên nhân như hạn chế về giống và điều kiện canh tác, bên cạnh đó là các bệnh sương mai, phấn trắng, gỉ sắt… là những loại bệnh thường xuyên xuất hiện gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới tình hình sản xuất đậu tương Thực tiễn này đòi hỏi phải có sự đánh giá, lựa chọn các giống đậu tương mới có năng suất cao, chất lượng tốt đồng thời có khả năng kháng được các bệnh, đặc biệt là bệnh gỉ sắt [12] Trong những năm gần đây, các công trình nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương đã được tiến hành nhiều nơi trên thế giới và ở Việt Nam [17], [32], [33], [34], [35], [36], tuy nhiên việc nghiên cứu một các hệ thống về bệnh gỉ sắt và khả năng kháng bệnh này ở cây đậu tương còn ít được đề cập đến

Ở nước ta, kết quả thí nghiệm của một số tác giả thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cho thấy các giống đậu tương trồng đều bị nhiễm bệnh với các mức độ khác nhau Các giống ít bị bệnh hay bị nhiễm muộn trên đồng ruộng hiện nay là M103, DT93, DT84, AK03, AK05, VX93, dòng 42 Các giống nhiễm bệnh nặng là V74 (DT74) và DH4 Trong nghiên cứu về mối quan hệ di truyền của 19 giống đậu tương Việt Nam với 25 cặp mồi bằng chỉ thị RADP, tác giả Đinh Thị Phòng và cộng sự cho thấy có 17/25 mồi có tính

đa hình với giá trị PIC (Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình) dao động từ 0,11 đến 0,6, trong đó có 3 mồi có tính đa hình cao (PIC>0,5) Ngoài ra, tác giả cũng cho rằng các giống có tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường như giống HL92 (kháng bệnh xoăn lá và thối quả) và HL203 (chống chịu khá với sâu bệnh) đều nằm trong cùng nhóm phụ III và có hệ số sai khác di truyền 0,114 Hoặc hai giống M103 (chịu nóng) và giống DT84 (chịu lạnh và chịu úng) đều nằm trong nhóm phụ II và có hệ số sai khác di truyền 0,082 [12]

Trang 25

Những năm gần đây, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ -Viện Cây lương thực và cây thực phẩm đã nghiên cứu, lai tạo và kiểm định được một số giống có khả năng kháng với bệnh gỉ sắt như: DT2000, CBU8325, DT95 Giống DT2000 được công nhận là giống Quốc gia có khả năng kháng cao đối với gỉ sắt ở các mùa vụ khác nhau Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR bước đầu khả quan Như vậy, do các đoạn SSR có mức độ đa hình cao

và phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương nên chúng có thể cung cấp những dẫn chứng chính xác và tin cậy trong nghiên cứu sinh học phân tử, di truyền học và lai tạo giống cây trồng

Trong nghiên cứu của Vũ Thanh Trà và cộng sự (2006), mười một giống đậu tương bao gồm các giống nhập nội như DT2000 (có khả năng kháng bệnh

gỉ sắt), DT12, VX92 và VX93 (có năng suất cao), các giống địa phương như Cúc Vàng, Vàng Mường Khương và CBU8325 (có khả năng chịu sâu, nấm và chịu hạn tốt) và các giống tạo ra từ bằng phương pháp đột biến như DT84, DT95, M103 và DT96, con lai của DT84 và DT90 (có khả năng kháng bệnh

gỉ sắt) được đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ số tích luỹ bệnh theo thời gian AUDPC kết hợp các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo bào tử và tạo quầng [17] Kết quả cho thấy, các giống DT95 và CBU8325 có chỉ số AUDPC thấp khả khả năng kháng bệnh gỉ sắt gần tương đương với giống kháng đối chứng (DT2000) Hạt giống của các giống này được tiếp tục nghiên cứu về chất lượng hạt trên phương diện hoá sinh và cho thấy chúng có hàm lượng protein và lipid từ trung bình đến cao, có mặt đầy đủ các loại dự trữ chính, đảm bảo là nguồn cung cấp thực phẩm có chất lượng dinh dưỡng cao cho con người và gia súc

Trang 26

TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

Hiện nay trong phân tích tính đa dạng di truyền của thực vật người ta có thể tiến hành thực hiện ở các cấp độ và phương pháp khác nhau, từ các đặc điểm hình thái, sinh lý và hoá sinh đến đặc điểm của phân tử DNA, protein Phân tích đa dạng di truyền ở đậu tương dựa trên một số phương pháp như chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh và chỉ thị phân tử DNA

1.3.1 Chỉ thị hình thái

Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thường được biểu hiện dưới dạng một tính trạng được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ như các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ Mặc dù chỉ thị hình thái được sử dụng như một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong chọn giống gặp phải nhiều hạn chế bởi chúng luôn chịu ảnh hưởng của các nhân tố di truyền như sự tương tác giữa các sản phẩm của gen Các nhân tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm cũng có tác động qua lại giữa kiểu gen và kiểu hình, gây ảnh hưởng không nhỏ đến các giai đoạn phát triển của thực vật

Biểu hiện khả năng kháng và nhiễm bệnh về mặt hình thái ở thực vật được xác định theo các tiêu chí nhất định Đây là chỉ thị quan trọng để tìm kiếm và tạo giống kháng bệnh Ví dụ như bệnh gỉ sắt được xác định trên cơ sở đánh giá vết bệnh trên lá, mức độ tạo quầng, mức độ tạo bào tử, từ đó có thể phân biệt được các giống đậu tương kháng tốt, kháng trung bình và mẫn cảm với bệnh

Hơn nữa, một số tính trạng trội được tạo ra theo ý muốn của con người thông qua đột biến Các tác nhân này gây ra một số hiện tượng như lùn, bạch tạng có hại cho cơ thể của thực vật Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của các chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hoá sinh học, những khó khăn trên đang từng bước

Trang 27

được giải quyết [17]

1.3

Các chỉ thị hoá sinh có trong hầu hết các protein đa hình như isozymevà các protein dự trữ (stograge protein) Các isozymecó thể được phân tách theo trọng lượng, kích thước phân tử và các chất mang Nhờ vậy, bằng kỹ thuật điện di trên gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, người ta có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, ví dụ như isozymeamylase, esterase… Các biến dạng này có thể cung cấp thông tin như là một loại chỉ thị đồng trội

Phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và đơn giản hơn phân tích DNA Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen, số lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định quá trình phát triển của cá thể Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác một phần bản chất di truyền

Hiện nay, kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional electrophoresis) là kỹ thuật phân tách protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ nhất) và theo trọng lượng phân tử (chiều thứ hai) Kỹ thuật này ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và cơ thể [17]

1.3.3.Chỉ thị phân tử

Kỹ thuật RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và cộng sự [42] RAPD đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đang dạng di truyền của cùng một loài hoặc sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi

Trang 28

oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên Các sản phẩm RAPD được phân tách bằng cách điện di trên gel agarose Hệ gen của các đối tượng khác nhau hoặc của hai loài sẽ cho sự khác nhau về những phân đoạn DNA, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các đối tương nghiên cứu

Về nguyên tắc, kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction), bằng cách sử dụng những mồi ngắn có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các mồi Mồi (primer) là những đoạn oligonucleotide ngắn, một mạch (khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lượng G+C cao (từ 60-70%) và không có đầu tự bổ sung Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA của hệ gen Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việc nghiên cứu đa dạng và lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i)Thiết kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn nhân bản trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyềnvà thiết lập sơ đồ quan hệ di truyền của các đối tương nghiên cứu Các sinh vật cùng loài có kiểu gen hoàn toàn giống nhau thì các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước giống nhau, khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào trong phản ứng PCR-RAPD Với các sinh vật khác loài, khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD, các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau Để tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên với số lượng lớn

Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu tính đa dạng

di truyền các giống, phát hiện khả năng di truyền liên quan đến một tính trạng

Trang 29

hoặc thiết lập bản đồ di truyền Có rất nghiều nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới và Việt Nam sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học như ở Brazil về nghiên cứu trên đối tượng ngô, ở Hy Lạp trên đối tượng chè, ở Việt Nam trên nhiều đối tượng cây trồng [12], [13], [19]

Chỉ thị SSR

Kỹ thuật SSR do Litt và Luty (1989) [28], phát hiện lần đâu tiên người SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide nào đó Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ 1 đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ

2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucleotide như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài động và thực vật Phương thức lặp lại được phân thành 3 loại chính: lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một số nucleotide khác); lặp lại phức tạp (sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau)

Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Phân lập đoạn SSR từ thư viện hệ gen; (ii) Xác định trình tự của vùng có SSR; (iii) Xác định các cặp mồi đặc trưng là các trình tự DNA bảo thủ giới hạn hai đầu của đoạn SSR; (iv) Nhân vùng gen tương ứng bằng PCR sử dụng các mồi đặc trưng; (v) Phân tích kích thước của sản phẩm PCR nhằm xác định được sự có mặt của các alen SSR

SSR là công cụ hữu ích của phân tích hệ gen, lập bản đồ gen và đặc biệt

là chọn giống phân tử vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Song nhược điểm cơ bản của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi đắt đỏ, mỗi một loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài nhất định [25], [31], [33]

Trang 30

Trong thực tế, chỉ thị này đã được sử dụng trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại

Kỹ thuật này được sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ đa hình các alen thuộc cùng một locus

Các DNA vi vệ tinh hay các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeats – SSRs) có mặt khắp nơi trong hệ gen của sinh vật nhân thực Trong thập kỷ qua, các chỉ thị này đã được nghiên cứu và khẳng định rất hữu dụng trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách

di truyền, ước tính dòng chảy gen và xây dựng bản đồ liên kết [33], [40] Mặc

dù các chỉ thị SSR có tính ưu việt rất lớn trong việc nghiên cứu di truyền hệ gen, phân tích đa dạng di truyền, xác định khoảng cách di truyền và xây dựng bản đồ liên kết… Tuy nhiên, cho đến nay chỉ có một số lượng rất ít các công trình nghiên cứu công bố về một số lượng không lớn các chỉ thị SSR trong nghiên cứu genome đậu tương Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, SSR được áp dụng để nghiên cứu

đa dạng trên cả đối tượng động vật và thực vật vì nó cho độ đa hình cao và đáng tin cậy Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên một số loài như lạc, mơ, lúa mì [10], [12], [16], và đang phát triển ở các giống cây trồng khác như đậu tương [17] Trong việc nghiên cứu tạo giống mới, chỉ thị SSR liên quan đến một số tính trạng đã được xác định như chọn giống nhờ chỉ thị (marker-assistedselection) Chọn các dòng lúa có năng suất cao và hàm lượng protein dự trữ cao hoặc để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống cây trồng ở một số đối tượng như: lúa, mía, đậu tương hay xác định giới tính thực vật trên đối tượng đu đủ

Trang 31

Các chỉ thị RFLP và AFLP

Các chỉ thị phân tử như RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism)

và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa hình DNA

Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu (trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu Kỹ thuật RFLP được tiến hành như sau: các endonuclease cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA bộ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng loạt các phân đoạn nhỏ có kích thước khác nhau Số lượng các phân đoạn này phụ thuộc vào điểm nhận biết trong bộ gen Sản phẩm của quá trình cắt sẽ được điện di, sau đó được chuyển nguyên

vị và cố định trên màng lai Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn sẽ được phát hiện bằng sự kết hợp giữa mẫu dò đã được đánh dấu (bằng phóng xạ hoặc bằng phương pháp hoá học) và các đoạn DNA của mẫu cần phân tích (được tạo ra từ cùng một locus theo nguyên tắc bổ sung)

Trong khi đó, AFLP là một kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhân các đoạn được cắt hạn chế bởi enzyme giới hạn Cũng như các chỉ thị phân tử khác, AFLP khám phá hiện tượng đa hình qua sự khác nhau về độ dài của các đoạn DNA được nhân Kỹ thuật này gồm 3 bước: cắt DNA bộ gen bằng enzyme giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter), nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn và phân tích trên gel các đoạn DNA được nhân lên Chỉ thị AFLP ít phức tạp hơn RFLP, với ưu điểm

là độ đa hình cao nhận dạng tới cá thể, thông qua đó có thể tìm được những chỉ thị liên kết rất chặt và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền [39]

Các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử ở đậu tương sử

Trang 32

dụng chỉ thị RAPD đôi khi cho kết quả tính đa hình thấp Vì thế, gần đây việc thiết kế mồi SSR chuyên dụng cho đậu tương đã và đang được một số Viện nghiên cứu trên thế giới tiến hành [20] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu tính chịu nóng, chịu hạn ở thực vật nói chung và đậu tương nói riêng còn rất hạn chế, đặc biệt là trên đối tượng đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và cây thực phẩm Việt Nam, hàng trăm mẫu giống đậu tương nhập nội và giống đậu tương địa phương đã được đánh giá

về khả năng chịu nóng, chịu hạn, kháng sâu bệnh Việc chọn tạo giống chủ yếu dựa trên những phương pháp thủ công truyền thống trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, nông sinh học mà chưa đi sâu vào chọn lọc dựa trên những đặc điểm di truyền phân tử Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương là rất cần thiết [17]

1.3.4 Bản đồ QTL

Bản đồ các locus kiểm soát tính trạng số lượng QTL (Quantitative Trait Loci) xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng số lượng đang được quan tâm Từ bản đồ QTL ta có thể xác định được những vùng trên NST có liên quan đến một tính trạng hay không Các bước để lập bản đồ QTL như: (i) xác định cặp lai có tính trạng đối kháng nhau; (ii) lai và tạo quần thể cho lập bản đồ (300 -600 cá thể); (iii) theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể; (iv) xử lý thống kê và lập bản đồ

Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí gen, hiệu quả và hoạt động của các locus liên quan trong mối tương tác giữa các sản phẩm của gen và tương tác QTL với môi trường, từ đó chọn lọc được các dòng với tính trạng mong muốn nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS -Marker Assisted Selection) Năm

2002, các nghiên cứu lập bản đồ QTL liên kết với tính trạng qui định khối

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	2,16 MB

sử dụng chỉ thị ssr để phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng bệnh gỉ sắt khác nhau

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU