HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG UNG THƯ VÚ MCF7 CỦA MỘT SỐ CAO TRÍCH VÀ HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC CÂY THUỘC CHI HEDYOTIS

đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để chữa trị các vết rắn cắn, viêm nhiễm vết thương và đặc biệt là bệnh ung thư [4-6] Các nghiên cứu khoa học cho thấy, trong các cây thuốc

TẠP CHÍ ĐẠI HỌC SÀI GÒN, tháng 10, 2009

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG UNG THƯ VÚ MCF-7

CỦA MỘT SỐ CAO TRÍCH VÀ HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC

TỪ CÁC CÂY THUỘC CHI HEDYOTIS

PHẠM NGUYỄN KIM TUYẾN (*)

NGUYỄN KIM PHI PHỤNG ( ** ) PHẠM ĐÌNH HÙNG ( *** )

TÓM TẮT

Kết quả thử nghiệm tính kháng khuẩn cho thấy cao etanol của H nigricans có hoạt tính trên ba

chủng B subtilis, E coli và S typhi Kết quả thử nghiệm độc tính Brine Shrimp và khả năng gây

độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 cho kết quả khá tương đồng, ngoại trừ arbutin

(LC 50 =20 g/ml) và rutin (LC 50 =50 g/ml) có độc tính Brine Shrimp mạnh nhưng không độc đối

với dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (I%= 1,33 đối với arbutin và I%= 3,53 đối với rutin) Hai

hợp chất 4'-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon (I%= 92,60) và -amyrin (I%= 98,23) cho hoạt tính

mạnh nhất trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Các nghiên cứu về hoạt tính của chi Hedyotis

vẫn đang được tiếp tục

ABSTRACT

The ethanol extract of H nigricans exhibited strong antibaterial activity on Bacillus subtilis,

Escherichia coli and Salmonela typhi Arbutin and rutin exhibited strong Brine shrimp toxicity

(LC 50 20 g/ml and 50 g/ml, respectively) but showed mild inhibition on breast cancer cell

MCF-7 (1.33 and 3.53% inhibition, respectively) The remaining extracts and compounds

showed the correlation on Brine Shrimp toxicity and cytotoxicity against breast cancer cell

MCF-7 Two compounds, 4'-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanone and -amyrin (92.60 and 98.23 %

inhibition, respectively) showed the strongest cytotoxicity against breast cancer cell MCF-7 The

further researche sare underinvestigated

1 TỔNG QUAN

Ở Việt Nam cũng như các quốc gia khác trong khu vực Đông Nam Á, các cây thuốc thuộc chi

Hedyotis, họ Cà phê Rubiaceae như H corymbosa, H diffusa v.v đã được sử dụng rộng rãi trong

y học cổ truyền để chữa trị các vết rắn cắn, viêm nhiễm vết thương và đặc biệt là bệnh ung thư

[4-6] Các nghiên cứu khoa học cho thấy, trong các cây thuốc này thường có chứa các hợp chất là

acid ursolic và acid oleanolic và hai hợp chất này được chứng minh là có hoạt tính kháng các

(*)

(

dòng tế bào ung thư như: tế bào ung thư phổi A549, tế bào ung thư buồng trứng SK-OV-3, tế bào ung thư da SK-MEL-2, tế bào ung thư não XF498, tế bào ung dạ dày SNU-1, tế bào ung thư bạch cầu L1210 [3-5] Do đặc điểm Hóa Thực vật, các loài cùng chi có thể chứa các hợp chất giống nhau hoặc có đặc điểm về dược tính tương tự nhau, nên việc nghiên cứu thành phần hóa học và

dược tính c a các cây thuốc m i thuộc chi Hedyotis là hết sức cần thiết Chính v các l do trên,

ch ng tôi đã tiến hành kh o sát thành phần hóa học c a ba loài thuộc chi Hedyotis là H

auricularia, H biflora và H nigricans Kết qu kh o sát cho thấy các loài Hedyotis này có chứa

các hợp chất steroid, acid triterpenoid, flavonoid, antraquinon và glycosid, trong đó c ba loài

Hedyotis kh o sát đều có chứa acid ursolic và acid oleanolic v i hàm lượng khá cao (0,07 – 0,14

% so v i bột cây khô) [9-12] Sau đó, các cao trích và các hợp chất cô lập đã được thử nghiệm

hoạt tính kháng sốt rét, kháng khuẩn, độc tính Brine Shrimp và kh năng gây độc trên dòng tế bào ung thư v MCF-7 nhằm góp phần phát hiện hoạt tính sinh học c a các cây thuốc m i thuộc chi

Hedyotis

2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Các cao trích và các hợp chất tinh khiết được tiến hành thử nghiệm các hoạt tính sinh học như:

kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, kháng khuẩn trên bốn ch ng Escherichia coli (Gram âm), Salmonela typhi (Gram âm), Staphylococus (Gram dương) và Bacillus subtilis (Gram

dương), độc tính Brine shrimp và kh năng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư v MCF-7 Cấu tr c hóa học các hợp chất thử nghiệm hoạt tính sinh học được tr nh bày trong h nh 1

Kết qu thử nghiệm hoạt tính kháng sốt rét trên cao etanol thô ban đầu c a hai loài Hedyotis cho thấy, ở nồng độ 100 mg/ml, cao etanol H auricularia và H nigricans đều không có hoạt tính kháng k sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum Chính v thế, cao etanol thô còn lại c a H

biflora không được nhận thử tiếp Như vậy, các cao etanol thô ban đầu c a ba cây Hedyotis kh o

COOH

9

12

13

19 20

23 24

25

29

30

9

12 13

19 20

23 24 25

29 30

26

9

12 13

19 20

23 24 25 29 30

26

(13)

18 20

21 22 24 28 26 27 25 23

5 6

11 15

OH

O HO

OH

OH

1' 2' 3'

4' 5'

O H

1 3 5

(14)

(21)

S

OH

3 10 5

8 9

O

O

OH

OH

1

3

10

11

9 13

5

6

8

O OH

3 10 5

8 9

O OH

5' 3 10 5

8 9

O OH

O

4' 2' 5' 3 10 5

8 9 1

HO

OMe

O

OH

OH

HO

O O HOHO

H OH O

H H

OH

O OH HO

O

1"

1"'

O

OH

OMe

4' 2' 5' 3

10

5

8 9

MeO

OMe

O OH

OH

4' 2' 5' 3 10 5

8 9

(24) (22)

S

OH

OMe

4' 2' 5' 3 10 5 6

8 9

MeO

OMe

(23)

O OH

4' 2' 5' 3 10 5

8 9

4' 2' 5' 3 10 5

8 9

(26)

Hình 1: Cấu tr c hóa học các hợp chất được thử nghiệm hoạt tính sinh học

sát đều không có kh năng gây chết k sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, điều này cũng phù hợp v chưa có tài liệu nào nói đến hoạt tính kháng sốt rét c a các cây thuộc chi Hedyotis

Kết qu thử nghiệm tính kháng khuẩn trên bốn ch ng E coli, S typhi, S aureus và B subtilis c a

cao etanol thô ban đầu c a ba loài Hedyotis được tr nh bày trong b ng 1 Các mẫu được thử ở

nồng độ 100 mg/ml Các cao etanol thô cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn v i các mức độ mạnh,

yếu khác nhau Cao etanol thô ban đầu c a H auricularia có hoạt tính tốt v i các ch ng S

aureus và E coli Cao etanol c a H nigricans có hoạt tính tốt v i các ch ng B subtilis, E coli và

S typhi

Bảng 1: Kết qu thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn c a cao etanol c a ba cây Hedyotis kh o sát

(tính bằng bán kính vòng vô khuẩn kể từ đĩa giấy, mm)

1 Cao alcol c a cây

2 Staphylococus

aureus

3 Bacillus subtilis

4 Escherichia

coli

5 Salmonela

typhi

Ghi chú: (-): không thấy rõ tính kháng khuẩn

Kết qu thử nghiệm độc tính Brine shrimp c a các cao trích và một số hợp chất được trình bày

trong b ng 2 Kết qu được tính bằng liều LC50 (g/ml) là nồng độ hoạt chất (g/ml) gây chết

50% số ấu thể Artemia salina thử nghiệm Các nghiên cứu khoa học cho thấy khi mẫu thử cho độc

tính Brine shrimp thì sẽ có hoạt tính kháng ung thư Một số cao chiết cho độc tính Brine

shrimp mạnh như cao etanol và cao cloroform c a loài H auricularia; cao etanol, cao cloroform, cao etyl acetat và nhất là cao metanol c a loài H nigricans Một số hợp chất cho độc

tính Brine shrimp mạnh như h ợ p c h ấ t arbutin, -amyrin, 1,4-dihydroxy-9,10-antraquinon, 5-hydroxyflavon, 5,7,4'-trihydroxyisoflavon, rutin, 5,7-di5-hydroxyflavon, 5-hydroxythioflavon, 5,7-dihydroxyflavon, 4'-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon, 5,7,4'-trihydroxyflavanon, acid oleanolic và nhất là acid ursolic

Kết qu thử nghiệm kh năng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 c a các cao

trích và một số hợp chất được trình bày trong b ng 2 Kết qu được tính bằng giá trị I%, biểu thị

kh năng kháng phân bào c a chất thử Giá trị I% càng l n, chất thử có hoạt tính càng mạnh Một

số cao chiết có hoạt tính tốt như cao etanol thô ban đầu, cao cloroform c a H auricularia và nhất

là cao metanol c a H nigricans Trong số các hợp chất thử nghiệm, hai hợp chất

4'-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon (I%= 92,60) và nhất là -amyrin (I%= 98,23) cho hoạt tính mạnh nhất, hai hợp chất 5,7,4'-trihydroxyflavanon và 5,7,4'-trihydroxyisoflavon cho hoạt tính khá trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7

Thử nghiệm độc tính Brine shrimp và kh năng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú

MCF-7 cho kết qu khá tương đồng, ngoại trừ hợp chất arbutin (LC50=20 g/ml) và rutin (LC50=50 g/ml) có độc tính Brine shrimp mạnh nhưng không độc đối v i dòng tế bào ung thư

vú MCF-7 (I%= 1,33 đối v i arbutin và I%= 3,53 đối v i rutin)

So sánh hoạt tính kháng ung thư trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 c a một số hợp chất thioflavon và flavon tương ứng cho thấy trong số các hợp chất thử nghiệm, hai cặp hợp chất 5-hydroxythioflavon (I%= 21,83) và 5-hydroxyflavon (I%= 20,39); 3,7,2',4'- tetrametoxy-5-hydroxythioflavon (I%= 9,89) và 3,7,2',4'-tetrametoxy-5-hydroxyflavon (I%= 9,59) cho hoạt tính gần như tương tự nhau, trong khi đó hợp chất 4'-butyloxy-5,7- dihydroxythioflavon (I%= 28,04) cho hoạt tính yếu hơn nhiều so v i 4'-butyloxy-5,7- dihydroxyflavanon (I%=92,60)

Bảng 2: Kết qu thử nghiệm độc tính Brine shrimp và kh năng gây độc tế bào trên dòng tế bào

ung thư vú MCF-7 c a các cao trích và hợp chất tinh khiết

21 N0 22 Loại cao chiết

23 hoặc hợp chất tinh khiết

24 Độc tính

25 Brine shrimp

26 LC50 (g/ml)

27 Gây độc

tế bào

28 ung thư

vú

29 MCF-7 (I%)

30 1 31 Gossypol (Mẫu chứng dương) 32 10 33 97,10

34 2 35 Cao etanol thô ban đầu H auricularia 36 100 37 40,86

38 3 39 Cao cloroform H auricularia 40 100 41 47,97

42 4 43 Cao etanol thô ban đầu H biflora 44 1000 45 - 4,78

50 6 51 Cao etanol thô ban đầu H nigricans 52 100 53 24,27

54 7 55 Cao eter dầu hỏa H nigricans 56 500 57 1,25

58 8 59 Cao cloroform H nigricans 60 100 61 31,07

62 9 63 Cao etyl acetat H nigricans 64 100 65 13,54

86 15 87 -Sitosterol 3--O-D-glucopyranosid 88 500 89 - 3,34

90 16 91 1,4-Dihydroxy-9,10-antraquinon

93 23,63

94 17 95 5,7-Dihydroxyflavon (Chrysin) 96 100 97 19,69

98 18 99 3,5,7,3',4'-Pentametoxyflavon 3-rutinosid

101 3,53

102 19 103 5,7,4’-Trihydroxyisoflavon (Biochanin A) 104 20 105 73,37

106 20 107 5-Hydroxyflavon (Primuletin) 108 100 109 20,39

114 22 115 3,7,2',4'-Tetrametoxy-5-hydroxyflavon 116 500 117 9,59

118 23 119 3,7,2',4'-Tetrametoxy-5-hydroxythioflavon 120 500 121 9,89

122 24 123 5,7,4'-Trihydroxyflavanon (Naringenin) 124 50 125 71,92

126 25 127 4'-Butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon 128 50 129 92,60

130 26 131 4'-Butyloxy-5,7-dihydroxythioflavon 132 100 133 28,04

Riêng đối v i hợp chất 5,7,4'-trihydroxyflavanon (I%=71,92) sau khi được t h ự c h i ệ n p h n ứng alkyl hóa thành 4’-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon (I%= 92,60) cho hoạt tính mạnh hơn thấy rõ

Dựa trên kết qu nghiên cứu c a Trần Thành Đạo [1], các thioflavon có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn và có kh năng ức chế sự tạo ra NO trên tế bào vi thần kinh đệm BV-2 từ bằng so v i các flavon tương ứng Tuy nhiên, v i hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư vú MCF-7, các hợp chất thioflavon thử nghiệm cho hoạt tính bằng hoặc yếu hơn so v i hợp chất flavon tương ứng

Nghiên cứu về cây thuốc là một trong những nội dung nghiên cứu đang được quan tâm nhằm đóng góp các cây thuốc giá trị vào nguồn dược liệu c a Việt Nam Những kết qu thử nghiệm hoạt tính trên là tiền đề quan trọng cho những nghiên cứu lâm sàng trong quá tr nh t m kiếm các th o dược

m i

3 THỰC NGHIỆM

1.1 Các cao trích và các hợp chất tinh khiết thử nghiệm hoạt tính sinh học thu được từ việc

kh o sát thành phần hóa học c a ba loài cây thuộc chi Hedyotis là H auricularia (L.) Lam., H

biflora (L.) Lam và H nigricans (L.) Lam ) [9-12] Các hợp chất thioflavon được điều chế từ

ph n ứng giữa các flavon tương ứng và tác chất Lawesson trong điều kiện chiếu xạ vi sóng không dung môi [13]

1.2 Thử tính kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum: gửi mẫu thử tại Phòng thí

nghiệm Sinh học kí sinh trùng và Sinh hóa trị liệu, Viện B o tàng thực vật Quốc gia, Cộng hòa Pháp, do Tiến sĩ Tôn Thất Quang thực hiện

1.3 Thử tính kháng khuẩn: gửi mẫu thử tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử,

Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM

1.4 Thử độc tính Brine shrimp: mẫu thử được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ,

Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM

Một mẫu được xem là không độc nếu liều LC50> 1000 g/ml Một mẫu được xem là có nhiều hứa hẹn có hoạt tính nếu liều LC50< 200 g/ml

1.5 Thử kh năng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7: gửi mẫu thử tại phòng

thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử, Khoa Sinh, trường ĐH KHTN Thử nghiệm được tiến hành bằng phương pháp MTT trên tế bào ung thư vú MCF-7

Phương pháp MTT: là phương pháp so màu nhạy có tính định lượng, dùng để xác định sự

sống, tăng sinh và hoạt động c a tế bào Phương pháp này dựa trên kh năng c a những enzym dehydrogenase trong các tế bào sống sẽ chuyển hợp chất màu vàng, tan được trong nư c là bromur 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium thành s n phẩm formazan màu xanh đen, không tan trong nư c Số lượng formazan tạo thành sẽ ph n ánh trực tiếp số lượng tế bào không phân chia nhưng vẫn sống Đo OD ở các giếng thử nghiệm sau 72 giờ Các giá trị thu được được lặp lại ở các lần thí nghiệm là giá trị I%, biểu thị kh năng kháng phân bào c a hợp chất, đơn vị là % AVE là giá trị trung b nh c a I% c a các lần lặp lại STD là giá trị độ lệch chuẩn giữa các lần lặp lại I% được tính theo công thức sau :

I% = C T

C



  x 100 %

I%: kh năng kháng phân bào c a hợp chất (%)

C : giá trị OD c a lô đối chứng

T : giá trị OD c a TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Tran Thanh Dao (2005), T N Tuyen, H Park, Synthesis and iNOS inhibitory activities of

thioflavones, Arch Pharm Res., 28, 652-656

2 Phan Đức Bình (2000), Tạp chí Thuốc và Sức khỏe, 125, tr 31

3 Ho T-I., Chen G-P., Lin Y-C., Lin Y-M., Chen F-C (1986), An anthraquinone from Hedyotis

diffusa, Phytochemistry, 25, pp 1988-1989

4 Hong X.X., Min W., Boon N.L (1996), Screening of traditional medicines for their

inhibitory activity against HIV-1 protease, Phytother Res, 10, pp 207 - 210

5 Kim Sung Hoon, Ahn Byung-Zun, Ryu Shiyong (1998), Antitumour effects of ursolic

acid isolated from Oldenlandia diffusa, Phytother Res, 12, pp 553-556

6 Phạm Hoàng Hộ (2006), Cây có vị thuốc ở Việt Nam, NXB Trẻ, tr 512-515

7 Montagnac A., Provost J T., Litaudon M., Pais M (1997), Antimitotic and cytotoxic

constituents, Myodocarpus gracilis, Planta Med., 63, pp 365-366

8 Đỗ Tất Lợi (1986), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà

Nội, tr 264 -268

9 Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đ nh Hùng (2005), Khảo sát thành

phần hóa học của cây Hoa Kim Cương Hedyotis nigricans, họ Cà Phê (Rubiaceae), Tạp chí

Hóa học Việt Nam, 43(6), 778-782

10 Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đ nh Hùng (2007), Khảo sát thành

phần hóa học của cây An Điền Tai Hedyotis auricularia, họ Cà Phê (Rubiaceae), Tạp chí Hóa

học Việt Nam, 45(2), 233-236,

11 Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đ nh Hùng, Poul Erik Hansen

(2007), Khảo sát thành phần hóa học của cây An Điền hai hoa Hedyotis biflora, họ Cà phê

(Rubiaceae), Tuyển Tập Các Công Trình Hội nghị Khoa Học và Công nghệ Hóa học Hữu cơ

toàn quốc lần thứ 4, 252-255

12 Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng (2008), Cô lập một

vài flavon và antraquinon từ cây Hedyotis auricularia, họ Cà phê (Rubiaceae), Tạp chí Khoa

học và Công nghệ, 46, 237-243

13 Pham Nguyen Kim Tuyen, Nguyen Kim Phi Phung, Fadhil S Kamounah, Wei Zhang

and Poul Erik Hansen, NMR of a series of novel hydroxyflavothiones, Magn Reson Chem,

Published online in Wiley Interscience, July 2009